UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CURSO DE GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
BARBARA BEATRIZ PHILIPPI MARTINS
EFEITOS DO ESTRESSE NEONATAL SOBRE A MORFOLOGIA DE NEURÔNIOS E CÉLULAS GLIAIS DO HIPOCAMPO EM RATOS MACHOS WISTAR AOS 90 DIAS DE
IDADE
Florianópolis 2016
Barbara Beatriz Philippi Martins
EFEITOS DO ESTRESSE NEONATAL SOBRE A MORFOLOGIA DE NEURÔNIOS E CÉLULAS GLIAIS DO HIPOCAMPO EM RATOS MACHOS WISTAR AOS 90 DIAS DE
IDADE
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial à obtenção do Grau de Bacharel em Ciências Biológicas Orientador: Profª. Drª Elisa Cristiana Winkelmann Duarte
Florianópolis 2016
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
Philippi Martins, Barbara Beatriz
EFEITOS DO ESTRESSE NEONATAL SOBRE A
MORFOLOGIA DE NEURÔNIOS E CÉLULAS GLIAIS DO HIPOCAMPO EM RATOS MACHOS WISTAR AOS 90 DIAS DE IDADE / Barbara
Beatriz Philippi Martins ; orientadora, Elisa Cristiana Winkelmann Duarte - Florianópolis, SC, 2015. 46 p. Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) -
Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de
Ciências Biológicas. Graduação em Ciências Biológicas. Inclui referências
1. Ciências Biológicas. 2. Estresse. 3. Intervenção Ambiental. 4. Manipulação neonatal. 5. Hipocampo. I. Winkelmann Duarte , Elisa Cristiana . II. Universidade Federal de Santa Catarina. Graduação em Ciências
Barbara Beatriz Philippi Martins
EFEITOS DO ESTRESSE NEONATAL SOBRE A MORFOLOGIA DE NEURÔNIOS E CÉLULAS GLIAIS DO HIPOCAMPO EM RATOS MACHOS WISTAR COM 90 DIAS DE
VIDA
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de Bacharel em Ciências Biológicas e aprovado em sua forma final pelo Programa de Graduação em Ciências Biológicas.
Florianópolis, x de Fevereiro de 2016.
________________________ Profª. Drª Maria Risoleta Freire Marque Coordenadora do Curso de Ciências Biológicas Banca Examinadora:
________________________
Orientadora: Professora Dra. Elisa Cristiana Winkelmann Duarte Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof.ª Drª. Kieiv Resende Moura de Souza
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof.ª Drª Viviane Mara Woehl Universidade Federal de Santa Catarina
RESUMO
Intervenções ambientais de diversos níveis são causadoras de mudanças fisiológicas e morfológicas no Sistema Nervoso Central, principalmente durante os primeiros estágios de desenvolvimento deste sistema. Estas mudanças são conhecidas por interferir no desenvolvimento morfológico normal do SNC, causando também modificações nas suas taxas de plasticidade neural normal. O hipocampo, região relacionada a formação de memórias e ao desenvolvimento cognitivo, apresenta neurogênese continuada na vida adulta, tornando-o extremamente sensível a mudanças ambientais no início da vida. Utilizamos aqui a manipulação neonatal como modelo para o estresse, sendo esta considerada uma intervenção moderada/baixa. Sendo assim, este trabalho tem como objetivo investigar as alterações a longo prazo causadas pela manipulação neonatal no desenvolvimento e plasticidade cerebral de ratos Wistar. Ratos Wistar machos (90 dias) foram submetidos a manipulação neonatal ao longo dos seus primeiros 11 dias de vida, sendo posteriormente sacrificados aos 90 dias e tendo seus encéfalos removidos e crioprotegidos. Após cortados, foram realizados tratamentos imunohistoquímicos com anti-GFAP, anti-NeuN e coloração Cresil violeta nos encéfalos. Com a análise destes observamos que a manipulação neonatal influenciou na plasticidade no hipocampo de ratos Wistar machos, as quais mantiveram-se até os 90 dias de idade. A análise da densidade glial e neuronal das regiões CA1, CA2, CA3, CA4 e DG demonstrou que houve aumento do número de células da micróglia na região CA3, enquanto a análise da densidade neuronal apresentou efeito contrastante, onde as regiões CA2, CA3, CA4 e DG apresentaram diminuição do número neurônios. A comparação das densidades celulares entre hemisférios demonstrou que houve lateralização, com maior número de células gliais e neuronais nos hemisférios direito e esquerdo, respectivamente, em animais manipulados. Assim, podemos concluir que a manipulação neonatal em ratos machos tem efeitos opostos no desenvolvimento hipocampal, gerando distúrbios na plasticidade celular neural. Estes efeitos também são opostos aos resultados previamente observados na literatura. Desta forma, este trabalho ressalta a importância das interferências ambientais neonatais no desenvolvimento neuronal normal, assim como a sensibilidade hipocampal para alterações fisiológicas.
Palavras-chave: Estresse; Intervenção ambiental, manipulação neonatal; hipocampo; himunohistoquímica; anti-GFAP; anti-NeuN; Cresil Violeta.
ABSTRACT
Environmental interventions of different levels cause physiological and morphological changes on the Central Nervous System, particularly on its first development stages. These changes are known to interfere on the normal morphological development of the CNS, also causing changes on its normal plasticity rates. The hippocampus, region associated to memory formation and cognitive development, shows continuous neurogenesis throughout adult life, thus being extremely sensitive to environmental changes on the beginning of life. On the present work the neonatal handling was used as a model of stress, acting as a mild environmental intervention. Hence, this work investigates the modification caused by neonatal handling on the neural development and plasticity of Wistar rats. Male Wistar rats (with 90 days of age) were handled through its 11 first days of life, furthermore being euthanized at its 90 days of age, finally having the removal and crioprotection of its brains. After slicing, the brains were stained with immunohistochemistry, using anti-GFAP, anti-NeuN antibodies and with Cresyl violet staining. The analysis of the slicing shown that neonatal handling influenced the hippocampu's plasticity os male Wistar rats, which were present on adult animals. Glial and neural density analysis demonstrated that the CA1, CA2, CA3, CA4 and DG regions had an increase of microglial cells on CA3, while neural cells decreased on CA2, CA3, CA4 and DG. Comparisons between hemispheres demonstrated that lateralization occured, with an increase on glial cells density on the right hemisphere and neural cells denstity on the left hemisphere of handled animals. Consequently, this present study concludes that neonatal handling caused contrasting effects on the hippocampal development of adult male Rat, influencing its neural plasticity. These effects are also conflicting with the results previously found and reported on the literature. In conclusion, this study emphasizes the role of environmental interventions on the normal neural development, as well as the hippocampus sensitivity to physiological changes.
Keywords: Stress; Environmental Intervention; Neonatal handling, Hippocampus, immunohistochemistry; anti-GFAP, anti-NeuN; Cresyl violet.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática de um corte transversal do hipocampo...19 Figura 2. Imagem de uma sessão coronal do hipocampo de rato Wistar corado com Cresil
Violeta...19 Figura 3. Área teste do hipocampo de animal controle 90 dias, demonstrando células gliais com GFAP...27 Figura 4. Área teste do hipocampo de animal controle 90 dias, demonstrando células piramidais da região CA1 imunocoradas com neu-N...27 Figura 5. Área teste do hipocampo de animal controle 90 dias, demonstrando células gliais e
granulares da região DG coradas com Cresil violeta...27 Figura 6. Efeito da manipulação neonatal no desenvolvimento de células gliais marcadas com GFAP no hipocampo de ratos Wistar...30 Figura 7. Efeito da manipulação neonatal no desenvolvimento de células neuronais marcadas com neu-N no hipocampo de ratos Wistar...31 Figura 8. Efeito da manipulação neonatal no desenvolvimento de células neuronais marcadas com Cresil no hipocampo de ratos Wistar...32
LISTA DE QUADROS
Síntese dos resultados obtidos na avaliação do desenvolvimento celular das regiões CA1, CA2, CA3, CA4 e DG hipocampais...34
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS:
MN- manipulação neonatal
CA1-CA4 – regiões 1 à 4 do cornus ammonis, células piramidais do hipocampo DG – giro dentado, região de células granulares do hipocampo
GFAP - Glial fibrillary acidic protein (proteína ácida fibrilar glial) Neu-N – neuronal nuclei (núcleo neuronal)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...17
1.1 O estresse e suas alterações na fisiologia e desenvolvimento do Sistema Nervoso Central...17
1.2 Efeitos do estresse no desenvolvimento hipocampal...18
1.3 A manipulação neonatal como modelo no estudo de estresse...21
2 OBJETIVOS...23 3.1 Objetivo Geral...23 3.2 Objetivos Específicos...23 3 METODOLOGIA...25 3.1 Animais...25 3.2 Manipulação Neonatal...25 3.3 Análise Morfológica...25 3.4 Análise estatística...26 4 RESULTADOS...29
4.1 Análise da densidade de células gliais marcadas com GFAP, neu-N e Cresil Violeta...29
5 DISCUSSÃO...36
6 CONCLUSÃO...39
1. INTRODUÇÃO
1.1 O estresse e suas alterações na fisiologia e desenvolvimento do Sistema Nervoso Central. O estresse é caracterizado por mudanças fisiológicas, geralmente relacionadas com mecanismos de “luta e fuga”, criadas em resposta a um estímulo externo ou intervenção ambiental (SAGERSTROM E MILLER, 2006). Estes mecanismos foram evolutivamente selecionados para permitir respostas eficientes a ameaças ambientais, como perseguição por predadores ou lutas entre grupos rivais (SAGERSTROM E MILLER, 2006). Atualmente, entretanto, seres humanos raramente deparam-se com os desafios e mudanças ambientais que seus ancestrais enfrentavam, acarretando em um mal uso dos mecanismos de regulação fisiológica de resposta ao estresse (ELLIOT E EISDORFER, 1982). Apesar de menos intensas, situações de estresse tornaram-se mais frequentes, desencadeando mecanismos de defesa fisiológicos (tais como diminuição dos níveis de cortisol, taquicardia e hiperglicemia) em resposta a situações de estímulo ambiental duradouras, como períodos de exames acadêmicos e desordens de estresse pós-traumático (BOS et al,, 2010). Estas respostas, tanto agudas quanto crônicas, foram demonstradas como desencadeadoras de sequelas psicológicas e cognitivas (OSTERBERQ et al,, 2014), imunossupressão (COHEN et al,, 2001), atraso no desenvolvimento sexual e desenvolvimento neuronal retardado (MCEWEN, 2014) em humanos.
Intervenções ambientais de diversos níveis são causadoras de mudanças fisiológicas e morfológicas no Sistema Nervoso Central, principalmente durante os primeiros estágios de desenvolvimento deste. Por exemplo, experiências gestacionais estressantes em humanos são associadas com diversas neuropatologias, como depressão, ansiedade, esquizofrenia e autismo na prole (KOENIG et al.,2002). O período neonatal é também crítico para o desenvolvimento cerebral, onde neurogênese e plasticidade cerebral ainda ocorrem (KOROSI et al.,2012). Durante este período a qualidade ambiental, experiências e o relacionamento entre pais e filhos são associados ao desenvolvimento de psicopatologias e declínios cognitivos na vida adulta (KOROSI et al.,2012). Em humanos, situações de modificações ambientais estressantes (como abandono, pobreza extrema e traumas agudos) nos primeiros anos de vida são relacionadas à alterações nos níveis de cortisol, no volume do hipocampo e córtex (HODEL et al., 2015; CARRION E WONG, 2012; LUBY et
al.,2013). Segundo Chugani et al. (2001), adolescentes e crianças institucionalizadas apresentam
atividades anormais nas regiões límbicas incluindo o hipocampo, apresentando consequentemente diminuição em sua capacidade cognitiva. Entretanto, estes efeitos deletérios podem ser revertidos se intervenções forem realizadas dentro do período crítico de desenvolvimento neuronal pós-natal, o qual estende-se até o segundo ano de vida (BOS et al.,2010).
18 Ratos, por serem animais modelo, possuem extensos estudos de impacto do estresse no desenvolvimento cerebral, suas consequências no comportamento social e modificações fisiológicas. Animais expostos a estímulos estressantes agudos apresentam lateralização neuroquímica cerebral, com diferentes taxas de produção de noradrenalina, catecolaminas e tirosina hidroxilase (SPASOJEVIC et al.,2013). Durante o período neonatal, estímulos ambientais têm efeitos duradouros sobre o comportamento emocional e reatividade ao estresse em animais adultos (KOLB et al.,2014). Observações em laboratório demonstram que estímulos estressantes elevados no período perinatal produzem uma grande gama de anormalidades comportamentais, como respostas prolongadas e intensas ao estresse, diminuição de capacidades cognitivas e memória, alteração de comportamento sociais, aumento da ansiedade e aumento no interesse por álcool (DUAN et al, 2013).Segundo Beane
et al, (2002), os efeitos das intervenções ambientais durante o período pós-natal podem constituir a
base da vulnerabilidade do indivíduo a doenças resultantes do estresse. Alterações agudas são apontadas como causas de altas taxas de dimorfismo sexual e baixa conectividade entre mãe e ninhada (FUJIMOTO et al.,2014; REIS et al., 2014).
1.2 Efeitos do estresse no desenvolvimento hipocampal.
O hipocampo (do latim “cavalo marinho”) é uma estrutura parte do sistema límbico, tendo importante papel no desenvolvimento cognitivo (KESSEL et al.,2001), regulação de humor e formação de memórias (VAGO et al.,2014). Esta estrutura encontra-se no lobo temporal medial, sendo a base do chifre temporal do ventrículo lateral (VAGO et al.,2014). Suas células são distintamente distribuídas de forma laminar, formando sub-regiões e camadas com células e características distintas (figura 1) (HARRY E D’HELLENCOURT, 2003). As regiões do cornu
ammonis CA1-CA4 são formadas por células piramidais, os quais possuem seus corpos celulares
distribuídos em lâmina única (figura 2). O giro dentado (DG), por sua vez, é assim chamado por ser constituído de células granulares, também laminarmente distribuídas. Neurônios hipocampais apresentam prolongamentos intraestruturais (entre regiões) e extraestruturais (entre hipocampo e outras regiões do sistema límbico), os quais são responsáveis pela formação de circuitos cerebrais límbico-corticais (MCEWEN, 1999). Por exemplo, as células granulares da região DG projetam fibras de mossy ligando-se a células piramidais CA3, enquanto células piramidais CA3 projetam-se para a região CA1 (figura 1) (HARRY E D’HELLENCOURT, 2013).
Figura 1: Representação esquemática de um corte transversal, esquematizando as regiões primárias do hipocampo e suas principais projeções. Observa-se que células piramidais de CA3 projetam-se em CA1; por sua vez, células do DG alongam-se para sua porção molecular interna, assim como em direção a região CA3. DG: Giro denteado; CA1-3: Camada de células piramidais. Fonte: Harry e d’Hellencourt (2013).
Figura 2: Imagem de uma sessão coronal do hipocampo de rato Wistar, corado com Cresil violeta. As porções coradas representam corpos celulares. As regiões CA1, CA2, CA3 e CA4 são formadas por células piramidais; DG: Giro denteado. Fonte: Imagem capturada pelo autor.
20
O hipocampo de mamíferos, e particularmente o giro dentado, é uma das poucas regiões do cérebro no qual a neurogênese continuada na vida adulta. Este processo é chamado de neurogênese hipocampal, sendo uma forma de plasticidade cerebral importante para o desenvolvimento de circuitos cerebrais, aprendizado e regulação emocional (AIMONE et al.,2011; LUCASSEN et
al.,2010). Em primatas, células granulares são predominantemente formadas durante o período
pré-natal, sendo que em humanos o desenvolvimento de DG continuando por 4-6 meses após o nascimento (SERESS, 1992). O desenvolvimento dendrítico, por sua vez, estende-se em humanos até o 5º ano de vida (HARRY E D’HELLENCOURT, 2003). Em ratos, cerca de 85% do giro dentado é formado após o nascimento, especialmente na primeira semana após pós-natal, assumindo maturidade no dia 21 de vida (BAYER et al.,1982). A neurogênese hipocampal é fortemente regulada por experiências, hormônios e condições ambientais. Por exemplo, aprendizado e exercícios são causadores de aumento nos níveis de neurogênese; em contraste, envelhecimento e exposição a estresse agudo ou crônico suprimem o desenvolvimento celular (KOROSI et al.,2012). O hipocampo como um todo é uma estrutura alvo de hormônios gonadais, da tireoide e adrenais, os quais modulam alterações na formação de sinapses, estruturas de dendritos e regulação do volume do giro dentado, tanto durante o desenvolvimento cerebral quanto na vida adulta. (RANCI et al, 2009)
A plasticidade neuronal é uma importante propriedade cerebral, caracterizada pela ocorrência de mudanças reversíveis ou de longo prazo em suas estruturas. Classicamente dois tipos de plasticidade estruturais hipocampais são observadas em resposta à estímulos estressantes: estímulos repetidos causadores de atrofia dos dendritos da região CA3, e estímulos agudos e crônicos inibidores de neurogênese no giro dentado (MCEWEN, 1999). Outro ponto importante a ser considerado na neurogênese hipocampal é a irreversibilidade de desregulações ocorridas no início da vida: enquanto reduções na neurogênese causadas por estresse na vida adulta podem ser remediadas (OOMEN et
al.,2007), eventos estressantes no período crítico do desenvolvimento cerebral são persistentes
(LEMAIRE et al.,2000). Kerosi et al, (2012) afirma ainda que eventos estressantes no início da vida são causadores de alterações permanentes no sistema neuroendócrino e cognitivo, diminuindo a capacidade de aprender e memorizar. Entretanto, foi-se observado que estímulos estressantes de baixa intensidade, como a manipulação neonatal, são estimulantes de plasticidade cerebral (WINKELMANN-DUARTE et al.,2011), causando também alterações comportamentais e fisiológicas positivas (SEVERINO et al.,2003).
1.3 A manipulação neonatal como modelo no estudo de estresse.
A manipulação neonatal (MN) é uma intervenção ambiental de baixa intensidade, a qual baseia-se na breve remoção dos filhotes do ninho seguida por contato físico com as mãos do manipulador (WINKELMANN-DUARTE et al.,2011). Em ratos, a estimulação de filhotes através de MN tem sido usada como um modelo experimental para examinar os mecanismos pelo qual variações do ambiente de baixa intensidade durante o período neonatal influenciam o desenvolvimento de sistemas neurais do SNC, dando origem a alterações comportamentais e neuroendócrinas de longa duração (BOUFLEUR, 2013). A MN afeta diversas funções do indivíduo durante a infância e fase adulta, como perda da função reprodutiva (PADOIN et al,, 2001, GOMES
et al., 2006), alterações hormonais (Severino et al., 2003, Todeschin et al., 2009) e morfológicas
(WINKELMANN-DUARTE Et al.,, 2007, CAMOZATTO et al,, 2009, WINKELMANN-DUARTE
et al.,2011). Além disso, intervenções no início da vida aumentam a liberação de fatores neurotróficos
(GAROFLOS et al., 2005), neurotrofina-3 (GAROFLOS et al., 2007), o fator de crescimento do nervo e diminuem receptores AMPA (KATSOULLI et al., 2014) no hipocampo.
A manipulação neonatal afeta o desenvolvimento das respostas do estresse sobre o eixo hipotálamo-hipófise adrenal (WINKELMANN-DUARTE et al.,2011). A redução da atividade do eixo hipotálamo-hipófise adrenal induzida por esta intervenção parece resultar, em partes, da redução da densidade de receptores para glicocorticoides no hipocampo e córtex pré-frontal, ocorrendo um feedback negativo no controle deste eixo (MEANEY et al., 1993, MEANEY et al., 1994). Estudos prévios demonstram que a MN reduz o número de neurônios no Locus coeruelus (LUCION et al., 2003), no núcleo paraventricular do hipotálamo (WINKELMANN-DUARTE et al., 2007; TODESCHIN et al., 2009) e área pré-óptica medial (CAMOZZATO et al.,2009) em ratos de 11 e 90 dias de idade. As alterações morfológicas causadas pela MN, entretanto, ainda não são bem compreendidas. Com base no que foi exposto até aqui, é perceptível que o hipocampo tem grande potencial de suscetibilidade às intervenções ambientais durante o período neonatal. Assim, este trabalho busca observar quais as consequências da intervenção neonatal induzida pela manipulação no número de células do hipocampo.
2 OBJETIVOS 1.1.1 Objetivo Geral
Verificar a alteração causada pela manipulação neonatal na densidade, multiplicação e lateralização celular do hipocampo de ratos Wistar submetidos a manipulação neonatal.
1.1.2 Objetivos Específicos
Comparar o número de células neuronais nas regiões CA1, CA2, CA3, CA4 e DG dos hemisférios direito e esquerdo do hipocampo em ratos manipulados e não manipulados no período neonatal, com idade de 90 dias.
Comparar e densidade óptica de astrócitos das áreas CA1, CA2, CA3, CA4 e DG dos hemisférios direito e esquerdo do hipocampo em ratos manipulados e não manipulados no período neonatal, com idade de 90 dias.
3 METODOLOGIA
3.1Animais
Para a realização dos experimentos foram utilizadas 40 ratas Wistar prenhas, sendo que cada ninhada teve número de filhotes padronizados em 8. Os filhotes foram mantidos com as mães até o 21º dia de vida, quando serão mantidos em caixas individuais. Todos os animais foram alojados em caixas, sendo estes mantidos em ciclo claro-escuro de 12 horas (luzes acendendo as 7h), em condições controladas de temperatura (22 ± 1ºC) e com acesso a água e ração ad libitum. Os experimentos foram executados de acordo com os padrões internacionais de bem-estar animal recomendados pela Lei 11.794/2008.
3.2 Manipulação neonatal
Os filhotes foram estudados aos 90 dias de idade, sendo cada grupo formado por dez ninhadas formadas por 8 indivíduos machos e fëmeas. Os animais manipulados receberam este tratamento nos primeiros 11 dias de vida, sendo o dia do nascimento considerado dia zero. As ninhadas permaneceram com as mães até os 21 dias, data na qual foi realizado o desmame, sendo eutanaziados aos 90 dias de vida. O mesmo procedimento foi realizado com os grupos controles, porém sem realização de manipulação. O método de manipulação consiste na separação dos filhotes da mãe, sendo estes gentilmente manipulados com as mãos, sempre pela mesma pessoa, com uso de luvas de látex. O procedimento foi realizado durante 1 minuto, diariamente e em horários alternados (variando entre matutino e vespertino).
3.3 Análise morfológica
Aos 90 dias de idade foram retirados um filhote (macho) de cada ninhada. Os animais foram anestesiados com xilasina/ketamina (0,1ml/100g de peso corporal) e perfundidos. A perfusão garante a retirada do sangue dos tecidos do animal, o qual pode afetar a análise microscópica posterior, e a fixação do tecido. A perfusão é realizada com solução salina heparinizada e solução fixadora (paraformaldeído 4% em tampão fosfato pH 7,4). Os encéfalos foram retirados cirurgicamente e fixados por 24 horas na mesma solução fixadora utilizada na perfusão. Após a fixação, os encéfalos a serem usados para coloração com cresil violeta foram incluídos em resina paraplast. Os cortes do hipocampo foram feitos segundo Paxinos & Watson (2008) em micrótomo a 5µm de espessura e intervalo de 200µm.
Para a técnica imunoistoquímica os encéfalos foram crioprotegidos em sacarose e cortados no criostato (Leica, modelo CM1850) a 50µm de espessura e coletados em lâminas histológicas. Com
26 estes cortes foram realizadas diferentes técnicas de imunoistoquímica, usando anticorpos primários para anti-GFAP (proteína fibrilar ácida glial, presente nas células gliais) e anti-neu-N (proteína específica do cérebro de mamíferos, presente nos neurônios) e anticorpos secundários conjugados com moléculas fluorescentes conforme protocolos de cada Kit. As figuras 3 e 4 demonstram a marcação celular de GFAP e neu-N, respectivamente. A análise da densidade celular foi feita com o software Chptool (Cyclops Histolopathological Tool). Por fim, os cortes também foram corados com cresil violeta, o qual cora a substância de Nissl em neurônios (figura 5). A marcação de células gliais e neuronais separadamente possibilita a individualização destas.
Os cortes contendo as diferentes regiões do hipocampo (CA1, CA2, CA3, CA4 e DG) foram observados ao microscópio Olympus Modelos Bx41, utilizando-se o programa Q-capture Pro 5.1. Foram fotografadas áreas de 300pt (390,06µm2) em objetiva de 40x para a contagem das células. Para cada região de cada animal foram analisadas 5 áreas, sendo estas de 5 cortes diferentes. A contagem do número de células foi feita através do método do dissector óptico.
3.4 Análise estatística
A análise da densidade celular foi feita com o software Chptool (Cyclops Histolopathological Tool). A estatística das diferenças dentre áreas dos hemisférios direito e esquerdo de animais controle e manipulados foi utilizada com análise de variância (ANOVA de uma via), seguida pelo teste de Newman Keuls (p<0,05) e Bonferroni (análise comparação múltipla), realizada com o software GraphPad Prism 6.2.
Figura 3: Área teste do hipocampo de animal controle 90 dias, demonstrando células gliais com GFAP. A:
Hemísfério direito; B: Hemisfério esquerdo. Fonte: Imagem capturada pelo autor.
Figura 4: Área teste do hipocampo de animal controle 90 dias, demonstrando células piramidais da região CA1
imunocoradas com neu-N. A: Hemisfério direito; B: Hemisfério esquerdo. Fonte: Imagem capturada pelo autor.
Figura 5: Área teste do hipocampo de animal controle 90 dias, demonstrando células gliais e granulares da região
4.0 RESULTADOS
4.1 Análise da densidade de células gliais marcadas com GFAP, neu-N e Cresil Violeta. Na Figura 6 estão apresentados os resultados referentes a análise da densidade celular através da retenção de luz por células gliais marcadas com GFAP. Segundo o teste não paramétrico de Newman Keuls, a porcentagem de marcação celular da região CA3 apresentou diferença significativa (p=0,0026), enquanto as regiões CA1, CA2, CA4 e DG não apresentaram alterações significativas (respectivamente p=0,1733, p=0,2979, p=0,1507, p=0,1281). Na região CA3 o teste de Bonferroni considera significativas as alterações causadas nos hemisférios direito de animais controles e manipulados, havendo maior densidade células do hemisfério direito.
A figura 7 apresenta os resultados referentes a análise de multiplicação celular de células neuronais, as quais foram marcadas com neu-N. Segundo o teste de Newman Keuls, a diferença das marcações celulares entre hemisférios direito e esquerdo dos grupos controle e manipulado foi significativa para as regiões CA2, CA3, CA4 e DG (p=0,0223, p=0,0158, p=0,0023,
p=0,0090respectivamente). A região CA1 não foi afetada pela manipulação neonatal (p=0,9202)
(Figura 7A). Segundo o teste de Bonferroni, a região DG apresentou um maior número de células no hemisfério direto de animais não manipulados em relação ao mesmo hemisfério de animais manipulados. Em comparação entre hemisférios de animais manipulados, segundo o teste de Benferroni o DG apresentou um significativo maior número de células no hemisfério esquerdo (Fígura 7E)
A figura 8, por sua vez, demonstra os resultados observados na análise da marcação Cresil em células neuronais e gliais. O teste de Newman Keuls aponta que não há diferença estatística significativa no número de células nas regiões CA1 (p=0,1282), CA2 (p=0,0866), CA3 (p=0,2462), CA4 (p=0,4535) e DG (p=0,1210).
30 D e n s id a d e G F A P - C A 1 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rd o 0 1 0 2 0 3 0 4 0 D e n s id a d e d a m a rc a ç ã o c e lu la r (% ) D e n s id a d e G F A P - C A 2 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rdo 0 1 0 2 0 3 0 4 0 D e n s id a d e d a m a rc a ç ã o c e lu la r (% ) D e n s id a d e G F A P - C A 3 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rdo 0 1 0 2 0 3 0 4 0 * D e n s id a d e d a m a rc a ç ã o c e lu la r (% ) D e n s id a d e G F A P - C A 4 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rdo 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 D e n s id a d e d a m a rc a ç ã o c e lu la r (% ) D e n s id a d e G F A P - D G R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rd o 0 1 0 2 0 3 0 4 0 D e n s id a d e d a m a rc a ç ã o c e lu la r (% )
A
B
C
D
E
Figura 6. Efeito da manipulação neonatal no desenvolvimento de células gliais marcadas com GFAP no hipocampo de ratos Wistar. (A) Porcentagem da marcação celular da região CA1, (B) porcentagem da marcação
celular da região CA2, (C) Porcentagem da marcação celular da região CA3, (D) Porcentagem da marcação celular da região CA4, (E) Porcentagem da marcação celular da região DG. NM: Não Manipulado; M: Manipulado.
D e n s id a d e N E U n - C A 1 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rd o 0 5 1 0 1 5 N ú m e ro d e c é lu la s D e n s id a d e N E U n - C A 2 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rd o 0 5 1 0 1 5 N ú m e ro d e c é lu la s D e n s id a d e N E U n - C A 3 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rd o 0 2 4 6 8 N ú m e ro d e c é lu la s D e n s id a d e N E U n - C A 4 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rd o 0 2 4 6 8 * N ú m e ro d e c é lu la s D e n s id a d e N E U n - D G R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rdo 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 * N ú m e ro d e c é lu la s A B C D E
Figura 7. Efeito da manipulação neonatal no desenvolvimento de células neuronais marcadas com neu-N no hipocampo de ratos Wistar. (A) Porcentagem da marcação celular da região CA1, (B) porcentagem da marcação
celular da região CA2, (C) Porcentagem da marcação celular da região CA3, (D) Porcentagem da marcação celular da região CA4, (E) Porcentagem da marcação celular da região DG. NM: Não Manipulado; M: Manipulado.
32 D e n s id a d e C r e s il - C A 1 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rdo 0 1 0 2 0 3 0 4 0 N ú m e ro d e c é lu la s D e n s id a d e C r e s il - C A 2 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rd o 0 1 0 2 0 3 0 4 0 N ú m e ro d e c é lu la s D e n s id a d e C r e s il - C A 3 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rd o 0 1 0 2 0 3 0 4 0 N ú m e ro d e c é lu la s D e n s id a d e C r e s il - C A 4 R e g iõ e s a n a lis a d a s NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o M E sq ue rd o 0 1 0 2 0 3 0 N ú m e ro d e c é lu la s D e n s id a d e C r e s il - D G R e g iõ e s a n a lis a d a s co ntr ole dir eit o NM Dir eit o M D ire ito NM Es qu erd o 0 2 0 4 0 6 0 N ú m e ro d e c é lu la s A B C D E Figura 8.
Efeito da manipulação neonatal no desenvolvimento de células neuronais marcadas com Cresil no hipocampo de ratos Wistar. (A) Porcentagem da marcação celular da região CA1, (B) porcentagem da marcação celular da
região CA2, (C) Porcentagem da marcação celular da região CA3, (D) Porcentagem da marcação celular da região CA4, (E) Porcentagem da marcação celular da região DG. NM: Não Manipulado; M: Manipulado.
Como síntese dos resultados apresentados o Quadro 1 demonstra os resultados observados nas regiões hipocampais analisadas:
Quadro 1. Síntese dos resultados obtidos na avaliação do desenvolvimento celular das regiões CA1, CA2, CA3, CA4 e DG hipocampais.
Região GFAP Neu-N Cresil
violeta
CA1 NS NS NS
CA2 NS Menor número de células em AM.
p=0,0223,
NS CA3 Maior densidade celular em AM
p=0,0026
Significativo maior número de células no hemisfério direito de AM (em comparação com ANM).
Menor número de células em AM.
p=0,0158
NS
CA4 NS Menor número de células na região em
AM. p=0,0023
NS
DG NS Menor número de células na região em
AM p= 0,0090
Significativo maior número de células no hemisfério esquerdo de AM (em comparação com o hemisfério direito de AM)
NS
5. DISCUSSÃO
Com este trabalho foi possível realizar avaliações morfológicas do efeito da manipulação neonatal no desenvolvimento e plasticidade neuronal e glial de ratos Wistar adultos.
A partir dos testes realizados foi verificado que um estímulo de estresse neonatal de baixa intensidade, como é o caso da manipulação neonatal, teve efeitos duradouros no desenvolvimento hipocampal dos ratos submetidos aos experimentos. Isto foi observado com a análise da densidade celular astroglial (GFAP), número de células neuronais (Neu-N) e número total de células (Cresil) das diferentes áreas do hipocampo. A análise foi feita entre animais não manipulados e manipulados, e entre hemisférios direito e esquerdo aos 90 dias de idade. Este desenho experimental foi escolhido levando-se em consideração trabalhos prévios nos quais foram observadas diferenças na lateralização cerebral em animais expostos a estresse, ao aumento do contato maternal e a alterações hormonais (CATTANI et al, 2013; RAFTOGIANNI et al, 2012). Os três testes realizados neste trabalho tiveram como objetivo analisar o desenvolvimento e plasticidade das regiões CA1, CA2, CA3, CA4 e DG do hipocampo.
Como observado no Quadro 1, neste trabalho foi observado que ratos Wistar machos submetidos a manipulação neonatal apresentaram diminuição do número de células neuronais nas regiões CA2, CA3, CA4 e DG, enquanto a região CA1 não apresentou diferenças significativas. A densidade de células gliais da região CA3, entretanto, foi maior em animais manipulados. As outras regiões hipocampais não apresentaram diferenças significativas em sua densidade. Quanto ao número de células totais coradas por Cresil violeta, não houveram diferenças significativas entre animais manipulados e não manipulados nas regiões CA1, CA2, CA3, CA4 e DG. Resumidamente, os achados mais importantes destes trabalhos são: a) a manipulação neonatal aumentou a densidade glial na região CA3 de ratos adultos; b) animais adultos manipulados apresentaram menor densidade neuronal nas camadas CA2, CA3, CA4 e DG de células piramidais; c) a manipulação neonatal induziu à diferentes efeitos nos hemisférios direito e esquerdo, com maior densidade glial e neuronal das camadas CA3 e DG nos hemisférios direito e esquerdo, respectivamente.
Estudos prévios demonstraram que a manipulação neonatal reduz o número de células gliais no Locus coerulios (LUCION et al., 2003), núcleo paraventricular (CAMOZZATO et al, 2009) e área preoptica medial (WINKELMANN-DUARTE et al., 2007) em ratos de 11 e 90 dias de vida. Entretanto, os efeitos da manipulação neonatal na densidade glial não são homogêneos em todas as estruturas cerebrais, podendos induzir consequências contrastantes em diferentes áreas. Em trabalho realizado por Winkelmann-Duarte et al. (2011), foi observado que a manipulação neonatal levou ao aumento no número de células gliais e neuronais no hipocampo de ratas fêmeas, o qual manteve-se
36 em animais adultos. Estes efeitos contrastantes em diferentes áreas neuronais são relacionados às características únicas da manipulação neonatal, a qual consiste em um estímulo ambiental de baixo impacto seguido por aumento da atenção maternal (comportamento de recompensa) (CAMOZZATO
et al, 2009).
Brunson et al (2003) demonstraram que a natureza das experiências ocorridas no início da vida de indivíduos é responsável por determinar as consequências nas funções hipocampais adultas. Assim sendo, estímulos de estresse de intensidade baixa durante o período neonatal resultam muitas vezes em consequências positivas, como aumento nas funções de memória (WINKEMANN-DUARTE et al., 2011; FENOGLIO et al., 2005). A manipulação neonatal é considerada um procedimento com efeitos aparentemente positivos no comportamento animal, levando a diminuição do medo e ansiedade (PADOIN et al, 2001) e facilidade nas respostas ao estresse na vida adulta (LIU
et al, 2000). Porém, o medo e a ansiedade são estímulos necessários para a sobrevivência da espécie,
uma vez que é através destes mecanismos que ocorre a fuga de diversas circunstâncias que poderiam provocar a morte dos indivíduos.
Neste estudo foi observado também um efeito de lateralização na densidade de células gliais, particularmente na região de células piramidais CA3, a qual foi maior no hemisfério cerebral direito (comparando-se com animais manipulados e não manipulados). O papel das células gliais em diferentes áreas do SNC é bastante compreendido. É sabido que células gliais, e principalmente astrócitos, possuem funções relacionada a migração e maturação de neurônios, formações das camadas de mielina, regulação de concentrações iônicas, integração sináptica e respostas a dando cerebral (I et al., 2001). Estudos também apontam para o papel das células gliais na plasticidade neuronal (MCCARTHY et al., 2002). Em estudo realizado em 2011 Samara et al., foi analisada a expressão de diversas proteínas no hipocampo de ratos adultos, onde 68% das proteínas analisadas (incluindo GFAP) foram mais expressadas no hemisfério direito. Entretanto, no trabalho aqui apresentado, não foi observada lateralização neuronal no hemisfério direito, mas sim no esquerdo.
Por sua vez, a diminuição da densidade neuronal observada nas regiões piramidais é contrastante com os resultados apresentados por Winkelmann et al (2011), em trabalho realizado com fêmeas. Neste trabalho os autores analisaram os efeitos da manipulação neonatal no desenvolvimento hipocampal de ratas fêmeas, tendo observado um aumento do número de neurônios nas áreas CA1, CA2 e CA3. Entretanto, como antes observado, os efeitos de intervenções ambientais em diferentes áreas cerebrais são diversos. Estudos prévios demonstraram que a manipulação neonatal reduz o número de células neuronais no Locus coerulios (LUCION et al, 2003), núcleo paraventricular (CAMOZZATO et al, 2009) e área preoptica medial (WINKELMANN-DUARTE, 2007) em ratos adultos. Adicionalmente, comportamentos sociais são reduzidos após intervenções ambientais no
início da vida (TODESCHIN et al., 2009), assim como a produção de espermatozoides e óvulos, e diminuição no volume de áreas cerebrais relacionadas a reprodução (WINKEMANN-DUARTE et
al., 2011). Estas alterações podem ser os causadores das diferenças encontradas na análise das
gônadas de machos e fêmeas.
Em conclusão, este trabalho demonstrou que intervenções ambientais no período neonatal são causadoras de consequências de longa duração, como aumento de densidade glial, diminuição da densidade neuronal e lateralização cerebral, as quais são observadas em animais adultos. Em vista destes resultados, podemos especular que a manipulação neonatal e estresse de baixa intensidade tem efeitos contrastantes no desenvolvimento hipocampal, gerando distúrbios na plasticidade celular neural. Como este estudo apresentou resultados contrastantes a análises previamente realizadas, é recomendável que futuras análises sejam feitas para corroboração das diferenças observadas. Em particular, são necessárias análises comportamentais (com foco em testes de inibição social, formação de memória e reprodução), de atividade celular (glial e neuronal) e de volume total do hipocampo.
38 6. CONCLUSÃO
A manipulação neonatal influenciou na plasticidade no hipocampo de ratos Wistar machos, as quais mantiveram-se até os 90 dias de idade.
A análise da densidade glial das regiões CA1, CA2, CA3, CA4 e DG demonstrou que houve aumento do número de células da micróglia na região CA3.
A análise da densidade neuronal das regiões CA1, CA2, CA3, CA4 e DG demonstrou que houve diminuição do número de neurônios nas regiões CA2, CA3, CA4 e DG.
A comparação das densidades celulares entre hemisférios demonstrou que houve lateralização, com maior número de células gliais e neuronais nos hemisférios direito e esquerdo, respectivamente.
A manipulação neonatal em ratos machos tem efeitos diversos no desenvolvimento hipocampal, gerando distúrbios na plasticidade celular neural. Estes efeitos também são contrastantes com os resultados previamente observados na literatura.
40
6. REFERÊNCIAS
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