INFORME N°01 - ANÁLISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S

Contenido

I. Introducción ... 2 II. Objetivos ... 3 III. Materiales ... 3 IV. Metodología ... 5 V. Resultados ... 10

5.1. Primer grupo de muestras: Hernan.zip ... 10

5.2. Segundo grupo de muestras: SeqsHerbert.zip ... 12

5.3. Tercer grupo de muestras: SeqsHerbert_9.zip ... 14

VI. Conclusión ... 16

I. Introducción

La secuenciación de ADN es el proceso de la determinación de una secuencia de nucleótidos de ciertas moléculas de ADN - desde un segmento corto de una sola molécula, tal como una región reguladora o un gen, hasta colecciones de genomas enteros. En la década de 1970, las primeras secuencias de ADN se obtuvieron a través de técnicas extremadamente laboriosas.

La tecnología de secuenciación se inició en 1975. Frederick Sanger desarrolló la primera técnica de secuenciación del DNA, abriendo paso a una tecnología que mejorará por momentos. Las aplicaciones de estos sistemas se basan en la investigación de genomas, en biomedicina y aplicaciones clínicas.

La viabilidad de la secuenciación masiva de todo el ADN contenido en una compleja muestra ambiental ha establecido el campo de la metagenómica. Uno de los objetivos finales de la secuenciación del medio ambiente es transferir la información extraída de los genomas de los organismos a las formas de vida sintéticas. Estos podrían ser diseñados 3 de diversas maneras para beneficiar a la humanidad y reducir los problemas ecológicos, que sirve como medicina, combustible o fertilizante por nombrar algunas aplicaciones.

Los avances tecnológicos en secuenciación hacen atractivo utilizar un enfoque basado en la secuenciación para identificar y cuantificar el transcriptoma de una célula en lugar de utilizar matrices que se limitan al análisis de las transcripciones específicas conocidas en el momento del diseño.

Uno de los puntos más importantes durante la secuenciación masiva de ADN es la calidad de los resultados debido a que depende en gran medida de la pureza y correcta cuantificación de las muestras de ADN analizadas.

Para la realización de la presente practica se tendrá material dispuesto por el docente, el cual se llevará primero al programa de BioEdit, es un programa gratuito para edición de alineamientos y análisis de secuencias, donde se observan los cromatogramas en diferentes picos de colores, donde cada color corresponde a un nucleótido. El conjunto de estos picos ordenados corresponde a la secuencia de un fragmento de ADN. Es, sin lugar a duda, uno de los programas más conocidos para edición de secuencias para dicho sistema operativo.

II. Objetivos

• Revisar los fundamentos de las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos. • Efectuar el análisis y la selección de electroferogramas automatizados de

secuenciación mediante la aplicación de software libre BIOEDIT en específico el estudio del gen ribosomal 16S.

III. Materiales

• BioEdit

Para el desarrollo de esta práctica se utilizará el programa Bioedit.

Bioedit es un programa gratuito para edición de alineamientos y análisis de secuencias que funciona únicamente sobre ambiente MS/Windows.

• Excel

Se utilizará este programa para ordenar nuestros datos de acuerdo a los parámetros de análisis que se dio en clase.

Excel es un programa que sirve para la creación, manejo y modificación de hojas de cálculo. Se puede utilizar en varios dispositivos y sistemas operativos.

• Ncbi-Blast

BLAST es un programa informático de alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN, ARN o de proteínas. El programa es capaz de comparar una secuencia problema contra una gran cantidad de secuencias que se encuentren en una base de datos.

• Laptop

• Archivos de secuencia

Estos archivos son proporcionados por el docente, en total son 3 carpetas de muestras a analizar.

IV. Metodología

- Para la presente practica utilizaremos el programa BioEdit para analizar los cromatogramas. Este ya debe estar previamente instalada en su equipo.

- Primero abriremos el archivo de secuencia proporcionada por el docente en formato “zip”. Seleccionamos la carpeta, y abrimos la primera muestra para su análisis, y así sucesivamente con cada una.

- Seguidamente procedemos a analizar el cromatograma, al hacer “click” en una de las muestras directamente se abre en el BioEdit y analizamos de acuerdo a saberes proporcionados por el docente, en esto para la comparación de cromatogramas observamos las características, forma, secuencia de picos, determinando así la calidad de las secuencias, obteniendo calificaciones como Buena, Mala o Regular. Los resultados obtenidos se colocan en una tabla resumen en una hoja Excel para su mejor comprensión y análisis.

- Luego del análisis de la calidad de los cromatogramas, exportamos los datos, dirigiéndonos a “File” dentro de ellos elegimos “Export as Fasta”.

- Seguidamente creamos una carpeta para los archivos a exportar, una vez elegido “Export as Fasta” colocamos el mismo nombre en el archivo a guardar.

- Ubicamos la carpeta y archivo guardado para abrirlo, una vez se hace “click” lo abrimos con el programa “Block de notas”.

- Observamos la secuencia y eliminamos los caracteres que “ensucian” (se considera estas como “N”) o distorsionan la cadena de ADN.

- Una vez realizado el procedimiento anterior, procedemos a llevar a analizar la secuencia a la pagina web de NCBI BLAST para que esta proceda en la búsqueda e identificación del tamaño y tipo de organismo al cual muestra similitud más cercano.

- Seguidamente hacemos “Click” en BLAST para que esta nos redirija a una siguiente ventana donde el software de la pagina web empezara con su búsqueda de identidades similares.

- En búsqueda de similitudes de las secuencias unas demoran mas que otras, pero siempre obtenido una respuesta ya sean negativas o el nombre de que tipo de organismo es, además del tamaño de secuencia y el porcentaje de identidad.

- Los resultados obtenidos se plasman en un cuadro resumen en Excel.

- Toda la metodología descrita se aplicará a todas las muestras de cada carpeta proporciona por el docente, además de agregar gráficos para una mejor interpretación de los resultados.

V. Resultados

Los siguientes cuadros a observar a continuación son los resultados finales correspondientes al análisis de las muestras entregadas.

5.1. Primer grupo de muestras: Hernan.zip

INTERPRETACION:

En el presente cuadro se observa en detalle el análisis de las muestras de secuencia en los programas BioEdit y NBCI Blast, el primero nos dio resultados de la calidad de

BUENA MALA REGULAR

DIVERSOS-_A07_1H_01.ab1 X 441 Negativo

---DIVERSOS-_A08_9H_02.ab1 X 626 Bacteria - Herbaspirillum seropedicae 91,51%

DIVERSOS-_A09_1_01.ab1 X 734 Pseudomonas sp. 82,08%

DIVERSOS-_A10_9_02.ab1 X 691 Bacteria no cultivada 87,70%

DIVERSOS-_A11_17_01.ab1 X 739 Negativo

---DIVERSOS-_B07_2H_03.ab1 X 773 Negativo

---DIVERSOS-_B08_10H_04.ab1 X 757 Bacteria - Leclercia adecarboxilata 85,62%

DIVERSOS-_B09_2_03.ab1 X 631 Bacteria - Klebsiella oxytoca 84,01%

DIVERSOS-_B10_10_04.ab1 X 651 Bacteria - Enterobacter soli 71,76%

DIVERSOS-_B11_18_03.ab1 X 660 Negativo

---DIVERSOS-_C07_3H_05.ab1 X 762 Enterobacter sp. NA10140 92,53%

DIVERSOS-_C08_11H_06.ab1 X 754 Enterobacter sp. NA10140 92,51%

DIVERSOS-_C09_3_05.ab1 X 706 Phytobacter diazotrophicus 86,91%

DIVERSOS-_C10_11_06.ab1 X 775 Negativo

---DIVERSOS-_C11_19_05.ab1 X 735 Negativo

---DIVERSOS-_D07_4H_07.ab1 X 742 Bacteria no cultivada 90,18%

DIVERSOS-_D08_12H_08.ab1 X 717 Uncultured bacterium 85.40%

DIVERSOS-_D09_4_07.ab1 X 761 Phytobacter diazotrophicus 89,23%

DIVERSOS-_D10_12_08.ab1 X 779 Pseudomonas guariconensis 83,87%

DIVERSOS-_E07_5H_09.ab1 X 708 Negativo

---DIVERSOS-_E08_13H_10.ab1 X 672 Beta proteobacteria no cultivada 73,24%

DIVERSOS-_E09_5_09.ab1 X 822 Klebsiella pneumo 89,35%

DIVERSOS-_E10_13_10.ab1 X 826 Negativo

---DIVERSOS-_F07_6H_11.ab1 X 725 Enterobacter ludwigii 96,22%

DIVERSOS-_F09_6_11.ab1 X 764 Klebsiella sp. 83,93%

DIVERSOS-_F10_14_12.ab1 X 1004 Negativo

---DIVERSOS-_G07_7H_13.ab1 X 751 Kosakonia oryzae 92,16%

DIVERSOS-_G09_7_13.ab1 X 773 Negativo

---DIVERSOS-_G10_15_14.ab1 X 742 Enterobacter cloacae 96,28%

DIVERSOS-_H07_8H_15.ab1 X 824 Negativo

---DIVERSOS-_H09_8_15.ab1 X 1085 Negativo

---DIVERSOS-_H10_16_16.ab1 X 762 Enterobacter sp. IICDBZ9 84,59%

CALIDAD DE LA SECUENCIA TAMAÑO DE LA

SECUENCIA ORGANISMO % IDENTIDAD CODIGO

la secuencia, pudiendo ser BUENA, MALA y REGULAR, en el segundo se obtienen resultados del tamaño de la secuencia, el tipo de organismo y el % de identidad.

BUENO 4

MALO 25

REGULAR 3

TOTAL 32

En el primer grupo se analizo en total 32 muestras de las cuales 25 son de mala calidad, 4 son buenos y 3 regular, siendo en mayoría malos en la calidad de secuencia.

0.00 % 91.5 1% 82.0 8% 87.70 % 0.00 % 0.00 % 85.6 2% 84.0 1% 71.7 6% 0.00 % 92.5 3% 92.5 1% 86.9 1% 0.00 % 0.00 % 90.1 8% 85.4 0% 89.2 3% 83.8 7% 0.00 % 73.2 4% 89.3 5% 0.00 % 96.22 % 83.9 3% 0.00 % 92.1 6% 0.00 % 96.2 8% 0.00 % 0.00 % 84.5 9% 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% 90.00% 100.00% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 3 1 3 2 % D E IDEN TIDA D N° DE MUESTRAS

%DE IDENTIDAD

BUENO MALO REGULAR

Series1 4 25 3

4

25

3

En su mayoría encontramos organismos de tipo organismos vivos, bacterias. Estas con un rango de 70% a 92% de porcentaje de identidad.

5.2. Segundo grupo de muestras: SeqsHerbert.zip

INTERPRETACION:

En el presente cuadro se observa en detalle el análisis de las muestras de secuencia en los programas BioEdit y NBCI Blast, el primero nos dio resultados de la calidad de la secuencia, pudiendo ser BUENA, MALA y REGULAR, en el segundo se obtienen resultados del tamaño de la secuencia, el tipo de organismo y el % de identidad.

BUENO 4

MALO 6

REGULAR 5

TOTAL 15

BUENA MALA REGULAR

USER_04set2007_01-419NZ_A01_01.ab1 X 719 Negativo

---USER_04set2007_02-526NZ_B01_03.ab1 X 612 Klebsiella variicola 88,98%

USER_04set2007_03-419AZ_C01_05.ab1 X 745 Klebsiella sp. MPUS7 97,35%

USER_04set2007_04-88NZ_D01_07.ab1 X 757 Klebsiella pneumoniae 94,39% USER_04set2007_05-88AZ_E01_09.ab1 X 665 Klebsiella pneumoniae 95,33% USER_04set2007_06-526Y1_F01_11.ab1 X 718 Klebsiella pneumoniae 95,91% USER_04set2007_07-419Y1_G01_13.ab1 X 727 Enterobacter sp. WF14-6 98,61%

USER_04set2007_08-375H_H01_15.ab1 X 691 Negativo

---USER_04set2007_09-419YZ_A02_02.ab1 X 684 Bacteria no cultivada 96,45%

USER_04set2007_10-88H_B02_04.ab1 X 662 Negativo

---USER_04set2007_11-375NZ_C02_06.ab1 X 726 Negativo

---USER_04set2007_12-526YZ_D02_08.ab1 X 646 Klebsiella sp. BR3357 95,25%

USER_04set2007_13-483NZ_E02_10.ab1 X 729 Enterobacter sp. 89,55%

USER_04set2007_14-483H_F02_12.ab1 X 607 Enterobacter asburiae 86,09% USER_04set2007_15-456NZ_G02_14.ab1 X 711 Bacillus thuringiensis 92,83%

CALIDAD DE LA SECUENCIA TAMAÑO DE LA

SECUENCIA ORGANISMO % IDENTIDAD CODIGO

En el segundo grupo se analizó en total 15 muestras de las cuales 6 son de mala calidad, 4 son buenos y 5 regular, siendo en mayoría malos en la calidad de secuencia, sin embargo, la calidad se mantiene entre lo bueno y malo buscando un equilibrio.

En su mayoría encontramos organismos de tipo organismos vivos, bacterias. Estas con un rango de 85% a 96% de porcentaje de identidad.

BUENO MALO REGULAR

Series1 2 9 13 2 9 13

CALIDAD DE LA SECUENCIA

85.0 3% 0.00 % 77.6 1% 78.1 8% 85.6 7% 0.00 % 0.00 % 72.1 7% 0.00 % 77.0 6% 0.00 % 85.7 1% 0.00 % 94.9 2% 88.8 4% 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% 90.00% 100.00% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 % DE IDE N TIDA D N° DE MUESTRAS

%DE IDENTIDAD

5.3. Tercer grupo de muestras: SeqsHerbert_9.zip

INTERPRETACION:

En el presente cuadro se observa en detalle el análisis de las muestras de secuencia en los programas BioEdit y NBCI Blast, el primero nos dio resultados de la calidad de la secuencia, pudiendo ser BUENA, MALA y REGULAR, en el segundo se obtienen resultados del tamaño de la secuencia, el tipo de organismo y el % de identidad.

BUENO 2

MALO 9

REGULAR 13

TOTAL 24

BUENA MALA REGULAR

user_12set2007_01_A03_01.ab1 x 677 Pantoea agglomerans 85.03%

user_12set2007_02_B03_03.ab1 x 861 Negativo

---user_12set2007_03_C03_05.ab1 x 873 Klebsiella pneumoniae 77.61%

user_12set2007_04_D03_07.ab1 x 837 Klebsiella pneumoniae 78.18%

user_12set2007_05_E03_09.ab1 x 862 Uncultured bacterium 85.67%

user_12set2007_06_F03_11.ab1 x 657 Negativo

---user_12set2007_07_G03_13.ab1 x 1093 Negativo

---user_12set2007_08_h03_15.ab1 x 940 Uncultured bacterium 72.17%

user_12set2007_09_A04_02.ab1 x 1004 Negativo

---user_12set2007_10_B04_04.ab1 x 659 Clon RsDiSp8 de Treponema no cultivado 77,06%

user_12set2007_11_C04_06.ab1 x 871 Negativo

---user_12set2007_12_D04_08.ab1 x 459 Klebsiella sp. 85.71%

user_12set2007_13_E04_10.ab1 x 881 Negativo

---user_12set2007_14_F04_12.ab1 x 949 Pantoea deleyi 94.92%

user_12set2007_15_G04_14.ab1 x 882 Klebsiella sp. 88.84%

user_12set2007_16_H04_16.ab1 x 929 Negativo

---usuarios_12set2007_1Y2_F04_12.ab1 x 925 uncultured proteobacterium 81.08% usuarios_12set2007_2Y2_G04_14.ab1 x 789 Herbaspirillum seropedicae 81.20%

usuarios_12set2007_3Y2_H04_16.ab1 x 957 Negativo

----usuarios_12set2007_17_A04_02.ab1 x 1023 Negativo

----usuarios_12set2007_18_B04_04.ab1 x 924 Enterobacter sp. 79.83%

usuarios_12set2007_19_C04_06.ab1 x 998 Negativo

----usuarios_12set2007_20_D04_08.ab1 x 855 Negativo

----usuarios_12set2007_21_E04_10.ab1 x 333 Unculture bacterium 74.24%

CALIDAD DE LA SECUENCIA TAMAÑO DE LA SECUENCIA ORGANISMO % IDENTIDAD CODIGO

En el tercer grupo se analizó en total 24 muestras de las cuales 13 son de mala calidad, 9 son buenos y 2 regular, siendo en mayoría malos en la calidad de secuencia.

En su mayoría encontramos organismos de tipo organismos vivos, bacterias. Estas con un rango de 70% a 95% de porcentaje de identidad.

BUENO MALO REGULAR

Series1 2 9 13 2 9 13 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

CALIDAD DE LA SECUENCIA

85.0 3% 0.00 % 77.6 1% 78.1 8% 85.6 7% 0.00 % 0.00 % 72.17 % 0.00% 77.0 6% 0.00 % 85.7 1% 0.00 % 94.9 2% 88.8 4% 0.00 % 81.0 8% 81.2 0% 0.00 % 0.00 % 79.8 3% 0.00 % 0.00 % 74.2 4% 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% 90.00% 100.00% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 % DE IDE N TIDA D N° DE MUESTRAS

%DE IDENTIDAD

VI. Conclusión

• Los programas presentados para el análisis de secuencia de ADN de las muestras proporcionan tanto BioEdit como NBCI Blast, en el primero se pudo observar los picos, caídas y sobreposiciones de la calidad de la secuencia, entonces podemos concluir que el programa BioEdit cumplio y sirvió para la determinación de la secuencia ya se que la muestra fuera de BUENA, MALA O REGULAR calidad. Además, se utilizó también el programa de NBCI Blast la cual almacena en su base de datos bastante información acerca de las secuenciaciones de gen, sirviéndonos satisfactoriamente con la práctica realizada, dándonos resultados de las identidades de organismos que presentaban cierta similitud según la secuencia insertada.

• Se concluye que la calidad de la secuencia en total, es decir en los 3 grupos presentados en su mayoría fueron de calidad mala, en el grupo 1 y 2 con 25 y 6 muestras malas, mientras que en el grupo 3 en su mayoría tenemos una calidad regular con 13 muestras de las 24.

• Se concluye en el porcentaje de identidad de los 3 grupos registran similitud de secuencias dentro de un rango entre 70% y 96%, siendo esto porcentajes muy altos y casi confiables.

VII. Bibliografía

Biotecnológica, E. C. (s.f.). Nucleotide BLAST. Obtenido de https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ María del Rosario Rodicio, M. d. (2004). Identificación bacteriana mediante secuenciación del

ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones. Elvesier.

Perez, D. V. (2011). SISTEMAS DE SECUENCIACION DE DNA DE NUEVA GENERACION. Madrid - BARCELONA: UNB.

Rojas, A. C. (2 de Octubre de 2017). Secuenciación convencional (Sanger). Obtenido de http://conogasi.org/

Valenzuela-González, F. (2015). El gen ARNr 16S en el estudio. Mexico.

Sanger, F., et al. (1992). "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. 1977." Biotechnology 24: 104-108.