UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIODIVERSIDADE, EVOLUÇÃO E MEIO AMBIENTE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DE BIOMAS
TROPICAIS
Marcos Roberto Beiral De Oliveira
Avaliação dos efeitos do fungicida Carbendazim sobre o comportamento do peixe-zebra Danio rerio
(Cyprimiformes, Cyprinidae)
Orientador(a): Eneida Maria Eskinazi Sant’Anna Co-orientador: Cristiano Schetini de Azevedo
Ouro Preto 2021
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIODIVERSIDADE, EVOLUÇÃO E MEIO AMBIENTE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DE BIOMAS
TROPICAIS
Avalia çã o dos efeitos do fungicida Carbendazim sobre o comportamento do peixe-zebra Danio rerio
(Cyprimiformes, Cyprinidae)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia de Biomas Tropicais do Instituto de Ciências Exatas e Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre.
Orientador(a) Eneida Maria Eskinazi Sant’Anna
Co-orientador: Cristiano Schetini de Azevedo
Marcos Roberto Beiral De Oliveira Ouro Preto
Oliveira, Marcos Roberto Beiral de.
OliAvaliação dos efeitos do fungicida Carbendazim sobre o
comportamento do peixe-zebra Danio rerio(Cyprimiformes, Cyprinidae).
[manuscrito] / Marcos Roberto Beiral de Oliveira. - 2022.
Oli54 f.: il.: color., gráf., tab..
OliOrientadora: Profa. Dra. Eneida Maria Eskinazi Sant'Anna.
OliCoorientador: Prof. Dr. Cristiano Schetini Azevedo.
OliDissertação (Mestrado Acadêmico). Universidade Federal de Ouro Preto. Departamento de Biodiversidade, Evolução e Meio Ambiente.
Programa de Pós-Graduação em Ecologia de Biomas Tropicais.
OliÁrea de Concentração: Evolução e Funcionamento de Ecossistemas.
Oli1. Comportamento. 2. Fungicidas. 3. Peixes. I. Azevedo, Cristiano Schetini. II. Sant'Anna, Eneida Maria Eskinazi. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Título.
Bibliotecário(a) Responsável: Luciana De Oliveira - SIAPE: 1.937.800
SISBIN - SISTEMA DE BIBLIOTECAS E INFORMAÇÃO
O48a
CDU 574
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO REITORIA
INSTITUTO DE CIENCIAS EXATAS E BIOLOGICAS PROGRAMA DE POS-GRADUACAO EM ECOLOGIA DE
BIOMAS TROPICAIS FOLHA DE APROVAÇÃO
Marcos Roberto Beiral de Oliveira
Avaliação dos Efeitos do Fungicida Carbendazim® Sobre o Comportamento do Peixe-zebra Danio rerio (Cyprimiformes, Cyprinidae)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ecologia de Biomas Tropicais da Universidade Federal de Ouro Preto como requisito parcial para obtenção do tulo de Mestre em Ecologia de Biomas Tropicais
Aprovada em 14 de janeiro de 2022
Membros da banca
Dra. Eneida Eskinazi - Orientadora - Universidade Federal de Ouro Preto Dra. Eliane Gonçalves de Freitas - Universidade Estadual Paulista Dra. Maria Elvira Pole Martucci - Universidade Federal de Ouro Preto
Profa. Dra. Eneida Eskinazi, orientadora do trabalho, aprovou a versão final e autorizou seu depósito no Repositório Ins tucional da UFOP em 03/01/2023
Documento assinado eletronicamente por Cris ano Sche ni de Azevedo, COORDENADOR(A) DE CURSO DE PÓS-GRADUACÃO EM ECOLOGIA DE BIOMAS TROPICAIS, em 03/01/2023, às 10:33, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art.
6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de outubro de 2015.
A auten cidade deste documento pode ser conferida no site h p://sei.ufop.br/sei/controlador_externo.php?
acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0 , informando o código verificador 0452734 e o código CRC 97320D62.
Sum á rio
Sumário
Agradecimentos... 4
Resumo...6
Abstract...8
1. Introdução...10
2. Materiais e métodos...177
2.1 Local de estudo, aquários e manutenção...177
2.2 Etograma...199
2.3 Coleta e Análise da água...21
2.4 Dados Comportamentais...21
2.5 Análise Estatística...22
4. Resultados...24
5. Discussão...355
6. Conclusão...42
7. Referências Bibliográficas... 433
Agradecimentos
Agradeço aos meus pais, Salvador e Irani, e também aos meus irmãos, por todo apoio nessa caminhada.
Agradeço a maior idealizadora desse sonho, minha avó Olivia Aragão, que sempre me apoiou nos estudos, porém, não conseguiu estar aqui para ver este sonho se tornar realidade. Sei que aonde você estiver, estará feliz por esta conquista.
A minha Tia Ivanilda, por sempre estar ao meu lado apoiando e me incentivando a seguir em frente.
Aos meus orientadores Dra. Eneida Eskinazi Sant’Anna, Dr. Cristiano Schetini Azevedo e Me. João Victor Saraiva, por todo empenho em me ajudar na confecção deste trabalho, por terem acreditado em mim e me ajudado nos momentos que mais precisei.
A Marina Beirão, por ter aceitado participar desse projeto: você e suas análises fizeram toda a diferença.
Aos laboratórios de Ecologia Aquática, Evolução e Conservação (LAECO/UFOP) e Zoologia de Vertebrados (LZV/UFOP), pelo acolhimento e aprendizado ao longo desses anos.
Ao laboratório de Toxicologia da Escola de Farmácia (EFAR/UFOP), em especial às professoras Dra. Maria Elvira Poleti Martucci e Dra. Karina Taciana Santos Rubio, Raíssa Miranda, Anderson Gonçalves e Victória Rambaldi, pela parceria na execução deste projeto.
A minha amiga e IC Isabela Profeta, pelo apoio, companheirismo e dedicação a este projeto.
A Fran, Tay, Gabi e Débora, minhas companheiras de turma, pelos momentos vividos nessa caminhada.
Aos meus amigos de BH, Sampa, Amapá e Argentina, pelo apoio e torcida:
mesmo que distante, vocês aliviaram muito esta caminhada.
Aos professores do Programa de Pós Graduação em Ecologia de Biomas Tropicais, por terem contribuído com a minha formação profissional.
E, por fim, agradeço ao CNPq, pelo financiamento que possibilitou a realização de todo este projeto.
MUITO OBRIGADO!
Resumo
O Brasilé um dos maiores consumidores de agrotóxicos no mundo e um dos agrotóxicos comumente utilizadosé o fungicida carbendazim. O carbendazim pode causar a formação de tumores, desregulações endócrinas, diferenciação sexual, dentre outros efeitos adversos em animais e seres humanos expostos de forma aguda e crônica, bem como provocar mudanças comportamentais nos animais. Entretanto, poucos são os estudos que avaliam os efeitos do carbendazim sobre o comportamento de peixes. Dessa forma, o presente estudo teve como principal objetivo avaliar os efeitos da exposição crônica de peixes-zebra adultos ao carbendazim. Foram estudados 177 indivíduos adultos de peixe-zebra (Danio rerio), mantidos em aquários de 3,5L, separados em grupos-controle (sem exposição ao carbendazim) e grupos- tratamento (expostos a uma concentração de 120 μg/L de carbendazim) e mantidos por 7, 14, 28 e 35 dias nos aquários. Os dados comportamentais foram coletados a partir das filmagens dos aquários, utilizando-se o método scan, com registro instantâneo e intervalo amostral de 30 segundos. Os dados comportamentais foram analisados através de Modelos Lineares Generalizados Mistos (GLMMs), onde os comportamentos apresentados pelos peixes-zebra foram as variáveis-resposta e a condição (tratamento ou controle), o tempo de exposição (7, 14, 28 e 35 dias) e a sua interação foram as variáveis explicativas. GLMMs também foram montados para avaliar se a condição (tratamento X controle; variável explicativa) influenciou o número de peixes ocupando o fundo, o meio ou a superfície do aquário (variável resposta). Os resultados indicaram que o fungicida carbendazim modificou o comportamento natatório e agressivo dos peixes-zebra, bem como aumentou a exibição de comportamentos anormais, sobretudo relacionado à natação.
Além disso, modificou também a área da coluna d’água mais utilizada pelos indivíduos (do fundo para a superfície). Em conjunto, os resultados mostraram que a exposição ao carbendazim, especialmente se de longo
afetando severamente seu comportamento. Em vida livre, essa mudança comportamental pode resultar em aumento do risco de predação e consequente diminuição ou extinção das populações.
Palavras-chaves:carbendazim, comportamento, fungicida, zebrafish.
Abstract
One of the commonest pesticides used in Brazil is the fungicide carbendazim.
Carbendazim can cause deleterious effects of the physiology and behaviour of acutely and chronically exposed animals and humans. However, few studies evaluated the effects of carbendazim on fish behaviour. Thus, the main objective of the present study was to evaluate behavioural changes in adult zebrafish exposed to carbendazim. We studied 177 adult zebrafishes (Danio rerio), divided into control groups (not exposed to carbendazim) and treatment groups, exposed to a concentration of 120 μg/L of carbendazim for 7, 14, 28 and 35 days. Behavioural data were collected using the scan
method, with instantaneous recording every 30 seconds. Data were analyzed using Generalized Linear Mixed Models (GLMMs), where the behaviours exhibited by the zebrafishes were the response variables and the condition (treatment or control), the exposure time (7, 14, 28 and 35 days ) and their interaction were the explanatory variables. GLMMs were also used to assess whether the condition (treatment or control; explanatory variable) influenced the number of fish occupying the bottom, middle or surface of the aquarium (response variable). The results indicated that carbendazim initially elicited slow swimming and later fast swimming, decreased aggressive behaviour, and increased the display of abnormal behaviours by zebrafishes. In addition, it also modified the area of the water column most used by individuals (from the bottom to the surface). The results showed that exposure to carbendazim,
especially in the long-term, caused behavioural problems and possibly distressed the fishes. In the wild, this behavioural change can result in an increased predation risk and consequent decrease or extinction of populations, revealing important ecological issues for animal communities living in
contamined water bodies.
Key-words:behavior, benzimidazole, fish, pesticid, water contamination.
1. Introdução
O Brasil é um dos maiores consumidores de agrotóxicos no mundo, com 497 substâncias diferentes autorizadas para o uso agrícola no país (ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2019; Barbosa et al., 2015; Ministério da Saúde do Brasil, 2011). O aumento na comercialização de agrotóxicos observado no Brasil se deu sem o aumento significativo das áreas plantadas, indicando uma intensa utilização nas lavouras brasileiras(Ministério da Saúde do Brasil, 2011).
Destes 497 agrotóxicos, o carbendazim (metil-1-H-benzimidazil-2-il- carbamato; C9H9N3O2) é um fungicida do grupo dos benzimidazóis comumente utilizado na agricultura (Andrade et al., 2016). Em 2020, por exemplo, o carbendazim foi o 13º agrotóxico mais vendido no Brasil, com mais de sete mil toneladas utilizadas na agricultura (IBAMA - Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis, 2021). A utilização desse composto no Brasil éusual nas plantações de arroz, cevada, milho, soja, dentre outros (ANVISA–Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2019; Pignati et al., 2017), já que éum produto acessível e de ampla eficácia (X. Li et al., 2011; Magnucka et al., 2007; Xu et al., 2018). A grande utilização do carbendazim traz preocupação às agências de saúde, pois tem sido encontrado em alimentos(Dos Santos et al., 2015; Machado & dos Santos, 2017) e nos corpos d’água(De Souza et al., 2019; Montagner et al., 2019).
Enquanto no Brasil a legislação permite concentrações de até 120 ug/L de carbendazim nos corpos d’água (Ministério da Saúde do Brasil, 2011), na União Européia a concentração permitida é de apenas 0.1 g/L (Consejo de la Unión Europea, 1998). Em 2012, o Carbendazim teve seu uso proibido nos Estados Unidos, a partir da detecção do produto nos sucos de laranja importados pelo Brasil, o que resultou em um grande impacto na balança comercial brasileira (Nakano et al., 2016; Reichert et al., 2015). Assim, o
carbendazim sobre os organismos é importante para se evitar problemas de saúde e ambientais.
O carbendazim é eficiente no controle de patógenos fúngicos na agricultura, indústria têxtil e de tintas, além de ser aplicado na conservação de safras frutíferas (Selmanoǧlu, 2001). Em fungos, ele écapaz de interagir com os microtúbulos; seu mecanismo de ação se dáa partir de sua ligação com as
-tubulinas, evitando a formação de dímeros de e -tubulinas e, consequentemente, das fibras de microtúbulos, essenciais para o rearranjo do citoesqueleto e migração processos celulares (Coutinho et al., 2006;
Magnucka et al., 2007). Em Saccharomyces cerevisiae, o carbendazim pode interagir com a β-tubulina, acarretando a inibição da polimerização dos microtúbulos (J. Li et al., 1996). Em humanos, a exposição aguda ou crônica ao carbendazim resultou em problemas relacionados ao aumento da produção de estrógeno e da expressão de aromatase, interferindo na produção de microtúbulos e evitando a formação de células (McKinlay et al., 2008). O carbendazim ainda é considerado carcinogênico para humanos, especialmente provocando tumores no fígado por trazer danos ao DNA (Nakai et al., 2002; Silva et al., 2014; Urani et al., 1995), problemas espermatogênicos, diminuição da fertilidade, atrofia testicular (Farag et al., 2011; Jia et al., 2003; Lim & Miller, 1997), além de apresentar efeitos teratogênicos sobre o feto (Morinaga et al., 2004).
O carbendazim, após aplicado, pode permanecer no solo ou ser carreado para o ambiente aquático, tendo sido detectado em concentrações variáveis em corpos d’água brasileiros, com quase 20% das amostras avaliadas em alguns estados apresentando concentrações de carbendazim superiores ao permitido pela legislação (Barbosa et al., 2015; Carbo et al., 2008; Montagner et al., 2019; Zini and Gutterres, 2021). O carbendazim, quando alcança um corpo d’água, pode sofrer adsorção na matéria orgânica, sedimento ou permanecer em solução até sofrer fotodegradação (Ludwikowska et al., 2013), o que pode levar entre 6 e 34 semanas,
demonstrando sua alta persistência na coluna d’água (Cuppen et al., 2000).
Ao permanecer na coluna d’água, pode acabar sendo ingerido por organismos aquáticos e gerar impactos negativos nas taxas de reprodução e alimentação, como no caso do cladócero Daphnia magna(Ribeiro et al., 2011) e das carpas prussianas (Carassius gibelio) (Ludwikowska et al., 2013)2013).
Ao ser ingerido, o carbendazim não apresenta especificidade de distribuição pelos órgãos corporais, mas as maiores concentrações dessa substância e de seus metabólitos tem sido encontradas no fígado, rins e tecidos musculares (Dorough, 1967; Krechniak and Klosowska, 1986;
Muthuviveganandavel et al., 2011; Nwozo et al., 2017). O carbendazim pode ser degradado em 2-amino-benzimidazol ou não ser degradado, sendo ambas as substâncias eliminadas via urina e fezes (Hershberger and Arce, 1993; Silva and Melo, 2008).
Além dos efeitos fisiológicos deletérios jámencionados, o carbendazim também pode modificar o comportamento dos animais. Em um estudo foi observado que as larvas do peixe-zebra (Danio rerio) apresentaram alterações em seu comportamento locomotor, tornando-se mais lentas e diminuindo suas taxas de ingestão de alimento (Andrade et al., 2016). Uma ação do carbendazim sobre a produção da enzima acetilcolinesterase nas fendas sinápticas já foi relatada na literatura, havendo um aumento da produção dessa enzima em exposições agudas (96h) e em concentrações maiores ou iguais a 4µg/L (outras concentrações testadas: 20, 100 e 500µg/L) (Andrade et al., 2016). Outros autores demonstraram que minhocas (Eisenia fetida) exibem mais comportamento de evitação em solos contaminados por carbendazim (Garcia et al., 2008). Disfunções em processos bioquímicos, esgotamento energético, aumento do estresse oxidativo e redução do condicionamento físico também foram relatados para peixes expostos à maioria dos agrotóxicos de uso contínuo, como o carbendazim (revisão:
Valavanidis et al., 2006). Novos estudos são necessários para um melhor
entendimento dos efeitos do carbendazim sobre o comportamento dos animais, especialmente de macrovertebrados aquáticos.
O tempo de exposição ao carbendazim, bem como a sua concentração, pode influenciar a resposta comportamental e fisiológica dos animais. Larvas de peixe-zebra (D. rerio) expostas por mais tempo eàmaiores concentrações do fungicida tiveram mais modificações fisiológicas (aumento da atividade das enzimas colinesterase, lactato-desidrogenase e glutationa) e comportamentais (aumento do tempo nadando, mas diminuição na distância nadada) (Andrade et al., 2016). O mesmo resultado para os efeitos do carbendazim sobre essas enzimas foi observado em outro estudo, juntamente com um aumento do número de micronúcleos dos embriões de peixe-leite Chanos chanos expostos à maiores concentrações do agrotóxico (Palanikumar et al., 2014).
O peixe-zebra Danio rerio (Cypriniformes, Cyprinidae), também chamado de paulistinha, possui destaque como modelo animal para estudos toxicológicos e comportamentais, se tornando qualificado por possuir características que podem ser extrapoladas para os demais grupos de vertebrados (Altenhofen et al., 2017; Suriyampola et al., 2016). Dentre as características que tornam o peixe-zebra ideal para estudos dos efeitos do carbendazim sobre o comportamento animal, pode-se destacar: (i) o cultivo dos embriões em laboratório é de fácil manejo; (ii) a reprodução possui alta taxa de sobrevivência; (iii) o confinamento em espaços reduzidos para cultivo é facilitado devido ao seu pequeno tamanho corporal; (iv) por sua similaridade de órgãos e genoma com o de outros vertebrados (Klüver et al., 2015). O sequenciamento do genoma do peixe-zebra demonstrou que este modelo compartilha 12.719 genes em comum com camundongos e humanos, correspondendo 70% de similaridade entres os genes do peixe-zebra e humanos(Howe et al., 2013).
O comportamento do peixe-zebra também é bastante conhecido (Kalueff et al., 2013; Spence et al., 2008). Cerca de 190 comportamentos já
foram descritos para a espécie, registrados tanto na natureza quanto em cativeiro(Blank et al., 2009; Cognato et al., 2012; Howe et al., 2013; Kalueff et al., 2013). É uma espécie bastante sociável, uma vez que vive em grandes cardumes e apresenta comportamento de hierarquia (Egan et al., 2009;
Graham et al., 2018; Suriyampola et al., 2016). Por possuir um sistema de hierarquia de dominância, a agressividade éum dos padrões mais estudados em função da sua associação com territorialismo, especialmente durante a escolha de sítios de reprodução (Filby et al., 2010; Oliveira, 2013). Como o carbendazim também diminui a atividade de larvas de peixes-zebra (Andrade et al., 2016), espera-se que a agressividade também diminua quando expostos a esse agrotóxico. Uma diminuição na agressividade de peixes expostos ao glifosato, um organosoforado, já foi demonstrada e essa diminuição estava ligada a um aumento da inatividade provocada por esse agrotóxico(Bridi et al., 2017). Estudos que avaliem os efeitos do carbendazim na agressividade de peixes adultos ainda são inexistentes.
Estudos sobre o comportamento de natação, alterações locomotoras e comportamento social também jáforam realizados para a espécie (Cognato et al., 2012; Dreosti et al., 2015; Giacomini et al., 2016). Esses comportamentos podem sofrer alterações sob efeito de substâncias farmacológicas e/ou toxicológicas (Howe et al., 2013; Oliveira, 2013). Por exemplo, um aumento da exibição de comportamentos de natação anormais, como nadar em espiral, natação errática ou subir à superfície com frequência para ingerir ar, já foram relatados para bagres-africanos (Clarias gariepinus) expostos aos carbendazim (Nwani et al., 2015). Comportamentos anormais de peixe-zebra, já observados em outros experimentos com exposição à diferentes substâncias químicas, são natação repetitiva em círculos, nadar para a frente e para trás no mesmo local, natação superficial na mesma rota próxima às paredes do aquário, bater a cabeça no vidro, abrir e fechar a boca com muita frequência, tremores, etc.(Kalueff et al., 2013; Zabegalov et al., 2019).
A alta sensibilidade a fármacos e as respostas semelhantes às exibidas por seres humanos, inclusive, também é uma grande característica do peixe-zebra, que o coloca como modelo animal ideal para estudos toxicológicos (Gunnarsson et al., 2008; Waugh et al., 2014). Desse modo, o uso do peixe-zebra torna-se importante ferramenta de estudos para o avanço do campo neurocientífico, comportamental e toxicológico (Waugh et al., 2014).
Estudos anteriores realizados sobre os efeitos do carbendazim na comunidade aquática caracterizaram a toxicologia e os efeitos sistêmicos (fisiológicos, anatômicos e genéticos) sobre os peixes-zebra (Andrade et al., 2016; Ludwikowska et al., 2013; Palanikumar et al., 2014). Entretanto, estudos que envolvam o efeito desse agrotóxico sobre o comportamento do peixes- zebra adultos ainda são raros (Andrade et al., 2016; Nwani et al., 2015). Dessa forma, o presente estudo teve como principal objetivo avaliar os efeitos da exposição crônica de peixes-zebra adultos ao carbendazim. As hipóteses testadas, juntamente com suas premissas, estão descritas abaixo:
Hipóteses:
Hipótese 1
Espécimes de Danio rerio (peixes-zebra) expostos ao carbendazim terão seus comportamentos alterados.
Premissas:
Peixes-zebra adultos, expostos ao carbendazim, se tornarão menos agressivos e menos ativos.
As modificações comportamentais observadas durante a exposição ao agrotóxico serão mais evidentes quanto maior for o tempo de exposição do animal.
Hipótese 2
O tempo de exposição de Danio rerio ao carbendazim será um fator determinante na exibição de comportamentos anormais.
Premissa:
A exposição prolongada de Danio rerio ao carbendazim acentuará a exibição de comportamentos anormais.
2. Materiais e métodos
2.1 Local de estudo, aquários e manutenção
O experimento foi conduzido no laboratório de Toxicologia da Escola de Farmácia (EFAR), localizado na Universidade Federal De Ouro Preto (UFOP). O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Ouro Preto, sob o protocolo de número 7061120319.
Foram estudados 177 indivíduos adultos de peixe-zebra (D. rerio), que foram aclimatados em aquários com capacidade de 3.5L de água. A temperatura da água foi controlada por termostatos, mantida entre 26°C e 28°C. A aeração dos aquários foi mantida com o auxílio de bombas, ligadas em tempo integral. O fotoperíodo foi ajustado através da iluminação da sala de cultivo, para que houvesse um ciclo claro/escuro de 14h:10h. Previamente, antes do início dos experimentos, os animais passaram por uma aclimatação/quarentena de duas semanas, para avaliar se eles possuíam alguma doença e para adaptação ao novo ambiente.
A água utilizada nos aquários foi previamente aclimatada em um tanque e preparada com neutralizador de cloro na proporção de 5ml de solução para cada 10L de água, de acordo com as informações fornecidas pelo fabricante. A troca de água dos aquários foi realizada a cada dois dias, onde cerca de 2L eram retirados e substituídos pelaágua que foi previamente aclimatada e condicionada.
A solução de carbendazim foi preparada em metanol, na concentração de 100μg/mL, e a partir dessa solução estoque foram preparadas as diluições para administração nos aquários. Na solução utilizada nos aquários foi acrescentado DMSO (dimetilsulfóxido) para garantir melhor absorção do carbendazim, já que ele é pouco solúvel em água (Hershberger and Arce, 1993). O DMSO é uma molécula que possui bastante solubilidade, com grande domínio polar, o que faz com que penetre com grande facilidade em
células e tecidos (Melo et al., 2008). Nos aquários do grupo controle foi adicionada uma concentração de 120g/L de DMSO; neste caso, o DMSO foi utilizado para criar um ambiente semelhante ao do grupo tratamento. No grupo tratamento foi adicionada uma concentração inicial de 120g/L de carbendazim solubilizado com DMSO e durante a manutenção dos aquários eram adicionados 120g/L do composto, visando manter a concentração inicial utilizada. A concentração final de DMSO nos aquários foi de 0.006%.
A exposição dos peixes ao carbendazim foi realizada de acordo com o protocolo OECD n°305, sendo padronizada a concentração de 120μg/L. Esse padrão foi utilizado com base no valor máximo permitido na água potável, seguindo a Portaria GM/MS Nº 888, de 4 de maio de 2021, do Ministério da Saúde (Brasil, 2021). É importante salientar que essa concentração é considerada sub-letal para o peixe-zebra, bem abaixo da concentração CL50 para o carbendazim (96h LC50: 0.83 mg/L; 0.55-1.97 mg/L 95%CI) (Federal Institute for Occupational Safety and Health, 2018).
Para este estudo os peixes foram divididos em oito aquários com 3,5L de água, sendo quatro aquários designados para a manutenção dos grupos- controle e quatro aquários designados para a manutenção dos grupos- tratamento (modelo experimental 4 x 4). O número de indivíduos por aquário está mostrado na Tabela 1. Os grupos-controle e tratamento foram mantidos por 7, 14, 28 e 35 dias nos aquários (Tabela 1). A solução de carbendazim não foi mais administrada nos aquários após 28 dias de manutenção, portanto, os peixes do tratamento de 35 dias passaram sete dias em água com degradação natural do carbendazim. Esse procedimento foi adotado para se avaliar se esse período de depuração seria suficiente para reverter os eventuais danos causados pelo carbendazim. O experimento foi realizado entre outubro e dezembro de 2020. Os peixes foram alimentados com ração floculada para peixes Alcon Basic® por aquário, uma vez ao dia, sempre às 9h. A quantidade de comida fornecida era suficiente para que todos os
Tabela 1: Número de peixes-zebra mantidos nos grupos-controle e tratamento, de acordo com o tempo de exposição ao carbendazim.
Aquário Grupo 7 dias Grupo 14 dias
Grupo 28
dias
Grupo 35
dias
Controle 22 23 22 22
Tratamento 21 21 22 24
Para obtenção dos dados comportamentais, cada um dos aquários foi filmado por 10 minutos diariamente, gerando 1680 horas de registros. As filmagens foram feitas após 30 minutos da alimentação dos peixes, com início às 9:30h da manhã, durante todo o experimento. Para as filmagens foram utilizadas duas câmeras montadas em tripés, sendo uma da marca Canon sx50 hs e uma da marca Sony hardcam dcr-dvd 106e, posicionadas diretamente em frente aos aquários. O observador entrava na sala apenas para ligar e desligar as câmeras, não permanecendo dentro da sala durante as filmagens.
2.2 Etograma
Um etograma para o experimento com os peixes-zebra foi montado a partir de 20 minutos de observações preliminares ad libitum e a partir de consultas à literatura científica (Kalueff et al., 2013; Orger and De Polavieja, 2017)(Tabela 2).
Tabela 2: Etograma de peixe-zebra (Danio rerio) utilizado no estudo, montado a partir de 20h de observações preliminares e de consultas à literatura científica(Kalueff et al., 2013; Orger and De Polavieja, 2017).
Comportamento Descrição
Inativo Peixe parado, porém, movendo os olhos e nadadeiras.
Comendo Comendo restos de ração no aquário.
Nadando devagar Natação lenta onde apenas as nadadeiras peitorais se mexem.
Nadando rápido Aceleração rápida em uma direção com uso da nadadeira caudal.
Nadando anormal Peixe nadando de lado, de ré, de cabeça para baixo, em espiral, em círculos ou convulsionando.
Cartesia Alternar entre afundar e emergir, de maneira vertical na coluna d’água, sem mexer as nadadeiras.
Agressão Ataque, mordidas, perseguição e flick (quando o peixe nada em direção um do outro, batem boca- boca, e nadam para o lado oposto).
Comportamentos anormais
Abrir a boca por muito tempo ou com muita frequência, bater a cabeça no vidro, tremor, nadar de um lado para o outro formando uma figura em 8.
Freezing Completa interrupção de movimentos, exceto olhos e opérculos, no fundo do aquário.
Ativo Propagação de ondas pelo corpo, comportamentos reprodutivos, forrageando, golfando ar da superfície, saltando para fora do aquário.
Não Visível No momento da coleta de dados, o peixe não está visível ao observador.
Outros Comportamentos não descritos previamente no etograma.
2.3 Dados Comportamentais
Os dados comportamentais foram coletadosa posteriori em laboratório, a partir das filmagens realizadas, utilizando-se o método scan, com registro instantâneo e intervalo amostral de 30 segundos (Altmann, 1974; Martin and Bateson, 2007). Foram anotados todos os comportamentos exibidos pelos peixes dentro dos aquários, além da posição em que cada peixe se encontrava dentro do aquário (superfície, meio ou fundo). Os comportamentos observados foram anotados em ficha de campo e transferidos para uma planilha no Excel, para posterior análise dos dados.
2.4 Coleta e Análise daágua
As coletas das amostras de água foram realizadas em todos os dias que ocorreram a limpeza e reposição de água dos aquários. Em cada coleta, foram reservados 500mL da água dos aquários, que foram armazenados em recipientes de plástico e levados para o Laboratório de Ecologia Aquática e Evolução do Instituto de Ciências Exatas e Biológicas (ICEB) da UFOP (LAECO-UFOP). No laboratório foram medidos o pH (com o uso de Phmetro de bancada modelo PHS-3E Ion previamente calibrado) e a alcalinidade da água, mensurada pelo método titulométrico (titulador digital Tirette®, modelo
Class A Precision de 50ml) (Apha, 2005). Para medir a alcalinidade da água foram obtidos os valores das concentrações do íon bicarbonato (HCO3-) e carbonato de cálcio (CaCO3). Para isso foram adicionados 100mL de água em um Erlenmeyer e adicionadas três gotas de alaranjado de metila em uma concentração de 0,1g/100mL e três gotas de fenolftaleína em uma concentração de 0,2g/100mL. Após a adição desses compostos foi obtida uma coloração alaranjada, seguida da titulação, com auxílio de uma bureta eletrônica contendo uma solução de 0,1 molar de H2SO4.Para se calcular a concentração de HCO3-foi utilizada a seguinte equação:
[HCO3-] = [H2SO4] X (Volume de H2SO4) X 1220
E para se calcular a concentração de CaCO3foi utilizada a seguinte equação:
[CaCO3] = [H2SO4] X (Volume de H2SO4) X 1000
Para a obtenção do oxigênio dissolvido (OD) foram utilizados testes multiparâmetros rápidos; a análise era feita uma vez por semana em todos os aquários do estudo. Os resultados dos parâmetros físico-químicos da água foram inseridos em uma planilha do Excel e utilizados nas análises, correlacionando-os aos dados comportamentais.
2.5 Análise Estatística
Os dados comportamentais foram analisados através da construção de Modelos Lineares Generalizados Mistos (GLMMs), onde os comportamentos apresentados pelos peixes-zebra foram as variáveis-resposta e a condição (tratamento ou controle), o tempo de exposição (7, 14, 28 e 35 dias) e a sua interação foram as variáveis explicativas. Modelos Lineares Generalizados Mistos também foram montados para avaliar se a condição (tratamento X controle; variável explicativa) influenciou o número de peixes ocupando o fundo, o meio ou a superfície do aquário (variável resposta). O dia de exposição foi a variável aleatória. Os menores modelos significativos foram
utilizados. A colinearidade entre os dados comportamentais foi testada utilizando-se a correlação de Spearman, previamente à construção dos GLMMs, mas nenhum comportamento apresentou colinearidade. A influência dos parâmetros físico-químicos da água sobre os comportamentos exibidos pelos peixes foi avaliada a partir de uma Análise de Componentes Principais (PCA). Todas as análises foram realizadas no programa R 4.0.4, utilizando-se a função glmer do pacote lme4, para a construção dos GLMMs (Bates et al., 2015) (sempre que necessário, ANOVAs foram realizadas como testes post- hoc) e a função PCA do pacote Vegan, para a análise dos componentes principais (Oksanen et al., 2020). Todos os modelos foram construídos com a distribuição do tipo Poisson. Todos os testes foram realizados ao nível de significância de 95%.
3. Resultados
Os comportamentos “inativo”, “anormal”, “freezing” e “cartesia” não foram registrados durante a coleta de dados. Os demais comportamentos apresentaram variação significativa de acordo com a condição (Tratamento x Controle), tempo de exposição (7, 14, 28 e 35 dias) e para a sua interação (Tabela 3).
Tabela 3: Resultados dos Modelos Lineares Generalizados Mistos para os comportamentos exibidos pelos peixes-zebra (Danio rerio) de acordo com sua condição (condition: tratamento X controle), dias de exposição (Group Days: 7, 14, 28 ou 35 dias), interação entre condição e dias de exposição (Condition:Group Days) e número de peixes ocupando o fundo (bottom), meio (middle) ou superfície (surface) dos aquários de acordo com a condição (tratamento x controle).
Response variables Explanatory variables
DF F value P-value
Eating Condition
Group Days
Condition:Group Days 1 3 3
0.2788 47.2059 17.1320
<0.0001
Swimming slow Condition Group Days
Condition:Group Days 1 3 3
10.305 12.573 26.843
<0.0001
Swimming fast Condition Group Days
Condition:Group Days 1 3 3
7.0179 7.6025 46.8447
<0.0001
Abnormal swim (whole model)
Condition Group Days
Condition:Group Days 1 3 3
54.423 13.659
0
<0.0001
Abnormal swim (reduced model)
Condition Group Days
1 3
59.776
14.103 <0.0001
Group Days
Condition:Group Days 3 3
23.944 39.859
Active Condition
Group Days
Condition:Group Days 1 3 3
30.070 39.881 52.317
<0.0001
Not visible Condition
Group Days
Condition:Group Days 1 3 3
8.6014 5.3214 5.9171
<0.0001
Aquarium bottom Condition 1 13.888 0.0003
Aquarium middle Condition 1 3.7043 0.064
Aquarium surface Condition 1 42.141 <0.0001
DF = degress of freedom
O comportamento “comendo” foi pouco registrado no estudo, sendo que os grupos de peixes da condição controle, mantidos por 14 e 28 dias, apresentaram significativamente a menor quantidade de registros desse comportamento (Figura 1).
Figura 1: Número de registros do comportamento “comendo” exibidos por peixes-zebra (Danio rerio) para as duas condições (controle x tratamento) e para os diferentes dias de exposição (7, 14, 28 e 35 dias).
O comportamento “nadando devagar” foi mais exibido pelo grupo tratamento, especialmente pelos peixes que ficaram expostos por mais tempo ao carbendazim (35 dias) (Figura 2). Para os peixes do grupo controle, os mantidos a 14 dias no aquário exibiram mais esse comportamento do que os demais grupos (Figura 2).
Figura 2: Número de registros do comportamento “nadando devagar”
exibidos por peixes-zebra (Danio rerio) para as duas condições (controle x tratamento) e para os diferentes dias de exposição (7, 14, 28 e 35 dias).
O comportamento “nadando rápido”variou bastante entre os peixes do grupo controle e do grupo tratamento, sendo encontradas diferenças estatísticas entre todos os grupos e entre os tratamentos (Figura 3). De maneira geral, os peixes do grupo controle apresentaram mais o comportamento de nadar rápido no início do estudo, caindo a sua exibição com o passar do tempo; já os peixes do grupo tratamento passaram a apresentar mais o comportamento de nadar rápido no final do experimento (28 e 35 dias) (Figura 3).
Figura 3: Número de registros do comportamento “nadando rápido” exibidos por peixes-zebra (Danio rerio) para as duas condições (controle x tratamento) e para os diferentes dias de exposição (7, 14, 28 e 35 dias).
O comportamento “nadando anormal” foi pouco exibido durante a coleta de dados, mas quando foi registrado, foi mais exibido pelos peixes do
grupo tratamento (Figura 4a), especialmente os mantidos por 35 dias (Figura 4b). O comportamento de atividade variou significativamente entre os tratamentos e entre os dias de manutenção (Figura 5). Para os peixes do grupo controle, esse comportamento aumentou com o tempo de manutenção, atingindo o seu pico de exibição no dia 35 (Figura 5). Já para os peixes do grupo tratamento, o padrão de crescimento ao longo do tempo também foi observado, mas com um pico no dia 28, seguido de uma queda significativa no dia 35 (Figura 5).
Figura 4: A) Número de registros do comportamento “nadando anormal”
exibidos por peixes-zebra (Danio rerio) para as duas condições (controle x tratamento); B) Número de registros do comportamento “nadando anormal”
exibidos por peixes-zebra (Danio rerio) para os diferentes dias de exposição (7, 14, 28 e 35 dias).
Figura 5: Número de registros do comportamento de atividade exibidos por peixes-zebra (Danio rerio) para as duas condições (controle x tratamento) e para os diferentes dias de exposição (7, 14, 28 e 35 dias).
A B
O comportamento de agressão também variou significativamente entre os tratamentos e entre os dias de manutenção, sendo mais frequente no grupo controle (Figura 6). Enquanto a agressividade dos peixes do grupo controle foi alta inicialmente (7 dias), houve uma queda acentuada com 14 dias e um aumento seguinte para os dias 28 e 35 (Figura 6). Já o grupo tratamento apresentou baixa agressividade com 7 dias de exposição ao carbendazim, um aumento significativo com 14 dias, seguido de uma queda significativa nos dias 28 e 35, voltando praticamente aos patamares do início da exposição (Figura 6).
Figura 6: Número de registros do comportamento de agressão exibidos por peixes-zebra (Danio rerio) para as duas condições (controle x tratamento) e para os diferentes dias de exposição (7, 14, 28 e 35 dias).
A quantidade de vezes que os peixes ficaram fora de visão do pesquisador foi muito baixa para ambas as condições (controle x tratamento),
sendo significativamente mais frequentes com sete dias de experimentação (Figura 7).
Figura 7: Número de vezes em que os peixes-zebra (Danio rerio) ficaram fora de visão do pesquisador nas duas condições (controle x tratamento) e nos diferentes dias de exposição (7, 14, 28 e 35 dias).
O carbendazim influenciou o uso do aquário pelos peixes-zebra: com a presença do fungicida, os peixes utilizaram mais a superfície do aquário do que o fundo (Figura 8a); sem o fungicida, os peixes-zebra usaram mais o fundo do aquário (Figura 8b).
Figura 8: A) Número de vezes em que os peixes-zebra (Danio rerio) foram registrados utilizando a superfície do aquário de acordo com a condição experimental (tratamento x controle); B) Número de vezes em que os peixes- zebra (Danio rerio) foram registrados utilizando o fundo do aquário de acordo
A B
Em relação aos parâmetros físico-químicos da água, as análises de componentes principais (PCA) mostraram que os dois primeiros componentes explicaram 94% da variação dos dados (Tabela 4).
Tabela 4: Resultados obtidos a partir de análises de componentes principais (PCA) para os fatores físico-químicos da água dos aquários onde eram mantidos peixes-zebra (Danio rerio) expostos ao fungicida carbendazim e em situação controle (não expostos ao carbendazim). CaCO3: Carbonato de cálcio; O2: oxigênio dissolvido.
PC1 PC2 PC3 PC4
Eigenvalue 2.88 0.89 0.23 0.002
Proportion explained 72% 22% 5.5% 0.5%
Cumulative proportion
72% 94% 99.5% 100%
Scores
pH 1.25 0.75 0.53 0.0006
CaCO3 1.52 0.06 -0.30 -0.05
O2 -0.87 1.25 -0.30 0.0009
Os fatores pH e carbonato de cálcio (CaCO3) apresentaram cargas fatoriais positivas com o componente 1, enquanto o fator oxigênio dissolvido apresentou carga fatorial negativa com o componente 1 (Figura 9). Todos os parâmetros avaliados apresentaram carga fatorial positiva para o componente 2 (Figura 9).
Figura 9: Fatores físico-químicos e suas relações com os grupos de peixes- zebras (Danio rerio) expostos ao carbendazim e ao grupo controle.
O pH apresentou uma variância significativa entre os dois grupos, sendo maior no grupo controle (média: 7.1± 0.4) do que no grupo tratamento (média: 6.4±1.5) (Figura 10a); porém analisados os dias de exposição dentro dos grupos não foram detectadas diferenças significativas (Figura 10b).
Figura 10: A) Dados de variância do pH em relação ao grupo controle versus tratamento; B) Variação do pH entre os dias de exposição para o grupo controle (azul) e tratamento (laranja).
O carbonato de cálcio (CaCO3) não apresentou diferenças significativas quando relacionados os grupos controle e tratamento (Figura 11a) e nem quando relacionado ao tempo de exposição (Figura 11b).
Figura 11: A) Variação do carbonato de cálcio (CaCO3) em relação aos grupos controle e tratamento; B) Variação do carbonato de cálcio entre os dias de exposição para o grupo controle (azul) e tratamento (laranja).
Não foram detectadas diferenças significativas no oxigênio dissolvido entre os grupos controle e tratamento (Figura 12a) e entre os dias de exposição (Figura 12b).
Figura 13: A) Variação do oxigênio dissolvido (O2) em relação aos grupos controle e tratamento; B) Variação do oxigênio dissolvido entre os dias de exposição para o grupo controle (azul) e tratamento (laranja).
4. Discussão
A exposição ao carbendazim modificou o comportamento do peixe- zebra adultos. O comportamento natatório variou entre momentos de lentidão e de rapidez, bem como o comportamento natatório anormal, significativamente mais demonstrado pelos peixes expostos por 35 dias ao carbendazim. A atividade dos peixes diminuiu com a exposição ao carbendazim, assim como a agressividade dos indivíduos. Esses resultados corroboram parcialmente nossas premissas iniciais, de que os peixes se tornariam mais letárgicos e menos agressivos, aumentando também a exibição de comportamentos anormais, de acordo com o tempo que ficassem expostos ao fungicida.
O carbendazim pode afetar a locomoção de peixes; segundo o estudo realizado porAndrade et al. (2016);larvas de peixe-zebra começaram a nadar mais lentamente após 40 minutos de exposição ao carbendazim. Já em bagres africanos (Clarias gariepinus) a exposição ao fungicida estimulou os indivíduos a nadarem de forma mais rápida após 15 dias de exposição(Nwani et al., 2015).
No presente estudo, a natação dos animais variou entre períodos de intensa natação rápida e períodos de intensa natação lenta, especialmente para os animais mantidos nos aquários por 35 dias ao agrotóxico. Essa modificação errática no padrão de natação foi registrada para larvas de peixe- zebra durante a exposição ao carbendazim (Zhang et al., 2022). Essa modificação no padrão natatório foi associada pelos autores a alterações na expressão gênica, como o DEG ctsbl, que processa e apresenta antígenos controla apoptose, autofagia e metabolismo, aumentando a morte celular, principalmente no sistema nervoso (Kara et al., 2019; Novais et al., 2012;
Zhang et al., 2022). Juntas, essas modificações fisiológicas podem estar induzindo interrupções motoras no comportamento natatório do peixe-zebra adulto no presente estudo.
A partir de uma revisão meta-analítica, a maioria dos estudos utilizando pesticidas, incluindo o carbendazim, demonstram uma redução significante da velocidade de natação de organismos aquáticos, incluindo os peixes (Shuman-Goodier and Propper, 2016). Os relatos destes autores sobre o efeito do aumento da letargia dos peixes estavam ligados à diminuição da liberação da enzima acetilcolinasterase no sistema nervoso, nestes casos a enzima não degradava corretamente a acetilcolina nas fendas sinápticas do tecido muscular, o que ocasiona uma falha na passagem de nervos impulsos e, consequentemente, diminuindo a mobilidade dos peixes.
Os efeitos da exposição ao carbendazim relacionados a produção da acetilcolinasterase em peixes-zebra foram avaliados, sendo observado um aumento na liberação desta enzima em exposições agudas (96h) e em concentrações iguais ou maiores a 4 µg/L, (concentrações testadas: 20, 100 e 500 µg/L) (Andrade et al., 2016).
No presente estudo a concentração de carbendazim utilizada foi de 120 µg/L, este valor é relacionado ao da produção de acetilcolinasterase em peixe-zebra (Andrade et al., 2016). Entretanto, a relação desta enzima com a modificação do comportamento natatório dos peixes-zebra adultos pode estar ligada as disfunções sinápticas das células musculares e neuronais. Um aumento significativo na produção da enzima acetilcolinasterase indica uma diminuição na concentração de acetilcolina na fenda sináptica, podendo levar a modificações nas células musculares, modificando analiticamente a atividades dos peixes (Pérez-Aguilar et al., 2018). Outra possibilidade seria que o aumento da liberação e da produção da acetilcolinasterase estaria ligado ao aumento da apoptose celular (Andrade et al., 2016), uma vez que os genes reguladores de ambas estão relacionados (Zhang et al., 2002;
Zhang and Greenberg, 2012). As respostas fisiológicas alteradas podem estar provocando anormalidades no comportamento natatório dos peixes- zebra. Disfunções endócrinas na tireoide, pois os hormônios tireoidianos
(Lebel et al., 1994; Puymirat et al., 1995), associadas à diminuição da resposta imune e ao aumento do estresse oxidativo, pode acarretar também no número de danos no DNA (Götte et al., 2020), podendo também estarem relacionados a esta alteração comportamental natatório. O monitoramento da atividade da acetilcolinasterase nos organismos aquáticos pode indicar a presença de contaminantes no corpo d’água, uma vez que a atividade e produção desta enzima responde a uma serie de agrotóxicos, dentre eles o carbendazim (Jebali et al., 2013).
No presente estudo a agressividade observada diminuiu com a exposição ao carbendazim, especialmente no grupo exposto por 28 dias à substância. Esta diminuição ocorreu concomitantemente com uma diminuição significativa na atividade. O peixe-zebra é caracterizado por apresentar um sistema hierárquico dominante, com a hierarquia sendo formada a partir de encontros agonísticos entre os indivíduos do cardume (Nasiadka e Clark, 2012). A agressividade se torna mais evidente durante este período de formação hierárquica e também na época reprodutiva (Nasiadka and Clark, 2012). Neste estudo, os peixes-zebra podem ter diminuído a agressividade à necessidade de redirecionar os reforços para outros comportamentos mais relevantes, como a natação rápida e a inatividade, com a finalidade de retomar à homeostase (Jacquin et al., 2020; Kristiansen et al., 2020). Uma alternativa para diminuir esta agressividade em ambos os grupos seria a partir da formação desta hierarquia dentro do cardume ao longo do tempo.
Porém, a hierarquia deste grupo de peixes é realizada em poucas horas, desde a formação do cardume (Filby et al., 2010), porem, no presente estudo, todos os peixes permaneceram juntos em quarentena durante 14 dias, desta forma descartamos esta hipótese.
O principal comportamento dos peixes-zebra observados no presente estudo foi ir até a superfície e engolir o ar. Houve um aumento na expressão desse comportamento, de acordo com a manutenção dos aquários do grupo controle, e de acordo com o tempo de exposição ao carbendazim ao longo
dos 28 dias, quando então observou-se uma queda brusca na expressão deste comportamento. A expressão deste comportamento já foi observada, para a carpa (Cyprinus carpio) exposta ao inseticida clorpirifós (Halappa and David, 2009), para a carpa rohu (Labeo rohita) exposta ao inseticida cipermetrina (Marigoudar et al., 2009) e também para o peixe brabo (Tor putitora), este também exposto a cipermtrina (Ullah et al., 2014). Em todos estes estudos, os autores sugeriram que a expressão deste comportamento pode estar ligada ao contato direto com a substância à qual foram expostos.
Apesar de os compostos citados não pertecerem a mesma classe, quando comparados ao carbendazim (cloropirifós: organofosforado; cipermetrina:
piretróide; carbendazim: benzimidazol), no presente estudo, este pode ser o motivo observado para o grupo tratamento, pois foi observado um aumento na exibição deste comportamento de acordo com o tempo de exposição, havendo uma queda significativa da exibição após os 28 dias, uma vez que não foi adicionado mais carbendazim nos aquários.
A inatividade e queda da expressão do comportamento de buscar o ar na superfície observada aos 25 dias de exposição pode estar ligada ao fato da água do aquário ter sido substituída completamente por água totalmente livre de carbendazim, sugerindo então que o termino da exposição ao carbendazim pode ter interrompido a expressão do comportamento de buscar ar na superfície. Entretanto, foi observado também um aumento da expressão deste comportamento no grupo controle, não exposto ao carbendazim. Todos os aquários receberam aeração continua e os níveis de oxigênio não apontaram um declínio durante o estudo. Tal comportamento é comum em peixes-zebra, podendo aumentar sua expressão de acordo com a qualidade dos ambientes, fatores como: parasitismo, estresse, depleção de oxigênio da água ou supersaturação de gás, podem corroborar para o aumento da expressão deste comportamento (Reed and Jennings, 2011).
Como foi observado um aumento na exibição de comportamentos agressivos
redirecionado o comportamento de buscar ar na superfície como resposta ao estresse causado pelos conflitos constantes.
A resposta de estresse à exposição ao carbendazim também é sugerida, uma vez que foi observado um aumento na expressão do comportamento natatório anormal, especialmente no grupo exposto a 35 dias.
O nado anormal é caracterizado quando o peixe nada de lado, para trás, de cabeça para baixo, espirais, com movimentos erráticos em forma de espiral, no presente estudo, todas as expressões desse modelo natatório foram registradas como comportamentos anormais. A exibição deste comportamento já foi observada para exposição à vários pesticidas (Cardoso et al., 2020; Dogan, 2017; Sabra and Mehana, 2015). A observação desse tipo de comportamento é um importante biomarcador do impacto dos agrotóxicos na biota aquática, uma vez que, o aparecimento pode estar ligado a fatores de estresse agudo e/ou crônico (Amoatey and Baawain, 2019;
Athira and Jaya, 2018; Dalzochio et al., 2016; Morado et al., 2017; Sarkar and Islam, 2020). A expressão do comportamento anormal indica baixo bem-estar e pode ocorrer tanto pela tentativa do animal de permanecer inconsciente de suas condições de vida subótimas quanto por alterações fisiológicas (Ashley, 2007; Galhardo and Oliveira, 2009; Martins et al., 2012).
Desta forma, peixes-zebra expostos ao carbendazim tendem a responder a este estressor, tornando o ambiente subótimo, aumentando então a exibição de comportamento natatório anormal, mesmo após uma queda na concentração de carbendazim, indicando então uma baixa qualidade de vida e bem estar destes peixes.
A expressão do comportamento de “comer” foi mais exibida no grupo tratamento de 7 dias, esse fato se dá devido ao inicio do experimento, o alimento permanecia disponível no aquário por mais de 30 minutos após a sua administração, permitindo então a alimentação fora dos horários estabelecidos, com o decorrer do experimento, forma feitos ajustes na administração do alimento, não sendo observado então a expressão deste
comportamento durante o estudo. Desta forma, a resposta não teve relação com os efeitos do carbendazim.
Em geral, a eliminação do carbendazim após 28 dias de exposição e a manutenção dos peixes por mais sete dias sem a presença deste composto, não produziu efeitos positivos no comportamento dos peixes-zebra expostos.
O aumento da natação errática e do nado anormal após 35 dias, associado à diminuição da agressividade, são indicativos de efeitos negativos prolongados do carbendazim na fisiologia dos peixes. De outro modo, o registro de diminuição da atividade após os 35 dias, e a expressão do comportamento de buscar ar na superfície, é um indicativo de que o estresse provocado pelo carbendazim, foi eliminado. Portanto, os efeitos deletérios do carbendazim nos peixes são observados por pelo menos 7 dias após a eliminação do poluente no corpo d’água, salientando a importância de evitar o uso desenfreado deste fungicida em culturas agrícolas.
Em relação aos parâmetros físico-químicos da água que foram avaliados, houve apenas uma diferença no pH dos grupos avaliados, sendo maior no grupo controle e menor no grupo exposto ao carbendazim. Em média o pH do grupo tratamento foi de 6,4 e o pH do grupo controle foi de 7,1, ou seja, o pH do grupo tratamento foi um pouco ácido em relação ao grupo controle que apresentou um pH neutro. Águas mais ácidas afetaram a resposta ao estresse secundário em peixe-zebra, onde a produção de glicose aumentou e a quantidade de glóbulos brancos e hemácias diminuíram com o tempo de exposição ao mesmo pH, demonstrando que os peixes estavam tentando lidar com o estresse causado pela água maisácida (Zahangir et al., 2015). Entretanto, o peixe-zebra sobrevive em águas com pH de 4, embora seja necessário ajustes fisiológicos (Kwong et al., 2014). No presente estudo, o pH do grupo tratamento tornou-se mais ácido em relação ao grupo controle.
Embora não tenha atingido os valores de 4 ou 5, esta é uma mudança de magnitude no pH que pode ser considerada o causador de alguns efeitos,
pelo menos em algumas interações eletrostáticas, essas modificações refletiram no aumento da velocidade de natação e no aumento da atividade.
5. Conclusão
Os resultados obtidos indicaram que o fungicida carbendazim modificou os comportamentos natatórios e agressivos do peixe-zebra, bem como aumentou a exibição de comportamentos anormais. Além disso, também modificou a área de utilização da coluna d’água pelos indivíduos (do fundo para a superfície). Em conjunto, os resultados obtidos, demonstram que a exposição ao carbendazim, principalmente na forma crônica, causa problemas nos peixes, afetando severamente sua fisiologia e seu comportamento. Em vida livre, essa mudança pode resultar em aumento do risco de predação e consequentemente diminuição ou extinção das populações. Desta forma, o uso indiscriminado do carbendazim pode estar causando efeitos severos na aptidão dos peixes.
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