julianamelo

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS IMUNOLOGIA E DIP. Juliana Melo. AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DAS MOLÉCULAS PD-1, CD39 E CD73 NA IMUNOMODULAÇÃO INDUZIDA PELA INFECÇÃO COM A BACTÉRIA Brucella abortus. Juiz de Fora 2017.

(2) JULIANA MELO. AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DAS MOLÉCULAS PD-1, CD39 E CD73 NA IMUNOMODULAÇÃO INDUZIDA PELA INFECÇÃO COM A BACTÉRIA Brucella abortus. Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Área: Imunologia e Doenças InfectoParasitárias para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas: Área: Imunologia. e. Doenças. Parasitárias. .. Orientador: Prof. Dr. Gilson Costa Macedo. Juiz de Fora 2017. Infecto-.

(3) JULIANA MELO. AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DAS MOLÉCULAS PD-1, CD39 E CD73 NA IMUNOMODULAÇÃO INDUZIDA PELA INFECÇÃO COM A BACTÉRIA Brucella abortus. Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Área: Imunologia e Doenças InfectoParasitárias para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas: Área: Imunologia. e. Doenças. Infecto-. Parasitárias.. Exame de Qualificação aprovado em:. _____/_____/_____. BANCA EXAMINADORA. _________________________________________________________ Drª Priscila de Faria Pinto Universidade Federal de Juiz de Fora.. __________________________________________________________ Drª Michele Cristine Ribeiro de Freitas Universidade Federal de Juiz de Fora.. __________________________________________________________ Prof. Dr. Gilson Costa Macedo (orientador) Universidade Federal de Juiz de Fora..

(4) Dedico esse trabalho a Deus que em sua infinita bondade e amor me permitiu dar mais esse passo em minha jornada..

(5) AGRADECIMENTOS. Seria impossível não iniciar os agradecimentos sem citar inicialmente Aquele que foi o grande pilar para a conclusão de mais uma etapa importante da vida. Meu muito obrigada. a. Deus. por. ter. me. amparado. e. sustentado. até. aqui.. Agradeço a minha família, em especial aos meus pais Regina e Ivamar por todo amor, orações, confiança e suporte. Obrigada por me amarem e entenderem a ausência. Agradeço ao Professor Dr. Gilson Macedo pela orientação e suporte na realização dessetrabalho. Aos amigos do laboratório de imunologia da UFJF que forneceram auxílio e fizeram esses. últimos. anos. mais. leves.. Agradeço também a professora Dra. Priscilla Pinto e sua aluna Danielle Merconato pelo acolhimento no laboratório de Bioquímica da UFJF bem como pelo auxílio em experimentos. Agradeço aos amigos de Resende por todo amor, compreensão pela ausência.. apoio, torcida além da.

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(7) “Aqueles que passam por nós, não vão sós, não nos deixam sós. Deixam um pouco de si, levam um pouco de nós.” Antoine de Saint-Exupéry, 1943..

(8) RESUMO. A brucelose é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias do gênero Brucella que acometem o homem e uma grande variedade de animais domésticos, resultando em prejuízos econômicos significativos aos sistemas de produção. Em humanos essa infecção pode causar febre ondulante, endocardite, artrite, osteomielite e complicações neurológicas enquanto em animais leva ao aborto e infertilidade. Sabe-se que a resposta imunológica a bactérias intracelulares como a Brucella ocorre essencialmente através da imunidade mediada por células, sendo macrófagos especialmente importantes no combate à infecção. Entretanto, apesar da efetividade da resposta, a B. abortus conta com diversos mecanismos de evasão, o que garante a sua sobrevivência no organismo hospedeiro. Dentre estes mecanismos, a modulação de células apresentadoras de antígenos tem sido apontada como um dos mais relevantes. Recentemente, diversos trabalhos têm evidenciado a importância das NTPDases e da molécula PD-1 na modulação da resposta imune. As NTPDases estão envolidas com a produção de adenosina que apresenta relevante caráter imunomodulador. Já a molécula PD-1 está associada a indução de um perfil anti-inflamatório com diminuição de IL-12 e aumento de IL-10. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi determinar se a infecção com B. abortus é capaz de alterar a expressão destas moléculas e assim limitar a ação do sistema imune, favorecendo a sobrevivência do patógeno. Para isso, células RAW 264.7 foram infectadas com B.abortus e a modulação das moléculas CD80, CD86, CD40, MHCII, foi avaliada por citometria de fluxo. Em seguida, a expressão de CD39 também foi determinada por citometria de fluxo e por Western Blot. Por fim analisamos possíveis alterações na expressão da molécula PD-1 induzidas pela bactéria. Como resultados, foi confirmado que a infecção é capaz de inibir a expressão de CD80, CD86 e CD40, embora o mesmo não tenha sido observado com o MHCII. Além disso, a expressão de CD40 se mostrou diminuída mesmo após o estímulo com LPS. De forma surpreendente, foi observada uma diminuição na expressão das moléculas CD39 e PD-1, o que pode ser explicado pela menor ativação celular induzida pela infecção. Assim, os dados obtidos até o momento demonstram que as moléculas CD39 e PD-1 não são utilizadas pela Brucella para.

(9) modular as APCs, mas são influenciados pela menor ativação celular induzida pelo patógeno. Palavras chave: Brucella.abortus. Imunomodulação. PD-1. CD39. CD73. ABSTRACT. Brucellosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Brucella that affect humans and a wide variety of domestic animals, resulting in significant economic losses to production systems. In humans the infection can cause undulant fever, endocarditis, arthritis, osteomyelitis and neurological complications while in animals leads to abortion and infertility. It is known that the immune response to intracellular bacteria such as Brucella occurs primarily by cell-mediated immunity, macrophage being especially important in fighting infection. However, despite the effectiveness of the response, B. abortus has several avoidance schemes, which ensures their survival in the host organism. Among these mechanisms, modulation of antigen-presenting cells has been identified as one of the most relevant. Recently, several studies have shown the importance NTPDase and PD-1 molecule to modulate the immune response. The NTPDase are envolidas with the production of adenosine which presents immunomodulatory relevant character. Since PD-1 molecule is associated with induction of an anti-inflammatory profile with decreased IL-12 and IL-10 increase. In this context, the aim of this study was to determine whether infection with B. abortus is able to alter the expression of these molecules and thus limit the action of the immune system, favoring the survival of the pathogen. To this end, RAW 264.7 cells were infected with B.abortus and modulation of CD80 molecules, CD86, CD40, MHCII, was evaluated by flow cytometry. Then the CD39 expression was also determined by flow cytometry and Western blot. Finally, we analyze possible changes in PD-1 molecule expression induced by bacteria. As a result, it was confirmed that the infection is capable of inhibiting expression of CD80, CD86 and CD40, although this has not been observed with MHCII. Additionally, CD40 expression showed decreased even after the stimulation with LPS. Surprisingly, it was observed a decrease in the expression of CD39 and PD-1.

(10) molecules, which can be explained by the lower cellular activation induced by the infection. Thus, the data obtained so far show that the PD-1 and CD39 molecules are not used by Brucella Modular APCs but are less influenced by cellular activation induced by the pathogen.. Keywords: Brucella.abortus. Immunomodulation. PD-1. CD39. CD73.

(11) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Marcadores de superfície envolvidos no desenvolvimento de respostas imunológicas ................................................................................................................................................. 24 Figura 2. Exemplificação da produção de adenosina após degradação sequencial de ATP/ ADP via CD39 e CD73 em macrófagos............................................................................... 28 Figura 3. Determinação da zona de macrófagos ........................................................................ 35. Figura 4. Análise da expressão de moléculas coestimulatórias CD80 ........................... 38 Figura 5. Análise da expressão de moléculas coestimulatórias CD86 ........................... 39 Figura 6. Análise da expressão de moléculas MHC II ............................................................. 41 Figura 7. Avaliação da expressão de moléculas CD40 .......................................................... 43 Figura 8. Análise da expressão de moléculas CD39 ............................................................... 45 Figura 9 Identificação da NTPDase 1/ CD39 em macrófagos pela técnica de Western blotting .......................................................................................................................................... 47 Figura 10. Avaliação da expressão de moléculas PD-1 ......................................................... 49.

(12) LISTA DE TABELAS. Tabela 1: Anticorpos utilizados nos ensaios de citometria .................................................... 34.

(13) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ADP. Adenosina difosfato. AMP. Adenosina monofosfato. APC. “Antigen presented cell” - Células apresentadora de antígenos. ATP. Adenosina trifosfato. BB. Meio Brucella Broth. CTLA-4. “Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein 4” – Antígeno 4 associado. a linfócito T citotóxico DMSO. Dimetilsulfóxido. DNA. “Desoxyribonucleic acid. FoxP3. Fator de transcrição Forkhead Box P3. IDO. Indoleamine-pyrrole 2,3dioxygenase. IFN- γ. Interferon-gama. IL. Interleucina. LPS. lipopolissacarídeo. MAPA. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. MCP-1. “Monocyte chemoattractant protein-1” - Proteína quimiotática de. monócitos-1 MHC. “Major Histocompatibility Complex” – Complexo de histocompatibilidade. principal MOI. “Multiplicity of infection” – Multiplicidade de infecção. NK. Natural Killer. NO. “Nitric Oxide” – Oxido nítrico. PAMPs. “Pathogen associated molecular patterns” - Padrões moleculares. associados a patógenos PBS. “Phosphate buffered saline” - Tampão salina fosfato. PD-1. Programador de morte celular-1. PNCEBT. Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e. Tuberculose PRRs. “Pattern recognition receptor” - Receptores de reconhecimento de. padrões SFB. Soro fetal bovino.

(14) TCR. “T cell receptor” – Receptor de célula T. TGF- β. “Transforming growth factor beta” – Fator-beta de transformação do. crescimento TH1. “ T helper 1” – Linfócitos T auxiliar 1. TH2. “ T helper 2” – Linfócitos T auxiliar 2. TLR. “Toll Like Receptor” - Receptores do tipo Toll. TNF- α. “Tumor necrosis fator alpha” - Fator alfa de Necrose Tumoral. UFC. Unidades formadoras de colônias.

(15) SUMÁRIO 1. INTRODUCÃO .................................................................................................................................... 13 1.1. EPIDEMIOLOGIA .................................................................................................................... 15 1.2. CARACTERÍSTICAS PATOGÊNICAS........................................................................... 16 1.3. RESPOSTA IMUNOLÓGICA CONTRA Brucella sp................................................. 19 1.4. REGULAÇÃO E IMUNOMODULAÇÃO .......................................................................... 22 1.5. SINALIZAÇÃO PURINÉRGICA ......................................................................................... 25 1.5.1. AS NTPDases ............................................................................................................... 26 1.6. Brucella sp. E EVASÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA ................................... 28 2. OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 31 2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................................. 31 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................ 31 3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................. 32 3.1. LINHAGEM BACTERIANA E CONDIÇÕES DE CULTIVO .................................. 32 3.2. LINHAGEM CELULAR ............................................................................................................ 32 3.3. CULTURA DE CÉLULAS....................................................................................................... 32 3.4. CITOMETRIA DE FLUXO ..................................................................................................... 33 3.5. CULTURA DE MACRÓFAGOS E PREPARO DE HOMOGENEIZADO CELULAR ............................................................................................................................................... 35 3.5.1. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA E IDENTIFICAÇÃO PELA TÉCNICA WESTERN BLOTTING .................................... 36 3.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................................ 36 4. RESULTADOS .................................................................................................................................. 37 5. CONCLUSÃO..................................................................................................................................... 51 6. PERSPECTIVAS .............................................................................................................................. 52 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................. 53.

(16) 1. INTRODUÇÃO A brucelose é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias do gênero Brucella, que acometem o homem e uma grande variedade de animais domésticos (NICOLETTI, 1989). Apresenta-se na forma endêmica em muitos países, resultando em prejuízos econômicos significativos aos sistemas de produção, além de sérias implicações na saúde animal e pública, visto seu caráter zoonótico (BRASIL, 2006).. 1.1.. HISTÓRICO. O grupo bacteriano responsável pela transmissão da brucelose foi descrito no homem pela primeira vez por Marston, em 1859, a partir de casos de febre ondulante seguidos de morte, ocorridos na Ilha de Malta, no Mar Mediterrâneo, sendo por isso denominada também de Febre de Malta (NICOLETTI, 2002; POESTER et al., 2009). Em 1887, o médico inglês, Sir David Bruce, isolou pela primeira vez uma bactéria do baço de soldados britânicos mortos na Ilha de Malta, denominando-a como Micrococcus melitensis (VIEIRA, 2004; GODFROID et al., 2005; POESTER et al.,. 2009).. Já. em. 1895,. Bernhard. Bang,. um. patologista. veterinário. dinamarquês,isolou um microrganismo do útero e de membranas fetais resultantes do aborto de vacas, identificando-o como Bacillus abortus (NICOLETTI, 2002; POESTER et al., 2009). Nos EUA, em 1918, Alice Evans demonstrou que os microrganismos isolados por Bruce e Bang apresentavam similaridades morfológicas, imunológicas e de cultivo. Em 1920, baseados em tais evidências, Meyer e Shaw propuseram a criação do gênero Brucella em homenagem ao autor do primeiro isolamento do agente, além da designação dos dois microrganismos descobertos anteriormente por Brucella melitensis e Brucella abortus, respectivamente (CORRÊA e CORRÊA, 1992; VIEIRA, 2004; RIBEIRO, MOTTA e ALMEIDA, 2008). No Brasil, o primeiro caso de brucelose humana foi descrito em 1913 por Gonçalves Carneiro e Danton Seixas, que um ano depois realizou pela primeira vez.

(17) no país o diagnóstico clínico da brucelose bovina no estado do Rio Grande do Sul (PAULIN e FERREIRA NETO, 2003; VIEIRA, 2004). Atualmente, dentro do gênero independentes. que. são. Brucella, são descritas dez espécies. classificadas. principalmente. por. diferenças. de. patogenicidade, preferência de hospedeiro e características bioquímicas e antigênicas (ALTON et al., 1988; PAJUABA, 2006; OIE, 2009). As espécies conhecidas são classificadas da seguinte forma: B. melitensis (caprinos), B. abortus (bovinos), B. suis (suínos), B. canis (cães), B. ovis (ovinos), B. neotomae (ratos do deserto), B. cetáceos (cetáceos), B. pinnipedia (pinípedes), B. microti (ratazanas), e B. inopinata (desconhecido). Dentre essas espécies conhecidas de Brucella, apenas B. abortus, B.melitensis, B.suis e B. canis são patogênicas para os seres humanos, sendo que as infecções causadas por B. canis são raras nos mesmos (CLOECKAERT et al., 2003; HE, 2012). Embora a B. melitensis seja a espécie mais patogênica, a B. abortus ganha destaque por ser a principal fonte de infecção em função da sua maior disseminação no mundo (CORBEL, 1997).. 1.2. EPIDEMIOLOGIA. A brucelose é uma zoonose distribuída mundialmente, sendo endêmica em regiões como América Latina, Oriente Médio, África, Ásia e na bacia do Mediterrâneo. Estima-se que são registrados anualmente no mundo cerca de meio milhão de novos casos de brucelose humana (MANTUR e AMARNATH, 2008; HE, 2012; AVILA-CALDERON et al., 2013). Embora já tenha sido erradicada em diversos países da região norte e central da Europa, além da Austrália, Japão e Nova Zelândia, essa zoonose reemergente continua se mostrando como um grave problema sanitário e econômico (CORBEL, 1997; PAULIN e FERREIRA NETO, 2003; OIE, 2009), podendo apresentar em determinados países uma taxa de prevalência superior a dez casos a cada cem mil habitantes, sendo ainda mais frequente em pessoas que trabalham em fazendas (MANTUR e AMARNATH, 2008). O Brasil está localizado na área em que a brucelose é endêmica, porém sua disseminação no território é relativamente diferenciada, principalmente em virtude da ampla extensão territorial e as características próprias de cada região (POESTER et al., 2002; RIBEIRO, MOTA e ALMEIDA, 2008; LAGE et al., 2008). Segundo boletim epidemiológico, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA, em 2001, instituiu o Programa Nacional de Controle e.

(18) Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), que consiste em um conjunto de medidas sanitárias estratégicas em busca da redução da prevalência e incidência da brucelose, adotando como medida profilática a vacinação de bezerras com idade entre três e oito meses em todo o país. Dentre outras atividades previstas no programa, destacam-se a adesão voluntária dos criadores na busca de rebanhos livres e monitorados, a prática de testes sorológicos regulares em rebanhos de elite para a participação em feiras e exposições, e o sacrifício dos animais positivos para brucelose (BRASIL, 2006). Esse programa tem como intuito reduzir os impactos causados por essas doenças na saúde pública, além de promover a competitividade da pecuária nacional, haja visto que o Brasil detém o maior rebanho bovino comercial do mundo (IDAF, 2011). Visando obter informações acerca da prevalência da brucelose bovina no Brasil, foi realizado nos estados brasileiros um levantamento epidemiológico a partir de dados amostrais obtidos de propriedades rurais entre os anos de 2001 e 2004. Tal estudo aponta que a prevalência de focos da doença nessas propriedades amostradas foi de 0,32% em Santa Catarina, 2,5% no Distrito Federal, 4,02% no Paraná, 4,2% na Bahia, 6,04% em Minas Gerais, 9% no Espírito Santo, 9,70% em São Paulo, 12,60% em Sergipe, 15,42% no Rio de Janeiro, 17,54% em Goiás, 21,22% em Tocantins e 35,18% em Rondônia (ALVES e VILLAR, 2011). O controle dos patógenos associados à doença, aliado a medidas profiláticas como a vacinação dos reservatórios animais, são fatores que contribuem de forma satisfatória para a redução da incidência da brucelose humana, fato que vem sendo observado em alguns países como Austrália, países do norte Europeu e América do Norte (PAPPAS et al., 2006a).. 1.3.. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DA BACTÉRIA Brucella sp.. As bactérias do gênero Brucella sp., patógenos causadores da brucelose, são classificadas. como. cocobacilos. Gram-negativos. pertencentes. à. classe. Proteobacteria. São microrganismos intracelulares facultativos, imóveis e não esporulados, e apresentam-se na forma de bastonetes curtos que medem de 0,6 a 1,5 µm por 0,5 a 0,7 µm de dimensão (VELASCO et al., 2000; REDKAR et al., 2001; PROBERT et al., 2004). Com relação a obtenção de energia, são classificados como.

(19) microrganismos aeróbios, entretanto, sob atmosfera com tensão de 5 - 10% de CO2 há favorecimento para o isolamento de algumas espécies. Apresentam temperatura de multiplicação de 20 a 40°C, sendo 37°C a temperatura ideal, e um pH ótimo que varia de 6.6 a 7.4 (PAJUABA, 2006; OIE, 2009). Classicamente, as bactérias do gênero Brucella podem ser divididas em grupos antigenicamente distintos, sendo denominadas lisas ou rugosas. Tais grupos são embasados em características observadas durante o crescimento bacteriano em meios de cultura e na constituição química da parede celular - presença ou ausência da cadeia O - um dos componentes do lipopolissacarídeo (LPS) localizado na superfície externa da Brucella spp que possui relação com a virulência de algumas espécies (NIELSEN et al. 2004; CARDOSO et al., 2006).. 1.4.. CARACTERÍSTICAS PATOGÊNICAS DA BACTÉRIA Brucella sp. E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA ZOONOSE. A patogenicidade das bactérias do gênero Brucella está intimamente relacionada a suas características morfológicas, aliadas aos mecanismos de evasão do microrganismo que favorecem a penetração, sobrevivência e multiplicação no hospedeiro (ARÉSTEGUI et al., 2001; NIELSEN et al., 2004; XAVIER, 2009). Em humanos, a brucelose pode ser veiculada pela ingestão de produtos de origem animal contaminados, principalmente leite e derivados que não passaram por processamento térmico. Essa doença é transmitida também através do contato direto ou indireto com animais infectados, fetos abortados ou anexos fetais, além da manipulação de carcaças e vísceras provenientes de animais infectados, sem a utilização de equipamentos de segurança (PAULIN e FERREIRA, 2008). Em regiões endêmicas, a via de infecção mais comum é o consumo de produtos lácteos não pasteurizados, principalmente o leite e o queijo (JONG; ROLAN e TSOLIS, 2010; EKICI et al., 2012; AVILA-CALDERON et al., 2013). Uma vez no interior do hospedeiro, seja em humanos ou outros animais, as bactérias do gênero Brucella podem persistir nas células do sistema monocítico fagocitário, nas secreções uterinas, na glândula mamária e na medula óssea. Sendo assim, o descarte adequado dos tecidos que concentram um grande número de bactérias pode reduzir e evitar a contaminação de carcaças e vísceras durante o abate (CARVALHO et al., 1995; PESSEGUEIRO, BARATA e CORREIA, 2003; PARDI et al., 2006)..

(20) A capacidade de penetração pela pele lesada ou íntegra e pelas membranas mucosas favorece a classificação dessa zoonose como uma enfermidade de caráter ocupacional, visto que acomete profissionais que desenvolvem atividades com maior risco de exposição ao agente causador da doença, sendo estes, consequentemente, mais propícios à infecção conforme tem sido observado em veterinários, laboratoristas e trabalhadores de matadouros e frigoríficos (LAGE et al., 2008; MINHARRO, 2009; OIE, 2009). Corroborando esses dados, estudos apontam a brucelose como a doença bacteriana mais comumente adquirida em laboratório no mundo (LUNAMARTÍNEZ e MEJÍA-TERÁN, 2002; PAPPAS et al., 2006a). As bactérias do gênero Brucella sp podem apresentar dose infecciosa até mesmo em baixas quantidades, além de possuírem grande potencial de dispersão pelo ar facilitando assim sua transmissão, visto que são bactérias facilmente aerossolizadas. Sabe-se também que infecções humanas com estas bactérias são debilitantes e difíceis de tratar (FRANZ et al., 1997; PAPPAS e PAPADIMITRIOU, 2007). Em função dessas características, estas bactérias encontram-se na lista dos agentes etiológicos que requerem atenção com relação ao seu potencial uso em bioterrorismo (GREENFIELD et al., 2002; PAPPAS et al., 2006b). Em diversos grupos animais, a brucelose apresenta-se como uma infecção crônica que persiste por toda a vida. O tropismo da bactéria pelos órgãos reprodutores é responsável por suas principais manifestações que são o aborto, a infertilidade e falhas reprodutivas (PESSEGUEIRO; BARATA e CORREIA, 2003; FRANCO et al., 2007). Com relação aos seres humanos, essa infecção pode causar sintomas como febre. ondulante,. endocardite,. artrite,. osteomielite. além. de. complicações. neurológicas. Tem sido relatado que formas agudas e crônicas da brucelose podem afetar também a coluna vertebral (PAPPAS et al., 2005) causando uma derivação da doença conhecida como brucelose espinhal que afeta principalmente idosos. A brucelose também pode levar à inflamação das articulações causando artrite, geralmente registrada nos pacientes com até 30 anos (ALP e DOGANAY, 2008). A doença raramente é fatal em seres humanos, apresentando um percentual de cerca de 2% de óbito, entretanto essa infecção pode provocar debilidade severa e levar à incapacidade do hospedeiro. A doença tende à cronicidade e persistência, podendo se tornar uma doença granulomatosa capaz de afetar qualquer órgão (CHRISTOPHER; UMAPATHY e RAVIKUMAR, 2010). Diagnosticar a brucelose humana de forma rápida e precisa ainda é considerado um desafio para profissionais da saúde em virtude de suas.

(21) características clinicas não especificas, sendo frequentemente confundida com a gripe em função da similaridade entre os sintomas iniciais (MEMISH et al., 2000). Dentre os métodos para diagnóstico, o isolamento do microrganismo, também conhecido como teste direto, é o teste padrão para confirmar a infecção, porém esse método requer tempo e técnicos qualificados. Além disso, o manuseio das amostras contendo o patógeno representa um alto risco de contaminação (LUNAMARTÍNEZ e MEJÍA-TERÁN, 2002; PAPPAS et al., 2006a). Já os testes indiretos ou sorológicos detectam os anticorpos contra Brucella spp presentes em diversos fluidos corporais como sangue, muco vaginal, sêmen e leite (POESTER et al., 2009). Até o momento, a ausência de uma vacina eficaz para a prevenção desta zoonose em seres humanos faz com que a erradicação ou controle da doença sejam feitos a partir de medidas aplicadas ao animal hospedeiro. O tratamento dessa infecção é alvo de discussão visto que ainda não existe acordo em relação ao melhor protocolo a ser usado, mas este geralmente requer a utilização prolongada de uma combinação de antibióticos, que produz um alívio na sintomatologia, diminuindo a duração da doença e a ocorrência de complicações, podendo assim prevenir uma possível recaída (PESSEGUEIRO; BARATA e CORREIA, 2003; ARIZA et al., 2007; FANNI et al., 2013). Além de apresentar relevância clínica quando acomete o homem, a ocorrência da brucelose em outros animais pode resultar em perdas econômicas significativas como a imposição de barreiras sanitárias e tarifárias ao comércio internacional de produtos de origem animal levando a perdas no rendimento industrial, gastos significativos devido aos altos custos para a implementação dos programas de controle e erradicação da doença, além de prejuízos envolvendo a produção animal, devido ao elevado número de abortos, nascimento de animais fracos, baixa fertilidade nas propriedades rurais e, principalmente, o declínio na produção de leite e carne (POESTER et al., 2009).. 1.5.. RESPOSTA IMUNOLÓGICA CONTRA Brucella sp.. A resposta imune efetiva contra a Brucella sp se inicia com o reconhecimento de padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs - do inglês, pathogen associated molecular patterns) por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs - do inglês, Pattern recognition receptor) (KAWAI e AKIRA, 2007) presentes na membrana plasmática ou em compartimentos intracelulares que permitem ao.

(22) hospedeiro distinguir bactérias de agentes virais e parasitários (JANEWAY e MEDZHITOV, 2002; HOEBE, JANSSEN e BEUTLER, 2004). Entre os PRRs, os receptores do tipo Toll (TLR – do termo em inglês Toll Like Recepor) recebem destaque uma vez que, após o reconhecimento e ligação aos PAMPs, atuam de forma direta ou indireta no processo de geração de respostas imunológicas inatas e adaptativas contra organismos invasores através de sinalizações distintas, exercendo também importante papel na ativação de linfócitos (O´NEILL, 2006). Além de atuarem na detecção e reconhecimento de patógenos, os TLRs ativam cascatas de sinalização induzindo a expressão de moléculas coestimulatórias como CD80 e CD86 expressas sobre a superfície das células apresentadora de antígenos (APC, do inglês, antigen presented cell) - células dendríticas, macrófagos e células B favorecendo assim o estabelecimento de respostas imunológicas (HOLGATE, 2012; DEURLOO et al. 2003). Em relação aos receptores TLRs envolvidos no reconhecimento da Brucella sp, estudos anteriores sugerem que os receptores TLR2 e TLR4 reconhecem esse patógeno e participam da sinalização que consequentemente induz a produção de diferentes citocinas (OLIVEIRA et al., 2008). Em 2005, Huang e colaboradores demonstraram que o DNA (DNA – do termo em inglês desoxyribonucleic acid) da Brucella sp apresenta ligantes para o receptor TLR9 e que a resposta de citocinas do tipo TH1 (T helper 1) é dependente dessa ativação (HUANG et al., 2005). Colaborando com esses dados, em 2008, Macedo e colaboradores evidenciaram a importante participação do TLR9 nesta resposta uma vez que sua ausência acarretou significativo aumento da carga bacteriana esplênica, associado a uma redução na produção da citocina IL-12 em macrófagos e em células dendriticas. Apesar disso, a produção da citocina TNF-α (Fator alfa de Necrose Tumoral) e de NO (NO - do inglês nitric oxide) não foi afetada pela ausência de TLR9, sugerindo a existência de outros receptores envolvidos nesta resposta. (HUANG et al., 2005; MACEDO et al., 2008). Além disso, em estudos mais recentes (2013), Almeida e colaboradores demonstraram que o TLR6 também é um importante componente envolvido no combate ao patógeno e está associado a produção de IL-12 e TNF-α por macrófagos e células dendríticas. (ALMEIDA et al., 2013). Após serem reconhecidas por tais receptores, bactérias intracelulares como a Brucella sp serão combatidas principalmente através de mecanismos mediados por células que são atraídas para o sítio infeccioso por meio de quimiocinas como a IL-8.

(23) e MCP-1, bem como a produção de citocinas inflamatórias como a IL-1, IL-6 e o TNF-α (COELHO-CASTELLO et al., 2009). Dentre. os. diversos. tipos. celulares. envolvidos,. os. macrófagos. são. especialmente importantes na infecção pela Brucella abortus uma vez que são os principais locais de sobrevivência e replicação da bactéria (BALDWIN e GOENKA, 2006). A ativação de macrófagos leva a fagocitose e a destruição do microrganismo através da produção de uma variedade de mediadores bioquímicos que atuam diretamente contra as bactérias, dentre eles o peróxido de hidrogênio (H 2O2), ânion superóxido (O2- ) e o óxido nítrico (NO) são os mais eficazes (COELHO-CASTELLO et al., 2009). Além disso, a ativação de macrófagos e de células dendríticas estimula a produção da citocina IL-12 que, como já mencionado, possui um papel de extrema relevância. Esta citocina é a grande responsável pela diferenciação dos linfócitos T para o perfil TH1, relacionado a liberação de citocinas de caráter próinflamatório como IFN- γ e o TNF-α que ativam mais macrófagos e potencializam a destruição do patógeno (BIRON, 1999; HUANG et al., 2001). Adicionalmente, a IL12 também ativa células Natural Killer (NK) que respondem produzindo mais IFN- γ potencializando a ativação de macrófagos (MURPHY et al., 2001). Tendo em vista que a atuação exclusiva da resposta imunológica inata não é capaz de promover a eliminação de bactérias patogênicas, há necessidade da participação da resposta imunológica adaptativa. Nesta etapa destacam-se os mecanismos efetores que envolvem linfócitos TCD4 e TCD8 (COELHO-CASTELLO et al., 2009). A ativação dos linfócitos T CD4 ocorre mediante dois sinais. O primeiro estimulo é recebido por esta célula a partir de um receptor presente em sua superfície, chamado TCR (do inglês, T cell receptor) que se liga especificamente a um peptídeo antigênico que é apresentado via MHC II (MHC - do inglês, Major Histocompatibility Complex), presente na superfície de uma célula apresentadora de antígenos (APC - do inglês, antigen presented cell). O segundo sinal essencial para a ativação linfocitária é fornecido por moléculas coestimulatórias que são expressas na superfície de células apresentadoras de antígeno ativadas. Classicamente, as moléculas B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) recebem destaque entre as moléculas coestimulatórias e exercem papel fundamental na ativação de linfócitos T a partir da interação com o correceptor CD28 que é constitutivamente expresso na superfície de células T (POD OJIL e MILLER, 2013). Sabe-se também que a interação entre as moléculas coestimulatórias CD40LCD40 possui papel fundamental em processos imunes celulares. Tem sido.

(24) demostrado que a ligação entre a molécula CD40L, expressa principalmente pelas células T e B ativadas, a molécula CD40, presente na superfície das APCs, impulsiona a produção de citocinas e induz a expressão de moléculas coestimulatórias facilitando assim a apresentação antigênica (ELGUETA et al.,2013). Outro tipo celular importante na resposta imune contra B. abortus são os linfócitos T CD8. Uma vez ativadas, estas células se diferenciam em linfócitos T citotóxicos (CTLs) capazes de reconhecer e eliminar células alvo através da liberação de proteínas citotóxicas e secreção de citocinas pró-inflamatórias, principalmente IFN- γ e TNF-α, que ativam os fagócitos (MURPHY et al., 2001). Já foi demonstrado que camundongos que não são capazes de montar uma resposta através de linfócitos T CD8+ (deficientes em MHC de classe I) apresentam um quadro de brucelose exacerbado, com um aumento substancial na carga bacteriana esplênica (OLIVEIRA e SPLITTER, 1995). Os linfócitos B também desempenham importante papel no combate ao patógeno uma vez que atuam na produção de anticorpos antígeno-especifico capazes de neutralizar e opsonizar o microrganismo, além de ativar o sistema do complemento e promover a citotoxicidade mediada por células (ADCC) (SKENDROS e BOURA, 2013). Em resumo, uma resposta imune efetiva contra a Brucella depende basicamente da ativação de linfócitos T via MHCI e MHCII, com auxílio dos coestimuladores (CD80 e CD86). Estas células ativadas se diferenciam em linfócitos TH1 ou CTLs que vão, respectivamente, potencializar a atividade dos macrófagos e destruir células infectadas..

(25) 1.6.. REGULAÇÃO E IMUNOMODULAÇÃO. Em paralelo a ativação imunológica dita anteriormente, um organismo saudável frente a infecções apresenta também a atuação simultânea de uma resposta regulatória que é extremamente importante para a manutenção da homeostase (HOLGATE, 2012). Tal resposta compõe o repertório imunológico e é obtida através de células e moléculas que possuem a função de suprimir a atuação do sistema imunológico e, consequentemente, manter a autotolerância e prevenir potenciais efeitos patogênicos (YAN e LIU, 2009; FEUERER et al, 2009). Tem sido relatado que, independente da linhagem, todas as células com caráter regulatório identificadas até o momento podem exercer sua função supressora através de características atribuídas a dois mecanismos essenciais, sendo eles o contato direto ou a secreção de citocinas imunossupressoras (SKAGGS, SINGH e HAHN, 2008). Dentre as principais citocinas relevantes para o perfil regulatório estão o TGFβ, IL-10 e a IL-35 que, em geral, promovem a anergia de células T e/ou disfunção de células apresentadoras de antígenos (BELKAID, 2007). O TGF-β apresenta efeitos antiproliferativos uma vez que é capaz de inibir a produção da citocina IL-2, essencial para a proliferação de células T (BRABLETZ et al.,1993). Além disso, essa citocina é capaz de induzir a diferenciação de células dendríticas para um perfil tolerogênico, limitando a expressão de CD40, CD86 e de MHCII, além de aumentar a expressão de CD45RB que é considerado um importante marcador de células dendríticas tolerogênicas. A citocina em questão também apresentou potencial indutor de IDO (Indoleamine-pyrrole 2,3dioxygenase) que é responsável pela degradação de triptofano (Song et al, 2014). Sabe-se que a falta desse aminoácido essencial tem sido apresentada como causa da inibição da ativação de células T e, consequentemente, responsável pela indução de apoptose dessas células (FALLARINO et al., 2003). A citocina IL-10 também é uma importante molécula imunorregulatória, sendo produzida principalmente por linfócitos T, células B, macrófagos, neutrófilos e também por alguns subconjuntos de células dendríticas (SARAIVA; O’GARRA, 2010). Essa citocina apresenta proeminente atividade anti-inflamatória tendo sua atuação primária em fagócitos e em células apresentadoras de antígeno, reduzindo a produção de citocinas pró-infamatórias, tais como TNF-α e IL-12, a expressão de.

(26) moléculas de MHC II e coestimulatórias, bem como a produção de intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio (FIORENTINO; BOND; MOSMANN, 1989; MOORE et al., 2001). Outra linha de atuação de células regulatórias é o contato célula- célula. Nesse contexto a elevada expressão de moléculas coinibitórias como o CTLA-4 e PD-1, também tem participação relevante para o perfil regulatório (BELKAID, 2007) (Figura1). A molécula CTLA-4 (do inglês, cytotoxic T-lymphocyte antigen 4) leva a inibição da ativação de células T por indução de um sinal negativo que coincide com a estimulação do TCR e/ou por coestimulação inibitória competitiva devido à alta afinidade em ligar-se ao CD80 e/ou CD86 quando comparado com CD28. A ligação entre células T e APCs via CTLA-4 – B7 acarreta na inibição das APCs e, consequentemente, na supressão das respostas de células T (VIGNALI, COLLISON e WORKMAN, 2008). Outra proteína que merece destaque na via de inibição é a molécula CD279 também conhecida como PD-1 (Programadora de morte celular-1) e seus ligantes PDL-1 e PDL-2, pertencentes à família B7:CD28. Tais moléculas são expressas em vários tecidos, com maiores níveis nos pulmões, coração e fígado, sendo que a expressão das mesmas é induzida por diferentes citocinas (BROWN et al., 2003). A molécula PD-1 é encontrada em células T CD4 e CD8, células B e células mieloides ativadas, entretanto, não é encontrado em células não estimuladas. Sua descrição foi concomitante a dos seus ligantes, PDL-1 e PDL-2, que são encontrados em monócitos e células dendríticas ativadas, sendo que a expressão de tais ligantes parece ser regulada pela citocina IFN- γ ou IFN- γ / LPS (LECHNER et al., 2001). A atuação do PD-1 na modulação da resposta imune é diferente da utilizada pela molécula CTLA-4, embora ambas tenham a capacidade de suprimir a ativação de células T (PARRY et al., 2005). Sabe-se que após interação com seus ligantes ocorre recrutamento de fosfatases que atuam nas quinases responsáveis pela sinalização via TCR, acarrentando a redução dessa via de sinalização e consequentemente, inibindo a proliferação e produção de citocinas por células T (GREENWALD, FREEMAN e SHARPE, 2005; MATSUMOTO et al., 2008)..

(27) Figura 1:. Marcadores. de. superfície envolvidos. no desenvolvimento. de. respostas. imunológicas. Expressão de moléculas coestimulatórias e coinibitórias na superfície de células dendríticas, macrófagos, e células tumorais capazes de gerar respostas variadas de acordo com o receptor alvo presente nas células T. FONTE: Adaptado de SHARMA, 2012; MELERO et al.,2013.. Embora a função da molécula PD-1 já tenha sido bastante estudada na regulação de células T, o seu papel na imunidade inata ainda não está bem elucidado. O mecanismo de atuação dessa molécula foi estudado em macrófagos por Huang e colaboradores, que demonstraram que a expressão de PD-1 pode ser induzida em monócitos e macrófagos frente a resposta inflamatória e dano tecidual, além de apresentar sua expressão ampliada em respostas imunológicas contra bactérias. Foi visto também que animais PD-1 -/- sépticos apresentaram os níveis citocinas pró-inflamatórias elevados e reduzida capacidade de combater/reveter o quadro de septicemia (HUANG et al., 2009) Colaborando com esses dados, também em 2009, Guitierrez mostrou que frente a infecção com Trypanosoma cruzi ocorre aumento da expressão de PD-1 em macrófagos, e que a deficiência dessa proteína ocasiona o aumento da capacidade tripanocida dessas células devido a otimização da ativação celular por IFN- γ, acarretando o aumento da produção de NO (GUTIERREZ, 2009). Tais dados.

(28) sugerem que a a atuação da molécula PD-1 em fagócitos é similar a que ocorre em células T, sendo então responsáveis pela regulação das respostas imunológicas.. 1.5. SINALIZAÇÃO PURINÉRGICA. O termo purinérgico foi introduzido em 1972 por Burnstock ao sugerir que moléculas de ATP atuariam como um novo transmissor em células neuronais. Com o avanço das pesquisas, novos dados corroboraram o papel dos nucleotídeos como compostos. de. sinalização. extracelular. (KÖLES,. FÜRST. e. ILLES,. 2007;. BURNSTOCK, 2012). Os purinoreceptores são representados por diversas famílias e provavelmente são um dos receptores mais abundantes em mamíferos (ABBRACCHIO et al., 2006). Sua sinalização é dependente de uma variedade de fatores, tais como a expressão do receptor, sua sensibilidade aos ligantes e a concentração de nucleotídeos extracelulares (BOURS et al., 2006). Os. receptores. purinérgicos. são. caracterizados. como. proteínas. transmembranares agrupadas em duas grandes famílias, P1 e P2, de acordo com os efeitos farmacológicos de antagonistas e agonistas dos nucleosídeos e nucleotídeos (BOURS et al., 2006). Os receptores P1 pertencem a superfamília de receptores do tipo serpentina, sendo subdivididos em receptores A1, A2A, A2B e A3, que se ligam a adenosina extracelular com diferentes afinidades (RALEVIC e BURNSTOCK, 1998). Com relação a família dos receptores do tipo P2, sabe-se que é subdivida em duas sub-famílias, sendo elas P2X e P2Y (BURNSTOCK, G.; KNIGHT, G.E. 2004). Os receptores do tipo P2X são proteínas transmembranas em forma de canal iônico que respondem primariamente ao ATP extracelular e os receptores do tipo P2Y são proteínas transmembrana que apresentam responsividade especifica de acordo com as subdivisões existentes nesse grupo (ABBRACCHIO et al., 2006). Atualmente já foram descritos oito subtipos do receptor P2Y (P2YR1,2,4,6,11,12,13,14), sendo eles responsivos a nucleotídeos purínicos (ATP, ADP) e pirimidínicos (UDP e UTP) (RALEVIC e BURNSTOCK, 1998; JACOBSON, JAYASEKARA e COSTANZI, 2012). Considerando que o controle dos níveis de nucleotídeos bem como a ativação dos seus receptores específicos são fatores essenciais para manutenção dos processos fisiológicos dependentes da sinalização purinérgica, tais como inflamação.

(29) e tromborregulação (ROBSON, SEVIGNY e ZIMMERMANN, 2006), cabe salientar a importância das enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos di e trifosfatados em seus respectivos mononucleotídeos permitindo assim sua ligação a purinoreceptores e consequentemente, a sinalização depentende dessa via (ZIMMERMANN, 2001).. 1.5.1. AS ECTO-NUCLEOTIDASES. Os principais nucleotídeos que exercem função biológica são o ATP, ADP e AMP. Essas moléculas são formadas a partir de uma base nitrogenada e uma pentose - ribose - constituindo os nucleosídeos, que posteriormente são fosforilados por quinases (ATKINSON et al., 2006). Os nucleotídeos representam uma importante classe de compostos extracelulares que, ao interagirem com seus receptores específicos, são responsáveis pela ativação de vias de sinalização fundamentais para o funcionamento celular (SOSLAU e YOUNGPRAPAKORN, 1997). Sabe-se que tanto nucleotídeos quanto nucleosídeos podem ser liberados no espaço extracelular durante lesão mecânica, necrose, apoptose, ativação de células inflamatórias (IDZKO, FERRARI e ELTZSCHIG, 2014) e/ou em resposta a patógenos exógenos (BOURS et al., 2006). Já foi relatado também que moléculas de ATP, além de participarem do processo de neurotransmissão, contração muscular, vasodilatação, metabolismo ósseo e metabolismo do glicogênio no fígado (BOURS et al., 2006), também atuam como um importante sinalizador na inflamação juntamente com o produto da sua hidrólise, o ADP (SOUZA et al., 2011). Adicionalmente, o AMP, um metabólito intermediário da hidrólise do ATP, funciona como importante molécula sinalizadora intracelular, sendo também substrato para a formação de adenosina (figura 2) que participa da regulação do processo inflamatório e apresenta efeitos imunomodulatórios (SOUZA et al., 2011). Já foi demonstrado que o acúmulo de adenosina é capaz de reduzir a fagocitose e a produção de reativos de oxigênio por macrófagos e neutrófilos além de inibir a produção de IL-12 e TNF-α. Além disso, tem sido sugerido que esta molécula é capaz de transformar macrófagos classicamente ativados (M1), relacionados com processos inflamatórios, em macrófagos alternativamente ativados (M2) (HASKÓ e PACHER, 2012). Esses últimos estão associados a um perfil regulador, sendo grandes produtores de IL-10 e TGF-β (BELKAID, 2007).

(30) Figura 2: Exemplificação da produção de adenosina após degradação sequencial de ATP/ ADP via CD39 (ENTPD1; ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1) e CD73 (ecto-5'nucleotidase) em macrófagos. ATP intracelular, gerado em resposta a padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPS), é liberado e convertido a adenosina pela ação das moléculas CD39 e CD73. A ligação da adenosina a seus receptores é capaz de reduzir a produção de citocinas inflamatórias e estimular a produção de citocinas imunomoduladoras. FONTE: Adaptado de HAMIDZADEH e MOSSER, 2016.. Nesse contexto, as ecto-nucleotidases, enzimas que podem tanto ser secretadas quanto localizadas nas membranas celulares (IVANENKOV, MURPHYPIEDMONTE e KIRLEY, 2003; MURPHY-PIEDMONTE, CRAWFORD e KIRLEY, 2005), tem sido foco de diversos estudos visto que possuem como função primária o metabolismo de nucleotídeos. Sabe-se que os produtos deste metabolismo estão.

(31) envolvidos em diversos processos celulares, incluindo a mediação da resposta imunológica (figura 2) e interação parasito-hospedeiro (DE MARCO et al., 2003; MAIOLI et al., 2004). A presença destas enzimas foi demostrada em animais vertebrados e invertebrados, plantas, leveduras (HANDA e GUIDOTTI, 1996; ZIMMERMANN E BRAUN, 1996; SMITH e KIRLEY, 1998) e diferentes protozoários como Toxoplasma gondii (BERMUDER et al., 1994; SILVERMAN et al., 1998), Leishmania amazonensis (BERREDO-PINHO et al., 2001; COIMBRA et al., 2002; PINHEIRO et al., 2006), Entamoeba histoIitica (BARROS et al., 2000), Trichinella spiralis (GOUNARIS, 2002), Trichomona vaginalis (DE AGUIAR MATOS et al., 2001), e Crithidia deanei (DOS PASSOS LEMOS et al., 2002). Em 2007, foi descrita também em procarioto, a Legionella pneumophila, um agente causal de pneumonia (SANSOM et al., 2007). Alguns trabalhos apresentam também uma correlação entre a ativação de hidrólise de ATP e um dado efeito biológico na interação parasito-hospedeiro (SILVERMAN et al., 1998; SANSOM et al., 2007; DE ALMEIDA MARQUES DA SILVA, E. et al., 2008; SANSOM, ROBSON e HARTLAND, 2008; Santos et al., 2009). Estes estudos, aliados a outros trabalhos, fazem associações entre fatores como a presença genética, a expressão gênica e/ou a atividade enzimática de ectonucleotidases de parasitos com a virulência, adesão celular, saída do parasito da célula infectada, controle da concentração de nucleotídeos das células hospedeiras e do meio extracelular e escape do sistema de defesa do hospedeiro (DE MARCO et al., 2003; MAIOLI et al., 2004). Na literatura existem sinônimos para este grupo de enzimas, como ectoapirase e ecto-ATPDase. A fim de facilitar a comunicação no meio cientifico, em 2001, Zimmermann e colaboradores propuseram uma nomenclatura única para este grupo enzimático, NTPDases. Contudo, o termo CD39 usado para designar a NTPDase 1 ainda é utilizado na imunologia (ZIMMERMANN et al., 2001; ROBSON, SEVIGNY e ZIMMERMANN, 2006). A NTPDase 1, ou CD39, foi caracterizada primeiramente como um marcador de ativação linfóide expresso em linfócitos B (MALISZEWSKI et al., 1994). Posteriormente sua expressão foi observada também em células T ativadas, células Natural Killer (NK), monócitos, células dendríticas (KOZIAK et al., 1999), células T Regulatórias (TReg) e macrófagos (DWYER et al., 2007), desempenhando importante função na sinalização purinérgica e, consequentemente, na resposta.

(32) imune visto que essa enzima é responsável pela degradação de ATP em AMP (ANTONIOLI et al., 2013). Sabe-se ainda que CD39 pode ter participação na adesão celular, proliferação, apoptose mediada por ATP e na secreção de citocinas (DWYER et al., 2007). Outra enzima que desempenha importante papel no metabolismo extracelular de nucleotídeos é a CD73 (ecto5’-nucleotidase). Essa molécula é considerada um antígeno de diferenciação leucocitário, além de ser caracterizada como um marcador de ativação de linfócitos T (CHRITENSEN, ANDERSEN e RYDER, 1996). Em relação a sinalização purinérgica, o CD73 é responsável pela conclusão da cascata de hidrólise do ATP, atuando na conversão de AMP em adenosina (ANTONIOLI et al., 2013) que, como já citado, apresenta importante efeitos imunomodulatórios. A atuação enzimática das moléculas CD39 e CD73 no sistema imune tem sido alvo de diversos estudos uma vez que claramente exercem importante papel em sua função, bem como na regulação das respostas imunológicas.. 1.6.. Brucella sp. E EVASÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA. Com a finalidade de assegurar a sobrevivência e a progressão da infecção, sabe-se que diversos patógenos utilizam as mais variadas estratégias de escape para manipular os mecanismos regulatórios do sistema imune (BELKAID, 2007). Como exemplo dessas estratégias, há mecanismos que envolvem a indução de respostas regulatórias normalmente associadas com o término das respostas imunes efetoras do hospedeiro. Essa indução pode ser feita diretamente, através da produção de citocinas regulatórias em resposta aos constituintes do patógeno, ou de forma indireta, através da geração de células com características regulatórias (BELKAID, 2007). A manipulação de células apresentadoras de antígenos também pode ser caracterizada como um mecanismo de evasão visto que interfere na expressão de moléculas coestimulatórias, além de ser capaz de induzir a produção de citocinas que podem direcionar os linfócitos para um perfil regulatório (BELKAID, 2007). Em relação a Brucella, sabe-se que dentre os mecanismos que impedem a detecção destas bactérias pelo sistema imunológico do hospedeiro estão a infecção intracelular prolongada com modificação da expressão dos genes, a sobrevivência.

(33) em vesículas acidificadas, a alteração da apoptose de macrófagos com bloqueio da fusão do fagolisossomo e redução da ativação dos mecanismos inflamatórios (RAJASHEKARA et al., 2006). Os microrganismos pertencentes a essa linhagem bacteriana são fagocitados principalmente por macrófagos logo após penetrarem na mucosa. Desse modo, sem ativarem fortemente o sistema imune tais bactérias coordenam a expressão de múltiplos fatores de virulência relacionados a sua entrada e tráfego, favorecendo assim a ocupação e permanência em seu nicho de replicação (RAMBOW-LARSEN et al., 2009). Diversos mecanismos reguladores da expressão gênica foram identificados no gênero Brucella, entre eles o Quorum sensing, stringent response, sistema regulatório de dois componentes e, mais recentemente, o blue-light responsive LOV-HK protein, que é responsável pela adaptação da bactéria a diferentes ambientes (RAMBOW-LARSEN et al., 2009). Além dos mecanismos já descritos acima, tem sido sugerido que este patógeno é capaz de modular as células apresentadoras de antígenos de forma a favorecer sua sobrevivência. De fato, já foi demonstrado que esta bactéria é capaz de infectar macrófagos (BALDWIN e GOENKA, 2006), linfócitos B (GOENKA et al.; 2012) e células dendríticas (SALCEDO et al., 2008), sendo também capaz de inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias, como a IL-12 (SATHIYASEELAN et al., 2006). Além disso, APCs infectadas com Brucella apresentam uma redução na expressão das moléculas coestimulatórias CD80 e CD86 (ZAITSEVA et al., 1996; BILLARD, DORNAND e GROSS, 2007; SALCEDO et al., 2008), bem como uma influência negativa sobre a expressão da molécula apresentadora MHC II (HELLER et al., 2012). A redução na expressão dessas moléculas resulta em uma menor ativação e proliferação de linfócitos, podendo favorecer a sobrevivência do patógeno. Entretanto, apesar de importantes, os mecanismos envolvidos nesta imunomodulação ainda não foram completamente elucidados. Sendo assim, uma vez que diversos estudos têm evidenciado a influência da molécula PD-1 e das ecto-nucleotidases CD39 e CD73 na ativação e produção de citocinas por células apresentadoras de antígenos, aliado ao fato de não existirem estudos que relacionam estes marcadores à Brucella, o objetivo deste trabalho é determinar se a infecção com B. abortus é capaz de alterar a expressão destas moléculas e assim limitar a ação do sistema imune, favorecendo a sobrevivência do patógeno..

(34) 2.. OBJETIVOS. 2.1.. OBJETIVO GERAL. Avaliar a participação das moléculas PD-1, CD39 e CD73 na imunomodulação induzida pela bactéria Brucella abortus em células da imunidade inata.. 2.2.. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 2.2.1.. Avaliar a expressão das moléculas coestimulatórias CD80 e CD86,. bem como da molécula apresentadora MHC II em macrófagos, células dendríticas e linfócitos B frente a infecção com B.abortus. 2.2.2.. Avaliar a expressão das moléculas CD39 e CD73 em macrófagos,. células dendríticas e linfócitos B infectados por B. abortus. 2.2.3.. Caracterizar os mecanismos de ação do efeito imunomodulador. desempenhado. pela. bactéria. B.abortus..

(35) 3.. MATERIAL E MÉTODOS. 3.1.. ANIMAIS. Foram utilizados camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6 com idade entre 8 e 10 semanas, pesando cerca de 18 a 20 g, que foram adquiridos do Centro de Biologia da Reprodução da Universidade Federal de Juiz de Fora. Os animais foram acondicionados em gaiolas plásticas e mantidos no Biotério do laboratório de Imunologia da Universidade Federal de Juiz de Fora com água e ração ad libitum.. 3.2.. LINHAGEM BACTERIANA E CONDIÇÕES DE CULTIVO. Foram utilizadas nesse trabalho bactérias B. abortus pertencentes as linhagens S2308 e RB51, ambas disponíveis no Laboratório de Imunologia de doenças InfectoParasitárias da Universidade Federal de Juiz de Fora. As linhagens utilizadas nos ensaios foram cultivadas em meio Brucella Broth (BB) líquido (DIFCO), a 37ºC sob agitação constante. Após três dias de crescimento, a cultura bacteriana foi centrifugada e o sedimento foi ressuspendido em tampão salina fosfato (PBS) 0,15 M pH 7,4 (2,8 mM Na2PO4; 7,2 mM Na2HPO4; 0,14 M NaCl). As alíquotas foram armazenadas em glicerol a 30%, a uma temperatura de 80°C. Para realização da contagem bacteriana, alíquotas destas culturas foram diluídas serialmente e plaqueadas em meio BB solidificado com 1,5% de ágar bacteriológico. Após incubação por 72 horas a 37ºC, foi possível determinar a concentração bacteriana presente na suspensão por meio da contagem do número de unidades formadoras de colônias (UFC) visualizadas na placa.. 3.3. INFECÇÃO Os animais foram infectados intraperitonealmente com 1x10 6 UFC da linhagem. S2308 ou RB51 da bactéria B. abortus diluídas em 200μl de PBS. Após os tempos de infecção (24, 48, 72 e 168 horas), os animais foram eutanasiados, por deslocamento cervical, para a retirada do baço e realização dos ensaios ex vivo.. 3.4.. LINHAGEM CELULAR.

(36) Os ensaios desenvolvidos nesse trabalho foram realizados em macrófagos murino pertencentes a linhagem RAW 264.7 (ATCC® TIB-71 TM), gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Jair Adriano Kopke de Aguiar.. 3.5.. CULTURA DE CÉLULAS. As linhagens RAW 264.7 foram cultivadas em garrafas de cultura de 25 cm 3 (SARSTEDT) com meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB e 1% de antibiótico e mantidas em estufa incubadora umidificada a 37°C com atmosfera de 5% de CO2. Periodicamente as células tinham seu crescimento e morfologia monitorados sendo que, de acordo com o índice mitótico, foram realizadas trocas do meio de cultura, havendo monitoramento até estas alcançarem confluência de aproximadamente 80%. Tal característica possibilitou que as células fossem então congeladas em meio apropriado de congelamento (90% SFB, 10% Dimetilsulfóxido (DMSO), VETEC), transferidas para garrafas de maiores dimensões (75 cm3, SARSTEDT) ou utilizadas nos ensaios. Uma vez que as linhagens celulares utilizadas são aderentes, suportes plásticos (cell scraper – 71 SARSTED) foram utilizados para sua remoção do interior das garrafas.. 3.6.. MACRÓFAGOS INTRAPERITONEAIS. O recrutamento dos macrófagos intraperitoneais foi realizado pela injeção intraperitoneal de 2 mL de tioglicolato 3% estéril (GORDON, UNKELESS e COHN, 1974). Após 4 dias, os animais foram eutanasiados para a realização de uma lavagem peritoneal onde 5 mL de tampão fosfato-salino (PBS, do inglês phosphate buffered saline) gelado foram injetados e, em seguida, recolhidos com seringa. O líquido coletado do peritôneo foi acrescido de PBS estéril até o volume final de 10 mL e submetido à centrifugação a 1500 RPM, por 10 minutos. As células obtidas foram ressuspendidas em 2 mL de meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 5% de SFB e 1% de antibiótico. A concentração celular foi determinada utilizando-se em câmara de Neubauer com corante azul de tripan..

(37) 3.7.. DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO. A quantidade de nitrito presente no sobrenadante das culturas estimuladas de células RAW 264.7 foi mensurada como um indicador da produção de NO por meio da Reação de Griess (GUEVARA et al., 1998). Para tanto, foram adicionadas 100 μL do sobrenadante das culturas tratadas a igual volume do Reagente de Griess. Em seguida, foi efetuada a incubação à temperatura ambiente por 10 minutos e posterior leitura em espectrofotômetro a 540 nm. A quantidade de nitrito (NO2-) nas amostras foi obtida por meio de curva padrão. 3.8.. CULTURA DE ESPLENÓCITOS. O baço extraído de cada animal foi macerado em 10 mL de PBS, com o auxílio de uma peneira de aço. Após serem macerados foram submetidos à centrifugação por 10 minutos a 1500 RPM. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 2 mL de tampão ACK (Ammonium-ChloridePotássium - 1% KHCO3 e 8% NH4Cl em água destilada) e incubadas por 5 minutos, a temperatura ambiente, ocorrendo a lise osmótica dos eritrócitos. Após a incubação, 28 mL de PBS foram acrescentados e seguiu-se nova centrifugação. Novamente o sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 2 mL de meio RPMI (GIBCO) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% dos antibióticos penicilina (100 U/mL, GIBCO) e estreptomicina (1 μg/mL, GIBCO). Em seguida a concentração das células foi determinada na câmara de Neubauer. As células foram plaqueadas na concentração de 1x106 células/poço em placas de 96 poços de fundo em U (NUNC), submetidas a marcação e realização da citometria de fluxo.. 3.9.. DETERMINAÇÃO DA PROLIFERAÇAO CELULAR. Esplenócitos derivados de animais de animais infectados ou não foram cultivados conforme descrito acima e estimulados com o mitógeno Concanavalina A (5μg/ml- Sigma-Aldrich). Após 72 horas de incubação à 37 oC e sob atmosfera com.

(38) 5% de CO2, o sobrenadante será retirados para a adição de 90 μl/poço de meio RPMI suplementado (10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico) e 10 μl/poço de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil. tetrazolium. bromido. (MTT. -. Sigma-Aldrich),. (5mg/ml). As células serão então novamente incubadas a 37°C e sob atmosfera com 5% de CO2 durante 4 horas. Após esse período, o sobrenadante será retirados para adição de 100 μl de DMSO (Dimetilsulfóxido- Synth). A reação será avaliada em leitor de microplaca (Biorad) em comprimento de onda de 550 nm. O índice de proliferação será então calculado levando-se em conta a metabolização do MTT de células estimuladas e células não estimuladas.. 3.10. CITOMETRIA DE FLUXO PARA AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS MARCADORES CELULARES DE SUPERFÍCIE. Após serem mantidas em cultura (células RAW 254.7) ou serem coletadas (macrófagos intraperitoneais), as células foram contadas em câmara de Neubauer utilizando o corante Azul de Tripan (Sigma), e posteriormente transferidas para placas de 96 poços de fundo chato, na concentração de 5 x 10 5 células por poço (adaptado do estudo de Huo et al.,2012). As células foram então incubadas por 24 horas e posteriormente infectadas com MOI (MOI – do inglês, multiplicity of infection) de 50:1 (WEISS, D. S. et al., 2005) das linhagens S2308 ou RB51 da bactéria Brucella abortus. Após 2 horas as placas foram então centrifugadas por 5 minutos, 1500 Rpm, 4 ºC e lavadas com solução estéril de tampão fosfato-salino (PBS- do inglês, phosphate buffered saline) acrescido de 1% de antibiótico. Foram então adicionados o estímulo lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli a 1 μg/mL (Sigma) como controle positivo e meio RPMI (GIBCO) administrado nas células não estimuladas sendo essas usadas como controle negativo. Após mais 24 horas de incubação à 37ºC e sob atmosfera com 5% de CO 2 iniciou-se o processo de marcação celular. Com relação aos esplenocitos oriundos de animais infectados, o conteúdo celular foi obtido conforme descrito no item____e em seguida submetido a marcação celular. Inicialmente, as placas contendo as células foram lavadas com 200 µl de tampão de FACS (PBS acrescido 1% de soro fetal bovino e 0,09% de azida (NaNO3) gelado a fim de remover as células aderidas. Em seguida o conteúdo celular foi transferido para uma placa de fundo em “U” que foi então centrifugada a 1500 RPM por 5 minutos a 4ºC e o sobrenadante foi removido por inversão rápida da placa..