UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DANIELA PRESCILA DEZIDÉRIO SACCONI
AVALIAÇÃO DO POLIMORFISMO Y402H NO GENE CFH E DA DELEÇÃO DOS GENES CFHR3/CFHR1 EM RELAÇÃO À ETIOLOGIA DA DEGENERAÇÃO MACULAR RELACIONADA À IDADE (DMRI) EM UMA AMOSTRA DA POPULAÇÃO
BRASILEIRA
CAMPINAS 2015
DANIELA PRESCILA DEZIDÉRIO SACCONI
AVALIAÇÃO DO POLIMORFISMO Y402H NO GENE CFH E DA DELEÇÃO DOS GENES CFHR3/CFHR1 EM RELAÇÃO À ETIOLOGIA DA DEGENERAÇÃO MACULAR RELACIONADA À IDADE (DMRI) EM UMA AMOSTRA DA POPULAÇÃO
BRASILEIRA.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas para obtenção de título de Mestra em Ciências, área de concentração Clínica Médica.
Orientadora: Profa. Dra. Mônica Barbosa de Melo
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA DANIELA PRESCILA DEZIDÉRIO SACCONI, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MÔNICA BARBOSA DE MELO.
CAMPINAS 2015
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
DANIELA PRESCILA DEZIDÉRIO SACCONI
ORIENTADORA: PROFA. DRA. MÔNICA BARBOSA DE MELO
COORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ PAULO CABRAL DE VASCONCELLOS
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. MÔNICA BARBOSA DE MELO
2. PROFA. DRA. MANOELA MARQUES ORTEGA
3. PROFA. DRA. MÔNICA DE CASSIA ALVES DE PAULA
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo seu amor, pelo cuidado especial a cada minuto, por ter me permitido alcançar mais um objetivo e ter me abençoado grandemente!!
À minha mãe, pelo apoio em todos os momentos, pelo amor incondicional, pelas orações, por ter me ensinado o caminho certo!
Ao meu esposo, por não me deixar desistir quando eu achei que as coisas não dariam certo, pela paciência, compreensão em momentos difíceis!
À profa. Dra. Mônica Barbosa de Melo, pela oportunidade de desenvolver um projeto de tal importância, pela confiança, paciência, ajuda, compreensão em determinados momentos,
Ao prof. Dr. José Paulo Cabral de Vasconcellos, pela ajuda nos assuntos clínicos,
Aos meus colegas de laboratório, pela agradável companhia, em especial à Letícia, Tamires e Danizinha, pelas conversas, risadas, pessoas que fizeram os meus dias mais alegres!
Agradeço a FAPESP e CAPES pelas bolsas e auxílios financeiros concedidos para a viabilização deste projeto de pesquisa.
RESUMO
Introdução: A Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI) é uma doença degenerativa de uma parte importante da retina, denominada mácula. É uma causa prevalente de perda da visão em países desenvolvidos, afetando em média pessoas acima de 60 anos. É caracterizada pela presença de drusas hiperpigmentadas ou despigmentadas em volta da mácula e pode ocorrer de duas formas, não exsudativa, ou seca, que afeta a membrana de Bruch e Epitélio Pigmentar da Retina (EPR), causando atrofia secundária de fotorreceptores e perda gradativa da visão, e forma exsudativa, ou neovascular, com a formação de vasos sanguíneos sob o EPR, acarretando perda mais acentuada da visão. Vários fatores estão envolvidos, dentre eles, fatores genéticos, ambientais, história familiar e idade avançada, sendo os dois últimos considerados os mais importantes. Dentre os genes envolvidos na etiologia da DMRI está o Fator do Complemento H (CFH), localizado no cromossomo 1 e os genes que codificam as proteínas relacionadas ao CFH, CFHR3/CFHR1. Objetivos: Os principais objetivos deste trabalho foram compreender melhor a contribuição da variante Y402H do gene CFH e da deleção dos genes CFHR3/CFHR1 na etiologia da doença. Métodos: Nesse estudo foram analisados 175 indivíduos apresentando DMRI (grupo caso) e 165 não apresentando DMRI (grupo controle). Os diferentes genótipos da variante Y402H foram analisados por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e digestão enzimática e a deleção CFHR3/CFHR1 foi analisada por meio de reação de PCR. Resultados: O alelo C foi mais frequente no grupo caso do que no grupo controle (47% comparado a 31%), com uma Odds Ratio (OR) (razão de chances) de 2,56. As ORs para os genótipos CC e TC foram 3,83 e 2,27 respectivamente. A frequência da deleção CFHR3/CFHR1 foi maior no grupo controle do que no grupo caso, com 8,5% e 1,7% respectivamente, com OR de 5,32. Conclusões: Os resultados sugerem que há uma contribuição da variante Y402H do gene CFH e da deleção CFHR3/CFHR1 na suscetibilidade e proteção ao desenvolvimento da DMRI nesta amostra da população brasileira, respectivamente.
ABSTRACT
Introduction: Age-Related Macular Degeneration (AMD) is a degenerative disease of an important part of the retina, called macula. It is a prevalent cause of vision loss in developed countries, affecting on average people over 60 years. It is characterized by the presence of hyperpigmented or depigmented drusen around the macula and can occur in two ways, not exudative form, or dry, which affects the Bruch's membrane and the Retina Pigment Epithelium (RPE), causing secondary atrophy of photoreceptors and gradual vision loss, and exudative form, or neovascular with the formation of blood vessels under the RPE, resulting in more pronounced vision loss. Several factors are involved, among them genetic, environmental factors, family history and age, the latter two considered the most important. Among the genes involved in AMD are the Complement Factor H gene (CFH) on chromosome 1 and the genes that code for the CFH-related proteins, CFHR3/CFHR1. Purpose: The main objectives of this work were to better understand the contribution of the Y402 variant in the CFH gene and CFHR3/CFHR1 genes deletion in relation to AMD etiology. Methods: In this study, 175 AMD (case group) and 165 non-AMD subjects (control group) were analyzed. The genotypes of the Y402H variant were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) and enzymatic digestion and the
CFHR3/CFHR1 deletion was analyzed by PCR. Results: The C allele was more
frequent in the case group than in the control group (47% compared to 31%) showing an odds ratio (OR) of 2.56. Odds Ratios for TC and CC genotypes were 3.83 and 2.27, respectively. The frequency of CFHR3/CFHR1 deletion was higher in the control group than in the case group, with 8.5% and 1.7%, respectively, with OR of 5.32. Conclusion: The results suggest that there is a contribution of the CFH gene Y402H variant and CFHR3/CFHR1 deletion in susceptibility and protection, respectively, to the development of AMD in this sample of the Brazilian population.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Retinografias de pacientes com DMRI. (A) Retina normal, sem qualquer alteração
no EPR. (B) Paciente 1 apresentando cicatriz disciforme com extensa fibrose sub-retiniana no olho direito e DMRI exsudativa com fibrose sub-retiniana e hemorragias no olho esquerdo. (C) Paciente 2 apresentando DMRI seca com discretas drusas no olho direito e DMRI exsudativa com membrana neovascular no olho esquerdo. (D) Paciente 3 apresentando DMRI seca com áreas de atrofia e drusas no olho direito e cicatriz disciforme no olho esquerdo. ... 17
Figura 2. Apresentação esquemática do envolvimento das espécies de oxigênio reativo na
patologia da DMRI. As células são expostas ao estresse oxidativo como resultado da exposição a diversos fatores como tabagismo, exposição a UV, fagocitose do EPR, entre outros, que geram dano celular levando a oxidação do DNA nuclear, peroxidação lipídica e dano ao DNA mitocondrial. Adaptação de Tokarz e cols., 2013 ... 20
Figura 3. Diagrama do olho humano (A) DMRI inicial onde ocorre o acúmulo de drusas
subretinianas que bloqueiam a chegada de nutriente aos fotorreceptores, causando dano e morte aos mesmos eventualmente levando à Atrofia Geográfica (AG). (B) Perda completa das células do EPR e neurodegeneração dos fotorreceptores. (C) DMRI úmida ou Neovascular, formação e rompimento dos novos vasos sanguíneos anormais e infiltração de macrófagos na retina levando à degeneração celular dos fotorreceptores. Adaptado de Schramm e cols, 2014 ... 22
Figura 4. Regiões duplicadas que compartilham 96% de homologia entre si (Hughes e cols.,
2006 ... 25
Figura 5. Os 20 domínios PCC (proteínas de controle do complemento) da proteína CFH
com seus sítios de ligação à C3b e à heparina e proteína C reativa (CRP). Figura adaptada de Schramm e cols., 2014 ... 26
Figura 6. Regiões duplicadas entre o gene CFH e seus genes relacionados, que
Figura 7. (A) Ligação bivalente do CFH a cargas aniônicas nas superfícies das células do
hospedeiro cobertas por sulfato de heparan e interação prejudicada entre o domínio 7 do FH e sulfato de heparan resultante da variante H402. Desta forma a proximidade do FH em relação aos domínios 1-4 de C3b ligado a superfície é reduzida. (B) Células alteradas do hospedeiro expondo seus lipídeos. A CRP é recrutada em direção a essas células e se liga ao FH do tipo selvagem (Y402) ao domínio 7 e aos domínios 19-20. Com a presença da variante H402 no domínio 7, a capacidade de ligação à CRP deste domínio é diminuída, resultando na degradação deficiente de C3b ligado à superfície celular. Figuras adaptadas de Perkins e cols 2012 e 2014. ... 28
Figura 8. Os 20 domínios PCC (proteínas de controle do complemento) da proteína CFH
com seus sítios de ligação e polimorfismos. Figura adaptada de Schramm e cols., 2014 .... 29
Figura 9. Região do cromossomo 1 onde se localizam o gene CFH com seu polimorfismo
(Y402H), suas proteínas relacionadas e a região em que ocorre a deleção de 84.000 pares de bases. Figura adaptada de Schramm e cols., 2014 ... 30
Figura 10. Eletroforese em gel de agarose 2% para visualização dos genótipos da variante
Y402H. Nos indivíduos homozigotos (3, 6 e 8) para o alelo selvagem T (TT) foi possível a visualização de apenas uma banda ao gel de agarose (532 pb), nos heterozigotos (1, 4, 5 e 7) para o alelo de risco C (TC) duas bandas foram visíveis (532 e 447 pb) e no indivíduo homozigoto (2) para o alelo de risco C (CC), apenas a banda de 447 pb. O número 9 se refere ao marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (InvitrogenTM·Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). ... 37
Figura 11.Eletroforese em gel de agarose 1,5% para visualização dos genótipos da deleção CFHR3/CFHR1. Indivíduos com bandas visíveis para ambos os amplicons (1, 2 e 3) foram classificados como não homozigotos para a deleção e o indivíduo apresentando somente a banda do gene CFH (325 pb) (4) foi classificado como homozigoto para a deleção. O número 5 se refere ao marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (InvitrogenTM·Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)... 38
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Frequência alélica da variante Y402H no gene CFH em casos e controles indicando que o alelo C apareceu com maior frequencia no grupo caso do que no grupo controle. ... 45 Gráfico 2. Frequência genotípica da variante Y402H do gene CFH em casos e controles indicando que os genótipos CC e TC apareceram com maior frequência no grupo caso do que no grupo controle. ... 46 Gráfico 3. Frequência da deleção CFHR3/CFHR1 entre casos e controles indicando que a deleção apareceu com maior frequência no grupo controle comparada ao grupo caso. ... 48
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características de idade, gênero e tabagismo para pacientes e controles. ... 40 Tabela 2. Características e comparação da idade dos pacientes entre as categorias de DMRI e controles. ... 41 Tabela 3. Avaliação de fatores de risco associados à DMRI por meio de análise de regressão logística. ... 41 Tabela 4. Dados e análise das frequências alélica e genotípica da variante Y402H do gene CFH entre o grupo caso e o grupo controle e entre os grupos estratificados por meio do teste chi - quadrado. ... 44 Tabela 5. Relação entre o alelo de risco C da variante Y402H e DMRI antes e após a estratificação por meio de análise de regressão logística. ... 45 Tabela 6. Avaliação de fatores de risco associados a DMRI após estratificação em tipos úmida e seca e formas avançada e não avançada por meior de análise de regressão logística. ... 47
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AG - Atrofia Geográfica
AMD - Age related macular degeneration APOE - Apolipoproteína E
ARMS2 - Age related macular susceptibility 2
AV - Avançada
C - Citosina
CARMS - Clinical age-related maculopathy staging system CFH - Fator H do complemento – Complement Factor H
CFHR3 - Proteína 3 relacionada ao CFH - Complement Factor H related 3 CFHR1 - Proteína 1 relacionada ao CFH – Complement Factor H related 1 CRP - Proteína C reativa – C reactive protein
DMRI - Degeneração macular relacionada à idade
DNA - Ácido desoxirribonucleico - Deoxyribonucleic acid dNTP - Desoxirribonucleotideo trifosfatado
EDTA - Ácido etilendiaminotetraacético - Ethylenediaminetetraacetic acid EPR - Epitélio pigmentar da retina
H - Histidina
HTRA1 - High Temperature Requirement A-1
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IC - Intervalo de confiança
mg - Miligrama
MgCl - Cloreto de Magnésio mM - Milimol
MNVC - Membrana Neovascular Coroidal
NA - Não avançada
Ng - nanograma
OR - Odds Ratio
P - Probabilidade estatística
PAR - Proliferação angiomatosa retiniana Pb - Pares de bases
PCR - Reação em cadeia da polimerase - Polymerase Chain Reaction Pmol - Picomol
SAS - Statistical Analysis System
SNP - Polimorfismo de nucleotídeo único - Single nucleotide polymorphism
T - Timina
VEGF - Fator de crescimento endotelial vascular - Vascular endotelial growth
factor
VPC - Vasculopatia polipoidal coroidal
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 15
1.1 Epidemiologia da Degeneração Macular relacionada à Idade ... 15
1.2 Estágios da DMRI ... 16
1.3 Fisiopatologia da DMRI ... 18
1.4 Associação de fatores de risco ... 22
1.5 Genética da DMRI ... 23 1.6 Fator do Complemento H (CFH) ... 25 2. OBJETIVOS ... 32 2.1 Objetivo geral ... 32 2.2 Objetivos específicos ... 32 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS ... 33 3.1 Casuística ... 33 3.2 Extração de DNA ... 34 3.3 Avaliação de polimorfismos ... 35
3.4 Avaliação da variante Y402H ... 35
3.5 Reação de sequenciamento ... 36
3.6 Purificação da reação de sequenciamento... 36
3.7 Reação de Digestão Enzimática ... 37
3.8. Avaliação da deleção CFHR3/CFHR1 ... 37 3.9 Análise estatística ... 39 4. RESULTADOS ... 40 4.1 Dados demográficos ... 40 4.2 Análise genética ... 42 5. DISCUSSÃO ... 49 6. CONCLUSÕES ... 54 7. REFERÊNCIAS ... 55 ANEXOS ... 68
1. INTRODUÇÃO
1.1 Epidemiologia da Degeneração Macular relacionada à Idade
A Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI) é uma doença multifatorial que afeta a área central do segmento posterior ocular conhecida como mácula, essencial para a visão de detalhes, cores e resolução de imagens.¹ É a terceira causa de cegueira de forma global e a primeira causa em países industrializados, segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS).²
Essa doença é responsável por 8,7% de todas as cegueiras do mundo (acima de 55 anos), principalmente em países desenvolvidos. É estimado que em 2020 o número de casos de DMRI aumente para 196 milhões e em 2040 para 288 milhões.³ Nos Estados Unidos, por exemplo, 10% de todos os indivíduos entre 65 e 75 anos e 30% com mais de 75 anos tem um dano visual relacionado à DMRI4 e há aproximadamente 50 milhões de pessoas com DMRI em todo o mundo.5
No estudo realizado em 2011, na população dos Estados Unidos, com indivíduos de 40 anos ou mais, a prevalência estimada de qualquer tipo de DMRI foi de 6,5% e a de DMRI avançada foi de 0,8%, sendo os negros o subgrupo menos afetado.6 Em populações de origem europeia, a prevalência estimada de DMRI avançada foi observada em 1,4% dos pacientes de 70 anos de idade, variando de 5,6% nos pacientes com 80 anos a 20% nos com 90 anos.7 A doença estava em primeiro lugar nos estudos do “Australian Blue Mountains” afetando 76% dos indivíduos com cegueira bilateral8 e em outro estudo nos Estados Unidos foi responsável por 54,4% dos casos entre caucasianos.9
Na Argentina, que apresenta 13,1% da sua população com 65 anos ou mais e 97% da população é branca, alguns estudos epidemiológicos sugerem que a DMRI represente 3-4% de casos de cegueira.10
Na população adulta de chineses em Beijing, na China, foi analisada a prevalência de maculopatias relacionadas à idade (MRI) em comunidades vivendo na região rural e outras na região urbana. O estudo, que avaliou 4376 indivíduos, sugeriu que maculopatias relacionadas à idade são raramente encontradas em
adultos chineses vivendo nesta região. A frequência de MRI exsudativa foi de 0,1% dos 4376 indivíduos.11 A estimativa de prevalência de DMRI nesse estudo foi menor do que a estimativa da população chinesa examinada no “Taiwanese Shih-Pai Eye Study” em que a DMRI foi a terceira causa mais comum de dano visual, representada por 10,4% dos casos.12
São poucos os estudos realizados no Brasil com relação à prevalência da DMRI. Foi observada uma prevalência de 23%-30% após 55 anos de idade em um hospital de Pernambuco13, enquanto que na cidade de Veranópolis, Rio Grande do Sul, a prevalência foi de 31,5% em pacientes acima de 80 anos.14Já no estudo de Oguido e cols 2008, realizado na cidade de Londrina, no estado do Paraná com descendentes de japoneses, a prevalência de DMRI inicial foi de 13,8% e de DMRI avançada foi de 1,3% com uma frequência geral de 15,1% aumentando com a idade.15
1.2 Estágios da DMRI
A DMRI se manifesta pela perda das células fotorreceptoras na região central da retina denominada mácula, levando à perda da visão central e fazendo com que os pacientes dependam somente da sua visão periférica.16
A doença pode ser dividida em DMRI inicial, seca e úmida. Na DMRI inicial ocorrem mudanças pigmentares na retina e depósito de material anormal sob o epitélio pigmentar da retina (EPR), denominado drusa.17 A forma seca é caracterizada pela degradação do EPR e, posteriormente, dos fotorreceptores na área macular. Como consequência ocorre um acúmulo de drusas entre o EPR e a membrana de Bruch. Nessa forma de DMRI a perda visual ocorre de forma gradual dependendo da extensão das drusas na área macular, permanecendo muitas vezes assintomáticas ou evoluindo para a atrofia das células do EPR e levando à forma mais avançada, a atrofia geográfica (AG). A AG é responsável por apenas 20% dos casos de cegueira legal entre os afetados pela degeneração.18Ainda hoje não existe um tratamento eficaz, embora alguns estudos tenham indicado o ômega 3 como um ácido graxo possivelmente associado à proteção contra o desenvolvimento dessa forma da doença.19-21
A forma úmida ocorre com menos frequência (15%) do que a seca (85%), porém é mais grave, representando dois terços dos indivíduos que tem perda de visão significante.22 Esta é caracterizada por um desequilíbrio entre fatores pro-angiogênicos e anti-pro-angiogênicos que leva a uma produção aumentada do Fator de Crescimento Endotelial Vascular ou Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). O VEGF é uma glicoproteína dimérica que ativa as células endoteliais retinianas causando a liberação de proteases e desencadeando a proliferação celular endotelial e sua migração em direção ao estímulo23, podendo levar à forma avançada da DMRI úmida, a Neovascularização Coroidal (NVC). A NVC caracteriza-se pelo aparecimento de uma membrana neovascular sub-retiniana (MNSR) que altera a anatomia macular, incluindo a interface fotorreceptor-EPR, permitindo o extravasamento de plasma e/ou sangue, o destacamento do EPR e cicatrização levando à perda irreversível dos fotorreceptores adjacentes, com consequente baixa de visão, geralmente mais rápida e acentuada do que a observada na forma seca.24 A figura 1 demonstra retinografias de pacientes em diferentes estágios de DMRI.
Figura 1. Retinografias de pacientes com DMRI. (A) Retina normal, sem qualquer alteração no EPR. (B) Paciente 1 apresentando cicatriz disciforme com extensa fibrose sub-retiniana no olho direito e DMRI exsudativa com fibrose sub-retiniana e hemorragias no olho esquerdo. (C) Paciente 2
apresentando DMRI seca com discretas drusas no olho direito e DMRI exsudativa com membrana neovascular no olho esquerdo. (D) Paciente 3 apresentando DMRI seca com áreas de atrofia e drusas no olho direito e cicatriz disciforme no olho esquerdo.
1.3 Fisiopatologia da DMRI
Vários processos patológicos e heterogêneos podem predispor o indivíduo à DMRI, considerada uma doença multifatorial e extremamente complexa. A idade representa seu determinante primário, enquanto os fatores ambientais como hábitos alimentares,25,26exposição à luz12, 27 e tabagismo,28, 29 contribuem para um aumento significante no risco de ocorrência da doença, associados a fatores genéticos.30-32
As drusas, que são um dos sinais iniciais da DMRI, consistem de depósitos extracelulares de material degenerativo, de forma redonda e amarelada, que podem ser divididas em drusas duras, pequenas e com margens bem delimitadas, e drusas moles, geralmente maiores e com margens mal definidas, que tendem a aumentar de tamanho. 33As primeiras são geralmente menos numerosas, distribuídas na periferia da retina e são comumente associadas com a idade. No entanto, podem coalescer em drusas moles, que são maiores e mais numerosas, causando anormalidades no EPR.34
A presença dessas drusas, segundo alguns autores, nas proximidades da membrana de Bruch (figura 3), pode levar à disfunção e/ou degeneração do EPR e da retina por induzir isquemia ou por restringir a troca de nutrientes e produtos residuais entre a coroide e a retina neural,35 acelerando a degeneração do epitélio e levando à morte celular neuroretiniana.36-38 As mudanças pigmentares, outro sinal inicial da DMRI, são interpretadas como uma disfunção ou perda parcial das células do epitélio pigmentar da retina.39-41
O EPR exerce múltiplas funções essenciais para a sobrevivência nos tipos celulares adjacentes e é um regulador crucial do ciclo visual. Estas células absorvem energia da luz, fazem o transporte de nutrientes e metabólitos entre os fotorreceptores e coriocapilares, controlam o equilíbrio iônico tecidual, produzem fatores de crescimento para os fotorreceptores, controlam o ciclo visual, regulam o metabolismo da vitamina A e criam uma barreira hemato-retiniana.42
Com o envelhecimento ou senilidade das células, ocorre um aumento na proporção de células apoptóticas no EPR. Este aumento é visto primeiramente na mácula. A morte dessas células na região macular pode ser causada por um acúmulo gradual dentro das células de produtos processados de maneira imprópria, provenientes da fagocitose dos segmentos externos dos fotorreceptores e que são
prejudiciais para as células.40 Tais produtos podem formar depósitos devido ao processamento indevido, ao invés de serem removidos como são normalmente, pela circulação coroidal.39, 43
O metabolismo desses materiais ocorre nos lisossomos, organelas que limpam as proteínas alteradas, glicoconjugados, lipídeos, e ácidos nucleicos tanto nos processos normais como patológicos em células de mamíferos44 das células do EPR. Muitas delas exibem disfunções na proteólise lisossomal com o envelhecimento.45, 46 Quando essas células do EPR morrem devido ao acúmulo de materiais impróprios, elas são substituídas por outras células que migram das partes mais periféricas da retina.4
Na atrofia geográfica, regiões das camadas de células do EPR são permanentemente excluídas, sugerindo uma falha em substituir as células perdidas (figura 3). A senilidade inibe os mecanismos de substituição, migração e replicação em muitos tipos de células46 e nas do EPR reduz a capacidade de replicação, embora os efeitos na migração não tenham sido identificados ainda.48
Embora a DMRI não seja considerada uma típica doença inflamatória, muitos estudos vêm sendo realizados mostrando o papel patogênico dos processos imunológicos no desenvolvimento e progressão da doença. Vários polimorfismos em genes inflamatórios e imunológicos são associados à DMRI, confirmando o envolvimento desses processos na patogênese da doença.49, 50
A inflamação é um processo defensivo que protege os tecidos dos estímulos danosos restaurando sua homeostase51 epode ser desencadeada pelo acúmulo de restos celulares fazendo com que a resposta do sistema imune se torne crônica e excessiva causando dano à retina.52 As células do EPR são capazes de produzir moléculas imuno-regulatórias solúveis, ligadas à superfície celular e um dos seus papeis é o de liberar imunossupressores e induzir células T regulatórias a bloquearem qualquer resposta excessiva e sua inflamação resultante, protegendo a retina de um dano permanente.53 A perda dessas células pode causar a ativação da cascata inflamatória que resulta na patogênese da DMRI.54
Em todos os estágios da DMRI, os macrófagos constituem um dos principais tipos celulares inflamatórios e são correlacionados com drusas, rupturas da membrana de Bruch e com os dois tipos de DMRI avançada, tanto atrofia geográfica quanto neovascularização coroidal, estimulando uma angiogênese aberrante.51
O estresse oxidativo, que é resultado do desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes, também contribui para o desenvolvimento da DMRI e o seu papel na geração de danos às células do EPR tem sido bem discutido.55 As células do EPR são expostas a estresse oxidativo crônico devido a seus altos níveis de consumo de oxigênio, sua exposição a produtos de peroxidação de lipídios derivados dos segmentos externos dos fotorreceptores e presença constante do estimulo da luz.56 Nas células epiteliais senis, a capacidade de responder ao estresse oxidativo aumentado é reduzida. Um sinal dessa incapacidade é o acúmulo aumentado de lipofuscina autoxidativa, que são agregados de lipídios, proteínas e derivados de pigmentos57 nos lisossomos das células do EPR e formação de drusas extracelulares entre o EPR e a Membrana de Bruch.58, 59 Na figura 2 podem-se observar as consequências das espécies reativas de oxigênio para as células do EPR.
Figura 2. Apresentação esquemática do envolvimento das espécies de oxigênio
reativo na patologia da DMRI. As células são expostas ao estresse oxidativo como resultado da exposição a diversos fatores como tabagismo, exposição a UV, fagocitose do EPR, entre
outros, que geram dano celular levando a oxidação do DNA nuclear, peroxidação lipídica e dano ao DNA mitocondrial. Adaptação de Tokarz e cols., 2013.60
Na DMRI úmida (neovascularização coroidal), o VEGF alfa (VEGF-A) é o principal desencadeante da doença. Ele exerce funções fisiológicas importantes na retina61 e é constitutivamente secretado pelo EPR.62 O VEGF alfa atua como um fator de sobrevivência retinoprotetor, protegendo as células de Muller, as células neuronais, os coriocapilares, e células do EPR.63, 64
A senilidade pode aumentar a expressão desse fator em um número de células humanas, efeito não estabelecido ainda nas células do EPR.65, 66 Um aumento na expressão de VEGF induzido pela senilidade, se ocorrido nas células do EPR, promoveria o crescimento de vasos sanguíneos e diminuiria a integridade da camada de células, favorecendo NVC (figura 3).67 Além disso, as mudanças induzidas pela senilidade, que têm sido observadas na morfologia e adesividade das células, poderia também enfraquecer a barreira formada pela camada de células do EPR68 levando também ao aparecimento de NVC.69
Figura 3. Diagrama do olho humano. (A) DMRI inicial, onde ocorre o acúmulo de drusas
subretinianas que bloqueiam a chegada de nutriente aos fotorreceptores, causando danos e morte aos mesmos e, eventualmente, levando à atrofia geográfica (AG). (B) Perda completa das células do epitélio pigmentar da retina (EPR) e neurodegeneração dos fotorreceptores. (C) DMRI úmida ou Neovascular, formação e rompimento dos novos vasos sanguíneos anormais e infiltração de macrófagos na retina levando à degeneração celular dos fotorreceptores. Adaptado de Schramm e cols, 2014.16
1.4 Associação de fatores de risco
Um número razoável de fatores de risco tem sido associado com o desenvolvimento e progressão da DMRI. Entre eles estão inclusos a idade,10, 15, 70, 71
ingestão de certos tipos de gorduras,78, 79, 80 obesidade,71, 81 consumo de álcool,82 história familiar,10, 81, 83 raça caucasiana, hipertensão, doença de Alzheimer, baixos níveis circulantes de antioxidantes endógenos39, 40 e exposição à UV.10, 27
A idade é, com certeza, o maior fator de risco para DMRI. De acordo com algumas estimativas, 25% das pessoas com idade entre 65 e 74 anos apresentam a doença ou possuem risco elevado em desenvolvê-la. Entre as que têm 75 anos ou mais, 33% apresentam DMRI.70
Níveis elevados de proteína C reativa (CRP) no sangue também estão relacionados com a doença. Indivíduos com mais de 3 mg/l de CRP tem um aumento na incidência de DMRI de 50% e quase 2 vezes mais risco de desenvolver DMRI neovascular.84
Muitos estudos também relatam o tabagismo como o principal fator de risco para o desenvolvimento de DMRI, o que aumenta tanto a prevalência quanto a taxa de progressão da doença por elevar o nível de estresse oxidativo na retina, ativação do sistema imune, redução do fluxo sanguíneo coroidal e ocorrência de micro infartos.82, 85, 86 Aqueles que fumam apresentam risco até três vezes maior de desenvolver DMRI do que os não fumantes.87
Alguns relatos indicam que atividades ao ar livre e exposição a raios ultravioleta foram associados com o desenvolvimento de drusas e outros tipos de DMRI.88, 89 No estudo de Moon e cols 2012, o nível de atividade física e o uso de medicamentos à base de plantas foi inversamente relacionado com DMRI inicial. Os mecanismos segundo o qual essas associações aconteceram não foram claros, sendo necessários mais estudos para confirmá-los.90
1.5 Genética da DMRI
A DMRI é uma doença multifatorial na qual o fator genético desempenha um papel fundamental para a sua ocorrência.91 Existe um alto grau de concordância na incidência de DMRI em gêmeos, particularmente em univitelinos, o que demonstra a importância do genótipo para a ocorrência da doença. Recentemente, alguns fatores genéticos foram associados à etiologia da DMRI. Entre as regiões propostas, as regiões cromossômicas 1q31 e 10q26 têm sido repetidamente ligadas à doença em
vários estudos.92-94 Estudos recentes de associação de genoma total (GWAS) identificaram aproximadamente 20 loci relacionados à doença.95, 96 Em 2005, a variante Y402H (rs1061170) no gene do Fator do Complemento H (CFH) na região 1q32 foi descoberta como a primeira variante de suscetibilidade à doença.97-100
Paralelamente à associação do polimorfismo Y402H (alelo C) no gene CFH ao risco aumentado de desenvolvimento de DMRI, outras variantes foram identificadas. Dentre elas destacam- se o polimorfismo A69S (rs10490924), que consiste na troca do nucleotídeo G pelo nucleotídeo T, resultando na substituição do aminoácido alanina na posição 69 da proteína por serina no gene LOC387715 (também designado ARMS2, age related macular susceptibility 2) e o polimorfismo rs11200638 que consiste na substituição do nucleotídeo G pelo nucleotídeo A na região promotora do gene Serina Peptidase 1 (HTRA1, High Temperature
Requirement A-1).101Esses dois polimorfismos se encontram em quase completo desequilíbrio de ligação e ainda não está claro qual dos dois executa um papel no mecanismo patológico da doença e qual serve somente como um marcador genético.102A variante A69S no gene LOC387715 associada à variante Y402H no gene CFH confere quase 60% do risco genético para a doença103 e tem sido associada à sua forma exsudativa.101, 104, 105
A Apolipoproteina E (ApoE), um gene polimórfico com três variantes alélicas (isoformas) comuns no cromossomo 19 (E2, E3 e E4), também tem sido ligada à patogênese da DMRI. O alelo E3 ocorre mais frequentemente na população branca. O alelo E4 tem sido correlacionado à diminuição do risco para DMRI, ou pelo menos ao atraso da ocorrência da doença. Em contraste, a presença do alelo E2 é associada com menor idade ao diagnóstico.102
Um polimorfismo na região promotora do gene IL-8 vem sendo associado à patogênese da DMRI e corresponde à substituição do nucleotídeo A pelo nucleotídeo T na posição -251.106 A função desta interleucina é atrair linfócitos e neutrófilos para o local da inflamação e também é conhecida como mediador primário da angiogênese.103
Outras moléculas inflamatórias associadas à DMRI são as quimiocinas, que atraem leucócitos para o local de infecção. Observou-se uma associação do gene do receptor 3 de quimiocina (CCR3) em uma população indiana na qual o genótipo TT
da variante rs3091250 foi identificado como um importante marcador de risco para a doença.93
1.6 Fator do Complemento H (CFH)
O Fator do Complemento H é uma glicoproteína do soro que regula a função da via alternativa do sistema complemento em sua fase fluida e na superfície celular.107 Ele é o mais potente regulador do sistema complemento, que exerce funções regulatórias importantes como queda de aceleração e atividade de cofator (Figura 4). Possui vários sítios de ligação a C3b (domínios 1-4 e 19-20) e consequentemente regula o complemento em nível de convertase C3.108 Além da ligação à C3b, ele também se liga à proteína C reativa (domínios 7 e 16-20) e à heparina (domínios 7 e 19-20) (Figura 5).109
Figura 4. (A) Atividade de cofator realizada pelo Fator 1 (FI) em associação com as proteínas PCM (proteína cofator de membrana), FH (fator H) ou CR1 (receptor 1 do complemento). (B) Atividade de aceleração de decaimento por meio do Fator H (FH) em fase fluida ou nas superfícies celulares dissocia Bb do C3b (ou C2a do C4b). Figura adaptada de Elizabeth Miller 2012.108
Figura 5. Os 20 domínios PCC (proteínas de controle do complemento) da proteína CFH com seus sítios de ligação à C3b e à heparina e proteína C reativa (CRP). Figura adaptada de Schramm e cols., 2014.16
O gene CFH se encontra na região de um grupo de genes reguladores de ativação do complemento (RCA), que também inclui cinco genes relacionados (CFHR3, CFHR1, CFHR4, CFHR2 e CFHR5), organizados in tandem no cromossomo 1q32.110 Eles se localizam em um segmento de 355 kb à extremidade proximal do grupo de genes envolvidos na regulação da ativação do complemento.111
Cada um dos genes relacionados ao CFH codifica uma única proteína plasmática112 e cada uma delas possuem de 4 a 9 domínios PCC que compartilham um grau de homologia entre si. O domínio 7 está presente em todas, menos na CFHR4.113 A análise de sequência dessa região mostra evidência de duplicação segmental resultando em um alto grau de identidade de sequência entre o gene
CFH e seus genes relacionados114, 115 (Figura 6). Essas duplicações são frequentemente associadas a rearranjos genômicos que em geral ocorrem como resultado de recombinação homóloga não alélica entre esses segmentos ou como resultado de conversão gênica.116, 117
Figura 6. Regiões duplicadas entre o gene CFH e seus genes relacionados, que compartilham 96% de homologia entre si (Hughes e cols., 2006).133
A variante Y402H faz uma contribuição importante para a susceptibilidade à DMRI. Esta alteração é decorrente de uma substituição do alelo T pelo alelo C no nucleotídeo 1277 no éxon 9 do CFH, que resulta na troca do aminoácido tirosina por histidina, contribuindo para mudanças na interação do CFH com a heparina e a proteína C reativa.118 A variante de tipo selvagem Y402 se liga mais fortemente aos seus ligantes do que a variante de risco H402 e essa diferença de ligação se deve a mudanças na distribuição de amino ácidos carregados positivamente pela variante H402. Essa ligação é essencial para uma ligação apropriada do domínio 7 a esses ligantes,119 evitando assim, a progressão e amplificação da cascata imune, formação de convertase C5 e ativação da via terminal que gera a lise celular.120 Portanto, essa variante afeta a regulação do complemento mediada pelo fator H (Figura 7).118
Figura 7. (A) Ligação bivalente do CFH a cargas aniônicas nas superfícies das células do hospedeiro cobertas por sulfato de heparan e interação prejudicada entre o domínio 7 do FH e sulfato de heparan resultante da variante H402. Desta forma a proximidade do FH em relação aos domínios 1-4 de C3b ligado a superfície é reduzida. (B) Células alteradas do hospedeiro expondo seus lipídeos. A CRP é recrutada em direção a essas células e se liga ao FH do tipo selvagem (Y402) ao domínio 7 e aos domínios 19-20. Com a presença da variante H402 no domínio 7, a capacidade de ligação à CRP deste domínio é diminuída, resultando na degradação deficiente de C3b ligado à superfície celular. Figuras adaptadas de Perkins e cols 2012 e 2014.121, 122
O risco de desenvolvimento da doença em indivíduos homozigotos para o genótipo CC é de 5 a 7 vezes maior quando comparado com homozigotos para o alelo normal T; heterozigotos TC também apresentam um risco aumentado, porém menor.99
Uma variedade de estudos em diversas populações envolvendo a variante C de risco estão disponíveis na literatura, relatando a importância dessa variante nos diferentes estágios da doença.71, 123, 124Na população japonesa, ao contrário de muitas populações em todo o mundo, não foi observada nenhuma associação da variante Y402H com a DMRI.125, 126
Outras variantes no gene do fator H também foram associadas ao desenvolvimento da doença, como a variante rara (R1210C), com alta penetrância, levando ao início precoce da doença. Localizada na região C-terminal da proteína CFH, a variante R1210C prejudica sua ligação à membrana celular, consequentemente, diminuindo sua função regulatória.127 As variantes R53C e D90G, ambas responsáveis pela atividade regulatória reduzida do CFH, foram identificadas através do sequenciamento inteiro do exoma de 9 famílias com DMRI, nas quais foram observadas segregando perfeitamente com a doença128 (Figura 8).
Figura 8. Os 20 domínios PCC (proteínas de controle do complemento) da proteína CFH com seus sítios de ligação e polimorfismos. Figura adaptada de Schramm e cols., 2014.16
As proteínas CFHR1 e CFHR3 são reguladoras do complemento. A proteína CFHR1 inibe a convertase C5 e as vias de complemento terminal e a CFHR3 mostra atividade de cofator para a serina protease fator I (CFI) na inativação e degradação de C3b. As três proteínas, CFHR1, CFHR3 e fator H, se ligam a sítios similares em C3b, e assim CFHR1 e CFHR3 competem com o fator H para a sua ligação e na falta dessas duas proteínas a ligação do fator H à C3b é aumentada.96
O estudo de Fritsche e cols 2010 relata evidências de que a deleção de
CFHR3/CFHR1, um polimorfismo comum no número de cópias (CNP) que abrange
uma região de cerca de 84.000 pares de bases (pb), resulta na perda de dois reguladores do complemento (CFHR1 e CFHR3) (demonstrados na figura 9) aumentando a regulação do mesmo mediada pelo CFH. Tal evento confere um efeito protetor contra o desenvolvimento da DMRI, independentemente, das sequências variantes do gene CFH. Assim, a regulação do complemento predominantemente pelo fator H agindo em nível de convertase C3 é benéfica para
a retina, mas o desequilíbrio entre os reguladores pode criar também um novo fator de risco para doenças autoimunes.96
Figura 9. Região do cromossomo 1 onde se localizam o gene CFH com seu polimorfismo (Y402H), suas proteínas relacionadas e a região em que ocorre a deleção de 84.000 pares de bases. Figura adaptada de Schramm e cols., 2014.16
Foi recentemente observada a origem da deleção em caucasianos, asiáticos e mais recentemente em africanos.92 O estudo de Hageman e cols 2006 sugeriu que há diferenças na frequência da população com relação à deleção CFHR3/CFHR1 mostrando que sua prevalência em homozigotos na população africana foi de 16%.129 No estudo de Holmes e cols 2013, avaliou-se o número de cópias CFHR3 e
CFHR1 e foi observado que as frequências alélicas mais baixas da deleção foram
encontradas na América do Sul (0%), Japão (0%), México (1,5%), Sibéria (2,1%) e China (6%) e que as mais altas foram na África subsaariana e Nigéria com 33,7% e 54,7% respectivamente.130
É possível que populações ancestrais africanas com uma baixa frequência alélica da deleção tenham sido as únicas que participaram da dispersão “out of África” (para fora da África) com um gargalo associado, reforçando a baixa frequência do alelo.131, 132 Poucos estudos foram realizados até agora, envolvendo a deleção como um fator protetor contra o desenvolvimento da doença.129, 133-135
Para que se conheça o impacto das variações genéticas e o risco de desenvolvimento da DMRI na população brasileira, propõe-se neste estudo a avaliação do polimorfismo do gene CFH (Y402H) e deleção (CFHR3/CFHR1) em
uma amostra da população brasileira atendida no Serviço de Retina do Hospital de Clínicas da Unicamp. Desta forma, o perfil genético desta população em relação a este gene será melhor compreendido, permitindo a realização de estudos com amostras maiores e provenientes de diferentes regiões do Brasil e assim contribuindo para possíveis aplicações deste conhecimento na prática clínica.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geralCompreender melhor a contribuição de fatores genéticos em relação à etiologia da DMRI.
2.2 Objetivos específicos
- Investigar o papel do polimorfismo Y402H do gene CFH e sua relação ao risco para o desenvolvimento da DMRI em uma amostra da população brasileira.
- Investigar a contribuição da deleção que compreende os genes CFHR1 e
CFHR3 na região 1q32 em relação ao risco para o desenvolvimento da DMRI em
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
3.1 Casuística
Realizou-se um estudo do tipo caso-controle. Foram estudados 175 pacientes com DMRI e 165 pacientes sem DMRI (caso controle). Os pacientes afetados pela doença foram selecionados no Ambulatório de oftalmologia do Hospital das Clínicas, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e os controles eram, normalmente, seus acompanhantes (cônjuges) ou pacientes do Serviço de Oftalmologia Geral. O estudo passou por aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Unicamp e o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) foi assinado pelos participantes do estudo (Anexos 1 e 2).
3.1.1 Grupo caso
3.1.1.1 Critérios de inclusão
Os 175 pacientes incluídos no estudo preencheram os critérios necessários para diagnóstico de DMRI graus 3, 4 ou 5 (DMRI intermediária e avançada), tanto do tipo exsudativa, quanto do tipo atrófica, segundo o sistema de classificação do CARMS (Clinical age-related maculopathy staging system).136 O grau 3 requer a presença de no mínimo 15 drusas intermediárias ou uma drusa grande associada ou não a descolamento drusenóide do EPR. A presença de atrofia geográfica envolvendo a região central da mácula ou atrofia geográfica não central com pelo menos 350µ define o estágio 4 da doença. O estágio 5 é caracterizado pela presença de doença do tipo exsudativo, incluindo descolamento do epitélio pigmentar não drusenóide, descolamento de retina hemorrágico ou seroso, membrana neovascular coroidal (MNVC) com fibrose ou hemorragia subretiniana, cicatriz consistente com tratamento de DMRI e cicatriz disciforme.
Foi classificado como DMRI avançada o pior olho que apresentava AG, MNV e DMRI disciforme. O pior olho que apresentava DMRI seca leve e moderada, atrofia do EPR, hipopigmentação e hiperpigmentação foram classificados como DMRI não avançada.
3.1.2 Grupo controle
3.1.2.1 Critérios de inclusão
Os indivíduos que compuseram o grupo controle (acompanhantes ou pacientes do Serviço de Oftalmologia Geral) apresentavam idade maior ou igual a 55 anos e ausência de qualquer evidência de alterações de fundo de olho, como drusas ou alterações no EPR.
3.1.2.2 Critérios de exclusão: grupos caso e controle
Pacientes com história familiar de cegueira, que apresentassem qualquer opacidade de meios que impedissem fundoscopia e/ou retinografia de boa qualidade foram excluídos do estudo. Pacientes com vasculopatia polipoidal coroidal (VPC), alta miopia (equivalente esférico >-6 dioptrias), estrias angióides, doença corioretiniana infecciosa, inflamatória ou hereditária, trauma, presença de hemorragia macular de qualquer causa e casos de neovascularização suspeita de proliferação angiomatosa retiniana (PAR) também foram excluídos.
3.2 Extração de DNA
Foram coletados 10 ml de sangue periférico em frasco estéril, com EDTA 10% como anticoagulante, de todos os indivíduos submetidos ao estudo. O DNA foi extraído segundo o método fenol/clorofórmio. As amostras foram identificadas e estocadas à -20ºC.
3.3 Avaliação de polimorfismos
A análise da variante Y402H foi realizada por meio de PCR e reação de digestão enzimática. A reação de sequenciamento foi realizada em apenas 20 amostras como forma de controle para a análise dos genótipos. Já a deleção de cerca de 84.000 pb no locus CFH, que compreende os genes CFHR1 e CFHR3 foi avaliada por meio de PCR.
3.4 Avaliação da variante Y402H
3.4.1 PCR
A PCR foi padronizada utilizando-se os seguintes reagentes, no mínimo: um par de cada iniciador compreendendo a variante Y402H do gene CFH cuja sequencia “sense” foi CGAAGAAAGGAGAGCACATAAG-3’ e anti-sense 5’-GGAGTAGGAGACCAGCCATT-3’, tampão da enzima (Tris-HCl 20mM (pH 8,4), KCl 50mM, MgCl2 1.5mM, gelatina 0,01%), mistura de nucleotídios (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) 0,2mM e 1 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen Life Technology, Gaithersburg, MD, EUA), somados a 0,5µg de DNA genômico. A seguir as amostras foram amplificadas por meio de aparelho termociclador. As temperaturas e duração dos ciclos foram: desnaturação inicial a 95°C durante 1 minuto; 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante um minuto, anelamento a 67°C durante um minuto e alongamento a 72°C durante um minuto; extensão final de 72°C durante 7 minutos e conservação a 4°C.
Ao final da reação, 3μL do produto da PCR foram misturados a 1μL do tampão de corrida 10X Blue Juice·Gel Loading Buffer (InvitrogenTM·Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) e submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo e observados sob iluminação ultravioleta. Os fragmentos amplificados foram comparados ao marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (InvitrogenTM·Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).
3.5 Reação de sequenciamento
Para a reação de sequenciamento foram utilizados de 10 a 40ng do produto da PCR para um volume final de reação de 10µL, contendo 1µL de “Big Dye Terminator Ready Reaction v3.0” (ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems Foster City, CA, USA), 3µL do tampão de seqüenciamento 5X (Applied Biosystems Foster City, CA, USA) e 1,6pmol de um dos iniciadores (“sense” ou “antisense”) utilizados na PCR, sendo o volume final completado com água deionizada estéril. As condições das reações de sequenciamento foram: 25 ciclos a 96ºC por 10 segundos, 50ºC por 5 segundos e 60ºC por 4 minutos.
3.6 Purificação da reação de sequenciamento
Após realização da reação de sequenciamento, aos 10μl do produto final foram adicionados 50μl de isopropanol 65%, permanecendo em repouso em ambiente escuro por 20 minutos e logo em seguida submetidos à centrifugação por 25 minutos a 25ºC a 13000rpm. Após centrifugação o sobrenadante foi retirado por pipetagem. Foram adicionados, em seguida, 250μl de etanol 60%, levando-se à centrifugação por 10 minutos a 25ºC a 13000rpm. Após centrifugação o sobrenadante foi retirado por pipetagem. Em seguida os tubos foram levados ao banho seco a 90ºC por 4 minutos para evaporação do etanol residual, permanecendo no tubo apenas o “pellet” do material tratado aderido à parede do tubo.
As amostras foram ressuspensas em 17μl de Formamida Hi-Di (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA), desnaturadas a 95ºC por 3 minutos, colocadas em gelo e submetidas à eletroforese no analisador automático de DNA “ABI PRISM 3500” (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA). Para confirmação da região genômica analisada, as sequências foram submetidas a buscas por similaridade, utilizando-se o “algoritmo de buscas” Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
3.7 Reação de Digestão Enzimática
Os produtos da PCR foram submetidos à digestão pela enzima de restrição
NlaIII (BioLabs®, New England, EUA) por 3 horas à 37ºC. Foram utilizados 15µl do
produto de PCR, 2µl de tampão G, 1µl de enzima (10 unidades por µl) e 2µl de água, para uma reação final de 20µl e os produtos aplicados em gel de agarose 2%. A análise foi feita pelo tamanho dos fragmentos de digestão. Figura 10.
Figura 10. Eletroforese em gel de agarose 2% para visualização dos genótipos da variante
Y402H. Nos indivíduos homozigotos (3, 6 e 8) para o alelo selvagem T (TT) foi possível a visualização de apenas uma banda ao gel de agarose (532 pb), nos heterozigotos (1, 4, 5 e 7) para o alelo de risco C (TC) duas bandas foram visíveis (532 e 447 pb) e no indivíduo homozigoto (2) para o alelo de risco C (CC), apenas a banda de 447 pb. O número 9 se refere ao marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (InvitrogenTM·Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).
3.8. Avaliação da deleção CFHR3/CFHR1
A genotipagem da deleção CFHR3/CFHR1 foi realizada por meio de PCR. Com apenas 1 par de primers foi possível amplificar produtos de regiões diferentes, uma região no gene CFH e outra que abrange os genes CFHR3/CFHR1, sendo possível devido a quase idêntica homologia que há entre essas regiões, resultando em dois fragmentos de tamanhos diferentes, com 325 pb e 381 pb respectivamente. Foi utilizado, então, um par de primers cujo sense foi
5’-CTCTTCTTTTTCTGCATCTGC-3’ e antisense
5’-ATTGCTGCTTATGGTAGATCAGG-3’,137 tampão da enzima (Tris-HCl 20mM (pH
8,4), KCl 50mM, MgCl2 1.5mM, gelatina 0,01%), mistura de nucleotídios (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) 0,2mM e 1 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen Life Technology, Gaithersburg, MD, EUA), somados a 0,5µg de DNA genômico. As temperaturas e duração dos ciclos foram: desnaturação inicial a 95°C durante 1 minuto; 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante um minuto, anelamento a 58°C durante um minuto e alongamento a 72°C durante um minuto; extensão final de 72°C durante 7 minutos e conservação a 4°C.
Ao final da reação, 3 μL do produto da PCR foram misturados a 1 μL do tampão de corrida 10X Blue Juice·Gel Loading Buffer (InvitrogenTM·Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) e submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo e observados sob iluminação ultravioleta. Os fragmentos amplificados foram comparados ao marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (InvitrogenTM·Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Figura 11.
Figura 11. Eletroforese em gel de agarose 1,5% para visualização dos genótipos da deleção CFHR3/CFHR1. Indivíduos com bandas visíveis para ambos os amplicons (1, 2 e 3) foram classificados como não homozigotos para a deleção e o indivíduo apresentando somente a banda do gene CFH (325 pb) (4) foi classificado como homozigoto para a deleção. O número 5 se refere ao marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder (InvitrogenTM·Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).
3.9 Análise estatística
A análise estatística foi realizada por meio do software estatístico SAS (Statistical Analysis System, versão 9.4, SAS Institute Inc, 2002-2008, Cary, NC, USA)138, 139, 140 para investigar a interação entre as variáveis idade, tabagismo, sexo, polimorfismo no gene CFH e deleção e a DMRI e seus estágios. Os testes do chi-quadrado e exato de Fisher foram utilizados para comparar variáveis categóricas. Os testes de Kruskal - Wallis e Mann – Whitney foram utilizados para comparar variáveis quantitativas. As análises de regressão logística univariada e multivariada foram utilizadas para investigar fatores de risco para a DMRI. Valores menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi utilizado para analisar a distribuição genotípica nos grupos caso e controle. O cálculo “post-hoc” do poder da amostra foi realizado por meio do programa ClinCalc, disponível em http://clincalc.com/Stats/Power.aspx.
4. RESULTADOS
4.1 Dados demográficos
Trezentos e quarenta pacientes não relacionados foram envolvidos nesse estudo, sendo 175 pacientes com DMRI (grupo caso) e 165 sem DMRI (grupo controle). 130 pacientes tinham a forma avançada da doença, 45 tinham a forma não avançada, 66 tinham DMRI seca e 109 tinham DMRI úmida. Dados sobre idade, gênero e tabagismo, referentes aos estágios e formas da doença e ao grupo controle encontram-se descritos na tabela 1. A média da idade no grupo caso foi significativamente diferente do grupo controle (p = 0,047) (teste de Mann Whitney). Quando os casos foram estratificados por estágios da doença e tipos de DMRI, a diferença se manteve, com p = 0,01 e p = 0,048, respectivamente (Teste de Kruskal-Wallis) (Tabela 2).
Quando as variáveis idade, gênero e tabagismo foram avaliadas em relação ao risco de desenvolvimento de DMRI, não houve diferença entre gênero e tabagismo para nenhuma das categorias da doença, mantendo-se significativa a variável idade (p = 0,0007; OR = 1,05) (Tabela 3).
Tabela 1. Características de idade, gênero e tabagismo para pacientes e controles. Dados Descritivos
Gênero Tabagismo* n Média Idade (anos) Homens (%) Mulheres (%) Sim (%) Não (%)
Casos 175 74,44 74 (42) 101 (58) 78 (45) 97 (55) Avançado 130 74,45 58 (45) 72 (55) 60 (46) 70 (54) Não avançado 45 74,42 16 (36) 29 (64) 18 (40) 27 (60) Seca 66 75,27 31 (47) 35 (53) 32 (48) 34 (52) Úmida 109 73,94 43 (39) 66 (61) 46 (42) 63 (58) Controle - 165 71,40 78 (47) 87 (53) 42 (25) 54 (33)
Tabela 2. Características e comparação da idade dos pacientes entre as categorias de
DMRI e controles.
Variável Categoria N Média Mediana D.P Min. Max. p Método
Idade Casos 175 74,44 76,00 8,02 46 92 0,047 Whitney Mann -Controles 165 71,56 72,00 7,10 55 89 Avançada 130 74,45 76,00 8,04 51 92 0,01 Kruskal-Wallis N AV 45 74,42 76,00 8,08 46 87 Controle 165 71,56 72,00 7,10 55 89 Úmida 109 73,94 75,00 7,92 51 90 0,048 Kruskal-Wallis Seca 66 75,27 77,00 8,19 46 92 Controle 165 71,55 72,00 7,10 55 89
N AV= Não avançada; N= número; DP= desvio padrão; Min= mínimo; Max= máximo; p= probabilidade.
Tabela 3. Avaliação de fatores de risco associados à DMRI por meio de análise de
regressão logística.
Regressão logística univariada
Variável n Categoria p OR IC 95%
Sexo 340 M X F 0,3028 1,253 0,816 – 1,925
Idade 340 - 0,0007 1,051 1,021 – 1,082
Tabagismo 271 Sim x Não 0,8965 1,034 0,626 – 1,707 Genótipos CFH 340 CC x TT < 0,0001 3,829 1,920 – 7,635 TC x TT 2,269 1,409 – 3,655 TC/CC x TT < 0,0001 2,563 1,630 – 4,031 Del. CFHR3/CFH R1 340 Sim x Não 0,0097 5,315 1,499 – 18,850 Regressão Multivariada Idade 340 - 0,0022 1,048 1,017 – 1,079 Genótipos CFH 340 CC/TC x TT 0,0001 2,442 1,542 – 3,867
Del= deleção; CFH= Fator H do complemento; CFHR3= gene da proteína 3 relacionada ao gene CFH; CFHR1= gene da proteína 1 relacionada ao gene CFH; N= número; M = masculino; F = feminino; p= probabilidade; OR= Odds Ratio (razão das chances); IC= intervalo de confiança de 95%.
4.2 Análise genética
4.2.1 Polimorfismo Y402H no gene CFH
Através do teste chi-quadrado foi comparada a frequência do alelo de risco (C) da variante entre os grupos caso e controle, obtendo-se resultado estatisticamente significativo, sendo que a variante de risco C apareceu com maior frequência no grupo caso (47%) do que no grupo controle (31%) (p = 0,000014) (Tabela 4, gráfico 1), mostrando associação com a DMRI. Os resultados referentes à distribuição dos alelos antes e após a estratificação em estágios avançado e não avançado, formas seca e úmida quando comparados com o grupo controle ou entre si encontram-se na tabela 5.
A frequência genotípica também foi diferente entre casos e controles, sendo que os genótipos CC e TC apareceram com maior frequência no grupo caso (20% e 53%, respectivamente) do que no grupo controle (10% e 42%, respectivamente) (p = 0,0002) (Tabela 4, gráfico 2). Ambos os genótipos foram estatisticamente diferentes quando comparados ao genótipo de tipo selvagem TT (p < 0,0001), onde o risco maior foi obtido para a comparação entre os genótipos CC e TT (OR = 3,83). A combinação dos genótipos CC e TC versus o genótipo TT também resultou em um valor estatisticamente significativo (p < 0,0001). Após a regressão logística multivariada, a associação permaneceu somente entre os genótipos combinados CC e TC versus TT do gene CFH (p = 0,0001) (Tabela 3). Para verificar se houve estratificação no grupo caso e no grupo controle, nós avaliamos o equilíbrio de Hardy–Weinberg e encontramos equilíbrio em ambos os grupos, com p = 0,76 e p = 0,98 respectivamente.
Após estratificação do grupo caso em tipo (úmida e seca) e forma (avançada e não avançada) de DMRI os resultados mostraram-se estatisticamente significativos para os genótipos do gene CFH tanto para a comparação de DMRI úmida versus o grupo controle quanto para DMRI seca versus controle (p = 0,0004). A OR mais alta foi alcançada pelo genótipo CC versus TT quando comparamos o tipo úmida versus o controle (OR = 4,4). Somente o genótipo CC versus TT foi associado à DMRI seca comparada ao grupo controle. Quando combinamos os genótipos CC e TC versus o
genótipo TT nós observamos associação com ambos os tipos de DMRI (p = 0,0001). Porém, quando comparados os tipos seca versus úmida da doença, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Após a regressão multivariada a associação permaneceu somente entre os genótipos combinados CC/TC x TT do gene CFH na comparação DMRI úmida versus o grupo controle (p < 0,0001). Dados detalhados encontram-se na tabela 6.
Quando analisamos o grupo caso estratificado nas formas avançada e não avançada com relação aos genótipos do gene CFH, observamos que o genótipo CC foi significativamente associado com ambas as formas da doença quando comparado ao grupo controle (p < 0,0001), com o risco maior para a forma avançada (OR = 4,17). O genótipo TC versus TT foi associado somente à forma avançada comparada ao grupo controle. Quando comparamos a forma avançada versus não avançada observamos uma tendência maior de associação do genótipo TC versus TT para a forma avançada. Na combinação dos genótipos CC e TC comparados ao genótipo TT, os resultados mostraram que a presença de um alelo C é suficiente para aumentar o risco de desenvolver a forma avançada da doença quando comparado ao grupo controle (p < 0,0001). Quando as formas avançada e não avançada da doença foram comparadas entre si, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Após a análise de regressão multivariada, a associação permaneceu somente entre a combinação dos genótipos CC/TC versus TT do gene CFH na comparação DMRI de forma avançada versus o grupo controle (p = 0,0002) (Tabela 6). O cálculo post-hoc do poder desta amostra foi de 85,9% considerando-se um alfa de 0,05.
Tabela 4. Dados e análise das frequências alélica e genotípica da variante Y402H do gene
CFH entre o grupo caso e o grupo controle e entre os grupos estratificados por meio do teste chi - quadrado.
Genótipos CFH N (%) Dados Estatísticos
Casos [n = 175] Controles [n = 165] p OR IC (95%) CC 36 (20) 16 (10) 0,0002 3,83 1,92 – 7,64 TC 92 (53) 69 (42) 2,27 1,41 – 3,66 TT 47 (27) 80 (48) Referência Avançado [n = 130] Não avançado [n = 45] CC 25 (19) 11 (24) 0,06 1,29 0,51- 3,25 TC 75 (58) 17 (38) 2,5 1,13 – 5,53 TT 30 (23) 17 (38) Referência Úmida [n = 109] Seca [n = 66] CC 22 (20) 14 (21) 0,26 1,38 0,57 – 3,34 TC 62 (57) 30 (46) 1,82 0,89 – 3,74 TT 25 (23) 22 (33) Referência Alelos CFH N (%) Casos [n = 175] Controles [n = 165] C 164 (47) 101 (31) 0,000014 1,99 1,46 – 2,74 T 186 (53) 229 (69) Referência Avançado [n = 130] Não avançado [n = 45] C 125 (48) 39 (43) 0,4 1,21 0,75 – 1,96 T 135 (52) 51 (57) Referência Úmida [n = 109] Seca [n = 66] C 106 (49) 58 (44) 0,4 1,21 0,78 – 1,86 T 112 (51) 74 (56) Referência
CFH = Fator H do complemento; OR = Odds ratio (razão de chances); p = probabilidade; IC = intervalo de confiança de 95%.
Gráfico 1. Frequência alélica da variante Y402H no gene CFH em
casos e controles indicando que o alelo C apareceu com maior frequencia no grupo caso do que no grupo controle.
Tabela 5. Relação entre o alelo de risco C da variante Y402H e DMRI antes e após a
estratificação por meio de análise de regressão logística.
Variável Categoria p OR IC 95% Alelo C Alelo C Presença x Ausência < 0,0001 2,563 1,630 – 4,031 NA X Controle < 0,0001 1,550 0,789 – 3,046 A X Controle 3,137 1,885 – 5,222 A X NA 2,024 0,977 – 4,190 Úmida X Controle 0,0001 3,162 1,841 – 5,432 Seca X Controle 1,882 1,037 – 3,416 Úmida X Seca 1,680 0,852 – 3,313
AV= avançada; NA= não avançada; p= probabilidade; OR = Odds ratio (razão de chances); IC= intervalo de confiança de 95%.
47 53 31 69 0 10 20 30 40 50 60 70 80 C T n ( % ) Casos Controles
Gráfico 2. Frequência genotípica da variante Y402H do gene CFH em
casos e controles indicando que os genótipos CC e TC apareceram com maior frequência no grupo caso do que no grupo controle.
20 53 27 31 42 48 0 10 20 30 40 50 60 CC TC TT n ( % ) Casos Controles
