Simulações de dinâmica molecular do receptor ativado de proliferadores de peroxissomos isoforma y
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(2) ´ FICHA CATALOGRAFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE QU´IMICA DA UNICAMP. Si38s. Silveira, Rodrigo Leandro. Simula¸co˜es de dinˆamica molecular do receptor ativado de proliferadores de peroxissomos isoforma γ / Rodrigo Leandro Silveira – Campinas, SP: [s.n], 2010. Orientador: Munir Salom˜ao Skaf Disserta¸ca˜o - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Qu´ımica. 1. Dinˆamica molecular. 2. Receptores nucleares. 3. PPARγ. 4. Rosiglitazona. I. Skaf, Munir Salom˜ao. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Qu´ımica. III. T´ıtulo.. T´ıtulo em inglˆ es: Molecular dynamics simulations of the peroxisome proliferatoractivated receptor isoform γ Palavras-chave em inglˆ es: Molecular dynamics, Nuclear receptors, PPARγ, Rosiglitazone ´ Area de concentra¸c˜ ao: F´ısico-Qu´ımica Titula¸c˜ ao: Mestre em Qu´ımica na a´rea de F´ısico-Qu´ımica Banca examinadora: Prof. Munir Salom˜ao Skaf (orientador), Prof. Rog´erio Cust´odio (IQ-UNICAMP), Prof. Gustavo de Miranda Seabra (DQF-UFPE) Data da defesa: 30/07/2010. ii.
(3) iv.
(4) Dedico esta disserta¸c˜ao ao meu pai Lucas, `a minha m˜ae Eliana e ao meu irm˜ao Henrique.. v.
(5) vi.
(6) Agradecimentos • Primeiramente, agrade¸co ao Prof. Munir pela excelente orienta¸ca˜o, pela amizade e por sempre estar a disposi¸c˜ao para ajudar. • Agrade¸co ao Leandro e ao Paulo, com os quais aprendi muito ao longo desses dois anos e que foram fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho. • A todo o grupo de pesquisa atual do Prof. Munir, al´em do Leandro e do ´ Paulo: Julio, Thiago, Clarisse, Melina, Lucas, Denise, Erica, Tatiana, Jorge. E aos antigos membros do grupo: Karen, Ary, Anders e Leandro novamente. • A todos os professores com os quais tive aulas no IQ e no IFGW e que contribuiram para a minha forma¸ca˜o. • Aos membros e suplentes da banca: Prof. Rog´erio Cust´odio, Prof. Gustavo Seabra, Prof. Ricardo Apar´ıcio e Prof. Douglas Galv˜ao. • Aos professores que participaram de meu exame de qualifica¸ca˜o e que deram valiosas contribui¸c˜oes: Prof. Ricardo Apar´ıcio e Prof. Pedro Vazquez. • A todos os funcion´arios do IQ, que foram fundamentais para deixar todo o instituto funcionando adequadamente. • Ao Instituto de Qu´ımica da Unicamp. • Ao CNPq e `a Fapesp pelo financiamento. • A toda a minha fam´ılia, em especial meus pais e meu irm˜ao pelo apoio incondicional em todos os momentos e porque sem eles nada teria gra¸ca.. vii.
(7) viii. Agradecimentos.
(8) Curriculum Vitae • Informa¸ c˜ oes pessoais Nome: Data de nascimento:. Rodrigo Leandro Silveira 03/06/1986. • Forma¸ c˜ ao universit´ aria Bacharelado em Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Lavras, 2004-2008.. • Mestrado Simula¸c˜oes de dinˆamica molecular do receptor ativado de proliferadores de peroxissomos isoforma γ Orientador: Prof. Dr. Munir S. Skaf (IQ-UNICAMP) Institui¸ca˜o: Instituto de Qu´ımica, Universidade Estadual de Campinas Ingresso: 08/2008, Defesa: 30/07/2010. • Prˆ emios e distin¸c˜ oes 1. Primeiro colocado na sele¸ca˜o para o ingresso ao doutorado, IQ-UNICAMP, 07/2010. 2. Terceiro colocado na sele¸c˜ao para o ingresso ao mestrado, IQ-UNICAMP, 07/2008. 3. M´erito acadˆemico de primeiro lugar entre os formandos de Engenharia de Alimentos de 07/2008, Universidade Federal de Lavras. ix.
(9) x. Curriculum Vitae • Projetos de inicia¸ c˜ ao cient´ıfica 1. 03/2008 a 07/2008: Simula¸c˜oes de dinˆamica molecular de difus˜ao em meios estratificados e fractais. Orientador: Prof. Dr. S´ergio Martins de Souza. Institui¸ca˜o: UFLA/MG. Bolsa: Fapemig. 2. 03/2007 a 02/2008: Modelagem matem´atica da difus˜ao em meios porosos. Orientador: Prof. Dr. S´ergio Martins de Souza. Institui¸c˜ao: UFLA/MG. Bolsa: Fapemig. 3. 03/2006 a 02/2007: Dinˆamica do modelo de Frenkel-Kontorova cl´assico unidimensional. Orientador: Prof. Dr. Antonio Tavares da Costa Junior. Institui¸ca˜o: UFF/RJ. Bolsa: Fapemig. • Artigo aceito para publica¸ c˜ ao 1. Hansson, A., Souza, P. C. T., Silveira, R. L., Mart´ınez, L., Skaf, M. S. “CHARMM force field parametrization of rosiglitazone.” International Journal of Quantum Chemistry, 2010. • Artigo em prepara¸ c˜ ao 1. Liberato, M. V., Nascimento, A. S., Lin, J. Z., Ayers, S., Silveira, R. L., Mart´ınez, L., Souza, P. C. T., Saidemberg, D., Deng, T., Togashi, M., Hsueh, W. A., Baxter, J. D., Phillips, K., Palma, M. S., Neves, F. A. R., Skaf, M. S., Webb, P., Polikarpov, I. “Medium chain fatty acids are PPARγ activators.” • Trabalhos apresentados em congressos 1. Silveira, R. L., Mart´ınez, L., Polikarpov, I. e Skaf, M. S. Estudo computacional do complexo PPARγ+ligante por dinˆamica molecular de equil´ıbrio. XV Simp´osio Brasileiro de Qu´ımica Te´orica, Po¸cos de Caldas, MG, 2009. Livro de resumos do XV SBQT, 2009. 2. Silveira, R. L., Souza, S. M. e Costa Jr, A. T. Determina¸ca˜o do coeficiente de autodifus˜ao do argˆonio por simula¸c˜oes de dinˆamica molecular. XXI Congresso de inicia¸ca˜o cient´ıfica, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, 2008. Livro de resumos, 2008..
(10) Curriculum Vitae. xi. 3. Silveira, R. L., Ferrua, F. Q. Estudo do efeito dos parˆametros do modelo de adsor¸ca˜o em leito fixo. XXI Congresso de inicia¸ca˜o cient´ıfica, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, 2008. Livro de resumos, 2008. 4. Silveira, R. L., Costa Jr. A. T. Simula¸c˜ao computacional do modelo de Frenkel-Kontorova cl´assico unidimensional. XXI Congresso de inicia¸ca˜o cient´ıfica, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, 2007. Livro de resumos, 2008. 5. Silveira, R. L., Costa Jr. A. T. Estudo da transferˆencia de energia ao longo de uma cadeia de N osciladores cl´assicos acoplados. XXI Congresso de inicia¸ca˜o cient´ıfica, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, 2007. Livro de resumos, 2007. 6. Silveira, R. L., Souza, S. M. e Costa Jr, A. T. Simula¸ca˜o computacional de processos difusivos por dinˆamica molecular. XXI Congresso de inicia¸ca˜o cient´ıfica, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, 2007. Livro de resumos. 2007. 7. Silveira, R. L., Costa Jr., A. T. Dinˆamica do modelo de Frenkel-Kontorova cl´assico unidimensional. XXI Congresso de inicia¸ca˜o cient´ıfica, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, 2006. Livro de resumos, 2006. • Experiˆ encia em ensino • IQ-UNICAMP: Programa de Est´agio Docente, n´ıvel C 1. 2010/1S - QF636 - Introdu¸ca˜o a` Espectroscopia e a` Termodinˆamica Estat´ıstica Supervisor: Prof. Dr. Munir S. Skaf 2. 2008/2S - QF531 - F´ısico Qu´ımica II Supervisor: Profa. Dra. Maria Isabel Felisberti • UFLA: Monitoria 1. 2005/2S - CEX175 - Mecˆanica Supervisor: Prof. Dr. S´ergio Martins de Souza.
(11) xii. Curriculum Vitae 2. 2005/1S - CEX167 - C´alculo II Supervisor: Profa. Dra. Iraziet da Cunha Charret ´ 3. 2004/2S - CEX166 - Geometria Anal´ıtica e Algebra Linear Supervisor: Prof. Dr. Eduardo Bearzoti • Disciplinas cursadas na P´ os-Gradua¸c˜ ao 1. 2010/1S - QP232 - Qu´ımica Quˆantica II (Conceito: A) Respons´aveis: Prof. Dr. Rog´erio Cust´odio e Prof. Dr. Nelson H. Morgon 2. 2009/2S - QP031 - Qu´ımica Quˆantica I (Conceito: A) Respons´avel: Prof. Dr. Yoshiyuki Hase 3. 2009/2S - QP433 - Introdu¸c˜ao `a Mecˆanica Estat´ıstica (Conceito: A) Respons´avel: Prof. Dr. Munir S. Skaf 4. 2008/2S - QP124 - Introdu¸c˜ao a` Qu´ımica Quˆantica e a` Espectroscopia (Conceito: A) Respons´aveis: Prof. Dr. Yoshiyuki Hase e Prof. Dr. Francisco B. T. Pessine 5. 2008/2S - QP125 - Introdu¸c˜ao `a Termodinˆamica e `a Cin´etica (Conceito: A) Respons´aveis: Profa. Dra. Maria Isabel Felisberti e Profa. Dra. In´es Joekes.
(12) Resumo O Receptor Ativado de Proliferadores de Peroxissomos Isoforma γ (PPARγ) ´e uma prote´ına pertencente `a superfam´ılia dos Receptores Nucleares. Atrav´es da liga¸ca˜o de pequenas mol´eculas, o PPARγ controla a transcri¸ca˜o de genes ligados a` diferencia¸ca˜o de adip´ocitos e ao metabolismo de glicose e de lip´ıdeos. O PPARγ tem uma enorme cavidade de liga¸ca˜o que permite a liga¸ca˜o de v´arias mol´eculas estruturalmente distintas que geram respostas fisiol´ogicas tamb´em distintas. O PPARγ ´e o receptor de uma classe de drogas antidiab´eticas cujo principal representante ´e a rosiglitazona. Al´em disso, diversos ligantes naturais ativam o receptor e, recentemente, foi descoberto que a´cidos graxos de cadeia m´edia podem se ligar e ativar o PPARγ. A estrutura cristalogr´afica do PPARγ na presen¸ca de ´acido nonan´oico mostrou que havia 3 ligantes simultaneamente ligados ao receptor. Neste trabalho, utilizamos simula¸c˜oes de dinˆamica molecular para investigar a dinˆamica do PPARγ ligado `a rosiglitazona e aos a´cidos nonan´oico, c´aprico e l´aurico. Observamos que a rosiglitazona n˜ao ocupa todo o s´ıtio de liga¸c˜ao, havendo uma complementaridade entre o ligante e o receptor na base do dom´ınio de liga¸ca˜o. Os ´acidos graxos, por outro lado, ocupam quase 100% da cavidade de liga¸ca˜o. Vimos que mol´eculas de a´gua dentro do s´ıtio s˜ao essenciais para a liga¸ca˜o dos ´acidos graxos. A capacidade de ativa¸ca˜o dos diferentes ´acidos graxos foi correlacionada `a capacidade dos mesmos manter liga¸c˜ao de hidrogˆenio com o res´ıduo Y473, localizado na h´elice 12, a qual deve ser estabilizada para ativar o receptor. Al´em disso, simula¸co˜es de complexos formados pela liga¸c˜ao simultˆanea da rosiglitazona e de um ´acido nonan´oico sugeriram que o receptor pode comportar diferentes ligantes simultaneamente. Por fim, utilizamos uma t´ecnica especial de dinˆamica molecular para investigar as poss´ıveis rotas de dissocia¸ca˜o dos a´cidos graxos do receptor. Observamos que existe um caminho preferencial para a dissocia¸c˜ao dos ligantes e que as principais flutua¸co˜es estruturais da prote´ına envolvidas no processo ocorrem na h´elice 3 do PPARγ.. xiii.
(13) xiv. Resumo.
(14) Abstract The Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Isoform γ (PPARγ) is a protein belonging to the Nuclear Receptors superfamily. PPARγ controls the transcription of genes related to adipocyte differentiation and lipid and glucose metabolism. PPARγ has a large ligand-binding pocket that allows the binding of many molecules with uncorrelated structure that generate distinct physiologic responses. PPARγ is the receptor of a class of antidiabetic drugs whose the main representant is rosiglitazone. Moreover, several natural ligands activate the receptor and, recently, it was discovered that medium chain fatty acids can bind and activate PPARγ. The crystallographic structure of the complex formed by PPARγ and nonanoic acid showed 3 ligands simultaneously binded to the receptor. In this work, we performed molecular dynamics simulations to investigate the dynamics of PPARγ in the presence of rosiglitazone and nonanoic, capric and lauric acids. We observed that rosiglitazone does not occupy the whole binding pocket and there is a complementarity between ligand and receptor. The fatty acids, on the other hand, occupy almost 100% of the binding pocket. We saw that some water molecules within the binding pocket are essential to the binding of the fatty acids. The activation capacity of the different fatty acids were correlated to the capacity to keep hydrogen bond with the residue Y473 of helix 12, which must be stabilized in order to activate the transcription. Furthermore, some simulations of the complex formed by simultaneus binding of rosiglitazone and nonanoic acid suggested that the receptor can bear different ligands simultaneously. Finally, we used a special technique of molecular dynamics to investigate the possible dissociation paths of the nonanoic acids from the receptor. The simulations suggest that there is a preferential path to the dissociation of the ligands and the main structural fluctuations involved in the process take place in the helix 3 of the receptor.. xv.
(15) xvi. Abstract.
(16) Sum´ ario Lista de Abreviaturas. xxi. Lista de Figuras. xxiii. Lista de Tabelas. xxix. 1. Introdu¸c˜ ao. 2. Receptores Nucleares 2.1 Mecanismo de a¸c˜ao . . . . . . . . . . . 2.2 Estrutura e fun¸c˜ao . . . . . . . . . . . . 2.2.1 Estrutura do LBD . . . . . 2.2.2 Estrutura do DBD . . . . . 2.3 A regula¸c˜ao da transcri¸ca˜o . . . . . . . 2.3.1 Intera¸c˜ao com coativadores 2.3.2 Intera¸c˜ao com correpressores 2.4 Mecanismos de dissocia¸ca˜o de ligantes .. 3. 1. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. O PPARγ 3.1 A biologia do PPARγ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Aspectos estruturais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Dom´ınio de liga¸ca˜o com ligante . . . . . . . 3.2.2 A h´elice 12 e a intera¸c˜ao com correguladores 3.3 Aspectos dinˆamicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 Os ligantes do PPARγ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.1 Ligantes naturais . . . . . . . . . . . . . . . 3.4.2 Ligantes sint´eticos . . . . . . . . . . . . . . xvii. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. 3 4 4 6 7 7 9 9 10. . . . . . . . .. 15 15 17 19 21 22 23 24 26.
(17) xviii 4. Sum´ario Simula¸c˜ oes de dinˆ amica molecular. 29. 4.1. Fundamentos te´oricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 29. 4.1.1. Dinˆamica molecular e mecˆanica quˆantica . . . . . .. 29. 4.1.2. Dinˆamica molecular e mecˆanica estat´ıstica . . . . .. 33. Solu¸ca˜o das equa¸c˜oes de movimento . . . . . . . . . . . . . . .. 36. 4.2.1. Ensemble microcanˆonico . . . . . . . . . . . . . . .. 37. 4.2.2. Outros ensembles . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 40. 4.3. Potenciais de intera¸ca˜o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 43. 4.4. Condi¸co˜es de contorno peri´odicas . . . . . . . . . . . . . . . . .. 47. 4.5. Dinˆamica molecular de prote´ınas . . . . . . . . . . . . . . . . .. 51. 4.5.1. Etapas envolvidas na simula¸ca˜o . . . . . . . . . . .. 51. 4.5.2. Dinˆamica molecular com amostragem ampliada . .. 54. 4.2. 5. Estudo dos complexos BRL-PPARγ e MCFA-PPARγ. 57. 5.1. Introdu¸ca˜o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 57. 5.2. Detalhes das simula¸c˜oes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 58. 5.3. O complexo BRL-PPARγ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 61. 5.3.1. Estrutura cristalogr´afica . . . . . . . . . . . . . . .. 62. 5.3.2. An´alise dos modos de liga¸c˜ao . . . . . . . . . . . .. 63. 5.3.3. Estabiliza¸c˜ao da h´elice 12 . . . . . . . . . . . . . .. 68. 5.3.4. Mobilidade da rosiglitazona . . . . . . . . . . . . .. 70. 5.3.5. Energias de intera¸ca˜o ligante-ambiente . . . . . . .. 73. Os complexos MCFA-PPARγ . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 73. 5.4.1. Estudos preliminares . . . . . . . . . . . . . . . . .. 74. 5.4.2. Estrutura cristalogr´afica . . . . . . . . . . . . . . .. 76. 5.4.3. An´alise dos modos de liga¸c˜ao . . . . . . . . . . . .. 77. 5.4.4. Estabiliza¸c˜ao da h´elice 12 . . . . . . . . . . . . . .. 83. 5.4.5. A mobilidade dos NA . . . . . . . . . . . . . . . . .. 85. 5.4.6. Energias de intera¸ca˜o e a hidrata¸ca˜o dos NA . . . .. 88. 5.4.7. Volume ocupado do LBD . . . . . . . . . . . . . . .. 91. 5.4.8. Os diferentes MCFAs . . . . . . . . . . . . . . . . .. 92. 5.5. Os complexos tern´arios BRL-NA-PPARγ . . . . . . . . . . . .. 95. 5.6. Conclus˜oes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 99. 5.4.
(18) Sum´ario 6. Estudo da dissocia¸c˜ ao dos ´ acidos nonan´ oicos por DMAA 6.1 Introdu¸ca˜o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2 Detalhes das simula¸c˜oes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3 Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.1 As rotas de dissocia¸ca˜o . . . . . . . . . . . . . . 6.3.2 Flutua¸c˜oes estruturais envolvidas na dissocia¸ca˜o 6.3.3 Considera¸c˜oes acerca da h´elice 12 . . . . . . . . 6.4 Conclus˜oes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. xix. . . . . . . .. . . . . . . .. 101 101 101 104 104 107 110 113. 7. Conclus˜ oes finais. 115. A. Nomenclatura e estrutura dos amino´ acidos. 119.
(19) xx. Sum´ario.
(20) Lista de Abreviaturas 15-dPGJ2. 15-deoxi-∆12,14 -prostaglandina J2. AF. Fun¸c˜ao de ativa¸c˜ao. AR. Receptor de andr´ogeno. BRL. Rosiglitazona (c´odigo no PBD). CA. ´ Acido c´aprico. DBD. DNA-binding domain. DMAA. Dinˆamica molecular com amostragem ampliada. DNA. ´ Acido desoxirribonucleico. ER. Receptor de estr´ogeno. LA. ´ Acido l´aurico. LBD. ligand-binding domain. LBP. ligand-binding pocket. MCFA. ´ Acido graxo de cadeia m´edia. NA. ´ Acido nonan´oico. PDB. Protein Data Bank. PPAR. Receptor ativado de proliferadores de peroxissomos xxi.
(21) xxii. Lista de Abreviaturas. PPRE. Elementos responsivos do PPAR. RMN. Ressonˆancia Magn´etica Nuclear. rmsd. root mean squared deviation. rmsf. root mean squared fluctuation. RAR. Receptor do a´cido retin´oico. RXR. Receptor do a´cido X retin´oico. TR. Receptor do hormˆonio tireoideano. TZD. Tiazolidinediona. VDR. Receptor de vitamina D.
(22) Lista de Figuras 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. 2.7. Esquema representativo dos dom´ınios estruturais de um receptor nuclear. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 5. Estrutura do LBD do receptor do a´cido retin´oico evidenciando os 3 planos de α-h´elices, as folhas β e o ligante a´cido trans-retin´oico (PDB: 2LBD) [6]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 6. Estrutura do DBD do receptor de estr´ogeno ligado aos elementos responsivos (PDB: 1HCQ) [8]. Os ´ıons Zn2+ est˜ao representados como esferas alaranjadas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 8. Esquema representativo dos dedos de zinco mostrando a P-box e a D-box. Adaptado de [11]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 8. Estrutura cristalogr´afica do PPARα associado a pept´ıdeo (a) coativador (PDB: 1K7L) e (b) correpressor (PDB: 1KKQ), ambos em lil´as, destacando a posi¸ca˜o da H12 em amarelo [15, 16]. . . . .. 10. Estrutura cristalogr´afica do LBD do (a) RXRα sem ligante (PDB: 1LBD) e (b) RXRγ+´acido retin´oico (PDB: 2LBD). Em destaque est˜ao as H12 e os loops entre a H11 e H12 [5, 6]. . . . . . . . . . .. 11. Trˆes caminhos de dissocia¸c˜ao para o receptor do hormˆonio tireoideano. O caminho I se assemelha ao mecanismo da ratoeira. Os caminhos II e III s˜ao novos e n˜ao contradizem a associa¸ca˜o com coativadores [27]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 12. xxiii.
(23) xxiv 3.1. 3.2 3.3 3.4. 3.5 3.6 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 5.1 5.2. Lista de Figuras Estrutura do complexo PPARγ+RXRα sobre o DNA. O PPARγ ´e mostrado em verde, o RXRα em azul, os pept´ıdeos coativadores em vermelho, os ´ıons zinco em amarelo e os elementos responsivos (DNA) em lil´as. Na parte superior, s˜ao vistos os dois LBD’s em contato e, na parte inferior, os DBD’s em contato com o DNA (PDB: 3DZY) [24]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estrutura cristalogr´afica do LBD do PPARγ (PDB: 1PRG). As α-h´elices aparecem em azul e a folha β em amarelo [25]. . . . . . Estruturas qu´ımicas de alguns ligantes naturais do PPARγ. . . . Curva dose-resposta dos agonistas sint´eticos rosiglitazona e pioglitazona e dos a´cidos hexan´oico (C6), octan´oico (C8), nonan´oico (C9), decan´oico (C10) e dodecan´oico (C12). . . . . . . . . . . . . Estrutura da rosiglitazona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estrutura da do agonista parcial GW0072. . . . . . . . . . . . . . Termos utilizados para modelar intera¸co˜es entre a´tomos ligados covalentemente: (a) o estiramento de liga¸c˜oes qu´ımicas, (b) a deforma¸ca˜o angular entre trˆes a´tomos ligados sucessivamente e (c) as tor¸co˜es diedrais associadas a quatro ´atomos ligados sucessivamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Representa¸c˜ao gr´afica dos potenciais de Lennard-Jones e de Coulomb. Enquanto o potencial de Coulomb decai lentamente e ´e sempre atrativo ou sempre repulsivo, o potencial de Lennard-Jones ´e de curto alcance e forma um po¸co de potencial de profundidade εij . A distˆancia interatˆomica onde o potencial de Lennard-Jones ´e m´ınimo ´e dada por Rmin,ij . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Condi¸co˜es de contorno peri´odicas. O sistema central ´e replicado em todas as dire¸co˜es e, quando um a´tomo deixa uma caixa atrav´es de uma face, um outro ´atomo entra na face oposta com a mesma velocidade do ´atomo que saiu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Representa¸c˜ao das distribui¸co˜es de carga consideradas na soma de Ewald. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Estrutura da rosiglitazona separada em 3 grupos. . . . . . . . . . Estrutura cristalogr´afica do complexo BRL-PPARγ. . . . . . . . .. 18 19 25. 26 27 27. 44. 46. 48 50 62 63.
(24) Lista de Figuras 5.3 5.4. xxv. Os res´ıduos polares em contato com o grupo A da rosiglitazona. As esferas vermelhas representam mol´eculas de a´gua. . . . . . . .. 64. Porcentagem de tempo em que h´a forma¸ca˜o de contatos entre cada res´ıduo do LBD e a rosiglitazona. Somente os contatos que se mantˆem em mais de 10% do tempo total de simula¸ca˜o foram considerados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 64. 5.5. Densidade de probabilidade das distˆancias m´ınimas entre os res´ıduos mais pr´oximos do grupo A da rosiglitazona. . . . . . . . . . . . . 65. 5.6. (a) Porcentagem de tempo em que h´a forma¸ca˜o de contatos entre cada res´ıduo do LBD e a rosiglitazona; (b) energia eletrost´atica m´edia de intera¸c˜ao entre cada res´ıduo e a rosiglitazona; (c) energia de van der Waals m´edia de intera¸ca˜o entre cada res´ıduo e a rosiglitazona; (d) energia total m´edia de intera¸ca˜o entre cada res´ıduo e a rosiglitazona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 66. 5.7. Redes de liga¸c˜oes de hidrogˆenio envolvidas na estabiliza¸ca˜o da H12. 69. 5.8. (a) Densidade de probabilidade do rmsd do movimento interno da rosiglitazona (preto) e do movimento relativo ao LBD (vermelho); (b) representa¸c˜ao gr´afica do movimento interno da rosiglitazona; (c) distribui¸ca˜o dos valores do ˆangulo diedro em torno da liga¸c˜ao C — O; (d) representa¸c˜ao do movimento da rosiglitazona em rela¸c˜ao ao LBD. A superf´ıcie lil´as mostra o volume varrido pela mol´ecula e as azuis mostram a camada de solvata¸ca˜o. . . . . . . . . . . . .. 71. (a) Disposi¸ca˜o dos NA antes da dinˆamica molecular; (b) evolu¸ca˜o temporal do rmsd do NA2, em rela¸c˜ao a` estrutura cristalogr´afica, durante a etapa 2 de prepara¸ca˜o; (c) disposi¸ca˜o dos NA ap´os o novo refinamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 75. Contatos polares NA-receptor vistos na estrutura cristalogr´afica. As esferas vermelhas s˜ao oxigˆenios de mol´eculas de a´gua. A Y327 mostrada na figura est´a pr´oxima ao NA1 mas n˜ao o suficiente para formar liga¸ca˜o de hidrogˆenio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 76. Porcentagem de tempo em que h´a forma¸ca˜o de contatos entre cada res´ıduo do LBD e (a) NA1, (b), NA2 e (c) NA3. Somente os contatos formados em mais de 10% do tempo total de simula¸c˜ao foram considerados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 77. 5.9. 5.10. 5.11.
(25) xxvi 5.12. Lista de Figuras Densidade de probabilidade (a) das distˆancias m´ınimas entre os res´ıduos polares mais pr´oximos do NA1 e (b) das energias de intera¸ca˜o envolvidas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 79. 5.13. Densidade de probabilidade das distˆancias m´ınimas entre os res´ıduos mais pr´oximos do carboxilato do NA3. . . . . . . . . . . . . . . . 81. 5.14. Densidade de probabilidade das energias de intera¸ca˜o NA3-res´ıduo polar/carregado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 82. Redes de liga¸co˜es de hidrogˆenio envolvidas na estabiliza¸c˜ao da H12, induzidas pelo NA1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 84. 5.16. Densidade eletrˆonica entre o NA1 e o res´ıduo Y327. . . . . . . . .. 85. 5.17. Flutua¸co˜es atˆomicas dos trˆes a´cidos nonan´oicos. . . . . . . . . . .. 86. 5.18. As cavidades do s´ıtio de liga¸ca˜o dos NA. (a) s´ıtio do NA1; (b) s´ıtio do NA2; (c) s´ıtio do NA3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 87. 5.19. Solvata¸ca˜o m´edia em fun¸ca˜o do tempo. . . . . . . . . . . . . . . .. 90. 5.20. Representa¸ca˜o da cavidade de liga¸ca˜o. Os NA na posi¸c˜ao da estrutura cristalogr´afica est˜ao em vermelho e em branco est˜ao a superposi¸ca˜o das conforma¸co˜es adotadas durante as simula¸c˜oes. As superf´ıcies transl´ ucidas de cor violeta, verde e alaranjado delimitam o volume ocupado pelos a´cidos graxos durante a simula¸c˜ao, levando em conta todas as conforma¸co˜es adotadas. A superf´ıcie azul mostra a ocupa¸ca˜o das mol´eculas de a´gua dentro do s´ıtio de liga¸ca˜o. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 92. (a) Probabilidade de que a distˆancia MCFA-Y473 seja maior que um dado valor; (b) mobilidade da H12 mostrada como densidade de probabilidade do rmsd. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 94. Rmsd da rosiglitazona (vermelho) e do NA2 (azul) em rela¸ca˜o a` estrutura inicial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 96. 5.23. A configura¸c˜ao resultante dos complexo BRL-NA2-PPARγ. . . .. 97. 5.24. Rmsd da rosiglitazona (vermelho) e do e NA3 (azul) em rela¸ca˜o a` estrutura inicial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 98. A configura¸c˜ao resultante dos complexo BRL-NA3-PPARγ. . . .. 98. 5.15. 5.21. 5.22. 5.25.
(26) Lista de Figuras 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. 6.6 6.7 6.8 6.9. xxvii. Estrutura do LBD colorida conforme as flutua¸c˜oes (rmsf) dos carbonos α no processo de dissocia¸c˜ao. Tons vermelhos indicam mais alta mobilidade e tons azuis indicam menor mobilidade. . . . . . 108 Estrutura do LBD colorida conforme a diferen¸ca de mobilidade dos carbonos α entre a forma holo e apo. Quanto mais intensa a cor azul, maior ´e a rigidez conferida pelos NA. . . . . . . . . . . . 109 Configura¸ca˜o inicial. A superf´ıcie em azul escuro `a direita corresponde a`s moleculas de a´gua ocupando a cavidade na superf´ıcie do LBD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 ` esquerda, vemos que a H3 (em amaConfigura¸ca˜o em 50 ps. A ` direita, vemos o aumento do relo) se quebra em duas partes. A tamanho da cavidade na superf´ıcie do LBD e seu preenchimento com mol´eculas de ´agua. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 Configura¸ca˜o em 75 ps. O NA3 expulsa as mol´eculas de a´gua e se forma uma cavidade desimpedida na superf´ıcie do LBD. O NA3 come¸ca a se dissociar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 Configura¸ca˜o em 100 ps. Com a cavidade ainda aberta, o NA2 come¸ca a se dissociar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 Configura¸ca˜o em 125 ps. A cavidade do LBD ´e fechada com a entrada de mol´eculas de ´agua no s´ıtio de liga¸c˜ao. . . . . . . . . . 112 Configura¸ca˜o em 150 ps. A H3 se reestrutura e a cavidade do LBD diminui, atingindo uma configura¸c˜ao semelhante `a inicial. . 112 Redes de liga¸co˜es de hidrogˆenio envolvendo a H12 da estrutura apo.113.
(27) xxviii. Lista de Figuras.
(28) Lista de Tabelas. 5.2. Energias (em kcal mol−1 ) de intera¸ca˜o da rosiglitazona com o ambiente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Energias (em kcal mol−1 ) de intera¸c˜ao dos NA com o ambiente .. 73 90. 6.1 6.2 6.3 6.4. Lista das simula¸c˜oes de DMAA. . . . . . . . . . . . . . Caminhos de dissocia¸ca˜o observados no sistema A. . . Caminhos de dissocia¸ca˜o observados no sistema B. . . Caminhos de dissocia¸ca˜o observados nos sistemas C, D,. 104 105 106 107. 5.1. xxix. . . . . . . . . . . . . E e F.. . . . .. . . . ..
(29) xxx. Lista de Tabelas.
(30) Cap´ıtulo 1. Introdu¸ c˜ ao. Nesta disserta¸c˜ao, s˜ao reportados os principais resultados da pesquisa desenvolvida ao longo dos dois anos do curso de mestrado do autor. O objeto de pesquisa foi um membro da superfam´ılia dos Receptores Nucleares conhecido como Receptor Ativado de Proliferadores de Peroxissomos Isoforma γ (PPARγ). Os receptores nucleares s˜ao prote´ınas que regulam a transcri¸ca˜o de v´arios genes importantes em in´ umeros processos biol´ogicos como, por exemplo, metabolismo, reprodu¸ca˜o e diferencia¸ca˜o celular. Os receptores nucleares controlam a transcri¸ca˜o mediante a liga¸ca˜o de pequenas mol´eculas. O PPARγ se liga a v´arias mol´eculas distintas e ´e um alvo importante para o desenvolvimento de f´armacos. Este trabalho visa contribuir para o entendimento do funcionamento do PPARγ mediante a liga¸ca˜o de mol´eculas ativadoras. Para isso, as modernas t´ecnicas de simula¸c˜ao de dinˆamica molecular foram utilizadas. Dois tipos de ligantes foram estudados: a rosiglitazona e a´cidos graxos de cadeia m´edia (MCFAs). A rosiglitazona (vide figura 3.5, p´agina 27) ´e uma potente droga utilizada no tratamento da diabete e os MCFAs, de f´ormula geral CH3 —(CH2 )n —COOH, com n = 4, . . . , 10, s˜ao ligantes naturais rec´em-descobertos no grupo de cristalografia de raio-X do Prof. Igor Polikarpov1 , que possuem caracter´ısticas nunca relatadas anteriormente na literatura. A disserta¸ca˜o est´a dividida em 6 cap´ıtulos (desconsiderando esta introdu¸ca˜o). Os cap´ıtulos 2 e 3 englobam uma revis˜ao bibliogr´afica atual sobre os receptores nucleares e sobre o PPARγ em particular. Em seguida, no cap´ıtulo 4, os fundamentos te´oricos da simula¸ca˜o de dinˆamica molecular ser˜ao apresentados. Os dois pr´oximos 1. Instituto de F´ısica de S˜ ao Carlos, Universidade de S˜ao Paulo. 1.
(31) 2. Cap´ıtulo 1. Introdu¸ca˜o. cap´ıtulos foram reservados para a apresenta¸ca˜o dos resultados. No cap´ıtulo 5, ser˜ao mostrados os resultados obtidos acerca do comportamento dos ligantes dentro do receptor e, no cap´ıtulo 6, resultados das poss´ıveis rotas de dissocia¸ca˜o de ligantes ser˜ao discutidos. Por fim, no cap´ıtulo 7, as conclus˜oes finais deste trabalho ser˜ao expostas..
(32) Cap´ıtulo 2. Receptores Nucleares. Os receptores nucleares constituem uma superfam´ılia de prote´ınas estruturalmente similares cuja fun¸ca˜o ´e regular a transcri¸ca˜o de genes relacionados com o desenvolvimento, diferencia¸ca˜o, reprodu¸ca˜o e homeostase em eucariotos. A regula¸ca˜o se d´a, na maioria dos casos, mediante a liga¸c˜ao de pequenas mol´eculas lipof´ılicas ao receptor, tais como hormˆonios esteroidais, retin´oides ou ´acidos graxos [1]. Pertencem a esta superfam´ılia de prote´ınas os receptores ativados de proliferadores de peroxissomos (PPAR), os receptores de progesterona (PR), de estr´ogeno (ER), de andr´ogeno (AR), de mineralocortic´oide (MR), de glicocortic´oide (GR), de vitamina D (VDR), de hormˆonio tireoideano (TR), de ´acido retin´oico (RAR), entre outros. Estudos tˆem mostrado que disfun¸co˜es no mecanismo de sinaliza¸c˜ao dos receptores nucleares levam a diversos tipos de complica¸c˜oes como cˆancer, infertilidade, obesidade, diabete e doen¸cas cardiovasculares. Em virtude disso, os receptores nucleares s˜ao alvos de in´ umeros f´armacos como, por exemplo, tamoxifeno, tiazolidinedionas e dexametasona que se ligam, respectivamente, ao ER, ao PPAR e ao GR [2]. A superfam´ılia dos receptores nucleares ´e tipicamente subdividida em trˆes fam´ılias ou classes com base no mecanismo de a¸ca˜o. A fam´ılia dos receptores esteroidais (classe I) inclui os receptores de progesterona, de estr´ogeno, de glicocortic´oide, de andr´ogeno e de mineralocortic´oide. A fam´ılia do receptor tireoideano (classe II) inclui os receptores do hormˆonio tireoideano, da vitamina D, do a´cido retin´oico e os receptores ativados de proliferadores de peroxissomos. A terceira classe de receptores nucleares ´e chamada de fam´ılia dos receptores ´orf˜aos. Esta denomina¸ca˜o se deve ao fato de que ainda n˜ao foram identificados ligantes para os mesmos; no entanto, possuem alta similaridade com os receptores pertencentes a`s. 3.
(33) 4. Cap´ıtulo 2. Receptores Nucleares. classes I e II e, por isso, s˜ao considerados receptores nucleares [1, 3].. 2.1. Mecanismo de a¸ c˜ ao. Embora todos os receptores nucleares tenham a fun¸ca˜o de regular a transcri¸c˜ao de genes, existem, entre as trˆes classes apresentadas acima, algumas diferen¸cas no mecanismo pelo qual atuam. Os receptores da classe I (fam´ılia dos receptores esteroidais) permanecem no citoplasma associados com as heat shock protein (HSP). Quando o ligante se encontra com seu receptor, o complexo receptor-HSP se desfaz e o complexo receptor-ligante penetra na membrana nuclear. Dentro do n´ ucleo, os receptores reconhecem, na forma de homod´ımeros, sequˆencias espec´ıficas de nucleot´ıdeos arranjadas na forma de pal´ındromos imperfeitos (repeti¸co˜es invertidas). O receptor de estr´ogeno reconhece a sequˆencia 5’-AGGTCA-3’ enquanto todos os outros membros da classe I reconhecem a sequˆencia 5’-AGAACA-3’. Uma vez ligado ao DNA, a transcri¸c˜ao dos genes-alvo ´e promovida [1, 10]. Os receptores da classe II, por outro lado, funcionam como heterod´ımeros. TR, VDR, RAR e PPAR associam-se com o receptor do ´acido X retin´oico (RXR) e se ligam a sequˆencias de nucleot´ıdeos arranjadas na forma de repeti¸c˜oes diretas. Todos estes receptores reconhecem a sequˆencia 5’-AGGTCA-3’ e permanecem, mesmo na ausˆencia de ligantes, ligados ao DNA e a prote´ınas correguladoras. Na ausˆencia do ligante espec´ıfico, o processo de transcri¸c˜ao ´e reprimido atrav´es de prote´ınas correpressoras; na presen¸ca do ligante, as prote´ınas correpressoras s˜ao liberadas e prote´ınas coativadoras s˜ao recrutadas ao receptor, o que ativa a transcri¸ca˜o [1]. Ainda n˜ao existe um completo entendimento do mecanismo de a¸ca˜o dos receptores o´rf˜aos, mas algumas evidˆencias indicam que eles podem atuar na forma de heterod´ımeros ou na forma monom´erica [1].. 2.2. Estrutura e fun¸ c˜ ao. Os receptores nucleares s˜ao cadeias polipept´ıdicas formadas por trˆes grandes dom´ınios: um dom´ınio C-terminal moderadamente conservado denominado dom´ınio de liga¸ca˜o com o ligante (LBD, ligand-binding domain), um dom´ınio central altamente conservado denominado dom´ınio de liga¸c˜ao com o DNA (DBD, DNA-binding domain) e um dom´ınio N-terminal altamente vari´avel [3]. Cada um destes dom´ınios.
(34) 2.2. Estrutura e fun¸ca˜o. 5. possui estrutura e fun¸ca˜o pr´oprias e est˜ao esquematizados na figura 2.1.. Figura 2.1. Esquema representativo dos dom´ınios estruturais de um receptor nuclear.. O dom´ınio C-terminal est´a associado com uma s´erie de fun¸c˜oes. A mais im´ ao LBD que pequenas mol´eculas portante delas ´e o reconhecimento de ligantes. E hidrof´obicas se ligam e provocam o desencadeamento de uma s´erie de processos interligados que controlam a transcri¸ca˜o de genes. Este dom´ınio tamb´em cont´em uma regi˜ao ativadora da transcri¸c˜ao que ´e dependente da liga¸ca˜o com o ligante, denominada fun¸ca˜o de ativa¸c˜ao 2 (AF-2). A AF-2 est´a envolvida no recrutamento de prote´ınas coativadoras essenciais no processo de trancri¸ca˜o. Outras fun¸co˜es do LBD incluem a dimeriza¸ca˜o e o silenciamento de genes [1, 3]. De uma maneira geral, o LBD pode ser visto como um sensor molecular que, na presen¸ca de um agonista1 , induz o receptor nuclear a um estado ativo capaz de promover a transcri¸c˜ao [4]. O dom´ınio de liga¸ca˜o com o DNA ´e respons´avel por interagir com as sequˆencias espec´ıficas de hexanucleot´ıdeos, os chamados elementos responsivos. Al´em disso, o DBD pode funcionar como um transmissor alost´erico de informa¸co˜es para outras regi˜oes da prote´ına. O DBD ´e conectado ao LBD atrav´es de uma pequena sequˆencia de amino´acidos denominada hinge. As propriedades funcionais da sequˆencia hinge ainda n˜ao s˜ao claras, mas sabe-se que ela pode ser fosforilada e fosforila¸ca˜o est´a relacionada a um aumento da atividade de trancri¸c˜ao [1]. O dom´ınio N-terminal, ou A/B, possui uma regi˜ao ativadora da transcri¸ca˜o (AF-1) que atua independentemente da liga¸c˜ao com ligantes e forma intera¸c˜oes diretas com outros dom´ınios do receptor e com prote´ınas coativadoras [3]. Sua estrutura n˜ao ´e ainda conhecida. 1. Agonistas s˜ ao ligantes que ativam o receptor..
(35) 6. Cap´ıtulo 2. Receptores Nucleares. 2.2.1. Estrutura do LBD. A primeira estrutura cristalogr´afica de alta resolu¸c˜ao do LBD de um receptor nuclear foi obtida em 1995 para a forma apo 1 do receptor do a´cido X retin´oico (RXR) [5]. Desde ent˜ao, as estruturas do LBD de aproximadamente metade dos receptores nucleares foram determinadas por cristalografia de raio-X. Essas estruturas revelam que, sem exce¸c˜ao, os LBD’s constituem um dom´ınio globular formado de aproximadamente 12 α-h´elices. No n´ıvel terci´ario, essas αh´elices est˜ao dispostas de modo a formar um “sandu´ıche” de h´elices paralelas, conforme a figura 2.2, que mostra a estrutura do a´cido retin´oico evidenciando 3 planos de α-h´elices em diferentes cores (verde, azul e roxo). As h´elices H1,. Figura 2.2. Estrutura do LBD do receptor do ´acido retin´oico evidenciando os 3 planos de α-h´elices, as folhas β e o ligante a´cido trans-retin´oico (PDB: 2LBD) [6]. H3, H7, H10 e H11 formam as duas camadas externas do sandu´ıche. O plano intermedi´ario ´e composto pelas h´elices H4, H5, H6, H8 e H9. A H12 posiciona-se perpendicularmente a`s outras h´elices e est´a localizada entre os planos externos. Nesse ponto, ´e importante ressaltar que a H12 ´e parte mais importante da fun¸c˜ao 1. Estrutura apo ´e a estrutura sem o ligante..
(36) 2.3. A regula¸ca˜o da transcri¸c˜ao. 7. de ativa¸c˜ao AF-2 referida anteriormente. Al´em das α-h´elices, h´a um conjunto de folhas β na base do LBD, tamb´em mostrado na figura 2.2 em amarelo. Com exce¸ca˜o da H6, uma pequena h´elice exposta ao solvente, a camada intermedi´aria constitui-se de α-h´elices que se localizam na parte superior do LBD, criando assim ´ nesta base que se localiza o s´ıtio de liga¸c˜ao, chamado uma cavidade em sua base. E de LBP (ligand binding pocket) [7].. 2.2.2. Estrutura do DBD. O dom´ınio de liga¸ca˜o com o DNA possui aproximadamente 70 res´ıduos e apresenta um alto grau de homologia dentro da superfam´ılia dos receptores nucleares. Existem 9 ciste´ınas conservadas entre os DBD’s dos receptores nucleares, sendo que 8 delas est˜ao envolvidas na coordena¸ca˜o de dois ´ıons Zn2+ em um arranjo tetra´edrico, formando os chamados dedos de zinco. Estes s˜ao importantes para a integridade do enovelamento do DBD e tamb´em para a liga¸c˜ao ao DNA. Cada dedo de zinco envolve uma α-h´elice e um loop adjacente, sendo que as duas α-h´elices se disp˜oem perpendicularmente uma a` outra atrav´es de suas faces hidrof´obicas. O primero dedo de zindo cont´em um conjunto de cinco amino´acidos chamado de caixa-P (ou P-box ) que est´a diretamente envolvido na liga¸c˜ao com os elementos responsivos no DNA e ´e respons´avel pelo reconhecimento de sequˆencias espec´ıficas de nucleot´ıdeos. No segundo dedo de zinco h´a um outro conjunto de cinco amino´acidos, chamado caixa-D (ou D-box ), respons´avel pela dimeriza¸ca˜o dos DBD’s quando ligados ao DNA [1, 3, 8–10]. A figura 2.3 mostra detalhes da estrutura do DBD do ER na forma de d´ımero ligado ao DNA e a figura 2.4 mostra a disposi¸ca˜o da P-box e da D-box ao longo do DBD.. 2.3. A regula¸ c˜ ao da transcri¸c˜ ao. Os receptores nucleares s˜ao fatores de transcri¸c˜ao que regulam a transcri¸ca˜o de determinados genes em resposta a` liga¸ca˜o de hormˆonios e metab´olitos. Atrav´es da ativa¸c˜ao ou repress˜ao desses genes, os receptores nucleares induzem v´arios eventos celulares como diferencia¸c˜ao, prolifera¸c˜ao ou morte celular. O mecanismo pelo qual os ligantes modulam a atividade dos receptores nucleares tem despertado grande interesse nos u ´ltimos anos. Estudos gen´eticos mostraram que prote´ınas correguladoras, que interagem diretamente com o receptor.
(37) 8. Cap´ıtulo 2. Receptores Nucleares. Figura 2.3. Estrutura do DBD do receptor de estr´ogeno ligado aos elementos responsivos (PDB: 1HCQ) [8]. Os ´ıons Zn2+ est˜ao representados como esferas alaranjadas.. Figura 2.4. Esquema representativo dos dedos de zinco mostrando a P-box e a D-box. Adaptado de [11]. nuclear, tˆem um papel fundamental na media¸ca˜o do efeito dos ligantes no processo de controle da transcri¸c˜ao de genes [12, 13]. Essas prote´ınas correguladoras podem ser coativadoras ou correpressoras, dependendo se elas induzem a ativa¸c˜ao ou a repress˜ao da transcri¸ca˜o. Em geral, os correpressores se ligam aos receptores nucleares na ausˆencia de ligantes ou na presen¸ca de antagonistas1 e, assim, impedem a transcri¸c˜ao. Quando um agonista se associa ao LBD ocorre ent˜ao a libera¸ca˜o do correpressor e posterior associa¸ca˜o do coativador, o que torna a transcri¸ca˜o dos genes-alvo poss´ıvel [14]. 1. Antagonistas s˜ ao ligantes que n˜ ao ativam o receptor..
(38) 2.3. A regula¸ca˜o da transcri¸c˜ao. 2.3.1. 9. Intera¸ c˜ ao com coativadores. As prote´ınas coativadoras e correpressoras contˆem m´ ultiplas sequˆencias conservadas que formam unidades estruturais de intera¸ca˜o com o LBD dos receptores nucleares e que podem ser generalizadas como LxxLL em coativadores e LxxxIxxx[I/L] em correpressores1 . Estudos de muta¸ca˜o mostraram que a superf´ıcie de intera¸ca˜o dos coativadores e correpressores com o LBD ´e tal que a associa¸ca˜o de coativadores e correpressores s˜ao eventos mutuamente exclusivos. Assim, tudo que o receptor precisa fazer ´e selecionar que tipo de corregulador recrutar ao LBD, e isso ´e controlado pelo ligante [14]. Estruturas cristalogr´aficas do LBD de v´arios receptores nucleares ligados a agonistas e a pept´ıdeos contendo a sequˆencia LxxLL revelaram que o modo de liga¸c˜ao do coativador ao LBD ´e conservado. As estruturas mostram que o pept´ıdeo coativador se liga ao receptor atrav´es de uma superf´ıcie formada por duas partes: uma composta pela H3 e H4 e outra formada pela H12. A primeira adota a mesma conforma¸ca˜o em todas as estruturas e, estruturalmente, n˜ao se altera com a presen¸ca de ligantes. Por outro lado, a segunda parte, formada pela H12 (AF-2), pode adotar diferentes conforma¸co˜es em fun¸ca˜o do ligante [7]. O que fica evidente a partir dessas estruturas ´e que uma posi¸c˜ao particular da H12 ´e essencial para o LBD suportar o coativador. Estudos posteriores confirmaram que o papel do agonista ´e estabilizar a H12 na posi¸ca˜o ativa e, assim, permitir a liga¸c˜ao da prote´ına coativadora [1, 14]. A figura 2.5(a) mostra a estrutura do complexo PPARα+pept´ıdeo coativador, destacando a posi¸ca˜o da H12 (em lil´as) e do pept´ıdeo coativador (em amarelo) em rela¸c˜ao ao corpo do LBD.. 2.3.2. Intera¸ c˜ ao com correpressores. A posi¸c˜ao da H12 ´e tamb´em importante no recrutamento de prote´ınas correpressoras. Como dito acima, os correpressores se ligam ao LBD atrav´es do motivo LxxxIxxx[I/L], que ´e semelhante ao LxxLL dos coativadores, exceto pela sua extens˜ao N-terminal. Enquanto o motivo LxxLL d´a origem a uma α-h´elice de 2 voltas, o LxxxIxxx[I/L] origina uma α-h´elice de 3 voltas. Apesar da superf´ıcie de intera¸ca˜o do correpressor se sobrepor, em grande parte, com a do coativador, a volta extra do motivo de intera¸ca˜o do correpressor se estende ao local de posiciona1. L e I significam, respectivamente, leucina e isoleucina. Os “x” s˜ao res´ıduos vari´aveis..
(39) 10. Cap´ıtulo 2. Receptores Nucleares. Figura 2.5. Estrutura cristalogr´afica do PPARα associado a pept´ıdeo (a) coativador (PDB: 1K7L) e (b) correpressor (PDB: 1KKQ), ambos em lil´as, destacando a posi¸ca˜o da H12 em amarelo [15, 16]. mento da H12 na conforma¸ca˜o ativa. Como consequˆencia, a H12 deve se deslocar para uma posi¸c˜ao alternativa para dar lugar ao correpressor. Isso leva o receptor a adotar uma conforma¸ca˜o inativa, que ´e estabilizada por um antagonista. Na figura 2.5(b), a conforma¸c˜ao inativa do PPARα ´e mostrada na presen¸ca de um correpressor. Observa-se que a superf´ıcie de intera¸ca˜o correpressor-LBD ´e semelhante a` superf´ıcie de intera¸c˜ao coativador-LBD, mas ´e necess´ario o deslocamento da H12 para a efetiva acomoda¸c˜ao do correpressor.. 2.4. Mecanismos de dissocia¸c˜ ao de ligantes. Em 1995, com a determina¸ca˜o das primeiras estruturas cristalogr´aficas do LBD do RXR e RAR, surgiu, a partir das an´alises dessas estruturas, uma proposta para o mecanismo de ativa¸ca˜o dos receptores nucleares dependente do ligante. Esse mecanismo, que ficou conhecido como mecanismo da “ratoeira”, apareceu com a compara¸ca˜o das estruturas do RXR na ausˆencia de ligantes e do RAR na presen¸ca do a´cido trans-retin´oico. Conforme mostra a figura 2.6(a), na ausˆencia do ligante, a H12 e o loop entre a H11 e H12 projetam-se para fora do corpo do LBD. J´a na presen¸ca do a´cido retin´oico, a H12 se dobra e posiciona-se sobre.
(40) 2.4. Mecanismos de dissocia¸ca˜o de ligantes. 11. o corpo do LBD, como mostra a figura 2.6(b). Isto sugeriu que o receptor, na ausˆencia do ligante, adotaria a conforma¸ca˜o da figura 2.6(a), que estaria “aberta” para a entrada do ligante e, com a entrada do mesmo, a H12 fecharia a cavidade de liga¸ca˜o, assemelhando-se assim a uma “ratoeira”. Com a H12 fechando a cavidade de liga¸c˜ao, os coativadores poderiam se ligar e, dessa forma, criar as condi¸co˜es para o in´ıcio da transcri¸ca˜o [5, 6, 18].. Figura 2.6. Estrutura cristalogr´afica do LBD do (a) RXRα sem ligante (PDB: 1LBD) e (b) RXRγ+´acido retin´oico (PDB: 2LBD). Em destaque est˜ao as H12 e os loops entre a H11 e H12 [5, 6]. Este mecanismo, contudo, apresenta algumas inconsistˆencias e tem sido questionado. A suposi¸c˜ao de que o ligante entra e sai pela regi˜ao da H12 ´e incompat´ıvel com o fato dos coativadores tamb´em se ligarem nessa regi˜ao. Como os coativadores se associam ao LBD na presen¸ca do ligante, ent˜ao a sa´ıda deste deveria ocorrer antes ou em consonˆancia com a sa´ıda do coativador, permitindo assim o rearranjo conformacional da H12. Isso ´e, de fato, muito improv´avel, j´a que, em virtude do tamanho relativo do ligante e do coativador (uma macromol´ecula), a sa´ıda daquele deveria ocorrer numa escala de tempo muito menor que a sa´ıda deste [27–29]. Esta inconsistˆencia seria resolvida se existissem outros caminhos pelos quais o ligante pudesse se dissociar do receptor. Assim, o ligante poderia sair e induzir.
(41) 12. Cap´ıtulo 2. Receptores Nucleares. altera¸co˜es dinˆamicas e conformacionais no receptor que resultassem na dissocia¸ca˜o do coativador numa escala de tempo bem maior. Com efeito, v´arios estudos realizados neste grupo, utilizando simula¸c˜oes computacionais, tˆem apontado para a existˆencia de caminhos alternativos de dissocia¸c˜ao. Em s´ıntese, as simula¸co˜es computacionais do receptor do hormˆonio tireiodeano revelaram trˆes caminhos distintos para a dissocia¸c˜ao do ligante, esquematizados na figura 2.7. O caminho I envolve uma abertura entre a H3 e H11, associada ao des´ o que mais se assemelha ao mecanismo da ratoeira, embora locamento da H12. E o deslocamento da H12 seja bem mais sutil do que o proposto pela estrutura do apo-RXR. O caminho II se localiza entre a H8 e H11, com a abertura do Ω-loop 1 . Por u ´ltimo, o caminho III envolve uma cavidade formada pela movimenta¸ca˜o da folha β, do loop entre a H1 e H2 e da H3. Estudos posteriores mostraram que o caminho III ´e o mais prov´avel para a dissocia¸c˜ao do ligante do TR [27–29].. Figura 2.7. Trˆes caminhos de dissocia¸c˜ao para o receptor do hormˆonio tireoideano. O caminho I se assemelha ao mecanismo da ratoeira. Os caminhos II e III s˜ao novos e n˜ao contradizem a associa¸c˜ao com coativadores [27]. Vale ressaltar nesse ponto que, nos cristais usados para a difra¸c˜ao de raios-X, as prote´ınas est˜ao sujeitas a v´arias intera¸co˜es associadas `a estabiliza¸ca˜o do cristal, que podem ser diferentes das intera¸co˜es associadas a`s suas conforma¸co˜es em solu¸ca˜o. O efeito do empacotamento cristalino ´e, naturalmente, mais pronunciado nas regi˜oes de maior mobilidade da prote´ına, em particular a H12 no caso do RXR. A estrutura cristalogr´afica do RXR na forma apo foi reconhecida como apenas uma das conforma¸co˜es que poderia adotar em solu¸ca˜o, j´a que a estrutura n˜ao revela ne1. Este ´e o loop entre a H2 e H3..
(42) 2.4. Mecanismos de dissocia¸ca˜o de ligantes. 13. nhuma cavidade de liga¸ca˜o. Assim, deveria ocorrer um equil´ıbrio conformacional entre a forma apo fechada (sem a cavidade de liga¸ca˜o) e a aberta (com a cavidade de liga¸ca˜o) [30]. Al´em do RXR, o receptor de estr´ogeno tamb´em teve a sua estrutura apo determinada num arranjo semelhante (H12 aberta). Entretanto, foi comprovado que isso era consequˆencia do empacotamento cristalino [31]..
(43) 14. Cap´ıtulo 2. Receptores Nucleares.
(44) Cap´ıtulo 3. O PPARγ. Os receptores ativados de proliferadores de peroxissomos1 (PPAR, peroxisome proliferator-activated receptor ) s˜ao membros da superfam´ılia dos receptores nucleares pertencentes a` classe II [1]. Existem trˆes isoformas de PPAR: α, γ e β/δ [17]. Estas isoformas s˜ao produtos de diferentes genes, distribuem-se em diferentes tecidos no organismo, possuem pap´eis fisiol´ogicos distintos e ainda s˜ao seletivas a seus pr´oprios ligantes [18]. O nome do receptor veio de estudos iniciais que mostraram que, em roedores, a isoforma α do PPAR responde a compostos que induzem a prolifera¸ca˜o de peroxissomos. Entretanto, essa fun¸ca˜o n˜ao ´e compartilhada pelas outras isoformas de PPAR [19]. O foco deste trabalho ´e a isoforma γ do PPAR e, neste cap´ıtulo, ser˜ao discutidos aspectos fisiol´ogicos, estruturais e dinˆamicos do PPARγ, al´em dos ligantes naturais e sint´eticos que se ligam ao receptor.. 3.1. A biologia do PPARγ. O PPARγ est´a primariamente envolvido no metabolismo de lip´ıdeos. Entretanto, diversos estudos revelam que o PPARγ ´e importante em um grande n´ umero de ´ expresso, predominanteprocessos biol´ogicos, muitos deles relacionados entre si. E mente, no tecido adiposo e tamb´em em uma ampla variedade de tecidos incluindo tecidos do cora¸c˜ao, c´olon, intestino, rins, pˆancreas e ba¸co. A seguir, alguns dos processos biol´ogicos em que o PPARγ atua ser˜ao considerados. 1. Peroxissomos s˜ ao organelas presentes no citoplasma respons´aveis pelo armazenamento de enzimas oxidativas, sendo que v´arias est˜ao relacionadas ao metabolismo de lip´ıdeos. A betaoxida¸c˜ ao de ´ acidos graxos de cadeia longa, por exemplo, ocorre nos peroxissomos.. 15.
(45) 16. Cap´ıtulo 3. O PPARγ. PPARγ e metabolismo de lip´ıdeos PPARγ tem importˆancia central na diferencia¸ca˜o de adip´ocitos. Estudos mostraram que a introdu¸ca˜o de PPARγ em c´elulas n˜ao-diferenciadas induzem a diferencia¸ca˜o das mesmas em adip´ocitos. Por outro lado, camundongos destitu´ıdos de PPARγ apresentaram reduzido teor de tecido adiposo, evidenciando o papel do receptor na adipogˆenese [19]. Al´em da adipogˆenese, o PPARγ est´a envolvido na manuten¸c˜ao das fun¸c˜oes dos adip´ocitos, como armazenamento de lip´ıdeos e libera¸ca˜o de energia, atrav´es da regula¸ca˜o da express˜ao de numerosos genes envolvidos no metabolismo de lip´ıdeos, sendo importante tamb´em na sobrevivˆencia dos adip´ocitos j´a diferenciados [20].. PPARγ e metabolismo de glicose A isoforma γ est´a tamb´em envolvida no metabolismo de glicose atrav´es de um aumento da sensibilidade `a insulina [20]. Estudos gen´eticos mostraram que roedores que apresentavam alta atividade do PPARγ devido a uma muta¸ca˜o n˜ao apresentavam resistˆencia a` insulina. Por outro lado, aqueles em que PPARγ n˜ao era expresso, desenvolviam alta insensibilidade a` insulina, o que gerava diabete tipo 2. O mecanismo pelo qual o PPARγ induz a sensibilidade a` insulina est´a intimamente ligado ao seu papel na adipogˆenese. Resumidamente, a diabete tipo 2, que ´e o resultado da resistˆencia a` insulina, est´a associada ao aumento dos n´ıveis de a´cidos graxos livres (FFA, free fat acids) no plasma e a indesej´avel deposi¸c˜ao de lip´ıdeos em tecidos n˜ao apropriados como o m´ usculo esquel´etico. A acumula¸ca˜o de FFA e lip´ıdeos no m´ usculo resulta na insensibilidade a` insulina e compromete a homeostase da glicose. A ativa¸ca˜o do PPARγ induz a adipogˆenese e, assim, os FFA e lip´ıdeos s˜ao capturados do m´ usculo esquel´etico, onde seu ac´ umulo gera efeitos no sentido de comprometer o metabolismo da glicose, para os adip´ocitos especializados no armazenamento de lip´ıdeos. N˜ao ´e de se surpreender, portanto, que drogas antidiab´eticas ativadoras do PPARγ, como as tiazolidinedionas, promovam aumento de peso em humanos [19]..
(46) 3.2. Aspectos estruturais. 17. PPARγ e cˆ ancer Agonistas do PPARγ tˆem efeitos significativos no crescimento celular e na diferencia¸ca˜o de c´elulas prim´arias derivadas de lipossarcomas1 humanos. Grande parte desses tumores expressam PPARγ em n´ıveis quase equivalentes ao de c´elulas adiposas normais. Experimentos realizados com lipossarcomas prim´arios mostraram que eles respondem a um agonista sint´etico de PPARγ com a completa diferencia¸ca˜o celular, incluindo mudan¸cas morfol´ogicas, armazenamento de lip´ıdeos e parada do crescimento celular. Isto sugeriu que a indu¸ca˜o da diferencia¸ca˜o dessas c´elulas pode ser alcan¸cada pela ativa¸c˜ao do PPARγ por meio de um agonista potente [22]. Embora PPARγ seja expresso em mais altos n´ıveis no tecido adiposo, quantidades substanciais est˜ao tamb´em presentes em outros tipos de c´elulas, como c´elulas epiteliais do c´olon, pr´ostata e mama. V´arios estudos mostraram que ligantes do PPARγ tamb´em podem induzir a diferencia¸ca˜o de c´elulas cancer´ıgenas desses tecidos [19]. PPARγ, inflama¸c˜ ao e aterosclerose A aterosclerose ´e caracterizada pelo ac´ umulo gradual de lip´ıdeos na parede arterial, o que d´a origem `a forma¸ca˜o da placa ateroscler´otica. A ruptura repentina dessa placa leva a` obstru¸c˜ao do fluxo sangu´ıneo, podendo ocasionar o infarto do mioc´ardio. A disfun¸c˜ao do endot´elio resulta da inflama¸c˜ao crˆonica da parede vascular, da prolifera¸c˜ao de c´elulas musculares lisas e da forma¸ca˜o das foam cells 2 ou “c´elulas espumosas”. Al´em de regular as concentra¸co˜es de lipoprote´ınas no plasma sangu´ıneo, PPARγ pode afetar a forma¸ca˜o das foam cells, modular a resposta inflamat´oria e influenciar na estabilidade da placa ateroscler´otica [23].. 3.2. Aspectos estruturais. O PPARγ, sendo um receptor nuclear, compartilha suas caracter´ısticas estruturais com os outros membros da superfam´ılia. Podem-se distinguir, no PPARγ, os trˆes dom´ınios estruturais caracter´ısticos: o dom´ınio N-terminal pouco conservado, o dom´ınio de liga¸ca˜o com DNA altamente conservado e o dom´ınio C-terminal de 1. Lipossarcoma ´e um tumor maligno que aparece no tecido adiposo. Foam cells s˜ ao c´elulas derivadas de macr´ofagos que acumulam lipoprote´ınas de baixa densidade (LDL) e que podem se romper e depositar o LDL na parede arterial. 2.
(47) 18. Cap´ıtulo 3. O PPARγ. liga¸ca˜o com ligantes moderadamente conservado. Em 2008, pela primeira vez foi determinada, por cristalografia de raio-X, a estrutura do PPARγ contendo o LBD, o DBD e um pept´ıdeo coativador, juntamente com o RXR, seu parceiro de heterodimeriza¸ca˜o [24]. A figura 3.1 mostra o arranjo global do heterod´ımero ligado aos elementos responsivos.. Figura 3.1. Estrutura do complexo PPARγ+RXRα sobre o DNA. O PPARγ ´e mostrado em verde, o RXRα em azul, os pept´ıdeos coativadores em vermelho, os ´ıons zinco em amarelo e os elementos responsivos (DNA) em lil´as. Na parte superior, s˜ao vistos os dois LBD’s em contato e, na parte inferior, os DBD’s em contato com o DNA (PDB: 3DZY) [24]..
(48) 3.2. Aspectos estruturais. 3.2.1. 19. Dom´ınio de liga¸c˜ ao com ligante. A primeira estrutura do LBD do PPARγ foi obtida em 1998 por cristalografia de raio-X. Depois disso, in´ umeras outras estruturas do LBD do PPARγ foram obtidas na presen¸ca de diferentes ligantes, tanto naturais quanto sint´eticos. As estruturas mostram que, de uma maneira geral, o enovelamento do LBD se assemelha bastante ao do LBD de outros receptores nucleares. No n´ıvel secund´ario, o LBD ´e constitu´ıdo de 13 α-h´elices e uma folha β formada por 4 fitas, conforme mostra a figura 3.2, enquanto a estrutura terci´aria mostra o sandu´ıche de α-h´elices caracter´ıstico dos receptores nucleares [25].. Figura 3.2. Estrutura cristalogr´afica do LBD do PPARγ (PDB: 1PRG). As α-h´elices aparecem em azul e a folha β em amarelo [25]. A estrutura do LBD do PPARγ difere dos demais receptores por possuir uma h´elice extra entre a primeira fita da folha β e a H3: a h´elice 2’. Uma outra diferen¸ca em rela¸ca˜o aos demais receptores nucleares, agora no n´ıvel terci´ario, ´e o posicionamento da H2 no PPARγ. Este posicionamento ´e tal que cria uma pequena abertura na superf´ıcie da prote´ına que seria uma poss´ıvel regi˜ao de entrada e sa´ıda.
(49) 20. Cap´ıtulo 3. O PPARγ. de ligantes [25]. A cavidade de liga¸c˜ ao Como o primeiro passo na ativa¸c˜ao de um receptor nuclear ´e a associa¸c˜ao do ligante, o LBP ´e uma unidade estrutural extremamente importante. O enovelamento do LBD na forma de sandu´ıche de h´elices ´e tal que, como apresentado no Cap´ıtulo 2, o plano intermedi´ario de h´elices se localiza na parte superior do dom´ınio, criando assim uma cavidade na parte inferior. No PPARγ, o LBP ´e limitado pelas h´elices H2’, H3, H4, H5, H6, H7, H11 e H12 e tamb´em pela folha β. A forma do LBP se assemelha a um Y, com trˆes prolonga¸co˜es bem definidas. Uma dessas prolonga¸co˜es situa-se entre a H3 e a folha β, outra se estende entre a H3 e H5, e a uma terceira fica entre a H12 C-terminal e a H3. O LBP ´e essencialmente hidrof´obico, mas possui tamb´em alguns res´ıduos polares/carregados [18, 25]. A particularidade mais not´avel do PPARγ ´e o seu volumoso s´ıtio de liga¸ca˜o. O volume total da cavidade est´a na faixa de 1300 ˚ A3 a 1400 ˚ A3 , que ´e substancialmente maior que dos outros receptores nucleares. O volume do RXR, por exemplo, ´e de apenas 470 ˚ A3 [17, 18, 25]. Essa varia¸ca˜o de volume do LBP entre os receptores nucleares parece estar relacionada ao processo biol´ogico ao qual o receptor est´a envolvido. O volumoso LBP do PPARγ confere uma versatilidade que permite a liga¸c˜ao de diversos metab´olitos diferentes; em contraste, receptores cujo LBP n˜ao ´e muito volumoso, como RXR ou TR, reconhecem ligantes bem espec´ıficos, como a´cido retin´oico ou hormˆonio tireoideano, respectivamente. Assim, existem in´ umeras substˆancias estruturalmente distintas que podem se acomodar no LBP do PPARγ e provocar respostas fisiol´ogicas distintas [7]. As superf´ıcies de heterodimeriza¸c˜ ao O PPARγ, e todos os receptores nucleares pertencentes `a classe II, ligam-se ao DNA na forma de heterod´ımeros com o receptor do a´cido X retin´oico (RXR). A estrutura cristalogr´afica do LBD e DBD do complexo PPARγ-RXR indica que h´a trˆes interfaces de heterodimeriza¸c˜ao no PPARγ: entre os DBD’s, entre os LBD’s e entre o LBD do PPARγ e o DBD do RXR. Dessas trˆes, a mais significativa ´e a interface entre os LBD’s dos dois receptores. A interface entre o LBD do PPARγ e o DBD do RXR foi vista apenas no PPARγ e envolve a folha β do LBD e a.
(50) 3.2. Aspectos estruturais. 21. extens˜ao C-terminal do DBD [24]. A interface de dimeriza¸ca˜o LBD-LBD ´e composta de uma rede de contatos hidrof´obicos e hidrof´ılicos envolvendo a H7, H9 e H10 e o loop entre a H8 e H9 de ambos os receptores. Os res´ıduos de amino´acidos das superf´ıcies dos LBD’s est˜ao dispostos de modo a formar uma complementaridade entre os contatos hidrof´obicos e hidrof´ılicos [26].. 3.2.2. A h´ elice 12 e a intera¸c˜ ao com correguladores. Conforme descrito no cap´ıtulo anterior, o que determina o recrutamento do coativador ou do correpressor e, portanto, a ativa¸ca˜o ou desativa¸ca˜o do receptor, ´e o posicionamento da H12 em rela¸ca˜o ao corpo do LBD. As estruturas cristalogr´aficas do PPARγ mostram que, na presen¸ca de agonistas, a H12 adota a conforma¸ca˜o ativa, onde ela se posiciona perpendicularmente a`s h´elices externas do LBD, de forma que permite o recrutamento de prote´ınas coativadoras [25]. Por outro lado, a estrutura do PPARα na presen¸ca de um antagonista mostra a H12 na posi¸c˜ao inativa e um correpressor ligado a ela (PDB: 1KKQ) [16]. Sendo assim, o antagonista do PPAR induz a mudan¸ca estrutural necess´aria para o recrutamento de correpressores. Essas informa¸co˜es revelam o papel dos ligantes na promo¸c˜ao e repress˜ao da transcri¸ca˜o dos genes-alvo dos PPAR’s A estrutura apo do PPARγ Diferentemente do RXR, cuja estrutura cristalogr´afica na forma apo apresenta a H12 numa conforma¸ca˜o estendida em rela¸ca˜o ao corpo do LBD (inativa), a estrutura apo do PPARγ, determinada em 1998, est´a na conforma¸ca˜o ativa, em que a H12 se posiciona contra o corpo do LBD expondo a superf´ıcie de intera¸ca˜o com coativadores. Al´em disso, enquanto a estrutura apo do RXR n˜ao mostra nenhuma cavidade de liga¸c˜ao dentro do LBD, a estrutura apo do PPARγ revela uma enorme cavidade onde o ligante pode se acomodar, inclusive uma abertura entre a H3 e a folha β que seria um poss´ıvel s´ıtio de entrada e sa´ıda de ligantes, coincidente com o caminho III (Cap´ıtulo 2, se¸ca˜o 2.4) [25, 27]. Estas informa¸co˜es, por um lado, ajudam a corroborar a hip´otese de que o LBD n˜ao precisa sofrer bruscas mudan¸cas conformacionais (principalmente a H12) para permitir a entrada do ligante. Por outro, originam quest˜oes acerca do papel do ligante na ativa¸c˜ao do PPARγ, j´a.
(51) 22. Cap´ıtulo 3. O PPARγ. que a H12 est´a posicionada na conforma¸ca˜o ativa. De fato, experimentos mostraram que os PPAR’s recrutam coativadores e exibem uma certa atividade basal mesmo na ausˆencia de ligantes. Na presen¸ca de agonistas, tanto o recrutamento de coativadores como a atividade biol´ogica aumentam [32]. Diante disso, fica evidente que somente informa¸co˜es estruturais n˜ao s˜ao suficientes para esclarecer o mecanismo de ativa¸c˜ao dos receptores nucleares e, em particular, do PPARγ. Estudos biof´ısicos tˆem apontado para a importˆancia das propriedades dinˆamicas do PPARγ e ser˜ao comentados a seguir.. 3.3. Aspectos dinˆ amicos. O estudo dos receptores nucleares por cristalografia de raio-X tem sido complementado, com grande sucesso, pela utiliza¸ca˜o de diversas t´ecnicas bioqu´ımicas e biof´ısicas, as quais tˆem sido u ´teis para a elucida¸c˜ao das propriedades dos receptores nucleares dependentes de sua dinˆamica, principalmente as que se relacionam com a presen¸ca e ausˆencia de ligantes. Os resultados desses estudos mostram que os receptores na forma apo s˜ao menos r´ıgidos, menos compactos e mais sens´ıveis a` prote´olise que na forma holo. Adicionalmente, filtra¸ca˜o em gel mostra que as formas apo possuem um maior tamanho e dicro´ısmo circular revela que elas se desnaturam em mais baixa temperatura que a correspondente forma holo. Estas informa¸co˜es, quando tomadas juntas, indicam que o ligante exerce um forte efeito estabilizador no LBD [14]. No caso do PPARγ, a distribui¸c˜ao dos fatores de temperatura da estrutura apo sugere que a parte inferior do LBD, que inclui a cavidade de liga¸ca˜o (LBP) ´e mais m´ovel que a parte superior. Estudos por espectroscopia de RMN realizados com apo-PPARγ e com holo-PPARγ 1 , tamb´em sugerem uma maior mobilidade conformacional da parte inferior do LBD na estrutura apo [58]. Na presen¸ca do ligante agonista, no entanto, essa mobilidade ´e reduzida. Dessa forma, fica evidente que as propriedades dinˆamicas do PPARγ se alteram com a presen¸ca do ligante. Isso, contudo, n˜ao responde `a quest˜ao de como o ligante leva a` ativa¸ca˜o do PPARγ, ou seja, sob que condi¸c˜oes o recrutamento de coativadores ´e favorecido. Como foi discutido no Cap´ıtulo 2, sob o ponto de vista estrutural, o posicionamento preciso da H12 na posi¸c˜ao ativa ´e fundamental para 1. A estrutura holo ´e aquela associada a algum ligante..
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