Prof (a) Dra Luciana D. Carvalho

Universidade Federal de Juiz de Fora

Instituto de Ciências Biológicas

Departamento de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia.

Disciplina: MICROBIOLOGIA GERAL E APLICADA A ENFERMAGEM

Bibliografia

• TRABULSI, L.R. Microbiologia, 5ª Ed., Atheneu, 2008.

• MURRAY, PATRICK R.; PFALLER, MICHAEL A.; ROSENTHAL, KEN S.

Microbiologia Médica. 5 ed. Ed. Elsevier, 2006.

• TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R. & CASE, C.L. Microbiologia, 6ª

edição, Editora Artmed, Porto Alegre, 2003.

• SANTOS, ROMANOS & WIGG. Introdução à virologia humana,

Ed.Guanabara-Koogan, 2002.

• JAWETZ, E.; MELNICK, J.L. & ADELBERG, E. Microbiologia

Morfologia Bacteriana

Bactérias

Morfologia Bacteriana:

As células bacterianas são caracterizadas morfologicamente pelo seu tamanho, forma e arranjo.

Tamanho: 0,3 /0,8 m até 10/25 m. As espécies de interesse médico variam entre 0,5 a 1,0 m por 2 a 5 m.

BACTÉRIAS - células procariontes, constituindo os menores seres vivos e os mais simples estruturalmente, embora complexos e diversificados do ponto de vista bioquímico e metabólico - ADAPTAÇÃO

Forma da célula:

• cocos

• bacilos

• vibriões

• espirilos

• Espiroquetas

• Formas de transição

Arranjos

– agrupamentos de indivíduos após a divisão

– seguem um padrão uniforme

– auxiliam na identificação do gênero bacteriano

Morfologia dos Procariotos

• Diplococos: cocos agrupados aos pares. Ex.: Neisseria (meningococo)

• Tétrades: agrupamentos de quatro cocos • Sarcinas: agrupamento de oito cocos em forma cúbica. Ex.: Sarcina

• Estreptococos: cocos agrupados em cadeias.

Ex.: Streptococcus • Estafilococos: cocos em grupos irregulares, lembrando cachos de uvas. Ex.: Staphylococcus

Forma e arranjo:

- Cocos (formas esféricas): grupo homogêneo em relação a tamanho, sendo células

Bacilos ou bastonetes: cilíndricos, forma de bastão, podendo ser longos ou

delgados, pequenos e grossos, extremidade reta, afilada, convexa ou arredondada.

• Diplobacilos: bastonetes agrupados aos pares.

• Estreptobacilos: bastonetes agrupados em cadeias.

Formas helicoidais ou espiraladas: células de forma espiral.

• Espirilos: possuem corpo rígido e

se movem às custas de flagelos

externos, dando uma ou mais

voltas espirais em torno do próprio

eixo.

• Espiroquetas: são flexíveis e locomovem-se provavelmente às custas de contrações do citoplasma, podendo dar várias voltas completas em torno do próprio eixo. Ex.: Gênero Treponema

• Além desses três tipos morfológicos, existem algumas formas

de transição.

• Quando os bacilos são muito curtos, podem se assemelhar aos

cocos, sendo então chamados de

cocobacilos

(Ex: Brucella

melitensis).

• Quando as formas espiraladas são muito curtas, assumindo a

forma de vírgula, eles são chamados de

vibrião

(Ex: V.

cholerae).

Formas de transição

• Bacilos muito curtos: cocobacilos. Ex.: Prevotella • Espirilos muito curtos, assumindo formas de vírgula: vibriões. Ex.: Vibrio cholerae

CITOLOGIA DA CÉLULA

BACTERIANA

CITOLOGIA BACTERIANA

Características básicas dos procariontes:

Ausência de compartimentos dentro da célula - metabólitos dispersos no citoplasma; Ausência de núcleo verdadeiro - cromossomo bacteriano disperso no citoplasma

A observação interna das estruturas celulares dá-nos uma idéia de como a bactéria funciona no ambiente. A figura a seguir representa as diversas estruturas bacterianas:

CITOLOGIA BACTERIANA

Nogueira & Silva Filho (2010)

Fímbrias

Estruturas filamentosas mais curtas e delicadas que os flagelos, semelhantes a pêlos, que se originam da membrana plasmática, e são usados para fixação, e não para motilidade.

São constituídas por uma proteína denominada pilina.

Estão relacionadas com a aderência às superfícies mucosas (fímbrias comuns) => colonização.

Pili F => relacionado com a transferência de material genético durante a conjugação bacteriana (fímbrias ou pili sexual – codificadas pelo plasmídeo F).

Estruturas Externas dos Procariotos

Cápsula e Camada Limosa (Glicocálix)

* composição: glicoproteínas e/ou polissacarídeos * função:

- adesão

Estruturas Externas dos Procariotos

Flagelos

* apêndices longos (10-20 m) e finos (20 nm)

* helicoidais

* distribuídos em número variável * Composição de proteína: flagelina * Estrutura:

- corpo basal (motor) - gancho - filamento Função: locomoção Monotríquio (polar) Lofotríquio Anfitríquio (polar) Peritríquio

Parede Celular

 Estrutura rígida que recobre a membrana citoplasmática e dá forma às células, além de proteção, mantendo a pressão osmótica intrabacteriana e prevenindo expansão e eventual rompimento da célula.

 Composição: peptidioglicano (mucopeptídeo ou mureína) – estrutura rígida da parede:

N-acetilglicosamina (NAG) ácido N-acetilmurâmico (NAM) tetrapeptídeo (4 aminoácidos)

Gram negativas: 10 % de

peptideoglicano (1-2 camadas) 2-3 nm

Gram positivas: 90% da parede formados de peptideoglicano (até 20 camadas) 30-60 nm

Parede Celular

Devido as propriedades da parede celular, as bactérias podem ser divididas em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS e GRAM NEGATIVAS, de acordo com a sua resposta à coloração de GRAM.

PAREDE DAS GRAM POSITIVAS

 Possuem maior quantidade de peptidioglicano, o que torna a parede dessas bactérias mais espessa e rígida.

 Composta por peptidioglicano e ácidos teicóicos (cadeias de polifosfato com resíduos de ribitol e glicerol) ou ácidos lipoteicócicos.

Citoplasma

Peptideoglicano Ácidos teicóicos

Membrana citoplasmática

Os ácidos teicóicos/lipoteicóicos estão ligados ao peptidioglicano APENAS nas bactérias Gram positivas, nunca nas Gram negativas.

PAREDE DAS GRAM NEGATIVAS

 Mais complexa - a quantidade de peptidioglicano é menor, e possui uma membrana externa envolvendo a fina camada de peptidioglicano, que se situa no espaço periplasmático.

 MEMBRANA EXTERNA: Serve como barreira seletiva que controla a passagem de algumas substâncias.

Estrutura: bicamada assimétrica, contendo fosfolipídios, semelhante à MP.

• Internamente => camada de fosfolipídeos e lipoproteína, que está ancorada ao peptidioglicano.

• Externamente => camada impermeável de lipopolissacarídeo (LPS) – molécula anfipática.

A membrana externa das bactérias Gram negativas contém porinas, que formam canais por onde penetram diversas substâncias.

Membrana citoplasmática Membrana externa Citoplasma Lipopolissacarideo Espaço periplasmático e lipoproteínas Peptideoglicano Espaço periplasmático

•Maior rigidez à parede celular

•Seus componentes são tóxicos quando injetados em animais •Participa do processo de nutrição formando canais de passagem

3 segmentos ligados covalentemente: lipídio A, cerne do polissacarídeo e antígenos O.

A porção lipídica do LPS é também chamada de ENDOTOXINA.

O LPS pode ser tóxico, causando febre, diarréia, destruição de hemácias e um choque potencialmente fatal.

Membrana Citoplasmática

Aproximadamente 10 nm e separa a parede celular do citoplasma. É constituída de fosfolipídeos e proteínas.

Desempenha importante papel na permeabilidade seletiva da célula – funciona como barreira osmótica.

Difere da membrana citoplasmática dos eucariotos por:

- não apresentar esteróis em sua composição;

- ser sede de numerosas enzimas do metabolismo respiratório; - controlar a divisão bacteriana através do mesossomo.

Reserva de energia e de blocos estruturais: * poli- -hidroxibutirato, amido e outros

* polifosfatos (grânulos metacromáticos) * enxofre

* magnetita (Fe₃O₄) (bactérias magnéticas usam para orientação)

“Magnetobulus multicellularis” (UFRJ)

Inclusões Citoplasmáticas

Área citoplasmática

 Ribossomos: ligados a uma molécula de mRNA, são chamados de poliribossomos. Presentes em grande número nas células bacterianas. São menores – ribossomos 70S

Tipo de rRNA em procariotos Número aproximado de nucleotídeos Localização da subunidade 16s 1542 30s 5s 120 50s 23s 2904 50s

Área nuclear

 Nucleóide: cromossomo bacteriano, constituído por uma única molécula dupla fita circular de DNA não delimitado por membrana nuclear e sem a presença de histonas. Contém as informações necessárias à sobrevivência da célula e é capaz de replicação.

 Plasmídeos: elementos extracromossomais, moléculas menores de DNA, também dupla fita, circulares, cujos genes não codificam características essenciais, mas podem conferir vantagens seletivas para as bactérias que os possuem (ex.: genes de resistência a antibióticos, metais tóxicos, produção de toxinas, etc). São capazes de auto-duplicação independente do cromossomo bacteriano, e podem existir várias cópias dentro da célula.

FISIOLOGIA BACTERIANA

Os microrganismos necessitam de um ambiente propício com todos os constituintes físicos e químicos necessários para seu crescimento. As substâncias ou elementos retirados do ambiente são utilizadas como blocos para a construção da célula.

Os nutrientes podem ser de vários tipos, dispostos em três categorias, de acordo com a sua concentração e importância na célula bacteriana:

macronutrientes, micronutrientes e fatores de crescimento.

MACRONUTRIENTES

Macronutrientes Funções

gramas Carbono (Compostos orgânicos, CO₂)

Constituintes de carboidratos, lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos

Oxigênio (O2, H2O, comp. orgânicos)

Nitrogênio (NH4, NO3, N2, comp. org.)

Hidrogênio (H2, H2O, comp. Orgânicos)

Fósforo (PO4)

Enxofre (SO4, HS, S, comp. enxofre)

mg

Potássio (K+₎ Atividade enzimática

Cálcio (Ca2+₎ Resistência ao calor do endosporo

Magnésio (Mg2+₎ Cofator de enzimas, complexos com ATP,

estabiliza ribossomos e membranas

Ferro (Fe2+_/Fe3+₎ Constituição de citocromos, cofator de enzimas,

FATORES DE CRESCIMENTO

São compostos que alguns tipos celulares necessitam em quantidades muito pequenas.

Embora a maioria dos microrganismos seja capaz de sintetizá-los, alguns microrganismos necessitam que eles sejam adicionados ao meio de cultura.

Estes compostos entram na composição das células ou de precursores dos constituintes celulares.

Aminoácidos

Purinas e pirimidinas

Colesterol

Heme

Vitaminas

Vitaminas requeridas pelos

microrganismos e suas funções

FONTES DE CARBONO E ENERGIA PARA O

CRESCIMENTO BACTERIANO

As bactérias, de acordo com a fonte de carbono e de energia que utilizam, podem ser classificadas em diferentes tipos nutricionais:

CARBONO

ENERGIA

HETEROTRÓFICOS AUTOTRÓFICOS FOTOTRÓFICOS QUIMIOTRÓFICOS

Microrganismos que utilizam carbono orgânico Microrganismos que utilizam carbono inorgânico (CO₂) Microrganismos que utilizam energia radiante (luz) Microrganismos que utilizam energia química (compostos químicos)

Principais tipos nutricionais dos

microrganismos

PROCESSO DE NUTRIÇÃO EM PROCARIOTOS

1) Nutrição em Gram positivos

=> Estas bactérias sintetizam uma série de exoenzimas, as quais são liberadas no meio, clivando os nutrientes, que são captados por proteínas transportadoras.

2) Nutrição em Gram negativos

=> Devido à presença de uma membrana externa de caráter hidrofóbico (LPS), as bactérias Gram negativas apresentam um grande número de porinas associadas à camada lipopolissacarídica, e que permitem a passagem de moléculas hidrofílicas, de baixa massa molecular.

=> No espaço periplasmático dessas células, são encontrados proteases, fosfatases, lipases, nucleases e enzimas de degradacão de carboidratos.

Os microrganismos exibem os mais diversos mecanismos nutricionais. A nutrição ocorre predominantemente pela absorção, através da oxidação de substâncias com alto valor

I

– Fermentação: processo no qual os compostos orgânicos são

parcialmente degradados

FORMAS DE OBTENÇÃO DE ENERGIA

Lática: ácido lático Alcoólica: etanol

Aceto-butírica: ácido butírico e acetona Acética: ácido acético (vinagre) Propiônica: ácido propiônico

=> Libera energia de açúcares (2 ATP) ou moléculas orgânicas;

=> Não requer oxigênio (mas pode ocorrer na presença deste);

=> Não requer o uso do ciclo de Krebs ou cadeia de transporte de elétrons;

=> Utiliza uma molécula orgânica como aceptor final de elétrons

II - Respiração

a)

RESPIRAÇÃO

AERÓBICA:

processo

onde

os

compostos

orgânicos

são

completamente

degradados, e o O

é o aceptor

final dos elétrons.

b) RESPIRAÇÃO ANAERÓBICA: processo no qual os compostos

orgânicos são completamente degradados, e uma molécula diferente

do O

é o aceptor final dos elétrons (SO

, CO

, NO

, fumarato, etc)

A quantidade de ATP gerada na respiração anaeróbica varia de acordo

com o microrganismo e a via.

Devido a somente uma parte do ciclo de Krebs funcionar sob

condições anaeróbias, o rendimento de ATP nunca é tão alto

Os microrganismos em crescimento estão, na verdade, aumentando o seu número e se acumulando em colônias

COLÔNIAS => grupos de células => visualização sem utilização de microscópio.

Quando falamos em crescimento microbiano no referimos ao número e não ao

tamanho das células.

CONDIÇÕES NECESSÁRIAS PARA O CRESCIMENTO MICROBIANO Físico-químicos (ambientais) • Temperatura • pH • Pressão Osmótica • O₂ Químicos • Água • Macronutreintes • Micronutrientes • Fatores de crescimento

REQUERIMENTOS FÍSICOS E AMBIENTAIS PARA O

CRESCIMENTO MICROBIANO

Temperatura

Cada tipo de bactéria apresenta uma temperatura ótima de crescimento. Acima do limite, ocorre desnaturação protéica e conseqüente morte celular. Temperaturas inferiores levam a uma desaceleração das atividades metabólicas.

pH

A maioria das bactérias cresce melhor dentro de variações pequenas de pH, sempre perto da neutralidade, entre pH 6,5 e 7,5.

Pressão Osmótica

A capacidade dos microrganismos se adaptar a pressões osmóticas chama-se OSMOADAPTAÇÃO.

Os microrganismos são frequentemente encontrados em ambientes onde a concentração do soluto é igual o seu citoplasma (meio isotônico).

• Halotolerantes: toleram altas concentrações de sais-10% NaCl • Halofílicos: requerem altos níveis de NaCl (Vibrio cholerae).

Presença de Oxigênio pode ser inócuo, indispensável ou letal para as bactérias, o que permite

Oxigênio

O oxigênio pode ser inócuo, indispensável ou letal para as bactérias, o que permite classificá-las em:

Incapacidade de eliminação ou capacidade limitada de eliminar

produtos do metabolismo do oxigênio molecular.

Redução do Oxigênio O₂ + e- _{= O} 2- (ânion superóxido) O₂ + 2 e- _{= H} 2O2 (peróxido de hidrogênio) O₂ + 3 e-_{= H} 2O + OH-(radical hidroxila) O₂ + 4 e- _{= H}

2O (água => redução total)

Espécies Reativas do Oxigênio (EROs)

Por que o oxigênio é letal para os

anaeróbios?

Estratégias de defesa dos microrganismos: mecanismos

antioxidantes

Reprodução bacteriana

As bactérias se multiplicam por divisão binária simples, um processo devido à formação de septos na região do mesossomo, que se dirigem da superfície para o interior da célula, dividindo a bactéria em duas células filhas.

A fissão é precedida pela duplicação do DNA, que se processa de modo semi-conservativo, e cada célula filha recebe uma cópia do cromossomo da célula-mãe.

O período da divisão celular depende do tempo de geração de cada bactéria

Tempo de geração: tempo necessário para um célula se dividir

em duas

Quando uma bactéria é semeada em um meio apropriado, nas condições apropriadas, o seu crescimento segue uma curva definida e característica:

A – Fase LAG: pouca divisão celular, os microrganismos estão se adaptando ao meio em que estão crescendo. As células aumentam de volume, mas não se dividem.

B – Fase exponencial (log): crescimento exponencial, divisões celulares sucessivas, grande atividade metabólica.

C – Fase estacionária: decréscimo na taxa de divisão celular, onde a velocidade de crescimento = velocidade de morte

D – Fase de declínio ou morte: condições impróprias para o crescimento, meio deficiente em nutrientes e rico em toxinas, onde as células mortas excedem o número de células vivas

CULTIVO DE MICRORGANISMOS

IN VITRO

Para cultivar microrganismos em sistemas artificiais, deve-se obedecer a requisitos básicos, como a utilização de um meio com aporte nutritivo adequado para o microrganismo, além de condições fisico-químicas adequadas para seu desenvolvimento.

O meio de cultura deve atender as exigências nutricionais específicas do gênero ou da espécie que se deseja cultivar.

Algumas bactérias crescem em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios especiais e há bactérias que não são capazes de crescer em nenhum meio de cultura já desenvolvido.

Meio de Cultura: mistura de compostos nutrientes necessários ao crescimento microbiano.

a) Quantidade de água necessária

b) Substâncias nutritivas em quantidades adequadas

 Fonte de energia

 Fonte de carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo  Fonte de sais e íons

 Fatores de crescimento

c) Condições físico-químicas adequadas

 Temperatura adequada (termófilos, mesófilos e psicrófilos)  pH adequado (2 à 9)

 Pressão osmótica adequada

 Atmosfera de incubação (aeróbios, anaeróbios, microaerófilos)

Estado Físico

Quanto ao estado físico, os meios de cultura podem ser:

 Líquidos

 Sólidos (1,5% de Agar p/v)

 Semi-sólidos (0,5 a 0,75% de Agar p/v)

Agar: polissacarídeo obtido a partir de algas, que

funciona como

agente solidificante.

Não tem função

nutritiva no meio de cultura (PF = 95°C)



MEIOS SINTÉTICOS OU QUIMICAMENTE DEFINIDOS:

meios

em que todos os constituintes são conhecidos. Utilizados para cultura

de cianobactérias e algas (fotolitoautotróficos). Neste caso a fonte

de carbono seria o CO

.



MEIOS COMPLEXOS:

meios que contém ingredientes de composição

química desconhecida. Utilizados para cultura de microrganismos com

requerimentos nutricionais complexos ou desconhecidos. Podem conter

peptonas (hidrolisados de proteínas preparadas por digestão

proteolítica parcial de carne, caseína, soja ou gelatina), extrato de

carne e/ou extrato de levedura.

Composição



MEIO SIMPLES:

meio que permite o crescimento de espécies

pouco exigentes como as

Enterobacteriaceae

. Ex: caldo nutritivo

(peptona, NaCl, extrato de carne); água peptonada.



MEIOS RICOS:

meio basal enriquecido com ovo, soro ou sangue,

substâncias que permitem o crescimento de bactérias muito

exigentes em termos nutricionais e que se encontram em número

reduzido. Meios caracterizados por ausência de inibidores. Podem

ou não ser diferenciais. Exemplos: Agar sangue, Brain and Heart

Infusion (BHI)

Meios de enriquecimento

São meios líquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras, facilitando o isolamento de um microrganismo de interesse. Ex.: caldo de selenito de sódio => permite enriquecimento de Salmonella sp e Shigella sp nas fezes.

Inoculado Não

Inoculado

caldo de selenito de sódio

Permitem apenas o crescimento das bactérias de interesse, pois

possuem substâncias inibidoras de outros grupos bacterianos.

Exemplos:

• Meio McConkey • Meio EMB

• Agar Manitol Salgado

Agar McConkey Agar EMB Agar Manitol

Meios que servem para o transporte e conservação de um

material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou

mais microrganismos. O papel principal deste meio é

manter os microrganismos vivos. Ex: meio de Stuart para

bactérias frágeis como

Neisseria gonorrhoeae.

Meios de transporte

Meios adicionados de agentes redutores (tioglicolato de sódio,

cisteína) que se combina com o oxigênio eliminando-o do meio de

cultivo. Ex.: Ringer PRAS, para anaeróbios

Cultivo de bactérias aeróbias

Cultivo de bactérias microaerófilas

(Métodos de produção de CO

)

Método físico

90% Nitrogênio, 10% CO₂

Método químico Jarra Gas Pak®

Cultivo de anaeróbios

(Métodos de produção de ambiente anaeróbio)

Incubação na estufa bacteriológica

85% Nitrogênio,

10% Hidrogênio,

5% CO

Método químico e físico

Câmara Anaeróbica

Bibliografia

•

TRABULSI. Microbiologia. Atheneu Editora, 2008.

•

MADIGAN

et al.

, 2004. Microbiologia de

Brock,

10

_edição.

•

TORTORA

et al

., 2005. Microbiologia – 8

. Ed. Artmed