CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA, ASPECTOS BIOLÓGICOS E PATOGENIA
DAS FORMAS EVOLUTIVAS DE
Babesia bovis
(BABÉS, 1888) E
Babesia bigemina
(SMITH & KILBORNE, 1893) (PROTOZOA:
BABESIIDAE) EM
Boophilus microplus
(CANESTRINI, 1887)
JAIRO DIAS BARREIRA
ITAGUAÍ, RIO DE JANEIRO
MARÇO, 1988
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA, ASPECTOS BIOLÓGICOS E PATOGENIA
DAS FORMAS EVOLUTIVAS DE
Babesia bovis
(BABÉS, 1888) E
Babesia bigemina
(SMITH & KILBORNE, 1893) (PROTOZOA:
BABESIIDAE) EM
Boophilus microplus
(CANESTRINI, 1887)
JAIRO DIAS BARREIRA
SOB A ORIENTAÇÃO DO PROFESSOR: DR. CARLOS LUIZ MASSARD
Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências em Medi-cina Veterinária. Área de Con- centração em Parasitologia Ve-
t e r i n á r i a .
ITAGUAÍ, RIO DE JANEIRO
MARÇO, 1988
DAS FORMAS EVOLUTIVAS DE
Babesia bovis
(BABES, 1888) E
Babesia bigemina
(SMITH & KILBORNE,
1893)
(PROTOZOA:
BABESIIDAE) EM
Boophilus microplus
(CANESTRINI, 1887)
AUTOR
JAIRO DIAS BARREIRA
TESE APROVADA EM: 15/03/1988
CARLOS LUIZ MASSARD
HUGO EDISON BARBOZA DE RESENDE
A memória de meu pai
ALFRE-DO, a minha mãe ELZA e a
Ma-RIA INÊS DOMa-RIA ROSSI, pelo
Aos p r o f e s s o r e s C A R L O S LUIZ M A S S A R D e C L A U D E T E DE A - R A Ú J O M A S S A R D pela o r i e n t a ç ã o , a m i z a d e e d e d i c a ç ã o na m i n h a f o r m a ç ã o c i e n t í f i c a e r e a l i z a ç ã o d e s t e trabalho. A Dra. C L A U D E T E DE A R A Ú J O M A S S A R D , p e l a d e d i c a ç ã o na r e a l i z a ç ã o dos t r a b a l h o s f o t o g r á f i c o s . Ao p r o f e s s o r N I C O L A U M A U É S DA S E R R A FREIRE, p e l a o- r i e n t a ç ã o , e n s i n a m e n t o s c i e n t í f i c o s e d e d i c a ç ã o na e s t r u t u r a - ção da Tese e e l a b o r a ç ã o dos e s t u d o s e s t a t í s t i c o s d e s t e tra- balho. Aos c o l e g a s do C u r s o de P ó s - G r a d u a ç ã o , em e s p e c i a l a D A L T O N G A R C I A DE M A T T O S JUNIOR, M Á R C I A DE S E N N A NUNES, P A U L O C E S A R DE F I G U E I R E D O , S É R G I O C A R M O N A DE SÃO C L E M E N T E e V Â N I A R I T A E L I A S P I N H E I R O B I T T E N C O U R T , p e l a a m i z a d e , s u g e s t õ e s e a p o i o d u r a n t e todo o curso. Ao M é d i c o V e t e r i n á r i o P A U L O R O B E R T O D A C O N C E I Ç Ã O , pe- lo auxílio, amizade e compreensão dedicada durante a realiza-ção d e s t e C u r s o de P ó s - G r a d u a ç ã o .
A MARIA INÊS DÓRIA ROSSI, pelo estímulo constante du-rante o d e s e n v o l v i m e n t o deste trabalho.
Ao professor GERALDO HELENO DA SILVEIRA, pela reali- zação das cirurgias dos animais u t i l i z a d o s no experimento.
A JEFERSON DIAS BARREIRA e JOÃO BATISTA DE OLIVEIRA LEMOS, c o - r e s p o n s á v e i s pela minha formação profissional.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Universidade Federal Rural do Rio de Ja-neiro e a Empresa Brasileira de Pesquisa A g r o p e c u á r i a - U A P N P S A na pessoa da Dra. CLAUDETE DE A R A Ú J O MASSARD.
A todos os funcionários da Área de Parasitologia e da Estação para Pesquisas Parasitológicas W.O. Neitz da UFRRJ, que direta e indiretamente contribuíram para o desenvolvimen-to deste trabalho, minha sincera gratidão.
JAIRO DIAS BARREIRA, filho de Alfredo Dias Barreira e Elza da Cunha Barreira, nasceu a 29 de dezembro de 1955, na ci-dade de Pinheiral, Estado do Rio de Janeiro.
Realizou o curso primário no grupo Escolar Alzira Var-gas do Amaral Peixoto, o ginasial no Colégio Municipal Roberto Silveira e o Técnico em Agropecuária no Colégio Agrícola Nilo Peçanha.
No segundo semestre de 1977, ingressou no Curso de Me-dicina Veterinária na Universidade Federal Fluminense, conclu-indo-o em 10 de julho de 1982.
Foi monitor da disciplina de Parasitologia Veteriná-ria do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Univer-sidade Federal Fluminense no período de 1981 a 1982.
No período de agosto de 1982 a março de 1984, desen-volveu a atividade de Clínica Médica de pequenos animais na ci-dade de Niterói, Rio de Janeiro, sob a direção do médico vete-rinário Paulo Roberto da Conceição.
Em março de 1984, ingressou no Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária - Parasitologia Veterinária, a nível de Mestrado, na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
Paralelamente ao curso de pós-graduação, vem partici-pando do projeto "Resposta imunológica dos bovinos contra a sa-liva de Boophilus microplus (Canestrini, 1887)", em andamento conjunto entre a UFF e UFRRJ, financiado pela FINEP.
1. INTRODUÇÃO
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Biologia de Babesia bovis e B. bigemina no ve-t o r 2.2. E f e i t o s da i n f e c ç ã o p o r B. bovis, B. b i g e m i n a e B a b e s i a sp. s o b r e os c a r r a p a t o s v e t o r e s 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. L o c a l do e x p e r i m e n t o 3.2. O b t e n ç ã o d o s a n i m a i s 3.3. M a n u t e n ç ã o dos a n i m a i s e m e x p e r i m e n t o
3.4. Obtenção e manutenção de larvas de B. microplus l i v r e s d e B. b i g e m i n a e B. b o v i s
3.5. Obtenção e manutenção de larvas de B. microplus i n f e c t a d a s c o m B. b i g e m i n a e B. bovis 3.6. I n f e c ç ã o e x p e r i m e n t a l d o s c a r r a p a t o s 3.7. M é t o d o s e a v a l i a ç ã o de i n f e c ç ã o d a s t e l e ó g i n a s 3.7.1. E x a m e da h e m o l i n f a 1 4 4 18 22 22 22 24 27 29 30 32 32
3.7.2. C á l c u l o do g r a u de i n f e c ç ã o das t e l e ó - g i n a s 3.7.3. E x a m e dos ó r g ã o s i n t e r n o s 3.7.4. E x a m e de o v o s e l a r v a s 3.7.5. E s t u d o s m o r f o m é t r i c o s das f o r m a s e v o - l u t i v a s de B. b o v i s e B. b i g e m i n a 3.8. C á l c u l o da p a r a s i t e m i a 3.9. E f e i t o s da i n f e c ç ã o de B a b e s i a sp. s o b r e te- l e ó g i n a s de B. m i c r o p l u s
4. RESULTADO E DISCUSSÃO
4.1. H o s p e d e i r o v e r t e b r a d o 4.1.1. S a n g u e p e r i f é r i c o 4.2. H o s p e d e i r o i n v e r t e b r a d o 4.2.1. T u b o d i g e s t i v o 4.2.2. H e m o l i n f a 4.2.2.a. M o r f o l o g i a 4.2,2.b. I n f e c ç ã o das t e l e ó g i n a s 4.2.3. O v á r i o 4.2.4. T u b o s de m a l p i g h i 4.2.5. Ovos 4.2.6. L a r v a não a l i m e n t a d a 4.3. E f e i t o s da i n f e c ç ã o por B. b i g e m i n a e B. b o - v i s no v e t o r B. m i c r o p l u s 4.4. T a x a de i n f e c ç ã o das t e l e ó g i n a sPÁGINA
33 34 35 36 37 38 41 41 41 44 44 56 56 67 73 76 78 83 87 905. CONCLUSÕES
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
P Á G I N A
9 6 9 8
FIGURA
PÁGINA
1.
2.
3.
4.
Merozoítas de Babesia bigemina em eritrócitos de b o v i n o c o m i n f e c ç ã o e x p e r i m e n t a l . Esfrega- ço de sangue p e r i f é r i c o c o r a d o p e l o m é t o d o de G i e m s a
Merozoítas de Babesia bovis em eritrócitos de b o v i n o c o m i n f e c ç ã o e x p e r i m e n t a l . E s f r e g a - ço de sangue p e r i f é r i c o c o r a d o pelo m é t o d o de G i e m s a
Merozoítas de Babesia bigemina em eritrócitos de b o v i n o s e m c o n t e ú d o i n t e s t i n a l de t e l e ó g i - na de Boophilus microplus seis horas pós-que-da. C o l o r a ç ã o p e l o m é t o d o de G i e m s a
Formas de Babesia spp. em desenvolvimento no conteúdo intestinal de teleógina de B.
micro-42
43
FIGURA
plus com 24 a 48 horas de incubação. Coloração pelo m é t o d o de G i e m s a
5. Oocineto de Babesia spp. em conteúdo intesti-nal de teleógina de B. microplus com três dias de incubação. C o l o r a ç ã o p e l o m é t o d o de Giemsa
6. Células raiadas de Babesia spp. em conteúdo in-testinal de teleógina de B. microplus com 24 horas de incubação. C o l o r a ç ã o pelo m é t o d o de G i e m s a
7. Formas em multiplicação de Babesia spp. na pa-rede intestinal de teleógina de B. microplus com 72 horas de incubação. C o l o r a ç ã o pelo mé- todo de Giemsa
8. D i f e r e n t e s e s t á g i o s e v o l u t i v o s de e s p o r o z o i - tas de
Babesia
spp. em h e m o l i n f a de t e l e ó g i n a de Boophilus microplus com quatro dias de in-cubação. C o l o r a ç ã o p e l o m é t o d o de Giemsa9. Esporozoitas de Babesia bigemina e Babesia bo-vis em hemolinfa de teleógina de Boophilus mi-croplus com sete dias de incubação. Coloração
pelo m é t o d o de G i e m s a
PÁGINA
48 50 52 55 57 59FIGURA
10. 11. 12. 13. 14. 15.Esporozoitas de Babesia bigemina. Formas matu-ras e i m a t u r a s em h e m o l i n f a de t e l e ó g i n a de Boophilus microplus com sete dias de incubação. C o l o r a ç ã o pelo m é t o d o de G i e m s a
Esporozoitas de Babesia bigemina em hemócito de teleógina de Boophilus microplus com quatro d i a s de incubação. C o l o r a ç ã o p e l o m é t o d o de Gi- emsa
Variação do comprimento de esporozoitas de
Ba-besia bigemina e n t r e 4 e 13 d i a s p ó s - q u e d a das
t e l e ó g i n a s de
Boophilus microplus
i n d i c a n d o - s e os v a l o r e s p a r a m é t r i c o s e m é d i aVariação da largura dos esporozoitas de Babe-sia bigemina entre 4 e 13 dias pós-queda das teleóginas de
Boophilus microplus
indicando-se os v a l o r e s p a r a m é t r i c o s e m é d i aR e l a ç ã o e n t r e c o m p r i m e n t o e l a r g u r a de e s p o r o - zoitas de Babesia bovis e Babesia bigemina in-d i c a n in-d o - s e os v a l o r e s p a r a m é t r i c o s e as m é in-d i a s o b t i d a s sobre 100 esporozoitas d e cada e s p é c i e
N ú m e r o e f r e q u ê n c i a a c u m u l a d a de i00 t e l e ó g i - nas de Boophilus microplus com infecção
compro-PÁGINA
61 62 63 64 66FIGURA
16. 17. 18. 19. 20.vada por
Babesia bigemina
no período de 0 a 17 dias pós-queda, a l i m e n t a d a s em b o v i n o e x p e r i - m e n t a l m e n t e i n f e c t a d oPercentual sobre 100 teleóginas de Boophilus microplus alimentadas em bovino experimental-mente infectado com
Babesia
spp., indicando-se os graus de infecção obtidos no período de 0 a 17 dias p ó s - q u e d a das t e l e ó g i n a sEsporozoitas de
Babesia
spp. com diferentes es-t á g i o s e v o l u es-t i v o s em h e m o l i n f a de es-t e l e ó g i n a de Boophilus microplus com quatro dias de incuba-ção. C o l o r a ç ã o pelo m é t o d o de G i e m s aEsporozoitas de Babesia bigemina e B. bovis em hemolinfa de teleógina de Boophilus microplus c o m sete dias de incubação. C o l o r a ç ã o p e l o mé- t o d o de G i e m s a
Esporozoitas de
Babesia
spp. em ovário de te-leógina deBoophilus microplus
com sete dias de incubação. C o l o r a ç ã o p e l o m é t o d o de GiemsaEsporozoitas de
Babesia
spp. em túbulos de mal-pighi de teleógina de Boophilus microplus com cinco dias de incubação. Coloração pelo métodoPÁGINA
68 69 70 72 75FIGURA 21. 22. 23. 24. 25. de G i e m s a N ú m e r o e f r e q u ê n c i a acumulada de p o s t u r a de 100 teleóginas de Boophilus microplus com infec-ção c o m p r o v a d a por
Babesia
spp. no p e r í o d o de 0 a 17 dias p ó s - q u e d a , a l i m e n t a d a s em b o v i n o e x p e r i m e n t a l m e n t e i n f e c t a d oEsporozoítas de
Babesia
spp. em ovos de teleó-ginas deBoophilus microplus
com dois dias de i n c u b a ç ã o . M a c e r a d o de ovos c o r a d o p e l o m é t o d o de GiemsaEsporozoitas de Babesia spp. em ovos de teleó-gina de Boophilus microplus com oito dias de
i n c u b a ç ã o . C o l o r a ç ã o p e l o m é t o d o de G i e m s a
Desenvolvimento de
Babesia
spp. em citoplasma
de células epiteliais do intestino de larvas deBoophilus microplus
com dois dias pós-eclo-são. C o l o r a ç ã o p e l o m é t o d o de G i e m s aDesenvolvimento de
Babesia
spp. em citoplasma de células epiteliais do intestino de larvas de Boophilus microplus com três diaspós-eclo-são. C o l o r a ç ã o pelo m é t o d o de G i e m s a
PÁGINA
77 79 81 82 85 86FIGURA
2 6 .
27.
28.
29.
Número de teleóginas de Boophilus microplus, infectadas por Babesia spp. separadas em 10 c l a s s e s de p e s o e n t r e 240 e 480 mg
Número de teleóginas de Boophilus microplus, não i n f e c t a d a s por
Babesia
spp. s e p a r a d a s em 10 c l a s s e s de p e s o e n t r e 180 e 380 mgNúmero de posturas de Boophilus microplus in-f e c t a d a s por
Babesia
spp. s e p a r a d a s em 10 clas- ses de p e s o s de p o s t u r a s e n t r e 5,36 e 21,45 mg c o m i n d i c a ç ã o da m é d i aNúmero de posturas de
Boophilus microplus
não infectadas por Babesia spp. separadas em 10 c l a s s e s de p e s o s de p o s t u r a s e n t r e 8,01 e 20,00 m g c o m i n d i c a ç ã o da m é d i aPÁGINA
88 89 91 92O desenvolvimento de Boophilus microplus, Babesia
bi-gemina e B. bovis
foi estudado em condições experimentais, u-sando bovinos mestiços originados de uma região livre destes parasitos.Observou-se uma sequência evolutiva dos hemoparasitos no carrapato vetor, partindo da presença de eritrócitos infec-tados na luz intestinal de teleóginas, durante as primeiras 24 horas após o desprendimento, até o aparecimento de esporozoi-tas nas larvas. No período de 24 a 48 horas após a queda de fê-meas ingurgitadas, verificou-se além da presença de alguns eri-trócitos infectados, a ocorrência de corpos raiados "Strahlen-korper" e de formas vermiformes e que por seus aspectos morfo-lógicos poderiam ser chamadas de oocinetos, podendo portanto estarem relacionados com a ocorrência de gametogonia. Por vol-ta de 72 horas após a queda das teleóginas, foi observado a presença de oocinetos no citoplasma das células epiteliais além de um grande número de esporozoitas imaturos. No mesmo período
foi observado a presença de esporozoitas imaturos e maturos de B. bigemina e B. bovis nas amostras de hemolinfa, e no interior
dos hemócitos. A partir do quarto dia de incubação verificou-se também, a preverificou-sença dos esporozoitas em amostras de tubos de malpighi e ovário. Estes protozoários foram observados em amos-tras de ovos a partir do quarto e quinto dia após a queda na-tural das teleóginas, e em larvas com dois dias pós-eclosão.
Concluiu-se que o período ideal para o diagnóstico das infecções por B. bigemina e B. bovis em amostras de hemo-linfa e ovos corresponde ao oitavo e 13º dia após a queda natu-ral do h o s p e d e i r o v e r t e b r a d o .
Comprovou-se a interferência da infecção por B. bige-mina e B. bovis em relação ao pêso e postura das teleóginas
a-pós d e s p r e n d e r e m - s e n a t u r a l m e n t e do h o s p e d e i r o .
Do total de 100 teleóginas coletadas de bovinos com parasitemia de 1,5% para B. bigemina e 0,4% para B. bovis, 96% apresentaram-se infectadas. Para o segundo grupo de teleóginas ingurgitadas em bovinos com parasitemia de 1,8% para B. bigemi-na e 0,7% para B. bovis, a taxa de infecção observada foi de
88%.
A taxa de mortalidade observada no primeiro e segundo grupo de teleóginas, durante o sétimo e o 12º dia, de incuba-ção foi de 94,79 e 75,0%, r e s p e c t i v a m e n t e .
The development of Boophilus microplus, Babesia bigemina
and Babesia bovis was studied in experimental
conditions in cattle raized in tick free area. The evolution of these blood parasites was followed in the tick vector, starting by the presence of infected erythrocytes in the intestinal lumen of engorged females, 24 hours after the ticks had dropped from the cattle host up to the detection of sporozoits in hatched larvae. During the period of 24 to 48 hours after engorged ticks dropped from the host it was observed the presence of infected erythrocytes as well as the presence of rayed bodies "Strahlenkorper" and vermiform bodies which looklike ookinete, result of gametogony. Ookineto werefound in the c y t o p l a s m of epithelial cells 72 hours after ticks hod neopped, as well as large number of immature sporozoites. During the some period of time the presence of immature and mature sporozoites of B. bigemina and B. bovis were found in h e m o l y m p h and in hemocytes. The presence of
sporozoites in samples of malpighi tubes and ovaries were noticed at day 4. Eggs examined in the fourth and fifth day after engorged ticks had dropped were found to be positives for the presence of both species of Babesia. The ideal period for the diagnostic of B. bigemina and B. bovis in the hemolymph and in eggs of ticks was found to be at the 8th and 13th day after females dropped from the host, respectively.
The examination of 100 engorged females of B. microplus from cattle which had a parasitemia of 1.5% for B. bigemina
and 0.4% for B. bovis were found an infection rate
of 96%. A second sample of females which dropped from cattle with a parasitemia of 1.8% for B. bigemina and 0.7% for B. bovis, had and infection rate of 88%. The evolution of B.
bigeminaand B. bovis in the invertebrate host affect the
survival of engorged females. The mortality rate of engorged females observed seven and twelve days after dropping from the host fot the first and second groups were 94.79% and 75.0%, r e s p e c t i v e l y .Das quatro espécies do gênero Babesia Starcovici, 1893 que parasitam bovinos (HOYTE, 1976) apenas Babesia bovis (Babés, 1888) e Babesia bigemina (Smith & Kilborne, 1893) são encontradas naturalmente infectando bovinos das várias re-giões geográficas do Brasil. A distribuição destas duas es-pécies tem íntima relação com a distribuição geográfica do carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887) considerada a espécie responsável pela transmissão destes protozoários no país.
No Brasil, a importância econômica dos parasitos do gênero Babesia começou a ser considerada no inicio do século, quando FAJARDO (1901) descreveu pela primeira vez a presença destes parasitos em amostras sanguíneas obtidas de bezerros e a-dultos recém importados. Tem sido quase impossível definir em termos exatos, a importância destes parasitos no desenvolvi-mento da pecuária nacional, contudo, é conhecida a interfe-rência destes protozoários no crescimento do rebanho bovino.
As babesias quando não devidamente controladas inter-ferem no desenvolvimento dos animais, reduzindo o crescimen-to, produção de carne e leite; podendo determinar aborto e in-fertilidade temporária de machos e fêmeas, e nos casos mais graves, principalmente em animais recém-importados de regiões indenes quando não adequadamente aclimatados e imunizados de-terminam a morte dos animais. O alto custo para a indução do estado de imunidade dos bovinos importados de áreas indenes, o tratamento com drogas específicas e o controle adequado dos vetores, constituem aspectos importantes no controle destas p a r a s i t o s e s para o a v a n ç o da p e c u á r i a bovina.
O primeiro trabalho científico envolvendo carrapatos como vetores de protozoários, segundo a literatura médica, de-ve-se a SMITH & KILBORNE (1893), quando estes caracterizaram a participação de Boophilus annulatus (Say, 1821) na transmis-são de Babesia bigemina para bovinos no Estado do Texas, EUA. A transmissão natural destes parasitos para hospedeiros ver-tebrados ocorre quando certos estágios do carrapato vetor se alimentam em bovinos sensíveis e inoculam esporozoitas junta-mente com a saliva (FRIEDHOFF & SMITH, 1981). Após a inocula-ção, os esporozoitas entram na circulação sanguínea, invadem os eritrócitos e multiplicam-se assexuadamente, destruindo a c é l u l a h o s p e d e i r a .
O ciclo dos p a r a s i t o s no h o s p e d e i r o i n v e r t e b r a d o foi e s t u d a d o pela p r i m e i r a vez no início do século, q u a n d o KOCH (1906) evidenciou formas evolutivas de Babesia bigemina em
vá-rias espécies de carrapatos identificados como
Boophilus
aus-tralis
(Fuller, 1899),
Rhipicephalus evertsi
(Neumann, 1897)
e Hyalomma aegyptium
(Linnaeus, 1758) Neumann, 1911.
Poste-
riormente vários trabalhos foram realizados
na tentativa
de
conhecer o comportamento das espécies de babesia nos respec-
tivos carrapatos vetores. RIEK (1964, 1966) estudou o compor-
tamento de
B. bigemina e B. bovis
no carrapato
B. microplus,
caracterizando a invasão e multiplicação destes
parasitos em
vários tecidos incluindo células epiteliais do intestino, cé-
lulas da hemolinfa, músculos, túbulos de malpighi e ovário.
Também foram evidenciados em células epiteliais do intestino
e glândula salivar de larvas e ninfas.
Paralelamente a este
estudo relativo ao ciclo biológico, vários autores também e-
videnciaram o efeito destas espécies de protozoários no car-
rapato vetor (DAVEY, 1981; GRAY, 1982).
O objetivo deste trabalho foi identificar, comprovar
e avaliar a multiplicação de
B. bovis e B. bigemina
em vários
órgãos do carrapato vetor
Boophilus microplus.
Nesta oportu-
nidade procurou-se ainda avaliar os efeitos patogênicos
des-
tes protozoários para o carrapato vetor.
2.1. B i o l o g i a de Babesia bovis
e
B. bigemina no v e t o rOs primeiros estudos referentes ao desenvolvimento de parasitos do gênero Babesia em especial a B. bigemina foram de KOCH (1906), CRAWLEY (1915) e ROSEMBUSCH (1927). Estes autores demonstraram a presença de formas evolutivas de B. bigemina no intestino, ovos e hemolinfa de Boophilus annulatus (Say, 1821), R. evertsi, H. aegyptium e B. microplus
.
Nestes trabalhos fo-ram relatados aspectos da morfologia das formas encontradas, as quais apresentavam-se quase sempre em forma de clava, piri-forme ou mesmo com aspecto amebóide. ROSEMBUSCH (1927), refe-rindo à multiplicação destas formas emB. microplus,
relatou a existência de multiplicação por divisão múltipla em células do tubo digestivo e órgãos vasculares das fêmeas ingurgitadas. O autor também relatou aspectos de migração destas formas alonga-das na hemolinfa, com posterior invasão alonga-das células do apare-lho genital e ovário. Após a invasão das células, foiregistra-da a existência de uma segunregistra-da multiplicação destas formas du-rante a embriogênese do ixodídeo, com passagem para a fase lar-v a r a p a r t i r do início da eclosão.
DENNIS (1932), ao revisar a literatura sobre a biolo-gia, anatomia e embriologia de B. annulatus
,
descreveu o ciclo biológico de B. bigemina em duas fases distintas. A primeira, constituída de um ciclo assexuado descrito no hospedeiro ver-tebrado, os bovinos, ocorrendo com multiplicação dos parasi-tos por fissão binária simples no interior dos eritróciparasi-tos. A segunda fase descrito como sexuada, ocorrendo no hospedeiro in-vertebrado. Após a ingestão de eritrócitos infectados, várias formas do parasito foram encontradas no interior de célula ou livre no conteúdo intestinal. Neste trabalho o autor observou que o início do ciclo ocorreu com a fusão de "isogametas" na luz intestinal, resultando na formação de "oocinetos" com gran-de motilidagran-de. Os oocinetos atravessavam a paregran-de intestinal penetrando em vários órgãos, incluindo os túbulos de malpighi, músculos e ovário. Após penetrarem no ovário os oocinetos tor-navam-se redondos, dando formação a "esporoblastos" com aspec-tos multinucleados, agora denominado "esporocineaspec-tos" os quais migravam através de todos os tecidos dos carrapatos. Alguns "es-porocinetos" migravam para a glândula salivar das larvas ou nin-fas, onde, após a total fragmentação originavam os pequenos "es-p o r o z o í t a s " i n f e c t a n t e s "es-para o h o s "es-p e d e i r o v e r t e b r a d o .Em condições experimentais, REGENDANZ (1936) estudou o comportamento de B. bigemina em teleóginas de B. microplus,
e verificando que após várias fissões, este hemoparasito apre-senta um estágio com características morfológicas vermiformes e com grande motilidade, essas formas invadiam vários órgãos i n t e r n o s do c a r r a p a t o , i n c l u i n d o o v á r i o s e ovos.
U t i l i z a n d o ovos, larvas, n i n f a s e a d u l t o s , i n f e c t a - dos natural e experimentalmente com B. bovis, PETROV (1941) t a m b é m o b s e r v o u a e x i s t ê n c i a de f o r m a s e v o l u t i v a s c o m a s p e c - tos c l a v i f o r m e s , p i r i f o r m e s , r e d o n d o s e m e s m o a l g u n s e l e m e n - tos c o m forma v e r m i c u l a r no tubo d i g e s t i v o de f ê m e a s i n g u r g i - tadas. Nos o v á r i o s e ovos d e s t a e s p é c i e , o a u t o r e v i d e n c i o u formas a r r e d o n d a d a s com g r a n d e s n ú c l e o s . Na c a v i d a d e do c o r p o de larvas, de ninfas e de adultos, bem como, nos músculos, in-t e s in-t i n o e g l â n d u l a s s a l i v a r e s foi d e m o n s in-t r a d a a e x i s in-t ê n c i a de e l e m e n t o s a r r e d o n d a d o s , o v a i s c o m n ú c l e o em d i v i s ã o , e m e s m o de c o r p o s p e q u e n o s c o m m o r f o l o g i a v e r m i c u l a r . B a s e a d o n e s t a s o b s e r v a ç õ e s , e s t e a u t o r p r o p ô s u m c i c l o de n a t u r e z a e s p o r o g ô - n i c a p a r a B. bovis a f i r m a n d o ter e v i d e n c i a d o a f u s ã o de "iso- g a m e t a s " c o m p o s t e r i o r f o r m a ç ã o de " o o c i n e t o s " ; e s t e s m i g r a - vam através da parede intestinal de Ixodes ricinus (Linnaeus) Latreille, 1804) atingindo a cavidade geral, ovário e ovos. R e f e r i u t a m b é m q u e as formas de " o o c i n e t o s " m i g r a v a m p e l o s ó r g ã o s i n t e r n o s d u r a n t e a fase e m b r i o n á r i a , a t i n g i n d o a g l â n - dula s a l i v a r das l a r v a s e p o s t e r i o r m e n t e , das n i n f a s e a d u l - tos. Uma vez a l c a n ç a n d o a g l â n d u l a salivar, os p a r a s i t o s tor- n a v a m - s e a r r e d o n d a d o s , c r e s c i a m e d a v a m o r i g e m a "esporoblas- tos", os q u a i s e v o l u i a m p a r a " e s p o r o z o i t a s " i n f e c t a n t e s .
annulatus), concluíram que após a fissão binária ou processo esquizogônico inicial, os parasitos penetravam nas células epi-teliais do tubo digestivo. Esses parasitos em forma de clava migravam para a cavidade geral do corpo, onde penetravam nos diferentes órgãos, prosseguindo com novas divisões assexuadas. Quando penetravam em ovos, este estágio evolutivo novamente se multiplicava por divisão binária, a semelhança do ocorrido nas células epiteliais do tubo digestivo. Durante a incubação dos ovos havia significativo aumento do número de formas vermicula-res, as quais distribuiam-se pelo corpo das larvas em desenvol-vimento.
Posteriormente, RIEK (1964) ao estudar o ciclo bioló-gico de B. bigemina em B. microplus coletados em bovinos com infecção experimental, observou que todas as formas presentes em esfregaços de sangue periférico eram encontradas no inte-rior dos eritrócitos intactos no conteúdo intestinal, durante as primeiras 24 horas. Em seqüência, evidenciou também que vá-rias formas eritrocíticas ingeridas eram destruídas no intes-tino do vetor, e que somente as formas ovais e arredondadas so-breviviam. A primeira indicação da invasão dos parasitos em cé-lulas epiteliais do intestino ocorria 24 horas após a repleção, quando foi evidenciada a presença de estruturas fusiformes com uma massa de cromatina na região central, medindo 10 µm x 2 µm. Durante o período de 48 a 60 horas estes parasitos
multiplica-vermículos medindo 9,0 - 13,0 um x 2,0 - 2,9 um (média de 11,0 um x 2,5 um) migravam através da parede intestinal, indo para a hemolinfa, onde atingiam a maturidade e invadiam vários ór-gãos da cavidade geral. Após o quarto dia, alguns vermículos invadiam células dos túbulos de malpighi e da hemolinfa, onde uma segunda multiplicação por fissão múltipla, formava novos vermículos, iguais aos originados nas células epiteliais do intestino. Descreveu ainda que vermículos invadiam o sistema reprodutor, efetivando transmissão vertical e atingindo o es-tágio larvas, onde novamente multiplicavam-se a nível de cé-lulas intestinais. O autor verificou que o final do ciclo e-volutivo no vetor, ocorria na glândula salivar do estágio nin-fal e as formas infectantes para o hospedeiro vertebrado apa-reciam 8 a 10 dias após a fixação das larvas. As formas encon-tradas nesse ciclo, resultaram também de fissões múltiplas, porém diferiam em relação ao tamanho e forma, visto que me-diam 2,2 - 2,7 um x 1,0 - 1,5 um, com forma similar aos cor-pos piriformes encontrados nos eritrócitos do hospedeiro ver-t e b r a d o .
RIEK (1966), ao estudar em condições experimentais o desenvolvimento e a morfologia de Babesia argentina (Lignie-res, 1903) (= B. bovis) nos hospedeiros vertebrado e inverte-brado, considerou o ciclo biológico no vetor B. microplus si-milar ao descrito para B. bigemina (RIEK, 1964). Nos
esfrega-ços de s a n g u e p e r i f é r i c o do h o s p e d e i r o v e r t e b r a d o f o r a m obser- v a d o s p a r a s i t o s c o m f o r m a s s i m p l e s e e s f é r i c a s , ou p a r e a d o s c o m a s p e c t o p i r i f o r m e . Os c o r p o s p a r e a d o s m e d i a m 1,5 - 2,3 um x 1,0 - 1,5 um (média de 1,8 um x 1,2 um) e apresentavam-se f o r m a n d o u m â n g u l o o b t u s o . S e g u n d o o autor, e s t a s f o r m a s são diferenciadas das de B. bigemina com base na morfologia e re-l a ç ã o do m a t e r i a re-l n u c re-l e a r c o m o c i t o p re-l a s m a . No h o s p e d e i r o in- v e r t e b r a d o , e s t a s f o r m a s f o r a m o b s e r v a d a s nos e r i t r ó c i t o s in- t a c t o s em e s f r e g a ç o s do c o n t e ú d o i n t e s t i n a l , q u a n d o confeccio- n a d o s logo após a q u e d a n a t u r a l das t e l e ó g i n a s . A p ó s o p e r í o - do de 24 horas o número de parasitos degenerados tendiam a re-duzir, predominando as formas esféricas. Por volta de 38 ho-ras, parasitos em formas de charutos evoluiam por fissão múl-tipla. As p r i m e i r a s f o r m a s v e r m i c u l a r e s f o r a m e n c o n t r a d a s na hemolinfa a partir do terceiro e quarto dia de incubação. Mais tarde, os vermículos maduros medindo 14,3 - 16,9 um x 2,8-3,5 um (média de 15,8 um x 3,0 um) migravam para o ovário, pe-netravam nos ovos, onde estabeleciam um ciclo nas células in-t e s in-t i n a i s das l a r v a s em d e s e n v o l v i m e n in-t o , p r o d u z i n d o v e r m í c u - los semelhantes aos observados nas teleóginas. Dois a três dias após a f i x a ç ã o das larvas, e s t a s f o r m a s m i g r a v a m para as glândulas salivares, onde multiplicavam-se por fissão múlti-pla, as quais tornavam-se infectantes para o hospedeiro ver-tebrado. As formas infectantes adquiriam um aspecto pirifor-me no interior da glândula salivar, pirifor-medindo em torno de 1,5 x 1,0 um.
Em seus e s t u d o s sobre a taxa de i n f e c ç ã o no c a r r a p a - to vetor B. microplus mantidos em bovinos infectados com B. argentina e B. bigemina,
MAHONEY & MIRRE (1971) observaram a
presença de vermículos nas amostras de hemolinfa coletadas de teleóginas entre o quinto e sétimo dia de incubação. Verifica-ram também, que no total de teleóginas coletadas dos bovinos infectados com B. argentina, 30% apresentavam-se infectadas. Entretanto, nas teleóginas obtidas de bovinos infectados com B. bigemina,a taxa de infecção foi de 36%.
MUANGYAI (1974), ao realizar estudos quantitativos da infecção transovariana de B. microplus com B. bigemina, ve-rificou que esta infecção pode ser constatada a partir de 13 ou 16 horas após o início da postura. Porém, concluiu que o terceiro dia de incubação era o período ideal para a realiza-ção dos exames dos esfregaços de ovos. Nas amostras coletadas o autor constatou que os merozoítas encontrados nos ovos eram menores do que os observados em amostras de hemolinfa origina-dos da mesma teleógina.
FRIEDHOFF & BUSCHER (1976), após revisarem os traba-lhos que apresentavam propostas sobre o estágio sexual de Thei-leria parva (Theiler, 1904), estudaram o desenvolvimento de B. bigemina em fêmeas de B. microplus. Nos exames das amos-tras de conteúdo intestinal extraído de teleóginas recolhidas após o desprendimento natural de bovinos experimentalmente in-fectados, observaram grande número de formas do parasito com aspecto raiado (Strahlenkorper) com acentuada variação na
mor-f o l o g i a e t a m a n h o durante o p e r í o d o de sete a 19 horas de incuba- ção. E m b o r a estes dados t e n h a m s u g e r i d o uma grande e v i d ê n c i a da existência de reprodução sexuada em B. bigemina, os auto-res não c o n s e g u i r a m e x p l i c a r a i m p o r t â n c i a d e s t a s formas no c i c l o b i o l ó g i c o deste p r o t o z o á r i o .
M A H O N E Y & M I R R E (1977), o b s e r v a n d o a d i n â m i c a da transmissão transovariana de B. bovis por B. microplus, reve-laram uma baixa proporção de ovos infectados durante os pri-m e i r o s cinco dias após a q u e d a das t e l e ó g i n a s . E n t r e t a n t o , as amostras de ovos coletados no sexto e sétimo dia apresentaram í n d i c e de infecção acentuado.
Em estudos experimentais, WATTENDORFF (1977) descre-veu quatro fases evolutivas do desenvolvimento de B. bigemina no tubo digestivo de fêmeas de B. microplus despreendidas na-turalmente de bovinos infectados. Nas primeiras horas após a queda das teleóginas foram observadas várias formas no inte-rior dos eritrócitos, semelhante as encontradas em sangue pe-riférico do hospedeiro vertebrado. Após 24 horas foram regis-t r a d o s a p r e s e n ç a de formas raiadas. Os "esquizonregis-tes" e "cine- tos" só foram e v i d e n c i a d o s no p e r í o d o c o m p r e e n d i d o e n t r e 72 e 124 h o r a s após a queda das fêmeas i n g u r g i t a d a s .
MORZARIA & BROCKLESBY (1977), utilizando dados morfo-métricos como principal critério para o diagnóstico, diferen-cial entre vermículos de Babesia major (Sergent, Donatien, Par-rot, Lestoquard & Plantureaux, 1926) e B. bigemina em esfre-gaços de hemolinfa obtidos de fêmeas de carrapato
Haemophy-salis punctata com infecção experimental, observaram a presen-ça de duas formas de vermículos para cada espécie. Os vermícu-los com vacúovermícu-los citoplasmáticos foram considerados como for-mas maturas e os vermículos não vacuolados como forfor-mas imatu-ras. As medidas dos vermículos imaturos de B. major variaram de 16,75 - 16,69 um x 3,86 - 4,15 um (média de 16,22 um x 4,01 um), que após atingirem a maturidade passaram a medir entre 15,20 - 15,86 um x 2,92 - 3,13 um (média de 15,53 um x 3,0 um). As mensurações realizadas em vermículos maturos de B. bigemina resultaram em valores menores, que variaram entre 11,46- 12,12 um x 2,45 - 2,65 um (média de 11,79 um x 2,55 um). Ao compara-rem os valores médios das formas maturas de B. major e B. bi-gemina,
os autores concluíram que a diferença observada no
com-primento dos vermículos podia ser adotada como mais um crité-rio para o diagnóstico diferencial entre estas espécies do gê-nero Babesia parasitos de bovinos.EL ALLAWY (1977) examinou esfregaços de hemolinfa e ovos de B. annulatus infectados com B. bigemina e relatou a presença de merozoíta com aspecto claviforme. Cada merozoíta era constituído de um núcleo corado de vermelho, localizado na região mediana, e citoplasma levemente azulado com um grande vacúolo. Estes merozoítas não só apresentavam as mesmas carac-terísticas morfológicas, como também possuiam aproximadamente o mesmo comprimento. Durante a realização dos exames das amos-tras de ovos com diferentes dias de incubação, foi registrado um aumento progressivo no número de merozoítas, caracterizando
assim a influência do período de incubação na reprodução dos merozoítas e na infectividade dos ovos. Após estas observa-ções o autor considerou o sexto dia de incubação como um limi-te ideal para r e a l i z a r os e x a m e s das a m o s t r a s de ovos.
STEWART (1978) trabalhando com duas cepas de B. bo-vis,
uma modificada por passagens sucessivas em hospedeiro
ver-tebrado e outra não modificada, observou grandes variações no ciclo biológico destes protozoários no hospedeiro invertebra-do B. microplus. Os espécimes originainvertebra-dos das duas cepas de B. bovisencontrados no conteúdo intestinal durante as primeiras
16 horas após a queda natural das teleóginas, apresentavam-se com grande semelhança morfológica. Após este período, suas es-truturas se diferenciavam. No período compreendido entre 16 e 24 horas pós repleção, um grande número de parasitos com for-mas esféricas sem evidenciar sinais de multiplicação foram en-c o n t r a d o s em e s f r e g a ç o s de en-c o n t e ú d o i n t e s t i n a l o b t i d o s de te-l e ó g i n a s i n f e c t a d a s c o m a cepa não m o d i f i c a d a . E n t r e o tercei- to e o quarto dia de incubação observou redução das formas es-f é r i c a s e n c o n t r a d a s no c o n t e ú d o i n t e s t i n a l , d e v i d o a p e n e t r a - ção e m u l t i p l i c a ç ã o nas c é l u l a s e p i t e l i a i s e s u b s e q u e n t e apa- recimento de formas vermiculares na hemolinfa. Ao contrário, as formas e s f é r i c a s da c e p a m o d i f i c a d a p e r m a n e c e r a m e m g r a n - de n ú m e r o d u r a n t e t o d o o p e r í o d o de o b s e r v a ç ã o . A l g u m a s for- mas s u g e r i n d o um p r o c e s s o de m u l t i p l i c a ç ã o f o r a m o b s e r v a d a s e n t r e 16 e 144 horas p ó s - r e p l e ç ã o . S o m e n t e as t e l e ó g i n a s in- fectadas com cepa não modificada, apresentaram formas
evoluti-vas em vários órgãos como túbulos de malpighi, músculos e ová-rios, com subsequente infecção e multiplicação nos ovos e lar-vas. Os v e r m í c u l o s o b s e r v a d o s em h e m o l i n f a m e d i r a m 14 - 16 um de c o m p r i m e n t o , no e n t a n t o nas larvas f o r a m d e s c r i t o s m e d i n d o
e n t r e 13 - 16 um de c o m p r i m e n t o .
A C H U T H A N e t a l . (1980), na t e n t a t i v a de i d e n t i f i c a r o m o d o de t r a n s m i s s ã o de B. b i g e m i n a p a r a b o v i n o s , u t i l i z a r a m larvas, ninfas e adultos de B. microplus, B. annulatus e
Hya-lomma marginatum (Koch, 1844). Durante a realização do experim e n t o f o r a experim e x a experim i n a d a s g l â n d u l a s s a l i v a r e s de t o d o s os e s t á -gios e v o l u t i v o s d e s t e s c a r r a p a t o s . Nos m a t e r i a i s e x a m i n a d o s v e r i f i c a r a m a p r e s e n ç a de e s p o r o z o í t a s c o m f o r m a s a l o n g a d a s e
esféricas em todos os estágios evolutivos dos carrapatos B. microplus e B. annulatus.
A K I M B O A D E & D I P E O L U (1981) i n v e s t i g a n d o a i n f e c ç ã o e x p e r i m e n t a l de B. bovis
e o
seu c o m p o r t a m e n t o no c a r r a p a t o Boophilus gaigyi (Aeschlimann & Morel, 1965), concluíram que o aparecimento inicial dos vermículos na hemolinfa ocorria en-tre o quarto e sexto dia após o ingurgitamento das teleógi-nas. Posteriormente foi registrado um aumento progressivo no número de vermículos até o oitavo dia; sendo em seguida, ob-servado uma redução acentuada até o total desaparecimento des-tas formas a partir do 14º dia após a queda natural das teleó-ginas. Os exames de ovos destas teleóginas registraram a pre-sença de vermículos a partir do quinto dia, com aumento no nú-mero de parasitos até o 24º dia de incubação. A partir desteperíodo, os v e r m í c u l o s r a r a m e n t e f o r a m d e t e c t a d o s .
DALGLIESH et al. (1981) verificaram que as passagens sucessivas das cepas de B. bigemina no hospedeiro vertebrado in-t e r f e r i a m na m o r f o l o g i a e i n f e c in-t i v i d a d e d e s in-t e s p r o in-t o z o á r i o s no intestino do hospedeiro invertebrado B. microplus
.
Os autores c o n s i d e r a r a m que as fêmeas desta e s p é c i e i n f e c t a d a s c o m cepas de baixa passagem em hospedeiro vertebrado apresentavam núme-ro r e d u z i d o de c o r p o s r a i a d o s d u r a n t e as p r i m e i r a s 48 horas de incubação. Ao c o n t r á r i o , as fêmeas i n f e c t a d a s c o m cepas de alta p a s s a g e m e v i d e n c i a r a m grande n ú m e r o de c o r p o s r a i a d o s no tubo digestivo, por período superior a 72 horas de incubação. Para DALGLIESH et al. (1981) a presença do grande número de formas raiadas estava associada com a redução da infectivida-de das cepas para o carrapato.STEWART et al. (1981), descrevendo aspectos do meca-nismo de transmissão dos parasitos do gênero Babesia, consi-deraram o ciclo biológico de B. bigemina no hospedeiro verte-brado e inverteverte-brado similar ao descrito para B. bovis. Os au-tores observaram que o desenvolvimento do ciclo no hospedeiro i n v e r t e b r a d o tinha início com a i n g e s t ã o dos e r i t r ó c i t o s in- fectados, seguido da penetração dos parasitos nas células epi-teliais do intestino, com subsequente multiplicação e reprodu-ção dos vermículos ou merozoítas. Na hemolinfa, os vermículos m i g r a v a m para o oviduto, p e n e t r a v a m nos ovos em desenvolvimen-
to, multiplicavam-se e permaneciam inativos até a eclosão das larvas. Quando da fixação destas larvas no hospedeiro
verte-brado, os vermículos alcançavam as células das glândulas sali-vares produzindo grande número de pequenos merozoítas, que fo-ram consideradas as formas infectantes para o hospedeiro ver-tebrado.
E L - A L L A W Y (1983) observou a presença de merozoítas de B. bigemina nas amostras de ovos coletados de teleóginas de B. annulatus e x p e r i m e n t a l m e n t e infectadas.
M E H L H O R N & SCHEIN (1984), e s t u d a n d o o ciclo biológi- co das espécies do gênero Babesia, descreveram vários aspec-tos do desenvolvimento destes protozoários nos respectivos ve-tores. Inicialmente observaram a fusão dos gametas na luz in- testinal, com produção de "cinetos" durante as primeiras ho- ras após a queda das teleóginas. Constataram também que os ci-netos migravam através da parede intestinal e, na cavidade ge-ral, invadindo e reproduzindo-se assexuadamente em células de vários órgãos do carrapato, p r i n c i p a l m e n t e nos hemócitos, fi- bras musculares, túbulos de malpighi e células do ovário, in- cluindo oócito. Durante o período de incubação dos ovos, os
"cinetos" evoluiam nas células epiteliais do intestino das larvas em desenvolvimento. Após o início da fixação das lar- vas dos carrapatos no hospedeiro vertebrado, as babesias mi- gravam para as glândulas salivares, aí p e r d i a m sua forma ca- racterística de cineto dando origem a uma nova fase, denomina-da "esporonte", a qual evoluía para esporozoíta, consideradenomina-da a forma infectante para o hospedeiro vertebrado.
vermículos de B. bovis e B. bigemina em hemolinfa de teleóginas de B. microplus entre o 4º e o 10º dia após desprenderem-se dos hospedeiros. Os autores verificaram que a probabilidade em de-tectar a presença de vermículos em fêmeas de B. microplus man-tidos em bovinos com baixa parasitemia (até 1,5%), foi maior quando os esfregaços de hemolinfa foram confeccionados no pe-ríodo compreendido entre o 9º e o 10º dia após a queda natural das teleóginas. Para as teleóginas mantidas em bovinos com uma parasitemia de 3,5%, o melhor dia para exame foi o 6º dia pós q u e d a da f ê m e a i n g u r g i t a d a .
AGBEDE et al. (1985), ao descrever o desenvolvimento de B. bovis no intestino de fêmeas de B. microplus infectadas experimentalmente, também verificaram a presença de corpos raia-dos (Strahlenkorper) no interior das células basófilas após o terceiro dia de incubação. Observaram ainda a presença de cor-pos em divisão que, após um período de 24 horas, evoluíram pa-ra " c i n e t o s " no i n t e r i o r das c é l u l a s i n t e s t i n a i s .
STEWART et al. (1986), estudando o desenvolvimento e a morfologia de B. bigemina nas fêmeas de B. microplus infecta-das naturalmente, observaram nas primeiras 24 horas pós reple-ção a presença de parasitos com formas ovais, esféricas, ame-bóides e piriformes, semelhante as descritas em sangue perifé-rico do hospedeiro vertebrado. Os parasitos piriformes foram encontrados com formas simples ou pareadas. Neste período de 24 horas pós repleção, um pequeno número de parasitos com for-mas esféricas, medindo aproximadamente 7 um de diâmetro foram
observados no conteúdo intestinal. Nas amostras coletadas 48 horas pós-repleção das teleóginas, os autores identificaram pa-rasitos localizados intra e extracelularmente com estrutura ce-lular precursora de fissão , assim como, corpos imaturos em di-ferentes fases de divisão celular. Em 72 horas pós-repleção das teleóginas foram observados em grande número de corpos maduros em divisão e vermículos (merozoítas), tanto nas células epite-liais do intestino do carrapato como, aparentemente, na luz in-t e s in-t i n a l .
2.2. Efeitos da infecção por B. bovis, B. bigemina e Babesia sp. s o b r e os c a r r a p a t o s v e t o r e s
RIEK (1964), ao descrever o ciclo de B. bigemina em B. microplus, observou que 90% das teleóginas coletadas de bo-vinos com parasitemia superior a 20% morreram após o sétimo dia de incubação. Para explicar o fenômeno o autor relacionou esta mortalidade com as alterações da permeabilidade na pare-de intestinal, em consequência da multiplicação pare-destes proto-zoários nas células epiteliais e a passagem de hemoglobina pa-ra h e m o l i n f a .
Em 1966, KIEK registrou que durante o quinto e o sé-timo dia de incubação havia uma acentuada taxa de mortalidade das teleóginas de B. microplus coletadas em bovinos com
para-sitemia por B. argentina superior a 5%.
foi evidenciado uma grande interferência do parasitismo por Babesia caballi
(Nuttal & Strickland, 1910) na longevidade
e potencial reprodutivo de fêmeas de Anocentor nitens (Neu-mann, 1897). Os autores verificaram que as teleóginas coleta-das após o desprendimento natural do hospedeiro vertebrado in-fectado, apresentaram-se com peso menor e capacidade de postu-ra inferior, quando compapostu-radas com fêmeas ingurgitadas em hos-pedeiro não infectado. Também foi constatada alta taxa de mor-talidade das teleóginas ingurgitadas em equino infectado, en-tre o período de sete a 10 dias de incubação. Segundo os au-tores, alguns aspectos como o da redução no peso e o da taxa de eclosão dos ovos originados de fêmeas infectadas estavam associados a intensa multiplicação dos parasitos nos ovários e p o r c o n s e g u i n t e nos ovos.MUANGYAI (1974), avaliando a taxa de infecção dos ovos de B. microplus infectados com B. bigemina, registrou a-centuada redução na produção de ovos quando as fêmeas apresen-tavam um elevado número de merozoítas na hemolinfa. Resultado semelhante foi encontrado por EL ALLAWY (1977) ao estudar a taxa de infecção de ovos de B. microplus com infecção por B. bigemina.
Esse autor também observou que os ovos obtidos nos
primeiros três dias após o início da postura apresentaram umataxa de i n f e c ç ã o igual a zero.
Em estudos experimentais, DAVEY (1981) observou que a presença de B. bovis não interferiu significativamente no peso das fêmeas de B. microplus, embora as fêmeas não
infecta-das tivessem apresentado um pêso superior (409,3 mg) ao infecta-das fê-meas infectadas (395,6 mg). O período de pré-postura registra-do no grupo de teleóginas não infectadas e infectadas não apre-sentaram grande diferença (3,7 e 3,8 dias, respectivamente). A massa de ovos obtida das fêmeas não infectadas (163,5 mg) foi significativamente maior do que as coletadas das fêmeas infec-tadas (93,1 mg). O período de postura apresentado pelo grupo das teleóginas não infectadas foi mais longo (15,7 dias), quan-do comparaquan-do com o grupo das teleóginas infectadas (8,8 dias). O período de incubação (26 dias) e a taxa de eclosão (85%) dos ovos coletados nos grupos das fêmeas não infectadas e infecta-das não sofreram interferência da infecção por B. bovis.
DALGLIESH et al. (1981), ao estudarem a patogenicida-de das cepas patogenicida-de B. bovis para B. microplus, observaram que 70% das teleóginas obtidas de bovinos infectados com cepa de B. bovis não modificada por passagens sucessivas em hospedeiro vertebrado apresentaram hemolinfas com coloração vermelho escu-ro. Tal alteração na cor da hemolinfa foi considerada como re-sultado da passagem de hemoglobina para hemolinfa, consequente a intensa destruição das células epiteliais do intestino do car-rapato durante a multiplicação dos parasitos. Verificaram tam-bém que tanto as teleóginas infectadas com cepas não modifica-da quanto as infectamodifica-das com cepas modificamodifica-das por passagens su-cessivas em bovinos, apresentaram igualdade no número de vermí-culos encontrados nas amostras de hemolinfa. Entretanto, somen-te nas somen-teleóginas infectadas com cepa não modificada foi
regis-trada grande taxa de mortalidade após o oitavo dia de incuba-ção.
GRAY (1982) registrou taxa de mortalidade de 93 a 100% entre teleóginas de B. microplus obtidas de bovinos com uma pa-rasitemia por B. bigemina entre 0,02 e 0,07%. As teleóginas que sobreviveram apresentaram um número reduzido de ovos em re-lação as fêmeas ingurgitadas no mesmo hospedeiro, porém antes da parasitemia. Após o período de incubação, tornou-se eviden-te o efeito da infecção na viabilidade e taxa de eclosão dos o v o s .
GUGLIELMONE et al. (1985) observaram mortalidade de 70% das teleóginas de B. microplus que ingurgitaram em bovinos com parasitemia de 1,5% para B. bovis e 3,5% para B. bigemina. Entretanto, nos animais com grau de parasitemia de 1,5% por B. bovis e B. bigemina, a taxa de mortalidade foi reduzida.
3.1. L o c a l d o E x p e r i m e n t o
O presente experimento foi desenvolvido nos labora-tórios da Área de Parasitologia na Estação para Pesquisas Pa-rasitológicas W.O. Neitz do Departamento de Biologia Animal, Instituto de Biologia, da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, município de Itaguaí, Estado do Rio de Janeiro, Brasil. A UFRRJ, está situada entre os paralelos 22º41' 22º45' de latitude sul e os meridianos 43º38 , 43º42 , de longitude oeste de Greenwich a uma altitude de 33 metros do nível do mar, apresentando um clima tipicamente tropical. No período de realização do experimento a temperatura média anual foi de 29,75°C, precipitação média anual de 98,97 mm e umidade relativa média anual de 70,5%.
3.2. Obtenção dos Animais
mes-tiços Bos taurus x Bos indicus, machos e fêmeas entre 6 e 8 me-ses de idade. Do total de animais utilizados, dois foram obti-dos da fazenda Vista Alegre, localizada no Planalto do Itatiaia a 22º44' de latitude sul e 44º60 ' de longitude oeste, a 2.400 m e t r o s a c i m a do n í v e l do mar.
O planalto é limitado ao sul pelas cadeias rochosas das Prateleiras, Pedra Assentada e Serra do Canto. Esta região é pecorrida em uma extensão de 10 km pelo Rio das Flores, onde atravessa toda a área meridional do planalto. A região norte abrange as nascentes dos rios Aiuruoca e Preto e está localiza da parcialmente no Estado de Minas Gerais. Nesta região exis-tem três faixas climáticas (BARTH, 1957), com início a 400 tros do Vale do Paraíba alcançando as Prateleiras, 2.787,4 me-tros de altitude. De acordo com a descrição do autor a primei-ra faixa é consideprimei-rada uma zona tropical, tendo inicio às mar-gens do Rio Paraíba, onde ocorre uma pequena elevação do ter-reno, formando pequenas colinas. Esta faixa apresenta um clima tropical, com verão úmido e inverno seco. A segunda faixa con-siderada como subtropical, apresenta uma área de mata entre 600 e 800 até 2.100 metros de altura. Nesta faixa há uma área de mata tropical entre 1.600 a 2.100 metros. A partir do limite superior há uma terceira faixa, com características tipicamen-te de campo, podendo ser observado arbustos nas áreas úmidas. No inverno a temperatura mínima chega a 6°C abaixo de zero, no verão pode atingir 1ºC nas primeiras horas do dia. O índice plu-viométrico ao verão apresenta uma média mensal de 306,404 mm,
porém no inverno pode ser registrado uma média mensal de 50 mm. As condições climáticas registradas na terceira faixa, constituem fatores limitantes a biologia do carrapato Boophilus microplus,
o que nos permitiu a utilização de animais livres de
Babesia spp. e outros protozoários que tem como vetor este car-rapato.No mesmo período dois animais jovens, com cinco a seis meses de idade foram obtidos no Instituto de Zootecnia da Uni-versidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Estes animais foram criados em regime de estabulação permanente sobre ripado de ma-d e i r a livres ma-de c a r r a p a t o s .
3.3. Manutenção dos Animais em Experimento
Antes da realização do experimento várias medidas fo-ram adotadas para avaliar as condições clínicas e sanitárias dos animais. Inicialmente os animais foram banhados com produto car-rapaticida piretróide a base de decametrina1 [(S) - alfa-ciano-3-fenoxibenzil CIS - (IR 3)-2,3-dimetil-3-(2.2-dibromovinil) ci-clopropanocarboxilato] na concentração de 25 ppm, para eliminar uma possível infestação ocorrida durante o transporte. Foram rea-lizados exames de fezes de cada animal para o diagnóstico de helmintos e protozoários intestinais e posteriormente tratados
c o m d r o g a s e s p e c Í f i c a s c o n t r a tais p a r a s i t o s .
Para avaliar o quadro hematológico dos animais foram coletadas amostras de sangue em tubos de vacutainer EDTA e pro-cessado em "Coulter Counter"2 veterinário. A leitura do volume globular foi efetuado das amostras coletadas em tubos capila-res heparinizados, processados em centrÍfuga para microhemató-c r i t o3.
Todas as medidas adotadas para avaliar as condições clínicas e sanitárias dos animais foram repetidas mensalmente até o final do experimento, exceto os banhos, que foram reali-zados de 12 em 12 dias até o iníco das infestações experimen-tais.
A pesquisa de Babesia spp. e outros hematozoários foi realizada através da confecção de esfregaços sanguíneos, sendo utilizada a primeira gota de sangue, obtida por punção de va-sos de pequeno calibre do pavilhão auricular. Os esfregaços fo-ram corados pelo método de Giemsa, com o seguinte procedimen-to: os esfregaços sanguíneos previamente secos ao ar e poste-riormente fixado em metanol foram colocados em vasos coplin con-tendo solução diluída de corante Giemsa, e mantidos por um pe-ríodo de 1 a 2 horas. Para o preparo da solução foram utiliza-dos III gotas da solução corante estoque de Giemsa 4 para 1 ml
2 Coulter Counter-Eletrônico Mod. DN.VET. 3 Centrífuga Microhematócrito - FANEM. 4 MERK-DARMSTADT.
de solução fosfatada tamponada pH 7,2. Após o período de colo- ração, os e s f r e g a ç o s f o r a m l a v a d o s c o m água c o r r e n t e e, após a secagem, os esfregaços foram examinados com microscópio5 ó-ticos com o b j e t i v a s de 10X, 40X, 1 0 0 X e n e s t e caso com a u x í l i o de ó l e o de i m e r s ã o e o c u l a r de 10X, d a n d o m a i o r a t e n ç ã o aos b o r d o s l a t e r a i s e a r e g i ã o final dos e s f r e g a ç o s , onde teorica- m e n t e o c o r r e uma m a i o r c o n c e n t r a ç ã o de p a r a s i t o s . P a r a c o m p l e m e n t a r o e x a m e r e a l i z a d o a t r a v é s de esfre- g a ç o s s a n g u í n e o s , t o d o s os a n i m a i s f o r a m s u b m e t i d o s ao t e s t e de i m u n o f l u o r e s c ê n c i a i n d i r e t a e o b s e r v a ç ã o d i á r i a da tempera- tura retal. Os a n i m a i s c o n s i d e r a d o s l i v r e s de i n f e c ç ã o p o r Babesia spp. ao t é r m i n o de t o d o s os e x a m e s f o r a m m a n t i d o s e m isolamentos, constituído de baias individuais medindo aproxi- madamente 5 m2 , tendo o piso de cimento liso, sobre o qual
foi c o l o c a d o um e s t r a d o de m a d e i r a p a r a dar p r o t e ç ã o as teleó- ginas, e v i t a n d o que ao d e s p r e n d e r e m - s e do h o s p e d e i r o f o s s e m p i s o t e a d a s . T o d a s as b a i a s f o r a m f e c h a d a s com tela m i l i m e t r a - da a prova de carrapatos e insetos. No ponto de união entre a p a r e d e de a l v e n a r i a e o q u a d r o de m a d e i r a u t i l i z a d o p a r a sus- t e n t a ç ã o da tela, foi c o l o c a d o uma c a m a d a de 2 cm de v a s e l i n a s ó l i d a p a r a i m p e d i r a p a s s a g e m de l a r v a s de c a r r a p a t o .
A a l i m e n t a ç ã o b á s i c a u t i l i z a d a para os a n i m a i s c o n s - tou de ração balanceada para bezerros, sal mineral e água à v o n t a d e .
3.4. Obtenção e manutenção de larvas de B. microplus livres de B. bigemina e B. b o v i s
A metodologia utilizada para criação e manutenção da colônia de carrapato B. microplus foi baseada no trabalho de NEITZ, BOUGHTON & WALTERS (1971) modificada, utilizando-se se-r i n g a s de p l á s t i c o d e s c a se-r t á v e i s .
Inicialmente foram utilizadas 350 fêmeas ingurgitadas (teleóginas) de B. microplus coletadas de bovinos mestiços man-tidos no Instituto de Zootecnia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
No laboratório, as fêmeas ingurgitadas foram lavadas com água corrente, secadas em papel de filtro, selecionadas de acordo com o pêso médio e capacidade de movimentação. Em segui-da, foram distribuídas em grupos de 10, por placa de petri (100 x 20 mm) contendo papel de filtro umidecido com água. Pos-teriormente, as placas de petri foram identificadas e incuba-das em câmara climatizada 6 à temperatura de 28°C e umidade
re-l a t i v a s u p e r i o r a 8 0 % .
Com dois dias de postura, os ovos de várias teleógi-nas foram coletados, homogeneizados e pesados em balança analí-tica7. Durante a pesagem, parte dos ovos foram separados em
lo-6 Estufa incubadora para BOD - Mod. 347 - FANEM. 7 Balança Sartórius - 1213P.
tes de 0,2 g, a c o n d i c i o n a d o s em s e r i n g a s p l á s t i c a s d e s c a r t á - v e i s a d a p t a d a s p a r a c r i a ç ã o de c a r r a p a t o s . A a d a p t a ç ã o c o n -
sistiu na retirada da extremidade anterior que passou a ser fechada com tecido de algodão tipo "popeline". As seringas com os ovos acondicionados foram identificadas e mantidas em câma-ra c l i m a t i z a d a , à t e m p e r a t u r a e u m i d a d e r e l a t i v a igual a uti- l i z a d a p a r a a m a n u t e n ç ã o das t e l e ó g i n a s . Para e v i d e n c i a r uma possível transmissão de Babesia spp. para os ovos, amostras d e s t e s f o r a m c o l e t a d a s p a r a c o n f e c ç ã o de m a c e r a d o s em l â m i n a s de vidro para microscopia; os macerados foram corados pelo mé-todo G i e m s a e e x a m i n a d o s c o m m i c r o s c ó p i o ó t i c o c o m o b j e t i v a de 100X e o c u l a r de 10X.
Dez d i a s após a e c l o s ã o , as l a r v a s f o r a m u t i l i z a d a s p a r a a i n f e s t a ç ã o de a n i m a i s s e n s í v e i s , l i v r e s de Babesia spp., onde c a d a b e z e r r o foi i n f e s t a d o com a p r o x i m a d a m e n t e 4 0 . 0 0 0 larvas.
A finalidade das infestações foi verificar se as lar-vas obtidas estavam negatilar-vas, reforçando assim a primeira pro-va r e a l i z a d a com as a m o s t r a s de ovos. De larpro-vas l i v r e s de in- f e c ç ã o se o b t e v e , por c o n s e q u ê n c i a , t e l e ó g i n a s n ã o i n f e c t a d a s para manutenção da colônia e estudo biológico da Babesia spp. no c a r r a p a t o vetor. T o d o s os a n i m a i s i n f e s t a d o s f o r a m c o n t r o -
lados d i á r i a m e n t e a t r a v é s de e x a m e clínico, e s f r e g a ç o s a n g u í - neo, a v a l i a ç ã o da t e m p e r a t u r a r e t a l e v o l u m e g l o b u l a r .
3.5. Obtenção e manutenção de larvas de B. microplus infecta-das com B. bigemina e B. bovis
A t é c n i c a a p l i c a d a na o b t e n ç ã o de larvas i n f e c t a d a s foi baseada nos trabalhos de THOMPSON (1976) e MAHONEY & MIR-RE (1977).
Para o b t e n ç ã o de larvas i n f e c t a d a s , foi u t i l i z a d o u m b e z e r r o m e s t i ç o (nº 340), c o m seis m e s e s de idade. O b e z e r r o foi m a n t i d o em i s o l a m e n t o d u r a n t e todo o e x p e r i m e n t o . As in- f e s t a ç õ e s f o r a m r e a l i z a d a s , por um p e r í o d o de 12 dias consecu- t i v o s c o m 0,2 g de larvas de B. m i c r o p l u s (aproximadamente 4.000 larvas), livres de Babesia spp.
Q u i n z e dias após a p r i m e i r a i n f e s t a ç ã o , o b e z e r r o foi i n o c u l a d o c o m 20 ml de sangue b o v i n o i n f e c t a d o com B. bovis e B. bigemina por via endovenosa, permitindo assim, que a para-s i t e m i a p r o v o c a d a p e l o para-sangue i n o c u l a d o v i e para-s para-s e a c o i n c i d i r c o m o ingurgitamento das fêmeas originadas das infestações ini-ciais.
As teleóginas que desprenderam-se naturalmente, fo-r a m c o l e t a d a s no p i s o e levadas p a fo-r a o l a b o fo-r a t ó fo-r i o onde fo-r e c e - b e r a m o m e s m o t r a t a m e n t o a d o t a d o p a r a as t e l e ó g i n a s não infec- tadas. Posteriormente a seleção, as fêmeas foram mantidas em placas de petri (100 x 20 mm) fixadas em fita adesiva para permitir a seleção dos ovos originados das teleóginas
infecta-das.
a 12 dias após o início da postura, a partir de teleóginas com-provadamente infectadas, pela observação da presença de esporo-zoítas (vermículos) em esfregaços de hemolinfa. Tais esfrega-ços foram tratados com metanol e corados pelo método Giemsa. Com auxílio de um pincel fino, os ovos foram coletados, pesa-dos, separados em amostras de 1 grama (aproximadamente 20.000 ovos) e acondicionados em seringas de plástico descartáveis a-daptadas para a criação e manutenção dos carrapatos. Em segui-da, identificadas e incubadas em câmara climatizada a tempera-tura de 28°C e u m i d a d e r e l a t i v a s u p e r i o r a 80%.
Para manutenção das larvas durante o experimento, foi infestado o bezerro mestiço nº 358, macho, com seis meses de idade e não esplenectomizado. A metodologia utilizada para es-ta infeses-tação foi a mesma aplicada anteriormente para o bezer-ro nº 340. As larvas foram mantidas em laboratório por um pe-ríodo de 20 dias pós eclosão, sob as mesmas condições de tempe-ratura e umidade, para serem utilizadas posteriormente em ou-tras i n f e s t a ç õ e s .
3.6. Infecção experimental dos carrapatos
O bezerro mestiço nº 359 macho, não esplenectomizado, foi utilizado para o experimento. Inicialmente o bezerro foi infestado durante 12 dias consecutivos, com 0,2 g de larvas de B. microplus
(aproximadamente 4.000 larvas) livres de Babesia
spp. Após a última infestação foi realizado uma segundainfes-tação onde o bezerro recebeu 0,5 g de larvas de B. microplus (aproximadamente 10.000 larvas) infectadas com Babesia spp.
Com o aparecimento das primeiras formas no sangue pe-riférico, o bezerro foi inoculado com Dexametazona 8 por via intramuscular na dosagem de 0,5 mg por kilo de peso por um pe-ríodo de 10 dias consecutivos. O uso desta droga teve como fi-nalidade aumentar o período e o grau de parasitemia, permitin-do assim, um maior tempo de exposição permitin-dos eritrócitos infecta-dos às t e l e ó g i n a s .
No laboratório, as teleóginas após desprenderem-se naturalmente do hospedeiro, foram lavadas com água corrente, secadas em papel de filtro e acondicionadas em tubos de vi-dro. Os tubos foram fechados com algodão hidrófilo, identifi-cados e acondicionados em câmara climatizada à temperatura de 28°C e umidade relativa superior a 80%. As teleóginas permane-ceram incubadas por um período de 30 dias, tempo necessário pa-ra a c o n c l u s ã o do e x p e r i m e n t o .
D u r a n t e o p e r í o d o de infecção, os b e z e r r o s foram a- c o m p a n h a d o s a t r a v é s da o b s e r v a ç ã o clínica, t e m p e r a t u r a retal e exame de e s f r e g a ç o de sangue p e r i f é r i c o . Os e s f r e g a ç o s fo- ram u t i l i z a d o s para a n a l i s a r a p r e s e n ç a e o grau de p a r a s i t e - mia do bezerro.
3.7. Métodos e avaliação da infecção das teleóginas
3.7.1. Exame da h e m o l i n f a
A metodologia aplicada ao diagnóstico das formas evo-lutivas de B. bigemina e B. bovis foi baseada na técnica des-crita por B U R G D O R F E R (1970).
Com os objetivos de evidenciar a presença de merozoí- tas (vermículos) de B. bigemina e B. bovis e o seu comporta-mento no carrapato B. microplus
,
foram examinados através dos esfregaços de hemolinfa de 100 teleóginas que ingurgitaram e desprenderam-se naturalmente do hospedeiro v e r t e b r a d o (bezer- ro nº 359) no período em que a parasitemia observada era de 0,4% para B. bovis e 1,3% para B. bigemina.Os esfregaços de hemolinfa foram preparados a partir da secção da região distal (tarso e/ou tíbia) de uma ou mais patas das teleóginas com auxílio de tesoura para cirurgia
ocu-lar, por um período de 17 dias consecutivos. As amostras de hemolinfa, f o r a m depositadas em lâminas de vidro para micros- copia previamente identificada, secadas em temperatura ambien- te, fixadas em metanol por um período de três minutos e cora- dos pelo método de Giemsa por 40 minutos. Sendo o tempo de colo- ração reduzido para 25 a 30 minutos quando os esfregaços apre- sentavam-se com maior espessura.
No preparo da solução diluída de Giemsa foram utili- zadas III gôtas da solução estoque para 1 ml de solução tam-
