Investigação da repercussão metabólica na prole adulta gerada à partir de mães expostas a luz constante durante a gestação e/ou lactação

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

DANILO DA SILVA FERREIRA

INVESTIGAÇÃO DA REPERCUSSÃO METABÓLICA NA PROLE

ADULTA GERADA A PARTIR DE MÃES EXPOSTAS A LUZ

CONSTANTE DURANTE A GESTAÇÃO E/OU LACTAÇÃO

CAMPINAS

DANILO DA SILVA FERREIRA

INVESTIGAÇÃO DA REPERCUSSÃO METABÓLICA NA PROLE ADULTA GERADA A PARTIR DE MÃES EXPOSTAS A LUZ CONSTANTE DURANTE

A GESTAÇÃO E/OU LACTAÇÃO

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia

Orientador: PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO DANILO DA SILVA FERREIRA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ.

CAMPINAS 2017

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO

ORIENTADOR: PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ

MEMBROS:

1. PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ

2. PROF. DRA. RENATA GORJÃO

3. PROF. DR. CAMILO DE LELLIS SANTOS

4. PROF. DRA. JOSEANE MORARI

5. PROF. DR. EVERARDO MAGALHÃES CARNEIRO

Programa de Pós-Graduação em FARMACOLOGIA da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

AGRADECIMENTOS

Tendo em vista que não é possível a realização de trabalho científico de forma isolada e solitária, é muito importante rememorar neste momento todos aqueles que de forma indireta ou direta, auxiliaram para a concretização dessa pesquisa.

Meus sinceros agradecimentos à toda população brasileira, que indiretamente fomentou a pesquisa, por meio de pagamento de impostos, viabilizando ao órgão de fomento FAPESP, fornecer o financiamento, possibilitando a aquisição de materiais.

Agradeço ao departamento de farmacologia de forma lato sensu, pois nos assistiu fornecendo desde secretárias até limpeza de ambientes, possibilitando a manutenção da ordem e conclusão dos trabalhos.

Ao Dr. Gabriel, que desde o mestrado me guiou na vida científica com muita maestria, com vasto repertório de conhecimento, pois ensinou desde uma simples pipetagem até o complexo delineamento de pesquisas e interpretação de dados, sendo assim, sou muito grato ao doutor, dado seu altruísmo e persistência nessa caminhada difícil que é o educar e pesquisar no Brasil.

À minha família, que me forneceu aporte financeiro e psicológico para encerrar mais uma fase da minha vida e concomitantemente alçar novos voos em área diversa da minha formação, permitindo ampliar minhas possibilidades intelectuais e ver que não há limites quando se faz aquilo que gosta, o reconhecimento e sucesso, nada mais são que consequências daquilo que fazemos com maestria.

Sendo assim, o presente ato adimple um contrato firmado com o Dr. Gabriel e deixará saudades, pois apesar de diversos percalços no transcorrer, fui feliz e acredito ter feito o melhor, sendo bem orientado e gerando dados, que sem dúvidas serão úteis para a realização de novos trabalhos, então deixo registrado meu Muito Obrigado à todos que fizeram dessa jornada de quatro anos cheia de conhecimento, principalmente as agências de fomento FAPESP, CAPES e CNPQ pelo aporte.

RESUMO

Uma série de estudos recentes tem demonstrado que o Diabetes Mellitus Tipo 2 (DM2), acompanhado de resistência periférica à insulina tem um caráter de programação dependente das condições metabólicas maternas durante o período gestacional e de lactação. Neste sentido, tem sido amplamente reportado que a subnutrição, a obesidade e a resistência à insulina durante a gestação e lactação são fatores importantes para a predisposição da prole adulta a uma maior incidência de DM2. Relatos recentes demonstram que a alteração do ritmo claro escuro durante o período gestacional também programa, por um mecanismo ainda não esclarecido, resistência à insulina na prole de ratos. É sabido que alterações na duração ou na ritmicidade das fases claras e escuras do ciclo claro/escuro, alteram o ritmo de secreções endócrinas, sendo que a produção de melatonina pela glândula pineal é particularmente sensível a modificações ambientais de tal natureza. Recentemente, nosso grupo demonstrou que a ausência de melatonina durante a gestação e lactação gera intolerância à glicose na prole adulta por dois mecanismos, resistência hepática à ação da insulina e diminuição na secreção de insulina pelas ilhotas pancreáticas. Deste modo, buscamos avaliar se a prole oriunda de mães expostas à luz constante durante a gestação e/ou a lactação manifesta intolerância à glicose na vida adulta. Investigamos também a influência da minoração da melatonina materna, como um possível agente causador de prejuízo metabólico para prole adulta, além de fatores que podem alterar o eixo HPA e programar o metabolismo da prole.

ABSTRACT

Several recent studies have demonstrated that Type 2 Diabetes Mellitus (DM2) and peripheral insulin resistance display programming features that are inwardly connected to maternal conditions during pregnancy and lactation. For that purpose, it has been widely reported that gestational undernutrition, obesity and insulin resistance programs increased risk of DM2 in the offspring. Recent reports also show that shifts in the light dark cycle during pregnancy are able to program glucose intolerance in the offspring through mechanisms not yet clarified. It is known that changes in the light/dark cycle can disrupt the rhythms of endocrine secretions particularly that of melatonin. Recently, our group has demonstrated that absence of melatonin during pregnancy and lactation programs glucose intolerance in the offspring due to hepatic insulin resistance and defective insulin release. Thus, the present project investigates if the offspring born to mothers exposed to constant light during pregnancy and/or lactation display changes in energy metabolism in adult life. We also investigated the influence of maternal melatonin reduction as a possible agent causing metabolic injury to adult offspring, as well as factors that can alter the HPA axis and program offspring metabolism.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACTH Hormônio adenocoticotrópico

CRH Hormônio liberador de corticotropina DM2 Diabetes Mellitus Tipo 2

DS Dia Subjetivo

EPM Erro padrão da média GLUT4 Transportador de glicose GR Receptores de glicocorticoides HIOMT Hidroxi-indol-O-metiltransferase HPA Hipotalâmico-pituitário-adrenal 5HTP 5-hidroxitriptofano

IR Receptor de Insulina

IRS Substrato do receptor de insulina ITT Teste de Tolerância à Insulina MC2-R Receptor de melanocortina MT1 e MT2 Receptores de melatonina NAS N-acetil-serotonina

NAT Arilalquilamina n-acetiltransferase

NS Noite Subjetiva

NSQ Supraquiasmático

PI3K phosphatidylinositol 3-Kinase

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ingestão Alimentar ... 28

Figura 2. Concentração de 6-sulfatoxi melatonina em ratas virgens ... 29

Figura 3. Concentração de 6-sulfatoxi melatonina em ratas grávidas ... 30

Figura 4. Peso e perfil glicídico 16ª semana de vida (macho) ... 31

Figura 5. Peso e perfil glicídico 16ª semana de vida (fêmea) ... 32

Figura 6. Peso e perfil glicídico 18ª semana de vida (macho) ... 33

Figura 7. Peso e perfil glicídico 25ª semana de vida (fêmea) ... 34

Figura 8. Teste de tolerância à insulina 20ª semana de vida (fêmeas) ... 35

Figura 9. Teste de tolerância à insulina 20ª semana de vida (macho) ... 36

Figura 10. Secreção de Insulina (fêmeas) ... 37

Figura 11. Avaliação de Leptina ... 39

Figura 12. Avaliação de Corticosterona ... 40

Figura 13. Avaliação da Massa ... 41

Figura 14. Avaliação perfil bioquímico ... 42

Figura 15. Avaliação de ACTH ... 43

Figura 16. Avaliação da expressão gênica Star ... 44

Figura 17. Avaliação de TG e colesterol ... 45

Figura 18. Avaliação da expressão gênica CRH e POMC ... 46

Figura 19. Expressão gênica STAR e LDL-R ... 47

Figura 20. Avaliação de Colesterol e TG ... 48

Figura 21. Expressão gênica CRH e POMC ... 49

SUMÁRIO

1. Introdução ... 11

1.1 Ritmos circadianos ... 11

1.2 Glândulas Pineal ... 12

1.3 Melatonina e metabolismo ... 13

1.4 Sinalização intracelular da insulina ... 14

1.5 Programação fetal da resistência à insulina ... 15

1.6 Eixo HPA e suas adaptações ... 17

2. Justificativa ... 19

3. Objetivo ... 20

4. Metodologia ... 21

4.1 Animais e grupos ... 21

4.2 Reposição de melatonina ... 22

4.3 Tratamento com leptina... 22

4.4 PCR quantitativo ... 23

4.5 Teste de tolerância à insulina e teste de tolerância à glicose ... 24

4.6 Secreção cumulativa de insulina ... 25

4.7 Dosagem de 6-sulfatoxi-melatonina... 25

4.8 Análise estatística ... 26

5. Resultados e discussão ... 27

5.1 Parâmetros da prole ... 27

5.2 Papel da leptina sobre o controle do eixo HPA em ratas expostas à luz contínua ... 38

5.3 Papel da melatonina no funcionamento do eixo HPA ... 45

6. Discussão ... 51

7. Conclusões ... 55

8. Referências ... 57

1. INTRODUÇÃO

1.1 Ritmos circadianos

É sabido que o núcleo supraquiasmático (NSQ), localizado no sistema nervoso central, é o grande temporizador do organismo, sendo importante para impor ritmos que são ubíquos nos seres vivos. Esse temporizador central, orquestrado pelo hipotálamo, pode ser entendido como uma forma adaptativa do organismo ao meio ambiente, fundamental nos mais diversos processos comportamentais e fisiológico [1,2,3]_.

O estudo da cronobiologia vem ocorrendo a longa data. A primeira definição de cronobiologia foi proferida em 1969 por Franz Halberg, imputando ser o estudo sistemático das características temporais de toda matéria viva. No entanto, com o avanço tecnológico, tais como, inserção de aparelhos eletrônicos e aumento de patologias como depressão, obesidade, diabetes, dentre outras, a comunidade científica voltou seus olhares para a associação entre a dessincronização do indivíduo e os processos de saúde e doença [4,5,6]_.

Os ritmos biológicos podem ser divididos em: (i) infradianos, que são os que possuem duração maior que 28 horas, (ii) ultradianos, com duração menor que 20 horas e (ii) circadianos, que oscilam entre 24 e 25 horas [7,8]_.

O NSQ possui um papel determinante na regulação do ritmo circadiano e tem sido extensivamente estudado, porém ainda temos uma compreensão limitada de como a função do relógio periférico contribui para a regulação dos processos fisiológicos. Além disso, é sabido que as glândulas adrenais desempenham um papel especial neste contexto já que, os hormônios secretados por elas demonstram forte ritmicidade circadiana com repercussão nos processos fisiológicos

Dentre os diversos órgãos que possuem modulação secretória de acordo com o período do dia, temos a glândula adrenal, que é um relógio circadiano periférico e modula o ritmo circadiano de glicocorticoides. Esta regulação ocorre através da interação entre relógio periférico e central,

localizado no NSQ do hipotálamo. Os ritmos dos glicocorticoides estão envolvidos na adaptação de respostas ao estresse (Jetlag, trabalho em regime de turnos), modulação imunológica e cognitiva, participando inclusive da coordenação do consumo/gasto energético e adaptação ao ambiente externo.

Para a manutenção da homeostasia corporal é fundamental a manutenção do ciclo vigília-sono, uma vez que, quando ocorre ruptura desse ciclo, diversos sistemas são acometidos, principalmente aqueles que são modulados circadianamente, como é o caso da concentração plasmática de cortisol e melatonina. As secreções arrítmicas desses hormônios podem levar o indivíduo a ter eventos deletérios cardiovasculares, reprodutivos e metabólicos [9,10]_.

1.2 Glândula Pineal

A glândula pineal em humanos está localizada na margem posterior do teto diencéfalo, acima dos colículos superiores. Com relação à massa e tamanho, são variáveis frente a idade e condições da glândula. De uma forma geral apresenta em média 129 miligramas e 12 milímetros. Nos roedores, a massa gira em torno de 1,5 miligramas e mede cerca de 2 milímetros [11]_.

Funcionalmente, a glândula pineal é considerada um órgão neuroendócrino, cuja secreção é composta principalmente de N-acetil-5-metoxitriptamina (melatonina) [12]_.

O primeiro passo para a produção de melatonina é a captação, pela pineal, do aminoácido triptofano, que é biotransformado em 5-hidroxitriptofano (5HTP) pela ação da enzima triptofano 5-hidroxilase, passo limitante para formação da serotonina. Subsequentemente, ocorre a sua descarboxilação por meio de descarboxilase de aminoácido inespecífica, originando a 5-hidroxitriptamina (serotonina). Em seguida, a serotonina é transformada em N-acetil-serotonina (NAS) pela ação da arilalquilamina n-acetiltransferase (NAT), enzima considerada importante por ser regulada diariamente pela

estimulação simpática. Por fim, a NAS é transformada em melatonina pela ação da hidroxi-indol-O-metiltransferase (HIOMT) [13,14,15]_.

Segundo Ozaki, 1976, a excreção diária de melatonina em um animal pinealectomizado é de 20% em relação a um rato controle, perdendo sua modulação rítmica frente ao período claro/escuro [16]_.

Em humanos, há 2 tipos de receptores de melatonina: MT1 e MT2, que apresentam uma semelhança de 60% de forma global e de 73% no domínio transmembrânico. A ação da melatonina também decorre de sua ligação a receptores intracelulares e de sua interação direta com outros sinalizadores intracelulares, tais como espécies reativas de oxigênio [17]_.

As descrições anteriores evidenciam o quão importante é a melatonina para o nosso metabolismo, sendo fundamental voltar os olhares para esse hormônio que, embora não pertença a endocrinologia clássica, esclarece questões importantes sobre metabolismo.

1.3 Melatonina e metabolismo

Os receptores de melatonina possuem grande distribuição pelo corpo e estão presentes em vários órgãos metabolicamente ativos, como fígado e pâncreas. Experimentos com animais pinealectomizados demonstraram um papel importante deste hormônio na manutenção da massa corporal e ação na sinalização periférica de insulina [18,19]_.

Um dos primeiros trabalhos relacionando adipócito e melatonina foi publicado em 1994 por Lima et.al., com tecido adiposo isolado. A incubação do adipócito com melatonina aumenta a captação de glicose estimulada por insulina, demonstrando aumento da sensibilidade do tecido adiposo à ação da insulina [20]_{. Posteriormente a esta constatação, o mesmo grupo realizou}

experimentos com animais pinealectomizados, constatando que a ablação da pineal gera uma intolerância à glicose no animal, inicialmente associada à diminuição na concentração do transportador de glicose GLUT4 no tecido adiposo [21]_.

Subsequente à constatação que a pinealectomia gera diminuição de GLUT4, foi observado que os animais pinealectomizados apresentam resistência à insulina frente ao teste de tolerância à insulina (ITT). Vale ressaltar que a captação de glicose pelo adipócito sofre alterações frente aos diversos momentos do ciclo claro/escuro e que a reposição de melatonina nesses animais reverteu tanto a resistência à insulina quanto a redução de expressão de GLUT4 no tecido adiposo [22,23]_.

Logo, é possível notar o quão íntimo é a relação de melatonina com o metabolismo, gerando efeitos diretos em grande parte da via de sinalização intracelular, que merece ser explorado de forma exaustiva, dada a relevância do tema.

1.4 Sinalização intracelular da insulina

A promoção dos efeitos biológicos pela insulina é ocorre pela sua ligação à porção extracelular de seu receptor transmembrânico. Essa ligação promove alterações estruturais na porção intracelular do receptor que, à partir desse momento, passa a exercer sua atividade enzimática. Além de catalisar a fosforilação de resíduos de tirosina de sua própria cadeia proteica intracelular, o receptor de insulina (IR) também catalisa a fosforilação de resíduos de tirosina de uma série de substratos proteicos intracelulares (IRS). Cada uma dessas distintas proteínas recrutadas por intermédio de fosforilação tem a capacidade de se associar a um grupo distinto de outras proteínas intracelulares que contêm o domínio Src homology 2 (SH2). A interação física entre essas proteínas e os substratos do receptor de insulina se dá pela associação entre o domínio SH2 e resíduos de aminoácidos vicinais ao tirosil fosforilado [24]_.

Dos substratos proteicos que são fosforilados pelo IR, os insulin receptor substrate 1 e 2 (IRS1 e IRS2) são aqueles cuja importância nos efeitos metabólicos da insulina já foi convincentemente demonstrada experimentalmente [25]_{. Em conjunto com o IRS1 e o IRS2, o parceiro}

reguladora de 85 kDa (p85) da enzima phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K). A subunidade catalítica desta enzima contém 110kDA (p110) e encontra-se constitutivamente associada e inibida pela p85 no citoplasma. Quando uma molécula de IRS fosforilada em tirosina encontra um heterodímero p85-p110 no citoplasma, ocorre uma rápida associação entre o substrato fosforilado em tirosina e a p85, liberando a p110, que passa a exibir a sua atividade enzimática. A p110 da PI3K catalisa a fosforilação do fosfatidilinositol (4,5) bifosfato na posição 3’, gerando, assim, fosfatidilinositol (3,4,5) trifosfato. Estudos in vitro e in vivo, com inibidores farmacológicos da PI3K, demonstraram que a atividade desta enzima é indispensável para a captação de glicose estimulada pela insulina. A via de sinalização ativada pela PI3K resulta em aumento da captação de glicose em tecidos que expressam o transportador de glicose GLUT4. Esta proteína, expressa preferencialmente no tecido adiposo e na musculatura esquelética, localiza-se na membrana de vesículas intracelulares. Quando há exposição da célula à insulina, com ativação da PI3K, ocorre a translocação para a membrana celular, fundindo-se a esta, o que provoca o aumento da quantidade de transportador e, consequentemente, do influxo de glicose para a célula [26,27]_.

Apesar de não se conhecerem, com exata precisão, todos os eventos intracelulares desencadeados pela PI3K, a maioria dos estudos envolvendo a sinalização da insulina demonstra que, para que a geração de fosfatidilinositol-3-fosfato resulte em translocação das vesículas de GLUT4 para a membrana celular, é necessária a fosforilação/ativação da enzima AKT [27]_.

1.5 Programação fetal da resistência à insulina

Atualmente muitos são os estudos que associam modificações no ambiente intrauterino repercutindo na vida adulta do indivíduo. Um dos pioneiros na descrição desse fenômeno foi Baker e colaboradores, que correlacionaram o baixo peso ao nascer com a maior suscetibilidade no desenvolvimento de eventos cardiovasculares após os 40 anos [28]_.

A relação intrauterina repercutindo na vida adulta é uma realidade que vem sendo a cada dia mais explorada, e não seria diferente na área da endocrinologia. A prevalência de obesidade associada à resistência à insulina vem crescendo acentuadamente em países industrializados [29,30]_{, em paralelo}

ao crescente consumo de dietas ricas em carboidratos e pobres em proteínas e gorduras [31]_{. Em mulheres, a prevalência da obesidade na idade reprodutiva}

também vem aumentando, sendo provável que este evento acompanhe o consumo excessivo de gorduras durante a gestação e/ou lactação. Esses dados epidemiológicos apontam também que o aumento da incidência do DM2 ocorre em paralelo à exposição a diversas outras situações ambientais que vão além de alteração da natureza da dieta, tais como, a crescente exposição à poluição luminosa e mudanças no horário de alimentação [32,33,34]_.

Um estudo realizado em usuárias do Sistema Único de Saúde no ano de 2012 demonstrou que, no Brasil, cerca de 30% das gestações cursam com obesidade no último trimestre. Essa situação é preocupante para obstetras e pediatras, uma vez que tal condição aumenta os riscos de macrossomia no nascituro, bem como a possibilidade de complicações infecciosas no puerpério [35]_.

Estudos em animais experimentais, mostram que a alta ingestão de gorduras durante a gestação e lactação tem consequências marcantes na prole quando adulta. Em especial, foi constatado que as proles oriundas de mães que consumiram dieta hiperlipídica durante a gestação e/ou lactação apresentaram resistência à insulina e intolerância à glicose logo após o desmame [36]_.

Esses estudos consolidaram a hipótese de que a programação fetal é relevante para a etiologia do DM2 e da resistência à insulina. Os mecanismos pelos quais essas alterações se estabelecem são certamente modulações epigenéticas que envolvem a expressão de microRNAs, metilação de DNA e modificações covalentes de histonas. Neste contexto, o DM2 acompanhado de resistência à insulina tem sido apontado como uma patologia com alto grau de determinante epigenético [37]_.

Além da natureza da dieta, já está estabelecido que a subnutrição materna durante a gestação gera uma prole de fêmeas adultas que se

caracterizam por hiperfagia, intolerância à glicose, resistência à insulina e maior adiposidade [34]_{. Essas adaptações transmitem-se tanto pela linhagem}

paterna quanto pela linhagem materna, inclusive para a prole gerada a partir da geração número 1 das mães subnutridas [36]_{. Além de alterações qualitativas e}

quantitativas na dieta, modificações na ritmicidade das fases clara e escura, durante a gestação de ratas, resultam também no surgimento de uma prole com resistência à insulina. Mais especificamente, foi demonstrado que retardos de 12h na fase clara do ciclo claro/escuro, de três em três dias, durante toda a gestação, fazem com que a prole, constituída de machos na 12ª semana de vida, apresente resistência à insulina, com níveis glicêmicos normais no teste de tolerância à glicose [38]_{. O retardamento no ciclo claro/escuro materno,}

durante o período gestacional, provavelmente causa um remodelamento na síntese de melatonina materna, repercutindo na sincronização do feto [38]_.

Os dados supracitados demonstram que alterações em ritmos circadianos podem repercutir no metabolismo do indivíduo adulto, bem como intercorrências no transcorrer gestacional podem repercutir na prole adulta, corroborando para a propositura de que o distúrbio circadiano materno pode alterar o metabolismo da prole.

1.6 Eixo HPA e suas adaptações

O aumento do hormônio liberador de corticotropina (CRH), é a etapa inicial da ativação do eixo Hipotálamo-pituitaria-adenal (HPA). O CRH é lançado na circulação por meio da via porta-hipofisária. Na adenohipófise há receptores CRH-R1 e uma vez liberado, o CRH liga-se no receptor e estimula as células da adenohipofise a produzirem o hormônio adenocoticotrópico (ACTH), que subsequentemente é liberado para a circulação periférica. O receptor de melanocortina MC2-R, localizado no córtex da adrenal, estimula a síntese de glicocorticoides. Assim como diversos sistemas fisiológicos, a produção de glicocorticoide está relacionada a feedback negativo, ou seja, a ligação do hormônio em receptores de glicocorticoides (GR) faz com que

ocorra a interrupção de CRH no hipotálamo e consequentemente interrompendo a sequência acima descrita [39,40]_.

É importante ressaltar que a secreção do ACTH bem como seu produto final, o cortisol, possui um padrão secretório rítmico, ou seja, é dependente de marcadores endógenos para secreção, apresentando um pico no período da manhã, após o despertar, e com secreção diminuída no transcorrer do dia, chegando a concentrações mínimas durante o sono [41]_.

Baseado nas informações anteriores, bem como na extensa descrição da literatura, para a manutenção da homeostasia corporal, se faz necessário o perfeito funcionamento do sistema endócrino, muitas vezes orquestrado pelo sistema nervoso central, sendo assim, o estudo de uma gama de hormônios, sinalizadores bioquímicos fundamentais para a homeostasia corpórea.

Um exemplo clássico a ser explorado é o tecido adiposo, anteriormente visto como um protetor térmico e contra impactos, tem hoje, sido amplamente estudado, por ser um tecido importante no controle e manutenção da homeostasia endócrina, por ter função secretora e impactar diretamente no metabolismo energético, sendo considerado de suma importância para o controle da saciedade, por exemplo [42]_.

A leptina, secretada pelas células adiposas, possui função sobre o hipotálamo e influência direta no metabolismo, é importante ressaltar que a expressão de leptina se dá em diversos tecidos além do tecido adiposo, dentre eles estão a mucosa do fundo gástrico, músculo e placenta [43,44,45,46,47]_.

2. Justificativa

A exposição à luz contínua entre o décimo e o décimo oitavo dia de gestação de ratas grávidas suprime completamente a ritmicidade materna de produção de melatonina. Este mesmo estudo mostra que a prole originada desta mãe apresenta baixo peso ao nascer e maior produção de corticosterona pelas adrenais [48]_.

Dados recentes de nosso laboratório demonstram que a ausência de melatonina materna durante a gestação e lactação imprime na prole de machos e de fêmeas adultas alterações metabólicas marcadas por intolerância à glicose. Assim, observamos que a prole oriunda de mães pinealectomizadas desenvolve resistência hepática à ação da insulina e menor secreção de insulina no final da fase clara do ciclo claro/escuro [49]_.

Os fenômenos acima descritos, foram observados em prole cujas mães foram pinealectomizadas e assim permaneceram durante todo o transcorrer gestacional e lactacional. É sabido que a pinealectomia na clínica é realizada em casos extremos, como calcificação de pineal, algum tipo de acidente ou algum tipo de câncer que acomete sistema nervoso central obrigando o cirurgião a retirar a glândula [48]_.

Sendo assim, por estarmos diante de um modelo um tanto quanto longe do fisiológico, sabendo que a presença de luz contínua causa diminuição da melatonina produzida pela pineal e que são diversos os estímulos fóticos no período noturno, além de que profissionais gestantes que trabalham em turno e consequentemente tem um déficit na sua concentração de melatonina plasmática, propusemos o presente projeto, no intuito de avaliar a repercussão metabólica na prole adulta, gerada à partir de mães expostas à luz contínua.

3. Objetivo

O presente trabalho teve como objetivo investigar se a exposição à luz contínua durante a gestação e lactação, imprime na prole alterações no metabolismo glicêmico e se essas possíveis alterações decorrem da ausência de melatonina materna.

4. Metodologia

4.1 Animais e grupos

Foram utilizados machos e fêmeas da linhagem Wistar em todos os experimentos. Os animais foram mantidos em caixas coletivas (com 4 animais por gaiola) sob condições de temperatura ambiental controlada de 25°C e, ciclo de iluminação claro/escuro de 12h/12h (período escuro iniciando às 19h), até a décima segunda semana de vida. Todos os animais receberam ração balanceada padrão (Nuvital) e água ad libitum.

Na 12ª semana de vida, as fêmeas foram alocadas duas a duas em caixas junto com um macho por 48 horas. Essas fêmeas foram mantidas em duplas em biotério com fotoperíodo padrão (12 horas claro / 12 horas escuro) até o 10º dia gestacional, momento no qual foram individualizadas e subdivididas nos seguintes grupos:

Grupos Animais Fotoperíodo

Grupo 1 Ratas virgens 12 horas claro

12 horas escuro

Grupo 2 Ratas grávidas 12 horas claro

12 horas escuro

Grupo 3 Ratas virgens Luz constante

Grupo 4 Ratas grávidas Luz constante

Os animais foram mantidos nestas condições por 8 dias, momento no qual foi realizada a eutanásia, para estudo prévio nos parâmetros bioquímicos maternos.

Nos experimentos que originaram as proles usadas nos estudos, as ratas grávidas foram mantidas em três condições:

Animais Fotoperíodo Condição Grupos Ratas grávidas 12 horas claro

12 horas escuro

Gestação Lactação

Controle

Ratas grávidas Luz contínua

Gestação 10 dias Lactação

Luz

Ratas grávidas Luz contínua

Gestação 10 dias Lactação + Melatonina Luz + Melatonina 4.2 Reposição de melatonina

Todos os grupos continuaram a receber água e ração padrão ad libitum no transcorrer gestacional, sendo que á partir das 19 horas foram realizadas a substituição da garrafa de água, por garrafas contendo melatonina nos grupos com suplementação com o hormônio. Nos demais grupos foi oferecido apenas o veículo (etanol com concentração final de aproximadamente 0,0001%, v/v). As garrafas eram substituídas por garrafa de água novamente às 7 horas do dia seguinte. A dose de melatonina usada foi de 0,25mg/kg quando do tratamento com ratas grávidas e 0,50mg/kg quando realizado com ratas virgens. Vale ressaltar que os frascos tinham a coloração âmbar minimizando o processo de degradação da melatonina, pois trata-se de uma molécula potencialmente termossensível.

4.3 Tratamento com leptina

Para o tratamento com leptina, foram utilizadas ratas virgens, as quais foram dividas em quatro grupos:

Grupos Fotoperíodo Tratamento

Controle 12 horas claro

12 horas escuro

Veículo

Controle + Leptina 12 horas claro 12 horas escuro

Leptina

Luz Luz constante Veículo

Luz + Leptina Luz constante Leptina

A leptina utilizada durante o tratamento (rat recombinant Leptin, RD, cat nº 598-LP) foi diluída em Tris-HCL (0,05M pH8,0) e aplicada no dorso do animal na dose de 20nmol/kg, sempre administrada no volume de 200μL, os animais controle receberam a injeção somente com veículo Tris-HCL (0,05M pH8,0) [28]_.

As injeções (veículo ou leptina), foram sempre realizadas no ZT 24 (uma hora antes de acender a luz) durante 6 dias. Após este tratamento os animais foram anestesiados, decapitados e os seguintes tecidos foram removidos: adrenal, hipotálamo, hipófise e fígado.

4.4 PCR quantitativo

O RNA total foi extraído de fragmentos dos seguintes tecidos: hipotálamo, hipófise e adrenal. Esses tecidos foram homogeneizados com 1mL de reagente Qiazol® para extração de RNA total de acordo com as recomendações do fabricante. Para eliminar eventuais contaminações com DNA genômico, as amostras foram tratadas com DNAse, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. A análise da concentração e pureza do RNA foi realizada por espectrofotometria nos comprimentos de onda de 260 e 280nm.

As amostras com qualidade adequada foram submetidas à síntese de cDNA por transcrição reversa convencional de 2μg de RNA total de cada amostra com o kit High Capacity Transcription Assay (Life Technologies). Os cDNAs obtidos de hipotálamos foram usados para detecção dos mRNA de POMC, CRH e GAPDH como constitutivo. Os ensaios usados para este fim

foram de tecnologia Taqman. Os cDNAs de tecido adiposo foram usados para amplificação do gene da leptina e GAPDH como constitutivo, também com tecnologia TaqMan. Os cDNAs de adrenal foram usados para amplificação do gene da Star usando RPL37A como contitutivo. Estes usaram SYBR como

fluoróforo. As sequências são: RPL37A sense:

CAAGAAGGTCGGGATCGTCG; antisense:

ACCAGGCAAGTCTCAGGAGGTG; STAR sense:

CATGGTGCTTCATCCACTGGC; antisense: TGGGCAGTCCTTAACACTGGG. Com relação a tecnologia taqMan, os seguintes primers foram utilizados: Rn00565158_m1; Rat leptin; Rn01462661_g1; Rat GAPDH.

4.5 Teste de tolerância à insulina e teste de tolerância à glicose

Para a realização do teste de tolerância a glicose (GTT) os animais (jejuados por 12 horas) receberam uma injeção intraperitoneal de glicose (2g/kg) e a glicemia foi medida antes e 5, 10, 15, 30, 60 e 120 min após a injeção. O sangue foi coletado através de uma incisão na extremidade da cauda. A área sob a curva (glicemia vs. tempo) foi calculada como parâmetro de tolerância à glicose.

Os testes descritos a seguir foram realizados nos grupos de Prole CTL, Prole Luz e Prole Luz+Mel, na 16ª, 18ª e 25ª semana de vida. Para a realização do teste de tolerância a insulina (ITT) os animais (previamente jejuados por 12 horas) receberam uma injeção intraperitoneal de insulina (2UI/kg) e a glicemia foi medida antes e 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos após a injeção. A coleta de sangue foi feita através de incisão na extremidade da cauda. Os valores da glicemia foram convertidos para escala logarítmica na base e. Em seguida, a inclinação da reta (resultante do logaritmo da glicemia vs. tempo) foi calculada. Este valor em módulo multiplicado por 100 foi assumido como a constante de decaimento de glicose após o ITT (KITT) na unidade min-1_x100.

Em ambos os testes, a glicemia foi mensurada usando-se um glicosímetro (Accu-Check Active - Roche, Brasil), que determina os valores de glicose em sangue total a partir do método enzimático da glicose oxidase.

4.6 Secreção cumulativa de insulina

As ilhotas coletadas foram transferidas para placas de cultura com 24 reservatórios contendo 0,5mL de solução de Krebs, suplementada com 0,5% de albumina bovina (m/v) e 5,6mM de glicose (pH=7,4). Em cada reservatório haviam 5 ilhotas, que foram acondicionadas em estufa à 37ºC e mantidas em ambiente controlado (atmosfera úmida com 5% de CO2). As

ilhotas permaneceram, então, pré-incubadas por 45 minutos nessa solução. Ao final do período, a solução foi rapidamente removida e substituída por nova solução de incubação, contendo agora 5.6, 8.3, 11.1 ou 16.7mM de glicose. Após 1 hora de incubação, as placas foram resfriadas à 4ºC, o sobrenadante foi removido e quantificado por radioimunoensaio, usando padrão de insulina de rato.

4.7 Dosagem de 6-sulfatoxi-melatonina

Após a individualização e separação das ratas no 10º dia de gestação, estas foram mantidas sob as condições experimentais anteriormente descritas. Entre o 15º e 16º dias de gestação, as ratas foram alocadas em gaiolas metabólicas, onde permaneceram aproximadamente por 12 horas (durante a noite) para coleta da urina. Posteriormente, as amostras de urina foram usadas para dosagem do metabolito da melatonina 6-sulfatoxi-melatonina (6-S-mel) pelo kit Melatonin-Sulfate Urine ELISA, (RE54031,IBL international). A massa de 6-S-mel produzida por cada animal durante a noite foi encontrada multiplicando-se a concentração do analito pelo volume total da amostra.

4.8 Análise estatística

Os resultados estão expressos como média  erro padrão da média (EPM) e analisados estatisticamente por análise de variância. Os dados foram testados para normalidade usando o software GraphPad Prism - Versão 4 para Windows. No caso das análises das mães, foi aplicado o ANOVA de duas vias com pós-teste de Student-Newman-Keuls, considerando o fator gestação (ausência ou presença de gestação) e o fator tipos de ciclo de luz (ciclo claro/escuro ou luz contínua), usando o Software SigmaStat 3.5. No caso dos dados das proles, foi usado ANOVA de uma via com pós-teste de Tukey, usando o software GraphPad Prism - Versão 4 para Windows. Em todos os resultados, foram adotados 5% como limite de significância estatística (p<0,05).

5. Resultados e Discussão

5.1 Parâmetros da prole

O perfil diário de ingestão alimentar foi avaliado em ratas grávidas expostas aos dois ciclos de luz (claro/escuro; CTL e luz constante; LUZ), durante 8 dias. As medidas foram feitas de 12 em 12 horas. No caso de ratas expostas à luz contínua, os intervalos de 12 horas representam a noite subjetiva (NS) ou o dia subjetivo (DS).

No primeiro dia da exposição à luz contínua, as ratas mantiveram o padrão preferencial de alimentação espontânea durante a NS, caracterizada por maior ingestão de ração no intervalo das 12 horas que correspondiam à noite de fato, antes de se iniciar a exposição ao tratamento (luz contínua). As ratas expostas à luz contínua, entretanto, demonstraram um progressivo desaparecimento deste hábito alimentar, caracterizados por surtos durante a NS. Assim, nos últimos dois dias de exposição à luz contínua, as ratas grávidas apresentaram valores de ingestão alimentar similares, durante o dia e a noite subjetiva. As ratas expostas ao ciclo de luz claro/escuro (CTL), ingeriram mais ração na fase escura, se comparadas com o ingerido na fase clara (Figura 1).

Figura 1. Ingestão alimentar: As ratas grávidas no 11º dia de gestação, foram

expostas a uma situação controle de ciclo claro/escuro de 12h (CTL) ou luz contínua (LUZ). A ingestão alimentar foi mensurada em intervalos de 12 horas.

* indicando diferença de ingestão noturna de CTL vs. a ingestão diurna de CTL

Outro parâmetro explorado foi a melatonina, uma vez que parte dos animais foram submetidos à luz contínua e, assim se fez necessário a avaliação do metabólito da melatonina, 6-sulfatoxi-melatonina, para sabermos se analogamente à pinealectomia, haveria uma redução significativa do hormônio. Para realizar o presente estudo, o metabólito ativo foi mensurado na urina de ratas virgens (idade pareada) e ratas grávidas entre o 15º e 16º dias de gestação. A exposição à luz contínua fez com que houvesse uma diminuição de cerca de 40% na massa de 6-S-Mel. A reposição de melatonina durante a fase escura subjetiva, reverteu esta diminuição, tanto em ratas virgens como em ratas grávidas. (Figuras 2 e 3).

LUZ CTL

Sendo assim, é possível notar a diferença entre a concentração plasmática nos animais pinealectomizados e animais submetidos a período de luz contínua, já que a luz contínua mantém uma concentração relativamente alta de melatonina, podendo essa concentração, se oriunda da glândula pineal, ser suficiente para a sincronização dos diversos órgãos, mitigando um efeito deletério ou danoso ao metabolismo.

Figura 2. Concentração de 6-sulfatoxi melatonina em ratas virgens:

Concentração de 6-sulfatoxi melatonina na urina de ratas expostas a um fotoperíodo padrão (CTL); Ratas expostas à luz contínua por um período de 8 dias (LC) Ratas expostas à luz contínua por 8 dias com reposição de melatonina (LCM). Os dados são apresentados como Média ± EMP com One way ANOVA teste T Student entre grupo CTL vs LUZ. *p<0.05 vs. CTL.

Figura 3. Concentração de 6-sulfatoxi melatonina em ratas grávidas:

Concentração de 6-sulfatoxi meltonina entre o 15º e 16º dias de gestação na urina de ratas grávidas expostas a um fotoperíodo padrão (CTL-preg); Ratas grávidas expostas a luz continua à partir do 10º dia de gestação (LC-preg) Ratas grávidas ratas expostas a luz contínua à partir do 10º dia de gestação com reposição de melatonina (LCM-preg). Os dados são apresentados como Média ± EMP com One way ANOVA teste T Student entre grupo CTL vs LUZ. *p<0.05 vs. CTL.

Com relação ao estudo com a prole, foram realizados 3 cruzamentos com animais em momentos distintos, visando minorar eventuais resultados tendenciados, fatores importantes quando a investigação concerne sobre metabolismo.

A compilação dos experimentos com as três proles confirmou que os machos nascidos de mães expostas à luz contínua, não desenvolvem intolerância à glicose na 16ª semana de vida. A prole de machos também não apresenta alterações no peso corporal. Estes resultados se mantiveram nos animais que nasceram de mães expostas à luz contínua e tratadas com melatonina (Figura 4). A prole de fêmeas, entretanto, apresentou perfil metabólico diferenciado na 16ª semana de vida. As fêmeas nascidas de mães expostas à luz contínua apresentaram intolerância à glicose na 16ª semana de

vida. Isso ocorreu sem aumento da glicemia de jejum e do peso corporal. As ratas nascidas de mães expostas à luz contínua e tratadas com melatonina, também mantiveram esta alteração fenotípica (Figura 5).

Figura 4. Peso e perfil glicídico na 16ª semana de vida (macho): Ratos

nascidos de mães controle (prole CTL), expostos à luz contínua (prole Luz) e expostos à luz contínua e tratadas com melatonina (prole Luz+Mel) foram usados para GTT na 16ª semana de vida (A) a área sob a curva foi calculada a partir da glicemia basal (B) a glicemia de jejum (C) e a massa corporal (D) também foram medidas.

Figura 5. Peso e perfil glicídico na 16ª semana de vida (fêmea): Ratas

nascidas de mães controle (prole CTL), expostas à luz contínua (prole Luz) e expostas à luz contínua e tratadas com melatonina (prole Luz+Mel) foram usadas para GTT na 16ª semana de vida (A); área sob a curva, calculada a partir da glicemia basal (B); glicemia de jejum (C); massa corporal (D); também foram medidas. *p<0,05 vs. prole CTL.

Os testes metabólicos realizados demonstram claramente que, com 16 semanas de vida, a exposição à luz contínua durante a gestação gerava um impacto metabólico na prole gênero-dependente. Para esclarecer se as alterações metabólicas da prole de machos poderiam ocorrer em momentos mais tardios na vida do animal, o estudo metabólico perdurou até a 18ª semana de vida dos animais. Neste momento, foram submetidos a novos testes de tolerância à glicose. Esta análise mostrou que os animais machos nascidos de mães expostas à luz contínua, se mantiveram sem alterações metabólicas também nesta idade (Figura 6).

Figura 6. Peso e perfil glicídico na 18ª semana de vida (macho): Ratos

nascidos de mães controle (Prole CTL), expostos à luz contínua (Prole Luz) e expostos à luz contínua e tratadas com melatonina (Prole Luz+Mel) foram usados para GTT na 18ª semana de vida (A); a área sob a curva foi calculada a partir da glicemia basal (B); glicemia de jejum (C); e a massa corporal (D); também foram medidas.

Constatada uma modulação metabólica de intolerância a glicose específica para a prole de fêmeas, foram empreendido esforços para caracterizar se as alterações apresentadas pela prole de fêmeas eram permanentes ou transitórias, para tanto, foi realizado novo teste de tolerância à glicose na prole constituída de fêmeas ao atingirem a 25ª semana de vida. Os resultados obtidos divergiram dos apresentados em momento anterior, ou seja, na 16ª semana de vida a prole nascida de mães expostas à luz contínua já não

apresentou intolerância a glicose. Apesar disso, aquelas ratas que nasceram de mães expostas à luz contínua e tratadas com melatonina, persistiram com a intolerância a glicose nesta idade (Figura 7).

Figura 7. Peso e perfil glicídico na 25ª semana de vida (fêmea): Ratas nascidas de mães controle (Prole CTL), expostas à luz contínua (prole Luz) e expostas à luz contínua e tratadas com melatonina (Prole Luz+Mel) foram usadas para GTT na 25ª semana de vida (A); a área sob a curva foi calculada a partir da glicemia basal (B); glicemia de jejum (C); massa corporal (D); também foram medidas. * p<0,05 vs. Prole CTL.

As alterações retro, não foram acompanhadas de mudanças na sensibilidade à insulina, como constatado pelo teste de tolerância à insulina na prole de fêmeas (Figura 8) e machos (Figura 9). Assim, visando compreender a intolerância à glicose transitória desacompanhada de intolerância à insulina (Figura 10), os estudos posteriores visaram explorar possíveis mudanças na secreção de insulina pela ilhota das fêmeas nascidas de mães expostas à luz

contínua. Os resultados obtidos mostram que, ao contrário do que era esperado frente aos resultados de GTT e ITT, as ilhotas da prole de fêmeas nascida de mães expostas à luz contínua apresenta maior secreção de insulina frente a concentrações estimuladoras de glicose (16,7mM). Tal resultado não é encontrado nas ilhotas de fêmeas nascidas de mães expostas a luz contínua e tratadas com melatonina.

Figura 8. Teste de tolerância à insulina 20ª semana de vida (fêmeas):

Ratas nascidas de mães controle (Prole CTL), expostas à luz contínua (prole Luz) e expostas à luz contínua e tratadas com melatonina (Prole Luz+Mel) foram usados para ITT na 20ª semana de vida (A); constante de decaimento de glicose (B); também foi calculada.

Figura 9. Teste de tolerância à insulina na 20ª semana de vida (macho):

Ratos nascidos de mães controle (Prole CTL), expostas à luz contínua (prole Luz) e expostas à luz contínua e tratadas com melatonina (Prole Luz+Mel) foram usados para ITT na 20ª semana de vida (A). A constante de decaimento de glicose foi calculada (B).

Figura 10. Secreção de Insulina (fêmeas): Secreção de insulina pelas ilhotas

pancreáticas da prole de ratas nascida de mães controle ou expostas à luz contínua com ou sem tratamento com melatonina. As ilhotas foram incubadas in vitro com diferentes concentrações de glicose (indicadas no gráfico em mM). Após incubação, a insulina do sobrenadante foi quantificada por radioimunoensaio. Os dados representam a secreção de insulina cumulativa ao longo de 1 hora e são dados com média ± EMP.

* diferença entre 5,6 e

De maneira geral, as análises das proles de nosso modelo experimental (reunidos nas figuras 1 à 10), juntamente com as análises dos perfis hormonais maternos, mostram que a exposição à luz contínua durante a gestação, programa intolerância à glicose na prole de fêmeas, mesmo que de forma transitória, ou seja, desaparece entre a 16ª e a 22ª semana de vida. É interessante notar que esta mesma prole que apresenta intolerância a glicose, também mostra tendência a maior secreção de insulina pelas ilhotas isoladas. Até o momento não há uma explicação definitiva para este cenário metabólico, mas este aumento da secreção de insulina pode ser uma consequência de resistência a insulina causadora da intolerância a glicose. Sendo somente

possível a presente explicação com resultados negativos no ITT, explorarmos a questão no que concerne a sensibilidade do teste, limitada para detectar discretas alterações na resposta periférica a insulina.

Independente da causa da intolerância a glicose, há uma notória diferença dos dados metabólicos de prole nascida de mães expostas à luz contínua e prole nascida de mães pinealectomizadas [49]_{. A pinealectomia antes}

da gestação leva à intolerância a glicose na prole de machos e de fêmeas. Os presentes resultados mostram que a luz contínua durante a gestação, causa intolerância a glicose somente na prole de fêmeas, sendo tal fenômeno transitório. A priori, com os resultados obtidos das três proles, elenca-se duas possibilidades para explicar a diferença:

1. A luz contínua, apesar de reduzir a produção da melatonina em ratas grávidas, induz outras alterações humorais que resultam em uma particular modulação metabólica da prole. Sendo o aumento da leptina e a manutenção nos níveis de corticostetona quando da exposição à luz contínua no período gestacional e modulação de ritmo alimentar como possíveis motivadores dos resultados descritos na prole. Concordante com esta hipótese, a pinealectomia, apesar de reduzir a melatonina circulante, não modula o ritmo alimentar, ao contrário da luz constante, induzindo redução da leptinemia e aumento de corticosterona [49]_.

2. O modelo escolhido de exposição à luz contínua se fez presente desde o 10º de gestação até o 10º dia de amamentação, ao passo que a pinealectomia materna capaz de originar intolerância a glicose na prole de fêmeas e machos, deve ocorrer na verdade antes da gestação e permanecer até o desmame, podendo ter ocorrido uma adaptação ao novo ritmo imposto.

5.2 Papel da leptina sobre o controle do eixo HPA em ratas expostas à luz contínua

Após a descrição do perfil metabólico da prole de ratos e ratas nascidas de mães expostas à luz contínua e notando a resiliência no aumento

da corticosterona plasmática em ratas grávidas expostas a luz contínua, foi iniciado um estudo na tentativa de elucidar a plasticidade diferencial do eixo HPA de ratas grávidas e não-grávidas expostas a luz contínua.

A modulação seletiva dos níveis de leptina em ratas grávidas e virgens em função da exposição à luz contínua foi um fator preponderante para a continuidade dos estudos. As ratas virgens apresentaram uma redução dos níveis de leptina quando expostas á luz contínua, o que não ocorreu com as ratas grávidas (Figuras 11 e 12). Já é sabido que, a exposição à pequenas doses de leptina de uma maneira subcrônica, resulta em supressão da secreção de ACTH e da massa da glândula adrenal [50]_.

Figura 11 Avaliação de Leptina: Ratas virgens e grávidas no 11º dia de

gestação foram expostas a uma situação controle de ciclo claro escuro de 12h (CTL) ou luz contínua (LUZ) por 8 dias. Ao final deste período os animais foram sacrificados e o soro foi usado para dosagem de leptina.

* p=0,036 vs. CTL

Figura 12. Avaliação de Corticosterona: Ratas virgens e grávidas no 11º dia

de gestação foram expostas a uma situação controle de ciclo claro escuro de 12h (CTL) ou luz contínua (LUZ) por 8 dias. Ao final deste período os animais foram sacrificados e o soro foi usado para dosagem de corticosterona.

Existe a possibilidade que a redução dos níveis de leptina em decorrência da exposição à luz contínua nas ratas virgens resulte por estimular o eixo HPA, o que não ocorreria nas ratas grávidas. Ratas expostas à luz contínua quando em estado gravídico, apresentam aumento da leptina circulante, diminuição da melatonina em paralelo a um não aumento das concentrações plasmáticas de corticosterona. Tal perfil caracteriza uma resiliência do eixo HPA da gestante. Os dados corroboram com a ideia de que a rata grávida apresenta um eixo HPA também refratário a hiper-ativação pela luz contínua. Trabalhos do grupo do professor Maleconkicz demonstrou que, em uma situação livre de gestação, a leptina pode agir diretamente em diferentes níveis do eixo HPA, suprimindo-o [50]_{. Deste modo, desenhamos}

experimentos que tinham por base o tratamento de ratas não grávidas com leptina e concomitante exposição a luz contínua, objetivando observar se uma

fonte exógena de leptina poderia impedir o aumento do eixo HPA quando da exposição à luz contínua.

Conforme descrito na metodologia, as extrações foram realizadas no ZT1 (uma hora após acender a luz), sendo que diversos parâmetros foram avaliados como massa e adiposidade, que não apresentaram diferença estatística quando dos tratamentos (Figura 13).

Figura 13. Avaliação da Massa: Ratas virgens controle de ciclo claro/escuro

de 12h (CTL); ciclo claro/escuro com 1 injeção diária de leptina (CTL+LEP); luz contínua (LUZ) e luz contínua com 1 injeção diária de leptina (CTL+LEP) por 6 dias. As ratas foram pesadas no final do tratamento (ZT1), momento no qual também foi retirado todo o tecido adiposo perigonadal e retoroperitoneal, para compor o resultado da adiposidade, não apresentando diferença estatística intergrupos.

A caracterização de parâmetros bioquímicos das ratas virgens expostas a luz contínua, com ou sem tratamento com leptina, envolveu medidas de glicemia, colesterol total e triglicerídeos. Os níveis de colesterol total e glicemia não apresentaram variação em nenhum destes grupos. No caso dos triglicérides, apesar de não haver interação (p=0,426), os valores do CTL+LEP foram menores que os do grupo CTL (p=0,004) (Figura 14).

Figura 14. Avaliação perfil bioquímico: Ratas virgens controle de ciclo claro

escuro de 12h (CTL); ciclo claro e escuro com 1 injeção diária de leptina (CTL+LEP); luz contínua (LUZ) e luz contínua com 1 injeção diária de leptina (CTL+LEP) por 6 dias. Ao final deste período os animais foram sacrificados (ZT1) e o soro foi usado para dosagem de glicemia, colesterol e triglicérides. *p<0,05 vs. CTL.

Do ponto de vista do eixo HPA, foram avaliadas as concentrações de ACTH, dando início a investigação no eixo. Fatores como de ciclo de luz e tratamento com leptina não modularam os valores de ACTH. Entretanto, houve interação (p=0,012) de modo que, analisando exclusivamente os animais sem tratamento com leptina. Se analisados somente os animais com tratamento com leptina, a luz constante resultou em redução dos níveis de ACTH (p<0,05 vs. claro/escuro) (Figura 15).

Figura 15. Avaliação de ACTH: Ratas virgens controle de ciclo claro/escuro

de 12h (CTL); ciclo claro/escuro com 1 injeção diária de leptina (CTL+LEP); luz contínua (LUZ) e luz contínua com 1 injeção diária de leptina (LUZ+LEP) por 6 dias. Ao final deste período (ZT1) os animais foram sacrificados e o soro foi usado para dosagem de ACTH. * p<0,05 vs. CTL.

A expressão da enzima Star (passo limitante para a síntese de corticosterona) foi selecionada como um parâmetro que evidencia o funcionamento do eixo HPA no âmbito da adrenal. A expressão desta enzima representa a fase final para a produção de costicosterona. Anteriormente as ratas grávidas expostas à luz contínua, apresentavam tendência de diminuição na expressão desse gene, corroborando com a hipótese da leptina ser a responsável pela resiliência no estado gravídico. Ao contrário, ratas virgens apresentavam um aumento da expressão desta enzima quando expostas à luz contínua. O tratamento com leptina nos permitiu concluir que a exposição à luz contínua modula a expressão gênica, de forma aumentar essa expressão e esse aumento, independente do tratamento com leptina (p=0,026). Vale ressaltar que não houve interação entre estes dois fatores (p=0,221) de modo que o efeito da luz não é afetado pela adição de leptina exógena (Figura 16).

Figura 16. Avaliação da expressão gênica STAR: Ratas virgens controle de

ciclo claro/escuro de 12h (CTL); ciclo claro/escuro com 1 injeção diária de leptina (CTL+LEP); luz contínua (LUZ) e luz contínua com 1 injeção diária de leptina (CTL+LEP) por 6 dias Ao final deste período (ZT1) os animais foram sacrificados e a glândula adrenal foi removida e usada para determinação do mRNA da Star por RT-PCR.

Os resultados apresentados nos conduz a concluir que o tratamento com leptina exógena, na via subcutânea, e no ZT 22 (duas horas antes da luz acender), suprime parcialmente a ativação do eixo HPA induzido pela luz constante. Deste modo, é possível que o aumento de leptina notado em ratas grávidas expostas à luz contínua contribua para a não ativação do eixo HPA naquelas ratas. Entretanto, o papel da leptina parece ser mais relevante no âmbito da hipófise de que na adrenal. Sendo possível que na adrenal, outros fatores inerente do próprio modelo, como injeção subcutânea diária, possa alterar o padrão secretório da adrenal.

5.3 Papel da melatonina no funcionamento do eixo HPA

Após a constatação que a leptina, por si só não é o responsável pela modulação negativa do eixo HPA e consonante com a literatura que reporta que a melatonina é um supressor do eixo HPA e que esta supressão pode ocorrer diretamente na adrenal, por meio de receptores MT1 e MT2.[47]_{. Assim,}

os últimos experimentos realizados foram importantes para constatar a relação da melatonina no eixo HPA. A propositura dos experimentos objetivou avaliar se a melatonina modularia o eixo HPA de ratas expostas a luz contínua. Os experimentos a seguir descritos, foram realizados em dois momentos do ciclo claro e escuro, ZT1 e ZT10.

A exposição à luz contínua durante 6 dias (período análogo ao tratamento com leptina) ZT1, aumentou a concentração de triglicérides (p=0,0361 vs. CTL), sendo que este efeito desapareceu quando do tratamento simultâneo com melatonina. O colesterol total não foi modulado nestes grupos (Figura 17).

Figura 17. Avaliação de TG e colesterol: Ratas virgens controle de ciclo

claro/escuro de 12h (CTL); luz contínua (LUZ) e ciclo claro e escuro com reposição de melatonina na água de beber (LUZ+MEL) por 6 dias. Ao final deste período os animais foram sacrificados e o soro foi usado para dosagem de colesterol e triglicérides. * p<0,05 vs. CTL.

Não houve modulação nos neuropeptídios POMC e CRH no

hipotalamo, quando tratados com melatonina, não havendo portanto, relação

entre a melatonina e neuropeptídios orexigênicos e anorexigênicos, neste

modelo (Figura 18).

Figura 18. Avaliação da expressão gênica CRH e POMC: Ratas virgens

controle de ciclo claro escuro de 12h (CTL); luz contínua (LUZ) e ciclo claro e escuro com reposição de melatonina na água de beber (LUZ+ MEL) por 6 dias. Ao final deste período os animais foram sacrificados e o hipotálamo foi removido e usado para determinação do mRNA da Star por RT-PCR.

No que diz respeito a avaliação dos parâmetros adrenais relacionados ao funcionamento do eixo HPA, pudemos observar que o efeito da luz constante sobre a expressão da enzima STAR (p=0,024) e do LDLR (p=0,0025) foi suprimido pela melatonina (Figura 19).

Figura 19. Expressão gênica STAR e LDL-R: Ratas virgens controle de ciclo

claro/escuro de 12h (CTL); luz contínua (LUZ) e ciclo claro/escuro com reposição de melatonina na água de beber (LUZ+MEL) por 6 dias. Ao final deste período os animais foram sacrificados, a glândula adrenal foi removida e usada para determinação do mRNA da Star por RT-PCR. * p<0,05 vs. CTL.

A

B

Agora passaremos a descrever os resultados obtidos no ZT10. Vale ressaltar que as ratas foram submetidas à condições análogas as descritas anteriormente, alterando apenas o horário no qual a eutanásia foi realizada. Neste momento do ciclo claro/escuro, não observamos diferenças nas concentrações de colesterol e triglicérides, independente do ciclo de luz e da presença ou ausência de melatonina (Figura 20).

Figura 20. Avaliação de Colesterol e TG: Ratas virgens controle de ciclo

claro/escuro de 12h (CTL); Ratas virgens controle de ciclo claro/escuro de 12h com reposição de melatonina na água de beber (CTL+MEL), luz contínua (LUZ) e ciclo claro/escuro com reposição de melatonina na água de beber (LUZ+MEL) por 6 dias. Ao final deste período os animais foram sacrificados e o soro foi usado para dosagem. p<0,05 vs. CTL.

Com relação aos parâmetros hipotalâmicos, as expressões de CRH e POMC também não foram moduladas nos grupos neste ZT10 (Figura 21).

Figura 21. Expressão gênica CRH e POMC: Ratas virgens controle de ciclo

claro/escuro de 12h (CTL); Ratas virgens controle de ciclo claro/escuro de 12h com reposição de melatonina na água de beber (CTL+MEL), luz contínua (LUZ) e ciclo claro/escuro com reposição de melatonina na água de beber (LUZ+MEL) por 6 dias. Ao final deste período os animais foram sacrificados e o hipotálamo foi removido e usado para determinação do mRNA da Star por RT-PCR.

Com relação a expressão da enzima Star na adrenal, este parâmetro não foi modulado pelo fator ciclo de luz nem pelo fator tratamento com melatonina no ZT 10. Em relação a expressão de LDL-R na adrenal, o fator tratamento com melatonina reduziu a expressão deste gene (p=0,047). Esta redução foi exclusiva para aqueles animais expostos à luz contínua (p= 0,010). A luz, entretanto, aumentou a expressão do LDL-R (p=0,012) (Figura 22).

Figura 22. Expressão gênica LDL-R e STAR: Ratas virgens controle de ciclo

claro/escuro de 12h (CTL); Ratas virgens controle de ciclo claro/escuro de 12h com reposição de melatonina na água de beber (CTL+MEL) luz contínua (LUZ) e ciclo claro/escuro com reposição de melatonina na água de beber (LUZ+MEL) por 6 dias. Ao final deste período os animais foram sacrificados, a glândula adrenal foi removida e usada para determinação do mRNA da Star por RT-PCR. * p<0,05 vs. CTL.

A

B

6. Discussão

A melatonina materna possui grande importância no transcorrer gestacional. Varcoe et al, demonstraram que ratos nascidos de mães que foram submetidas a um crônico retardo de fase de iluminação durante a gestação apresentam resistência a insulina quando adultos[38]_{. A retirada da}

glândula pineal por meio cirúrgico desencadeia a ausência de pico noturno na prole análoga a genitora pinealectomizada nas primeiras semanas de vida e também acarreta diminuição da secreção de insulina pelas ilhotas pancreáticas na prole adulta [49]

Sabendo que a melatonina é fundamental para sincronização da prole no ambiente intrauterino e a ausência da glândula gera repercussões metabólicas na prole, principalmente no que diz respeito a intolerância a glicose, buscamos estudar se a exposição à luz contínua geraria alterações metabólicas na prole análogas à pinealectomia. Uma vez que já são descritos os efeitos deletérios de trabalhos em turnos ou hábitos de vida noturna. Pan e colaboradores, demonstraram aumento no risco de desenvolver Diabetes Mellitus Tipo 2 em mulheres que trabalham ao menos por dez anos em turno invertido [51]_.

Nosso grupo, em 2014, demonstrou que a ausência de melatonina materna, durante a gestação e a lactação, programa intolerância à glicose na prole por dois mecanismos: resistência hepática à insulina e diminuição da secreção de insulina pelas ilhotas pancreáticas [49]_.

Esses dados revelaram ainda um papel desconhecido da melatonina na fisiologia animal, podendo desequilibrar a homeostasia da glicose na prole quando há qualquer dessincronização frente ao ciclo claro/escuro, como os trabalhos em turnos.

Visando a resposta para pergunta anteriormente gerada, propusemos o modelo de exposição à luz contínua durante o transcorrer gestacional e os primeiros 10 dias da lactação, para posterior estudo

metabólico da prole e constatação se há analogamente à pinealectomia, programação na prole.

Ocorre que, a exposição à luz contínua, diferentemente da pinealectomia reduz a melatonina em cerca de 50%, o que segundo nossos dados é suficiente para não gerar programação metabólica persistente na prole adulta. Essa redução coaduna com a literatura. O grupo coordenado por Torres-Farfan, demonstrou que a exposição de ratas à ciclos claro/escuro invertidos durante o transcorrer gestacional, promoveu diminuição na melatonina em proporções análogas a por nós encontrado [52]_.

A exposição à luz contínua diferentemente da pinealectomia altera a ingestão alimentar, fazendo com que os animais comam fora de fase, analogamente a outro trabalho realizado pelo nosso grupo, onde a inversão na fase alimentar programa a prole à intolerância a glicose, não havendo relação direta com a secreção de melatonina [53]_.

Nossos resultados demonstram que a exposição à luz contínua, programa a prole adulta de fêmeas na 16ª semana para intolerância à glicose. Este é, aliás, um fato que não é revertido pelo grupo que recebeu reposição de melatonina durante a gestação e a lactação.

Subsequentemente após realizar teste de intolerância à insulina e secreção estática de insulina pelas ilhotas pancreáticas, ficou demonstrado que os grupos apresentados não possuíam intolerância à insulina nem mesmo alterações na secreção de insulina pelas ilhotas pancreáticas, novamente indo de encontro ao que ocorre com a prole cuja mãe é pinealectomizada.

A análise de parâmetros bioquímicos maternos nos permitiu perceber uma evidente tendência na supressão do eixo HPA em ratas grávidas expostas a luz contínua, motivo pelo qual exploramos de forma a evidenciar quais fatores seriam preponderantes para a supressão do presente eixo, focando os estudos em ratas virgens.

Após a dosagem da coricosterona e evidente tendência de supressão em ratas grávidas, buscamos entender quais fatores, no transcorrer gestacional, poderiam estar causando essa supressão. Como o estado