VOVED
Kampilobakterite go koloniziraat gast rointestinalniot trakt na golem broj doma{ni i divi `ivotni, vklu~uvaj}i gi tu ka i onie koi se odgleduvaat za ~ove~ka ishrana, {to igra centralna uloga vo pre-ne suvaweto na ovie mikroorganizmi kaj lu|eto[1, 2]. Kako glaven rezervoar na
in-fek cija za lu|eto so humanite enteropato geni kampilobakteri se naveduva `i -vinata, no vo pove}e studii e poso~eno deka i gastrointestinalniot trakt na ostanatite `ivotni e koloniziran so ovie mikroorganizmi.
Sviwite so kampilobakteri se kolo-niziraat vedna{ posle ra|aweto [3, 4] i ostanuvaat kolonizirani vo tekot na ce-liot svoj `ivot[5]. Tie od najrana vozrast ABSTRAKT
Termotolerantnite kampilobakteri se naj~estite bakteriski pri~initeli na humaniot infektiven
gastroen-terit vo celiot svet. Pritoa, naj~esto izolirani vidovi seCampylobacter jejuni i C. coli, dodeka vo pomal procent i
C. upsaliensis iC. lari. Kako predizvikuva~ na human enterit poso~en e i C. hyointestinalis, koj ne pripa|a na ovaa grupa kampilobakteri. Priroden rezervoar za navedenite kampilobakteri e intestinalniot trakt na golem broj cica~i i ptici, vklu ~u vaj }i gi tuka i doma{nite `ivotni. Kaj niv ovie bakterii naj~esto se nao|aat kako komensali a ni-vniot feces pretstavuva primaren izvor za kontaminacija na nadvore{nata sredina. Za razlika od fecesot kaj
lu|eto, koj voobi~aeno se ispituva pri pojava na proliv, termotolerantnite kampilobakteri i C. hyointestinalisvo
fe-cesot na `ivotnite naj~esto se prisutni vo mnogu pomala koli ~i na poradi {to i izolacijata mo`e da bide ne-uspe{na.
Celta na ova istra`uvawe be{e da se proceni validnosta na primenetata procedura za izolacija (i
identifi-kacija) na termotolerantnite kampilobakteri i C. hyo in testinalisod rektalni brisevi od sviwi, kako procedura za
de-tektirawe na kliconositelstvo kaj zdravi `ivotni.
Klu~ni zborovi:Termotolerantni kampilobakteri, Campylobacter hyointestinalis, izolacija, identifikacija.
IZOLACIJA NA TERMOTOLERANTNI KAMPILOBAKTERI I
C. hyointestinalis
OD REKTALNI BRISEVI KAJ ZDRAVI SVIWI
Mreno{ki, S.1, Marki}, Z.1, Prodanov, R.2, Sekulovski, P.3
1Katedra za mikrobiologija i imunologija, Fakultet za veterinarna medicina - Skopje 2Katedra za ishrana,Fakultet za veterinarna medicina - Skopje
3Katedra za bezbednost na hrana, Fakultet za veterinarna medicina - Skopje
E-mail: mrenoski@fvm.ukim.edu.mk
go izla ~u vaat kampilobakter vo svojata okolina [3], a farmite na koi se odgledu-vaat pretstavuodgledu-vaat izvor za infekcija na drugite `ivotni, kako i okolnata sredina i lu|eto.
Postojat standardni proceduri propi -{a ni od Me|unarodnata organizacija za stan dardi (ISO) koi se odnesuvaat na de-tekcija na termotolerantnite kampilo-bakteri vo hrana i sto~na hrana [6, 7],kako i voda (ISO/CD 17995:2002),no nitu edna od niv ne e optimalna za izolacija na kampi-lobakterite od `ivi `ivotni [8]. Osven
ISO, preporaki za izolacija i identifi-kacija na kam pilobakterite se dadeni i od strana na oficijalnite tela na poedini dr`avi[9, 10]. Sepak, najkompletnata pro-cedura koja mo`e da se upotrebi vo dija-gnostikata na mostrite od veterinarno poteklo, dadena e od strana na Svetskata organizacija za zdravjeto na `ivotnite (OIE)vo svojot OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[8].
Denes postojat pove}e podlogi koi se koristat za izolacija na termotolerant-nite kampilobakteri i pogolemiot del od niv se komercijalno dostapni [8, 10]. Pri-meri za selektivni bujoni koi slu`at za zbogatuvawe se Preston, Exeter, Bolton, Cam-pylobacter enrichment broth (CEB), CCDB (char coal cefoperazone deoxycholate broth) i
Park and Sanders bujonot, a primeri za se-lektivni agari na koi se vr{i izolacija se Skirrow, Campy-Cefex, Preston, Butzler i
Exeteragar (koi sodr`at krv) i modifici-ran Charcoal Cefoperazone Deoxycholateagar (mCCDA) i Karmali agarot (koi sodr`at
charcoal).
Koga se koristat selektivnite po-dlogi, mo`e da se upotrebat dve razli~ni proceduri na inokulacija, {to zavisi od tipot na mostrata [8, 10].Direktno zasadu-vawe na agar se aplicira koga se ispituvaat
mostri na koi ne im treba zbo gatuvawe, kako {to se fekalnite i intestinalite odn. cekalni mostri od `ivinata ili fe-cesot od lu|e so klini~ka slika na infek-cija. Primarno zbogatuvawe vo te~na podloga i posledovatelno subkultivi-rawe na agar se prepora~uva koga kampi-lobakterite se podlo`eni na deluvaweto na stresnite faktorite od nad vo re{ na ta sredina (na primer koga mostrata e feka-len bris) ili koga se raboti za nisko nivo na mikroorganizmi vo fecesot ({to e slu~aj i so fecesot od govedata, ovcite i sviwite) [8, 11].
Za optimalen rast na kampilobakte-rite e neophodna mikroaerofilna atmos-fera ko ja sodr`i 5-10% O2 i 5-10% SO2
[12, 13]. Ovaa koncentracija na gasovi mo`e da se obezbedi na pove}e na~ini no kako najednostaven e so inkubirawe na po-dlogite vo lonci zaedno so komercijalno dostapni ke si~ ki specijalno nameneti za izolacija na ovie bakterii (gas generator kitovi - Anaerocult C [Merck],Gas Generating Kit for Campylobacter [Oxoid]). Mikroaero-filnata at mo sfera e neophodna samo koga se inkubira inokuliraniot agar, {to ne e slu~aj i koga se vr{i zbogatuvawe. Pri zbogatuvawe, bujonite se razlevaat vo ep -ru veti ili boci so zatvora~i, vo koli~ina koja obezbeduva prostorot po me |u po vr -{i nata na bujonot i zatvara~ot da bide pomal od 2 cm [8].
Inokuliranite podlogi mo`at da se inkubiraat na dve temperaturi - 37oS ili
42oS [8]. Vtorata se koristi po~esto, kako
bi se minimiziral rastot na kontamina-ntite i selektiral optimalniot rast na
C. jejuniiC. coli. No so inkubacija na 37oS
mo`e da se podobri rastot na drugite kam-pilobakteri (C. lari, C. upsaliensis, C. helve-ticus, C. fetus iC. hyointestinalis)[8].
24 do 48 ~asa i presaduvaat na selektivni -ot agar. I toj se inkubira kako i bujon-ot, bi dej }i za 24 do 48 ~asa na tem peratura od 42oS, voobi~aeno rastat dvata naj~esto
izolirani kampilobakteri - C. jejunii C. coli[8].
Identifikacijata na izolatite se spro-veduva na dve nivoa - prvo se vr{i iden ti-fikacija na rodot (genus), odnosno se potvr duva deka izolatite se pripadni ci na rodotCampylobacter, za potoa da se od -redi vidot (species) na koi tie mu pri pa -|aat. Naj {iroko prifaten priod za identi fikacija (konfirmacija i di fe-ren cirawe) na kampilobakterite e baziran na klasi~nite fenotipski karak te ris ti -ki, koi gi opfa}aat podatocite dobieni od karakteristikite za rastot i morfo-logijata na koloniite, kle to~ nite karak-teristiki i biohemiskite testovi [7, 8, 10, 14], vklu~uvaj}i ja tuka i oset livosta/re-zistencijata na odredeni antimikrobni supstanci.
CEL
Celta na ova istra`uvawe be{e da se proceni validnosta na primenetata pro-cedura za izolacija (i identifikacija) na termotolerantnite kampilobakteri i C. hyoin testinalisod rektalni brisevi od svi -wi, kako procedura za detektirawe na kli conositelstvo kaj zdravite `ivotni so mala koli~ina na kampilobakteri vo svo-jot digestiven trakt.
MATERIJALI I METODI
Mostri vo istra`uvaweto bea rek-talni brisevi zemeni od 236 `ivotni, so poteklo od 4 sviwarski farmi na
terito-rijata na Republika Makedonija. Mo-strite se zemaa od 3 razli~ni proizvodni fazi(prasili{te, odgleduvali{te i tov), pri {to bea opfateni 4 proizvodni kate-goriina `ivotni (majki, prasiwa vo pra-sili{te, prasiwa vo odgleduvali{te i tovni sviwi. Za zemawe na mostrite, bea koristeni sterilni, poedine~no pakuvani plasti~ni brisevi koi vedna{ posle ze-maweto se transportiraa do bakterio -lo{ kata laboratorija pri Fakultetot za veterinarna medicina vo Skopje, kade se zasaduvaa istiot den (3-4 ~asa od zema-weto).
Za izolacija i dobivaweto na ~isti kulturi se koristea tri podlogi:Preston
bujon (Oxoid), Kampilobakter selektiven agar bez krv (modificiran Charcoal Cefo-perazone, Deoxycholate agar [mCCDA] - Pre-ston, Oxoid) iColumbia krven agar (Oxoid). Brisevite, so skrateni dr{ki po asep ti~ -na postapka, se stavaa vo epruvetkite so
Prestonbujon. Is ti te se zatvaraa so gumeni zatvara~i koi se fiksiraa so lepliva traka i inkubiraa vo aerobni uslovi, na temperatura od 42oS, vo traewe od 24 ~asa.
Posle selektivnoto zbogatuvawe, sekoj bujon se subkultivira{e so razreduvawe na posebna plo~a mCCDA, so cel da se do-bijat poedni~ni kolonii na termotole-rantni kampilobakteri. Plo~ite se inkubiraa vo plasti~ni sadovi (BBL Gas Pak, Anaerobic Systems), vo koi mikroaero-filnata atmosfera (8-10% O2 i 5-7% SO2) se sozdava{e so Anaerocult C (Merck). Inkubacijata na plo~ite be{e na tempe-ratura od 37oS, vo vremetraewe od 48 ~asa.
razreduvawe na krven agar za da se dobijat vo ~isti kulturi. Krvniot agar potoa se zasaduva{e pod isti uslovi kako i plo -~ite so mCCDAkaj primarnata izolacija.
So dobienite ~isti kulturi, se izve-duvaa trite t.n. pozitivni testovi za rodot Campylobacter: Grampreparat, vla -`en preparat i oksidaza test (Bactident oxi-dase, Merck). Soevite koi bea pozitivni na site tri testa (Gram-negativni spiralni ili izvitkani stap~iwa, so karakteri-sti~na podvi`nost vo vid na svrdel i po-zitivna produkcija na oksidaza), bea pro glasuvani za pripadnici na rodot Cam-pylobacter i bea identificirani do nivo na vid.
So sekoj od identifikuvanite soevi na nivo na rod, se izvr{uvaa slednite te-stovi za identifikacija na vidot:
(1) tolerancija na temperatura (zasa-duvawe na krven agar i inkubacija vo mi-kroaerofilni uslovi na 3 razli~ni temperaturi: 25, 37 i 42oS);
(2) Rast vo normalna atmosfera (zasa-duvawe na krven agar i inkubacija vo mi-kroaerofilni uslovi na temperatura od 37oS);
(3) test za hidroliza na hipurati (te-stot se izveduva{e po procedurata pre-pora~ana od OIE [233]);
(4) indoksil acetat test (se izve-duva{e so komercijalno proizvedeni in-doksil stripovi [Indoxyl Strips, Fluka, Sigma-Aldrich];
(5) ispituvawe osetlivost/rezisten-cija na cefalotin (KF30)i nalidiksi~na kiselina(NA30);zonite na inhibicija koi se koristea za interpretacija na rezulta-tite izrazeni vo mmbea za cefalotinot
R≤14i S≥18 odn. za nalidiksi~nata kise-lina R≤13iS≥19(R=rezistentno, S =oset-livo a vrednostite pome|u dvete navedeni bea zabele `u va ni kako I=intermedijarni);
(6) produkcija na H2Svo TSIagar i ka-talaza test.
Identifikacijata na pripadnosta na vidot, be{e vr{ena spored sovpa|aweto na detektiranite fenotipski karakteri-stiki na izolatot, so podatocite dadeni vo Tabelata 1.
REZULTATI
Od vkupno 236 zemeni i ispitani mo-stri, Campylobacter spp. be{e izoliran od 222, ili procentualno od 94% `ivotni.
Kaj pozitivnite `ivotni, bea identi-fikuvani trite termotolerantni kampi-lobakteri za koi kako nositel se poso~uva sviwata - C. coli, C. jejuni i C. lari. Osven niv, izoliran e i u{te eden vid na kampi-lobakter predizvikuva~ na humani ente-riti - C. hyointestinalis, koj ne spa|a vo prethodno navedenata grupa.
Pri diferencirawe na vidot kampi-lobakter, na nalidiksi~nata kiselina bea rezistentni 85,1% od izolatite na C. colii 78,6% od izolatite na C. jejuni. Osetlivost na cefalotin, od termotolerantnite kam-pilobakteri iska`aa samo 4% od izola-tite na C. coli. Od vkupniot broj na izo lirani soevi C. hyointestinalis, na cefa-lotin bea rezistentni 18,2%.
DISKUSIJA
Kaj `ivi `ivotni, istra`uvawata na
Osven toa, postojat podatoci za detekcija na C. jejuniod `ivotinski mostri [15]kade izolacijata od rektalni brisevi bila pou-spe{na od most ri te na feces. So ogled na navedenoto, rektalnite brisevi (kloa-kalni kaj `ivinata) se nametnuvaat kako poednostavno i zadovolitelno re{enie koga treba da se vr{at istra `u vawa na `ivi `ivotni. Tie se i pre pora~ani kako mostra i od OIE odn. WHO [8, 11] a kori-steni se i vo pove}e is tra `uvawa vr{eni kaj sviwite[2, 4, 16, 17, 18].
Poradi izrazenata osetlivost na vli-janieto na faktorite na nadvore{nata sre-dina, se prepora~uva transportot na most rite do laboratorijata da bide vo transpor ten medium i soodvetni uslovi (za{titeni od deluvawe na kislorod i son~eva svetlina, i na temperatura od 0 do 20oS) [8]. Kako u{te eden faktor koj e
poso~en za uspe{na izolacija, e i krat-kiot vremenski interval od zemaweto na mostrite do zasaduvaweto, koj vo studijata na Weijtensi sor. [19]iznesuval 3 ~asa i koj
Kolo-nii
Biohemiski testovi
Rast na krven agar vo razli~ni inkubacioni uslovi Osetli- vost na antibiotici Vid na kampilobakter G olemi
na na ko
lonii (vo mm ) Kat alaz a Indoksil acet at
Hidroliza na hipurat
i H2 S vo TS I 25
oS, mikroaero
f
ilni
u
slovi
37
oS, mikroaero
f
ilni
u
slovi
37
oS, nor
m a lna at m o sf e r a 37
oS, anaerobni
usl
ov
i
42
oS, mikroaero
f ilni uslov i C e falotin Nalidiksi~na kiselina
C. mucosalis 1,5 - - - +c - + N.D. + + S Rm
C. sputorum
biovar sputorum 1-2 - - - +
c - + N.D. + + S Rm
C. coli 1-2 + + - (-)b - + - - + R S
C. jejuni subsp. jejuni
1-2 + + + - - + - - + R S
C. hyointestinalis
subsp. hyointestinalis + - - (+)
b (+) + - - + V,Sf R
C. hyointestinalis subsp. lawsonii
Mnogu sitni do 1,5
+ - - (+)c - + N.D. + + S R
C. lanienae 0,5 + - - - - + N.D. +f + R R
C. lari 1-1,5 + - - - - + - - + R Sf
Tabela 1. Fenotipski karakteristiki na kampilobakterite koi mo`at da bidat izolirani od sviwi, a spored koi e vr{ena identifikacija na vidot na izoliranite soevi.
+, 95-100% soevi pozitivni; (+), 60-93% soevi pozitivni; (-), 14-50% soevi pozitivni; -, 0-11% soevi
pozitivni; b, koli~ini vo tragovi; c, vo obilna koli~ina;+f, rezultatite se slabo pozitivni; S, 89-100%
soevi osetlivi; Sf, pove}eto soevi (50-86%) osetlivi; R, 95-100% soevi rezistentni; Rm, 60-93% soevi
dovel do podobri rezultati komparirani so drugi studii kade mostrite bile pra-teni po po{ta [2]. Vo ova istra`uvawe, od site navedeni uslovi ne be{e ispolnet samo eden, koj se smeta kako najva`en, a toa e transportot na brisevite da bide vo transporten medium. No zatoa, vremeto od zemaweto na prviot bris na fra ma pa do zasaduvaweto na posledniot vo laborato-rija, iznesuva{e 3 do 4 sati {to za vi se{e od oddale~enosta na farmata od labora-torijata.
Od dvete proceduri na inokulacija (so direktno zasaduvawe na agar ili so zboga-tuvawe vo te~na podloga i posledovatelno subkultivirawe na agar), vo ova istra `u -va we e koristena vtorata, iako postojat naodi vo korist na prvata procedura koga se raboti za izolacija na kampilobakteri od dolnite delovi na gastrointestina-lniot trakt kaj sviwite [20]. Glavna pri~ina za toa e {to vo preporakite na
OIE [36], WHO [10]i upatstvoto za labora-toriite koi izoliraat kampilobakteri vo Nov Zeland [8], zbo ga tuvaweto se prepora~uva koga kampilobakterite se pod -lo `eni na deluvaweto na stresnite fak torite od nadvore{nata sredina (na pr. koga mostrata e fekalen bris) ili koga se raboti za veterinarni mostri, so nisko nivo na mikoorganizmi vo fecesot ({to e slu~aj i so fecesot od sviwite).
Kako {to e prethodno navedeno posto-jat pove}e razli~ni podlogi, bilo te~ni bilo cvrsti, koi mo`at da se koristat vo izolacijata na kampilobakteri. Ne po-stoi nekoe pravilo koi od ovie podlogi, nitu koja kombinacija, da se koristi koga se izoliraat termotolerantnite kampi-lobakteri za koi i se dizajnirani pogole-miot del od niv. Izborot na Prestonbujon i
mCCDAagarot vo ovaa studija, be{e od dve pri~ini. Prvata e deka i dvete podlogi
odvoeno se koristeni vo pove}e istra `u -va wa so sviwi [2, 4, 17]ili drugi `ivotni i lu|e [21, 22, 23, 24),a tokmu ovaa kombi-nacija ja koristea i Van LoovereniAarestrup [25, 26] vo svoite studii so mostri od sviwi. Vtorata pri~ina e {to vo nekoi komparativni ispituvawa [27, 28]na po ve -}e agari koi se koristat za izolacija na kampilobakterite (cefoperazone-amphotericin-teicoplanin [CAT] agar, Skirrow’s agar, Butzler
agar), mCCDA dal podobri rezultati odn. pogolem procent na izolacija. Dobriot izbor na podlogi za ovaa studija, pokraj visokiot procent na izolacija, go potvrdi i faktot {to tie poka`aa dobra selek-tivnost, so ogled na toa {to od vkupno za-sadenite 236 mostri samo na 25 plo~i (10.6%) bea detektirani kontaminenti.
Inkubacionite uslovi (temperatura, atmosfera i vreme), koi bea koristeni vo ovaa studija, bea vo odnos na peporakite na proizveduva~ot na podlogite (Oxoid). Iako mo`e da se koristi i mikroaero-filna atmosfera za inkubacija na bujo-nite [2], so nivna pravilna priprema (ostavawe na prazen prostor od 1 do 2 cm
nad povr{inata na bujonot) mo`e da se iz-begne koristeweto na gas-generator kito-vite [8] i so toa nepotrebnite tro{oci za nabavka na istite. Za razlika od bujonite, vo site referenci kade e vr{ena izola-cija na kampilobakteri na agar, koristena e mikroaerofilna atmosfera koja naj~esto e sozda vana od komercijalno dostapni gas-ge nerator kitovi, specijalno dizajnirani za ovie mikroorganizmi. Eden od selek-cionite uslovi za izolacija na ter mo -tolerantnite kampilobakteri (pokraj upo trebata na selektivnite podlogi) e i koristeweto na tem pe raturata od 42 oS vo
proizvoditelot (Oxoid), a koi se razliku-vaa od prethodnio navedenoto vo odnos na inkubacionata temperatura kaj mCCDA. Imeno, proizvoditelot prepora~uva plo -~i te so mCCDA da se inkubiraat na 37oS,
{to i e praktikuvano vo nekoi studii [17, 23], a so obrazlo`enie deka na toj na~in se podobruva procentot na izolacija. Bi dej }i vo ova istra`uvawe ne e vr{ena kompara-cija na dvete inkubacioni tem peraturi, ne mo`e nitu da se potvrdi nitu da se negira ova tvrdewe. Samo mo`e da se {pekulira deka temperaturata od 37oS dava
zadovo-litelni rezultati, so ogled na visokiot procent na izolacija koj e dobien vo stu-dijava. Isto taka, mislewe na avtorot na ovaa studija e deka koristeweto na tempe-raturata od 37oS ima druga prednost, a toa
e podobruvawe na izolacijata na kampilo-bakterite koi ne spa|aat vo grupata na termotolerantni (vo ovoj slu~aj toa e C. hyo in testinalis, koj is ka `u va podobar rast na 37oS otkolku na 42oS).
Identifikacijata na kampilobakte-rite, kako i kaj site bakterii, zapo~nuva u{te pri primarnata izolacija odn. vrz osnova na izgledot na koloniite. Opisot na izgledot na kolonii kaj termotole-rantnite kampilobakteri, koj treba da po-mogne vo prepoznavaweto na ovie mikroorganizmi na mCCDA, e daden vo pove}e referenci [8, 10, 29, 30, 31], pri {to nekade e opi{an i poedine~en izgled na koloniite na C. coli, C. jejunii C. lari. Za-pazuvaweto na avtorot na ovaa studija e deka izgledot na koloniite mo`e da upati samo na pripadnost na grupata na termo-tolerantni kampilobakteri, no ne i na poedine~niot vid. Toa proizleguva od faktot {to pri primarnata izolacija na
mCCDA, bea zabele`ani razli~ni mor-folo{ki karakteristiki na koloniite kaj pogolemiot broj na izolati, duri i
koga tie pripa|ale na ist vid. Poradi va-kvoto varirawe vo kolonijalniot izgled, sledeni bea preporakite za simultano presaduvawe na site kolonijalni tipovi prisutni na plo~ite so primarna izola-cija [31], od {to i proizleze da se subkul-tiviraat po 1, 2 ili 3 kolonii od edna plo~a mCCDAna krven agar poradi dobi-vawe na ~isti kulturi. I tuka situacijata be{e ista, odn. vrz osnova na izgledot na koloniite ne mo`e{e da se pretpostavi za koj termotoleranten kamilobakter se ra-boti.
Za razlika od termotolerantnite kam-pilobakteri, koloniite na C. hyointestina-lis imaa jasno izrazen, pospor rast na
mCCDAi nivnite sitni kolonii (pomali od 1 mm), lesno mo`ea da se selektiraat od plo~ite kade bea prisutni. Vakov po-spor rast be{e zabele`an i na krvniot agar. Izolacijata na C. hyointestinalis, vsu{ -nost be{e i edno od iznenaduvawata vo ova istra`uvawe, so ogled na faktot {to pri-sustvoto na cefoprazonot vo primarnata podloga mo`e da go inhibira rastot na ovoj vid kampilobakter so negova neus -pe{ na izolacija na mCCDA[23]. Sprotiv no na prethodnite literaturni po datoci, istra`uvawata na Nielseni sor. [2]i Haen-nineni sor. [32], isto kako i ova ist ra `u -vawe poka`aa deka mCCDA go poddr`uva rastot na C. hyointestinalis.
Identifikacijata na pripadnosta na rodot, vo po~etokot be{e vr{ena so trite konfirmaciski testa propi{ani so ISO
pova`ni vo iden ti fikacijata na kampi-lobakterite otkolku Gram-reakcijata [31, 34]. Vakviot na~in na konfirmacija e praktikuvan i od drugi avtori [2, 21, 22, 25].
Za identifikacija na vidot, predvi-deni se mnogu testovi koi mo`at da se ko-ristat za taa namena. Naj~esto koristeni fenotipski karakteristiki, propi{ani od ISO standardot [6] i aplicirani vo golem broj na istra`uvawa [2, 17, 21, 22, 24, 25, 33, 35]bea i onie koristeni vo ovaa stu-dija (vidi Tabela 1). Koga se dobija rezul-tatite od ovie testirawa kaj site izolati, pri odreduvaweto na vidot se prime-nuva{e sledniot sistem. Najprvo se isfr-lija od predvid kampilobakterite za koi sviwite ne se doma}ini, taka da kako mo`ni kampilobakteri izolirani vo ovaa studija ostanaa 7 vidovi - C. coli, C. hyinte-stinalis (so dvata podvida C. hyiontestinalis subsp. hyiontestinalis i C. hyiontestinalis subsp. lawsonii), C. jejuni, C. lanienae, C. lari, C. mu-cosalisi biovarot C. sputorum b.v. sputorum
od vidot C. sputorum. I kaj ovie vidovi be{e primenet sistemot na eliminacija. Bidej}i site obraboteni izolati bea ka-talaza-pozitivni, vedna{ od predvid bea isfrleni C. mucosalisi biovarot C. sputo-rum b.v. sputorum koi se katalaza-nega-tivni. Site izolati koi bea pozitivni so testot za hidroliza na indoksil acetat, bea smetani kako C. coliili C. jejuni, a va-kvite izolati bea ponatamu klasifici-rani vo soodvetniot vid vo zavisnost od testot za hidroliza na hipurati - C. colie negativen, a najgolemiot del od izolatite na C. jejunise pozitivni. Indoksil acetat negativnite soevi, koi bea jasno pozi-tivni na produkcija na H2Svo TSIbea pro-glasuvani kako C. hyointestinalis, za na kraj da ostane dilemata dali indoksil acetat i H2Svo TSInegativnite soevi se C.
lanie-nae ili C. lari. Kako {to mo`e da se vidi od Tabelata 1, rezultatite od najgolemiot del od testovi se isti i za dvata vida so isklu~ok na rastot na 37oS vo anaerobni
uslovi, kade pove}eto soevi na C. laniaenae
se pozitivni a C. larie negativen. Bidej}i vo studijata kaj ovie izolati nema{e rast vo vakvi uslovi, a i koloniite bea so go-lemina od 1-2 mmposle 48 ~asa inkubacija (koloniite kajC. laniaenaese so golemina od 0,5 mm posle inkubacija od 72 ~asa), ovie izolati bea proglasuvani kako C. lari.
jejuni i C. lari se detektirani vo istra `u -va wa so izolati od goveda, `ivina, otpa-dni vodi i lu|e [39, 44, 45, 46, 47].I vo ovaa studija, mal del od izolatite na C. coli
poka`aa osetlivost na ovaa antimikrobna supstanca dodeka toa ne be{e detektirano kaj izolatite na drugite dva termotole-rantni kampilobakteri. Iako C. hyointe-stinalis generalno se smeta za osetliv na cefalotin, vo nekolku referenci ovaa ka-rakteristika se smeta kako varijabilna
[48, 49] odn. se referira deka pove}eto soevi se osetlivi [50, 51]. I rezultatite od vo ovaa studija se sovpadnaa so ovie po-datoci, bi dej }i pogolemiot del od izola-tite na C. hyointestinalis bea osetlivi na cefalotin, no sepak varijabilnosta se po-tvrdi so naodot na 4 rezistentni izolati na nivo na site farmi. Tie ja dadoa vred-nosta od 18,2% rezistentnost od vkupniot broj na izolirani soevi C. hyointestinalis, {to se sovpadna so procentot iznesen vo re vijalniot pregled na identifikacioni te metodi za kampilobakteri i dr. bakte rii na On [50], kade kako ce falotinre zis -tent ni se poso ~u vaat 18% od izolatite na ovoj vid. Poradi opi{anata varijabilnost kaj cefalotinot, kako bi se izbegnala in-ter ferencija vo prezentiraweto na re-zul tatite, i toj ne be{e striktno ko risten kako identifikacionen parame-tar vo ova istra`uvawe.
ZAKLU^OCI
1. Rektalnite brisevi se sosema zado-volitelna mostra za izolacija na kampi-lobakteri kaj sviwi.
2. Dokolku brisevite se zasadat vo kus vremenski interval od nivnoto zemawe, nema potreba od koristewe na transpor-ten medium.
3. Procedurata na izolacija so zboga-tuvawe, pri {to se koristat Preston bujo-not, mCCDA agarot i temperatura na primarna izolacija od 37oS, e soodvetna za
izolacija na termotolerantnite kampi-lobakteri prisutni kaj sviwite kako i C. hyointestinalis.
4. Od trite prepora~ani konfirmaci-ski testovi, vla`niot preparat i oksi-daza testot se dovolni za da se potvrdi pripadnosta na izolatot kon rodot Cam-pylobacter.
5. Na~inot za diferencirawe na vidot kampilobakter korisen vo ova ist ra `u va we, dava zadovolitelni rezultati vo sekojd-nevnata rutinska laboratoriska dijag noza i pri otsustvo na posofisticirana me-toda (pr. PCR).
LITERATURA
1. Gorkiewicz, G., Feierl, G., Zechner, R., Zechner and E.L. (2002). Transmission of Campylobacter hyointestinalis from a Pig to a Human. Journal Of Clinical Microbiology, Vol. 40, No. 7, p. 2601–2605.
2. Nielsen, E.M., Engberg J. and Madsen, M. (1997). Distri-bution of serotypes of Campylobacter jejuni and C. coli from Danish patiens, poultry, cattle and swine. FEMS Im-munology and Medical Microbiology. 19 (1997) 47-56 3. Harvey, R.B., Young, C.R., Ziprin, R.L., Hume, M.E.,
Ge-novese, K.J., Anderson, R.C., Droleskey, R.E., Stanker, L.H. and Nisbet, D.J. (1999). (1999). Prevalence of Cam-pylobacter spp isolated from the intestinal tract of pigs rai-sed in an integrated swine production system.,
215(11):1601-4.
4. Weijtens, M.J.B.M., van der Plas, J., Bijker, P.G.H., Ur-lings, H.A.P., Koster, D., van Logtestijn, J.G. and Huis in't Veld, J.H.J. (1997). The transmission of Campylobacter in piggeries; an epidemiological study. Journal of Applied Microbiology; 83, 693-698.
5. Alter, T., Gaull, F., Kasimir, S., Gürtler, M., Mielke, H., Linnebur, M. and Fehlhaber, K. (2005). Prevalences and transmission routes of Campylobacter spp. strains within multiple pig farms. Veterinary Microbiology, Volume 108, Issues 3-4, Pages 251-261
6. ISO International Standard 10272 (1995)+Technical Corri-gendum 1 and 2 (1997). Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for detection of ther-motolerant Campylobacter. International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Va1rembé, Case Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Swit-zerland
7. ISO/CD 10272-1 and 10272-2 (2002). Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection and enumeration of Campylobacter growing at 41,5 degrees Celsius. Part 1: Detection method; Part 2: Colony count technique. International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varembé, Case Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Swit-zerland.
8. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terre-strial Animals (2004). Ch. 2.10.8. Campylobacter jejuni and Campylobacter coli.
9. FDA BAM (1998). FDA Bacteriological Analytical Ma-nual. Chapter 7, Campylobacter, Hunt, J.M., Abeyta, C. and Tran, T. 8th edition (revision A), 23 pages.
10. Donnison, A. (2003). Isolation of Thermotolerant Campy-lobacter – Review & Methods for New Zeeland Laborato-ries.
11. Bolton, F.(E.). (2000). Methods for isolation of Campylo-bacters from humans, animals, food and water. In: WHO, Department of Communicable Disease Surveillance and Response. The Increasing Incidence of Human Campylo-ISOLATION OF THERMOTOLERANT CAMPYLOBACTERS AND
C. hyointestinalis FROM RECTAL SWABS OF HEALTHY PIGS
Mrenoski, S.1, Markic, Z.1, Prodanov, R.2, Sekulovski, P. 3
1Department of microbiology and immunology, Faculty of Veterinary Medicine Skopje 2Department of animal nutrition, Faculty of Veterinary Medicine Skopje
3Department of food safety, Faculty of Veterinary Medicine Skopje
E-mail: mrenoski@fvm.ukim.edu.mk
SUMMARY
Thermotolerant campylobacters are the most common bacterial etiological agents of human infectious gastroenteritis worldwide. The most frequent isolated species among them are Campylobacter jejuni and C. coli, and less frequent C. upsaliensis and C. lari. Also C. hyointestinalis, that not belong to the group of thermotolerant campylobacters, has been indicate as an agent of human infectious gas-troenteritis. Natural reservoir of all named campylobacters is the intestinal tract of many mammals and birds, including domestic ani-mals. In these animals, campylobacters are commonly present as commensals and their feces is considered as a prime source for environmental contamination. Unlike the human feces which is usually examined in the cases of diarrhea, thermotolerant campylobac-ters and C. hyointestinalis in the animal feces are generally present in a much lesser amount and the isolation very often could be un-successful.
The aim of this study was to estimate the validity of applied procedure for isolation (and identification) of thermotolerant campy-lobacters and C. hyointestinalis from pig rectal swabs, as a procedure for detection of healthy animal carriers.
bacteriosis. Report and Proccedings of a WHO Consulta-tion of Experts, Copenhagen, Denmark, 2000.
12. Corry, J.E.L., Post, D.E., Colin, P. and Laisney M.J. (1995). Culture media for the isolation of campylobacters. Int. J. Food Microbiol., 26, 43–76.
13. Vandamme, P. (2000). Taxonomy of the family Campylo-bacteraceae. In: Campylobacter, Second Edition, Nacham-kin I. & M.J. Blaser, eds. ASM Press, Washington DC, USA, 3–26.
14. Vandamme, P.A.R. (2000). Methods for identification of Campylobacter. In: WHO, Department of Communicable Disease Surveillance and Response. The Increasing Inci-dence of Human Campylobacteriosis. Report and Procce-dings of a WHO Consultation of Experts, Copenhagen, Denmark, 2000.
15. Kaplan, R.L., Goodman, L.J., Barrelt, J.E., Trenholme, G.M. and Landau, W. (1982). Comparison of Rectal Swabs and Stool Cultures in Detecting Campylobacter fetus subsp. jejuni. Journal of clinical microbiology, vol.15, No. 5, p. 959-960.
16. Botteldoorn, N., Heyndrickx, M., Rijpens, N. and Herman, L. (2001). The prevalence of Salmonella, Campylobacter and VTEC in pig farms. Proceedings of the 4th Internatio-nal Symposium on the Epidemiology and Control of Sal-monella and other Foodborne Pathogens in Pork. 2-5 Sept. 2001, Leipzig, Germany
17. Steinhauserova, I., Fojtikova, K. and Matiasovic, J. (2001). Subtyping of Campylobacter spp. Strains and their incidence in piglets. Acta Vet. Brno, 70: 197–201 18. Steinhauserová, I., Fojtíková, K., Matiašovic, J. (2001).
The occurrence and typing of Campylobacter coli strains in pigs. Folia Veterinaria,Vol. 45, No. 3.
19. Weijtens, M.J.B.M., Bijker, P.G.H., Van Der Plas, J., Ur-lings, H.A.P. and Biesheuvel, M.H. (1993). Prevalence of Campylobacter in pigs during fattening; an epidemiologi-cal study. Vet. Q. 15:138-43.
20. Madden, R.H., Moran, L. and Scates, P. (2000). Optimi-sing recovery of campylobacter spp. from the lower por-cine gastrointestinal tract. J Microbiol Methods, 42(2)115-9.
21. Hald, B. and Madsen, M. (1997). Healthy Puppies and Kittens as Carriers of Campylobacter spp., with Special Reference to Campylobacter upsaliensis. Journal of clini-cal microbiology, Vol. 35, No. 12, p. 3351–3352
22. Keramas,G., Bang, D.D., Lund, M., Madsen, M., Bunken-borg, H., Telleman, P. and Christensen, C.B.V. (2004). Use of Culture, PCR Analysis, and DNA Microarrays for De-tection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from Chicken Feces. Journal of clinical microbiology, Vol. 42, No. 9, p. 3985–3991.
23. Kulkarni, S.P., Lever, S., Logan, J.M.J., Lawson, A.J., Stanley, J. and Shafi M.S. (2002). Detection of campylo-bacter species: a comparison of culture and polymerase chain reaction based methods. J Clin Pathol 55:749–753. 24. Petersen, L., Nielsen, E.M., Engberg, J, On, S.L.W. and
Dietz, H.H. (2001). Comparison of Genotypes and Seroty-pes of Campylobacter jejuni Isolated from Danish Wild Mammals and Birds and from Broiler Flocks and Humans. Applied and environmental microbiology, Vol. 67, No. 7, p.3115–3121
25. Aarestrup, F.M., Nielsen, E.M., Madsen, M. and Engberg, J. (1997). Antimicrobial susceptibility patterns of
thermop-hilic Campylobacter spp. from humans, pigs, cattle, and broilers in Denmark. Antimicrob. Agents Chemother. 41:2244–2250.
26. Van Looveren, M., Daube, G., De Zutter, L., Dumont, J.M., Lammens, C., Wijdooghe, M., Vandamme, P., Jouret, M., Cornelis, M. and Goossens, H. (2001). Antimicrobial susceptibilities of Campylobacter strains isolated from food animals in Belgium. J. Antimicrob. Chemother. 48:235–240.
27. Engberg, J., On, S.L.W., Harrington, C.S. and Gerner-Schmidt, P. (2000). Prevalence of Campylobacter, Arco-bacter, HelicoArco-bacter, and Suturella spp. in human fecal samples as estimated by reevaluation of isolation methods for campylobacters. J. Clin. Microbiol. 38:286–291. 28. Ono, K., Masaki, H. and Tokumaru, Y. (1995). Isolation of
campylobacter spp. From slaughtered cattle and swine on
blood-free selective medium.J Vet Med Sci.,
57(6):1085-7.
29. Health Protection Agency, UK (2003). National Standard Method: Identification of campylobacter species. Issue no: 1 Issue date: 01.12.2003 Issued by: Standards Unit, Eva-luations and Standards Laboratory Page 1 of 10, Reference no: BSOP ID 23i1
30. Health Protection Agency, UK (2003). Stan dard Operating Procedure: Detection of Campylobacter Species, Issue no: 1.3 Issue date: 02.06.03 Issued by Standards Unit, Eva lua-tions and Standards Laboratory on be half of the Group F, W & E Co-ordinators Forum and the Environmental Surveil-lance Unit, CDSC. Page 1 of 10, Reference no: F 21i1.3 31. USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook 3rd Edition (1998). Chapter 6. Isolation, Identification, and Enumeration of Campylobacter jejuni/coli from Meat and Poultry Products (Aithors: Ransom, G.M. and Rose, B.E.) 32. Haenninen, M.-L., Sarelli, L., Sukura, A., On, S.L.W.,
Har-rington, C.S., Matero, P. and Hirvelae-Koski, V. (2002). Campylobacter hyointestinalis subsp. hyointestinalis, a com-mon Campylobacter species in reindeer. Journal of Applied Microbiology, 92, 717±723
33. Sails, A.D., Bolton, F.J., Fox, A.J., Wareing, D.R.A. and Greenway, D.L.A. (2002). Detection of Campylobacter je-juni and Campylobacter coli in Environmental Waters by PCR Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Applied and environmental microbiology, Vol. 68, No. 3, p. 1319–1324 34. Government of Canada, Compendium of Analytical
Met-hods Volume 3. Isolation of thermophilic campylobacter from food. http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/microbio/ volume3/mflp46_e.html
35. Sasaki, Y., Fujisawa, T., Ogikubo, K., Ohzono, T., Ishi-hara, K. and Takahashi, T. (2003). Characterization of Campylobacter lanienae from pig feces. J Vet Med Sci. Jan;65(1):129-31.
36. Altwegg, M., Burnens, A., Zollinger-Iten, J. and Penner, J. L. (1987). Problems in Identification of Campylobacter je-juni Associated with Acquisition of Resistance to Nalidi-xic Acid. Journal Of Clinical Microbiology, 25(9): 1807–1808.
37. Lior, H. (1984). New, extended biotyping scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and „Campy-lobacter laridis.“ J. Clin. Microbiol. 20:636-640. 38. Megraud, F., Chevrier, D., Desplaces, N., Sedallian, A.
from an appendix and from human feces. J. Clin. Micro-biol. 26:1050-1051.
39. Morris, G.K., El Sherbeeny, M.R., Patton, C.M., Kodaka, H. Lombard, G.L., Edmonds, P., Hollis, D.G. and Brenner, D.J. (1985). Comparison of Four Hippurate Hydrolysis Methods for Identification of Thermophilic Campylobac-ter spp. Journal of clinical microbiology, Vol. 22, No. 5, p.714-718.
40. Ursing, J., Walder, M. and Sandstedt, K. (1983). Base composition and sequence homology of deoxyribonucleic acid of thermotolerant Campylobacter from human and animal sources. Curr. Microbiol. 8:307-310.
41. Walder, M., Sandstedt, K. and Ursing, J. (1983). Phenoty-pic characteristics of thermotolerant Campylobacter from human and animal sources. Curr. Microbiol. 9:291-296. 42. Gaudreau, C. and Gilbert, H. (1997). Comparison of disc
diffusion and agar dilution methods for antibiotic suscepti-bility testing of Campylobacter jejuni subsp. jejuni and Campylobacter coli. Journal of Antimicrobial Chemothe-rapy, 39, 707–712
43. Pedersen, K. and Wedderkopp, A. (2003). Resistance to quinolones in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from Danish broilers at farm level. Journal of Applied Microbiology, 94, 111–119.
44. Brooks, B.W., Garcia, M.M., Fraser, D.E., Lior, H., Ste-wart, R.B. and Lammerding, A.M. (1986). Isolation and characterization of cephalothin-susceptible Campylobacter coli from slaughter cattle. J Clin Microbiol. 24(4):591– 595.
45. Holler, C. (1988). Quantitaive and qualitative studies of Campylobacter in a sewage treatment plant. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [B] 185(4-5):326-39.
46. Ng, L. K., Taylor, D. E. and Stiles, M. E. (1988). Charac-terization of freshly isolated Campylobacter coli strains and suitability of selective media for their growth. J. Clin. Microbiol. 26:518-523.
47. Yildirim, M., Istanbulluoglu, E. and Ayvali, B. (2005). Prevalence and Antibiotic Susceptibility of Thermophilic Campylobacter Species in Broiler Chickens. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 29, 655-660
48. Edmonds, P., Patton, C. M., Griffin, P. M., Barrett, T. J., Schmid, G. P., Baker, C. N., Lambert, M. A. and Brenner, D. J. (1987). Campylobacter hyointestinalis associated with human gastrointestinal disease in the United States. J. Clin. Microbiol. 25:685-691.
49. Snelling, W.J., Matsuda, M., Moore, J.E. and Dooley, J.S.G. (2006). Under the microscope: Arcobacter (review). Letters in Applied Microbiology 42 (2006) 7–14
50. On, S.L.W. (1996). Identification Methods for Campylo-bacters, HelicoCampylo-bacters, and Related Organisms. Clinical Microbiology Reviews, July, p.405–422.
