DEFINIÇÕES E HISTÓRICO
Entende-se por enzima imobilizada, aquela física ou quimicamente associada a um suporte ou matriz, usualmente sólida, insolúvel em
água e inerte, que não seja essencial a sua atividade.
Objetivos da imobilização : 1- Reutizar a enzima
Histórico do Uso de Enzimas Imobilizadas
1916 - ocorreu a primeira utilização de enzima imobilizada (invertase em carvão vegetal) por Nelson e Griffin.
1960 - Katchalski introduziu os primeiros suportes úteis. 1978 - os processos com enzimas imobilizadas também têm
utilização industrial em larga escala - aminoacilase imobilizada em DEAE–Sephadex para produção L-aminoácidos.
Maior uso de enzimas imobilizadas é na produção de xaropes de frutose através da glicose-isomerase imobilizada é realizada em grande escala nos Estados Unidos
Resolução de Misturas Racêmicas de Aminoácidos
aminoacilase - tanto L como D-aminoácidos são completamente
convertidos a L-aminoácidos.
Produção de Ácido 6-Aminopenicilâmico (6-APA)
peniclina amidase e suporte bentonita entrecruzada .
Produção de leites e soros deslactosados
lactase imobilizada em fibras de acetato de celulose ou vidro poroso
ativado.
Produção de xaropes de frutose a partir de glicose
glicose isomerase utilizando como suporte proteínas entrecruzadas ou
USOS EM ESCALA INDUSTRIAL DAS ENZIMAS
IMOBILIZADAS
Vantagens e Desvantagens
Vantagens Desvantagens
Desenvolvimento de sistemas contínuos
Custo adicional de suportes, reagentes e da operação de imobilização
Maior estabilidade enzimática Perdas de atividade durante a imobilização
Uso mais eficiente do catalisador através de reutilizações
Possíveis exigências adicionais de purificação do catalisador
Flexibilidade no projeto de reatores Técnica pouco adequada a substratos insolúveis ou de alto peso molecular Efluentes livres de catalisadores Maiores riscos de contaminação na
operação contínua dos reatores Maior versatilidade na etapa de
separação
Restrições difusionais e impedimento estéreo
Menor custo de mão de obra
Facilidade de Automação e controle Possibilidade de utilização das
ESCOLHA DE MÉTODOS E DO SUPORTE DE
IMOBILIZAÇÃO
Dependerá das características da enzima e das condições de uso da enzima imobilizada.
Para uma escolha econômica do método de imobilização é necessário
o conhecimento da reação desejada, o processo de aplicação da
enzima imobilizada, condições do meio, modificações causadas na estabilidade, atividade, pH e demais fatores.
O binômio suporte–método mais adequado será aquele que propiciar uma maior atividade após imobilização.
Atividade da esterase de Bacillus subtilis imobilizada em
vários suportes e por diferentes métodos
SUPORTE MÉTODO POROS
(A) UI/g
Acetato de celulose Microencapsulamento 0,02 45
Poliacrilamida Microencapsulamento 2,5 50
Pérolas de vidro Ligação covalente 0,2-1,0 200
DEAE-Sephadex A25
Adsorção 0,1 650
Dowex 1X1 Adsorção 0,4 820
Suportes de Imobilização
Os suportes podem ser orgânicos ou inorgânicos, sintéticos ou naturais.
Suportes necessitam de mudanças ou inclusão de grupos reativos – ativação
do suporte.
Classificação dos suportes utilizados na Imobilização de Enzimas
TIPO DE SUPORTE
MATERIAIS POROSIDADE ESTABILIDADE
Não poroso Vidro, sílica, aço - Alta
Microencapsulado Triacetato de celulose 35 A Moderada Entrelaçado Poliacrilamida, PVP Variada Baixa Macroporoso Alumina, sílica 200-1000 A alta
Tipos de Suporte para Imobilização
Vidro Poliacrilamida Alumina sílica tela de nylon Fibra de casca de cocoCritérios para avaliação de um sistema
enzima-suporte
Estabilidade de fixação
a enzima deve estar bem fixa ao suporte.Estabilidade enzimática
a enzima não deve sofrer modificações como desnaturação.Resistência mecânica
o suporte deve resistir a várias condições desfavoráveis como, o peso do suporte dentro do reator.Capacidade de carga
o suporte deve fixar um número elevado de unidades enzimáticas por unidade de área - um pequeno reatorPor Oclusão ou Aprisionamento - encapsulamento
Oclusão em matrizes: Podem ser géis (amido, borracha, nylon,
poliacrilamida, sílica, alginato de cálcio, agarose, polietileno glicol) ou fibras. Nos géis ocorre o aprisionamento da enzima nos espaços
intersticiais da rede polimérica (enzima confinada no interior de micelas), enquanto que nas fibras o aprisionamento se dá nas micro-cavidades.
Métodos de Imobilização da enzima por encapsulamento em gel de ágar
Microencapsulamento:
A enzima é oclusa em membranas poliméricas de porosidade de
300 µm (celulose, policarbonato, colágeno, politereftalato,
polímeros em geral), semi-permeáveis esféricas de pequeno
diâmetro.
Reticulação ou Ligação Cruzada
Método que envolve o uso de agentes bifuncionais ou multi-funcionais, em geral diaminas alifáticas (di-isocianato) ou glutaraldeído, que induzem a auto-reticulação das enzimas, resultando assim na formação de uma rede tridimensional de moléculas de enzima
Ligação Covalente
A ligação covalente se dá pela reação de grupos reativos do suporte, matrizes como vidro, cerâmica, polímeros sintéticos, celulose, nylon e alumina, ativado ou não, com os grupos funcionais da enzima ligação de grupos - NH2, -COOH, -OH, -SH, entre outros, preferencialmente em
condições fisiológicas brandas, baixa temperatura, baixa força iônica, pH ótimo e muitas vezes na presença do substrato, a fim de proteger o sítio ativo da enzima evitando que haja diminuição da atividade da mesma
Adsorção Física
Utiliza força de Van der Waals; método simples que se baseia na adsorção física em superfícies sólidas, como alumina, carvão, argila, sílica gel, colágeno, vidro, por ligações iônicas, polares ou de Van der Waals.
Ligação Iônica
Ligação de grupos com cargas opostas através de forças eletrostáticas. Processo simples, suave e não deletério para a maioria das enzimas, sendo inclusive desprezíveis os efeitos difusionais.
Ligação Metálica
Forma quelatos pela ativação da superfície do suporte por meio do metal ou por seu óxido.
Nos dois primeiros métodos por adsorção, as forças são fracas levando a pequenas modificações conformacionais na enzima e, conseqüente, possibilidade de
dissolução da mesma (perda).
Imobilização de -amilase por adsorção física em carvão de casca de coco
EFEITOS CAUSADOS PELA IMOBILIZAÇÃO
Retenção da Atividade Enzimática
- algumas moléculas enzimáticas podem estar imobilizadas em uma configuração que impede completamente o acesso do substrato ao centro ativo;
- o grupo reativo do centro ativo pode estar envolvido a ligação ao suporte (a proteção do sítio ativo da enzima através de um inibidor reversível durante a ligação pode resultar em aumento na retenção da atividade;
- moléculas da enzima podem ter se ligado em uma configuração que as torne inativas;
- as condições de reação no processo de imobilização podem causar desnaturação ou inativação.
Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase na forma solúvel e imobilizada em três diferentes suportes (alginato de cálcio, quitina e polietileno ativado, respectivamente)
PARÃMETRO INVERTASE SOLÚVEL INVERTASE IMOBILIZADA
Km 26,0 mM 8,1 mM 52,2 mM 32,2 mM Vmáx 1,10 U 0,25 U 0,74 U 0,32 U pH
(para atividade máxima)
4,6 4,6 4,0 4,6 pH (maior estabilidade) 4,0-4,6 4,5 – 6,5 5,0 – 6,0 4,6 T
(para atividade máxima)
55-60 C 60 C 60 C 70C T (maior estabilidade) 25-37 C 45-50 C 25-40 C 25-40 C Ea (energia de ativação a 37C) 27,8 kJ/mol 24,4 kJ/mol 51,9 kJ/mol 37,5 kJ/mol H (variação de entalpia a 37C) 25,2 kJ/mol 21,9 kJ/mol 49,3 kJ/mol 34,9 kJ/mol G -13,6 kJ/mol -13,9 kJ/mol
Efeitos Difusionais
Quando a enzima é imobilizada, o substrato tem que difundir na
solução através de um filme líquido estacionário presente nas
superfícies do suporte e, se este é poroso, através dos poros
até alcançar o sitio ativo das enzimas - pode restringir a taxa de
reação
velocidade de difusão do substrato < velocidade de
transformação pela enzima
Vmáx mais baixa
Resistência Difusional Externa
Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser transportado do seio da solução até a superfície de catalise, devendo, por conseguinte
atravessar uma camada líquida, assim o consumo de substrato através da membrana líquida pode ser imaginado como resultado de
um gradiente.
A difusão do substrato e produtos dos centros ativos para a solução (ou vice-versa) ocorre através de mecanismos de difusão molecular e
convectiva.
Os efeitos de difusão externa afetarão o transporte de massa e podem ser minimizados tanto pelo aumento da agitação, caso de reatores continuamente agitados (CSTR), quanto pelo aumento do fluxo de
substrato, caso do reator pistonado (PFR).
Efeitos Microambientais
A enzima ao ser imobilizada passa a ser circundada por um ambiente diferente do que quando estava livre, especialmente se a matriz ou suporte possui carga. Os efeitos de circunvizinhança, que dependem da natureza física e química do suporte, podem acarretar uma distribuição desigual do substrato, produtos e cofatores entre a região vizinha ao sistema imobilizado e o resto da solução.
Efeitos Estereoespecíficos
Existem situações onde a atividade da enzima frente a um substrato com elevado peso molecular é reduzida durante o processo de imobilização, de uma forma mais extensa que frente a um
substrato com menor peso molecular - resultado de
impedimento estéreo, formado pelo suporte, ao acesso de moléculas grandes ao centro ativo da enzima (impedimento estérico).
