AVALIAÇÃO DA APLICAÇÃO DE POTENCIAL ELÉTRICO EM
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA NA DETERMINAÇÃO DE
SULFONAMIDAS E FLUOROQUINOLONAS EM OVOS.
i
CYNTIA CABRAL RIBEIRO
AVALIAÇÃO DA APLICAÇÃO DE POTENCIAL ELÉTRICO EM
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA NA DETERMINAÇÃO DE
SULFONAMIDAS E FLUOROQUINOLONAS EM OVOS.
CAMPINAS
2014
AVALIAÇÃO DA APLICAÇÃO DE POTENCIAL ELÉTRICO EM
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA NA DETERMINAÇÃO DE
UNIVERSIDADE ESTAD
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
CYNTIA CABRAL RIBEIRO
AVALIAÇÃO DA APLICAÇÃO DE POTENCIAL ELÉTRICO EM
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA NA DETERMINAÇÃO DE
SULFONAMIDAS E FLUOROQUINOLONAS EM OVOS.
de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas exigidos para o
Orientador: Prof. Dr. Felix Guillermo Rey Coorientadora: Profa. Dra.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À
DEFENDIDA PELA ALUNA CYNTIA CABRAL RIBEIRO E ORIENTADA PELO PROF. DR. FELIX GUILLERMO REYES REYES
________________________________
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
CYNTIA CABRAL RIBEIRO
AVALIAÇÃO DA APLICAÇÃO DE POTENCIAL ELÉTRICO EM
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA NA DETERMINAÇÃO DE
SULFONAMIDAS E FLUOROQUINOLONAS EM OVOS.
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Ciência de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Felix Guillermo Reyes Reyes Profa. Dra. Susanne Rath
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE CYNTIA CABRAL RIBEIRO E PELO PROF. DR. FELIX GUILLERMO REYES
________________________________
CAMPINAS
2014
UAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
AVALIAÇÃO DA APLICAÇÃO DE POTENCIAL ELÉTRICO EM
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA NA DETERMINAÇÃO DE
SULFONAMIDAS E FLUOROQUINOLONAS EM OVOS.
apresentada à Faculdade de Engenharia como parte dos requisitos Ciência de Alimentos.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Ribeiro, Cyntia Cabral,
R354a RibAvaliação da aplicação de potencial elétrico em extração em fase sólida na determinação de sulfonamidas e fluoroquinolonas em ovos / Cyntia Cabral Ribeiro. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.
RibOrientador: Felix Guillermo Reyes Reyes. RibCoorientador: Susanne Rath.
RibTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Rib1. Extração em fase sólida. 2. Potencial elétrico. 3. Ovos. 4. Sulfonamidas. 5. Fluoroquinolonas. I. Reyes, Felix Guillermo Reyes. II. Rath, Susanne. III.
Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Evaluation of the application of electric potential in solid phase
extraction for the determination of sulfonamides and fluoroquinolones in eggs
Palavras-chave em inglês:
Solid phase extraction Eletrical potential Eggs
Sulfonamides Fluoroquinolones
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Doutora em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Felix Guillermo Reyes Reyes [Orientador] Isabel Cristina Sales Fontes Jardim Eduardo Vicente
Sonia Claudia do Nascimento de Queiroz Adriana Pavesi Arisseto Bragotto
Data de defesa: 18-12-2014
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
v
BANCA EXAMINADORA
______________________________________
Prof. Dr. Felix Guillermo Reyes Reyes Orientador
______________________________________________ Profa. Dra. Isabel Cristina Sales Fontes Jardim
Membro Titular IQ / UNICAMP
_____________________________________________ Dr. Eduardo Vicente
Membro Titular
Instituto de Tecnologia de Alimentos - ITAL
_____________________________________________ Dra. Sonia Claudia do Nascimento de Queiroz
Membro Titular EMBRAPA
_____________________________________________ Dra. Adriana Pavesi Arisseto Bragotto
Membro Titular
Instituto de Tecnologia de Alimentos - ITAL
_____________________________________________ Profa. Dra. Carla Beatriz Grespan Bottoli
Membro Suplente IQ / UNICAMP
_____________________________________________ Dra. Marili Villa Nova Rodrigues
Membro Suplente CPQBA / UNICAMP
_____________________________________________ Prof. Dr. Eduardo Costa de Figueiredo
Membro Suplente
vii
RESUMO
AVALIAÇÃO DA APLICAÇÃO DE POTENCIAL ELÉTRICO EM EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA NA DETERMINAÇÃO DE SULFONAMIDAS E
FLUOROQUINOLONAS EM OVOS
Sulfonamidas e fluoroquinolonas são fármacos veterinários amplamente utilizados na produção aviária para prevenção e tratamento de doenças e , quando não respeitadas as boas práticas veterinárias, resíduos desses fármacos podem ser encontrados acima dos limites máximos de resíduos podendo representar risco à saúde dos consumidores. Sendo o ovo uma matriz biológica complexa, quantidades significativas de interferentes podem prejudicar a determinação dos analitos de interesse por cromatografia líquida, especialmente resíduos de fármacos veterinários, que se encontram em níveis na ordem de ng g-1. Entre as diversas técnicas de preparo de amostras capazes de eliminar
interferentes e concentrar o analito de interesse, a extração em fase sólida (SPE) se destaca pela sua eficiência, robustez, seletividade e baixo consumo de solventes. Ainda assim, devido à complexidade da matriz e a baixa concentração dos analitos, o estabelecimento de métodos de preparo de amostras com seletividade na remoção de interferentes e eficiência de extração adequados ainda é um desafio na análise de resíduos. Desta forma, a fim de se contornar as limitações da SPE convencional, esta tese teve como objetivo avaliar a aplicação de potencial elétrico em SPE (E-SPE) para a determinação de resíduos de sulfonamidas e fluoroquinolonas em ovos por cromatografia líquida de alta (HPLC) e ultra eficiência (UHPLC) associada à detectores por arranjo de fotodiodos (DAD), fluorescência (FLD) ou espectrômetro de massas sequencial (MS/MS). Os parâmetros de E-SPE foram avaliados de forma a obter a melhor condição no preparo de amostras e o método para a determinação de resíduos de sulfonamidas e fluoroquinolonas em ovos por E-SPE UHPLC-MS/MS foi avaliado em relação a linearidade, precisão, exatidão, além dos efeitos de supressão ou incremento de sinal analítico (efeito matriz).
Palavras chaves: extração em fase sólida, aplicação de potencial elétrico, preparo de amostras, ovos, sulfonamidas, fluoroquinolonas
ix
ABSTRACT
EVALUATION OF ELECTRICAL POTENTIAL IN SOLID PHASE EXTRACTION FOR THE DETERMINATION OF SULFONAMIDES AND FLUOROQUINOLONES
IN EGGS
Sulfonamides and fluoroquinolones are veterinary drugs widely used in the poultry production for the prevention and treatment of diseases and, when good veterinary practices are not observed, residues of these drugs can be found above the maximum residue limit and may represent a risk to the consumers health. Since egg is a complex biological matrix, significant amounts of interferents can hinder the determination of analytes by liquid chromatography, particularly residues of veterinary drugs, which are at levels in the order of ng g-1. Among the various sample preparation techniques capable to
eliminate interferences and concentrate the analyte of interest, the solid phase extraction (SPE) stands out for its efficiency, robustness, selectivity and low solvent consumption. Nevertheless, due to the complexity of the matrix and the low concentration of the analytes, the establishment of sample preparation methods with selectivity in removing interferents and appropriate extraction efficiency is still a challenge in residue analysis. Thus, in order to overcome the limitations of conventional SPE, this thesis aimed to evaluate the application of electrical potential in SPE (E-SPE) for the determination of sulfonamides and fluoroquinolones residues in eggs by high efficient (HPLC) and ultra efficient (UHPLC) performance liquid chromatography associated with a photodiode array (DAD), fluorescence (FLD) or sequential mass spectrometer (MS/MS) detectors. The E-SPE parameters were evaluated to obtain the best condition for sample preparation and the method for the determination of sulfonamides and fluoroquinolones residues in eggs by E-SPE UHPLC-MS/MS was evaluated for linearity, precision, accuracy, in addition to the effects of suppression or increase of the analytical signal (matrix effect).
Keywords: solid phase extraction, application of electrical potential, sample preparation, eggs, sulfonamides, fluoroquinolones.
xi
SUMÁRIO
LISTADEFIGURAS ... xxi
LISTADETABELAS ... xxvii
LISTADEABREVIATURAS ... xxix
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO ... 1
I.1 – Produção, consumo e composição dos ovos ... 3
I.2 – Medicamentos veterinários na avicultura ... 4
I.3 – Resíduos de fármacos em ovos comerciais ... 5
I.4 – Antimicrobianos na avicultura ... 6
I.4.1 – Sulfonamidas ... 6
I.4.2 – Fluoroquinolonas ... 8
I.4.3 – Determinação de sulfonamidas e fluoroquinolonas em ovos ... 10
I.5 – Princípios e aplicações das técnicas de preparo de amostras ... 12
I.6 – Aplicação de potencial elétrico em SPE ... 13
CAPÍTULO II - OBJETIVOS ... 17
CAPÍTULO III - AVALIAÇÃO DA E-SPE NA DETERMINAÇÃO DE SULFONAMIDAS EM OVOS POR HPLC-DAD ... 21
III.1 – Considerações gerais ... 23
III.2 – Parte experimental ... 25
III.2.1 – Reagentes e padrões ... 25
III.2.2– Material ... 25
III.2.3 – Equipamentos ... 26
III.2.4 – Métodos ... 27
III.2.4.1. Preparo das soluções ... 27
A) Solução estoque ... 27
B)Soluções de trabalho ... 27
C) Soluções tampão ... 28
III.2.4.2. Otimização das condições cromatográficas para a separação das sulfonamidas ... 28
xii
A) Avaliação das colunas cromatográficas, composição da fase móvel e
modo de eluição ... 28
B) Linearidade, faixa de aplicação e sensibilidade ... 31
III.2.4.3. Otimização do Preparo das amostras branco de ovos para SPE ... 31
A) Avaliação da massa de ovo empregada ... 33
B) Avaliação do tipo de sorvente empregado ... 33
III.2.4.4. Testes preliminares para a aplicação de potencial elétrico nos procedimentos de extração em fase sólida (E-SPE) ... 34
A) Avaliação do tipo de sorvente empregado na E-SPE: comparação do clean-up entre os sorventes a base de sílica fenil e C18. ... 35
B.) Tipo de modificador orgânico empregado na solução tampão de limpeza nos procedimentos de E-SPE... 36
C) Ajuste da condutividade do extrato das amostras branco de ovo. ... 36
C.1) Avaliação da estratégia 1. ... 37
C.2) Avaliação da estratégia 2 ... 39
D) Definição das condições iniciais de preparo das amostras branco de ovo. 40 III.2.4.5 Extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico (E-SPE) .. 42
A) Avaliação dos parâmetros de extração e eletrocromatográficos nos procedimentos de E-SPE ... 43
A.1) Avaliação do pH da solução tampão utilizada nos procedimentos de E-SPE ... 43
A.2) Avaliação do tipo e composição de modificador orgânico utilizado na solução tampão para os procedimentos de E-SPE ... 44
A.3) Avaliação da potência aplicada nos procedimentos de E-SPE ... 44
A.4) Avaliação do clean-up do extrato de amostra branco de ovo com a aplicação de potencial elétrico em E-SPE. ... 45
III.3. Resultados e discussão... 47
III.3.1 - Otimização das condições cromatográficas para a separação das sulfonamidas ... 47
A) Avaliação das colunas cromatográficas, composição da fase móvel e modo de eluição ... 47
B) Linearidade, faixa de aplicação e sensibilidade ... 50
xiii
A) Avaliação da massa de ovo empregada ... 51
B) Avaliação do tipo de sorvente empregado ... 52
III.3.3 - Testes preliminares para a aplicação de potencial elétrico nos procedimentos de extração em fase sólida (E-SPE) ... 55
A) Avaliação do tipo de sorvente empregado na E-SPE: comparação do clean-up entre os sorventes a base de sílica fenil e C18. ... 55
B.) Tipo de modificador orgânico empregado na solução tampão de limpeza nos procedimentos de E-SPE... 57
C) Ajuste da condutividade do extrato das amostras branco de ovo. ... 59
III.3.4. - Extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico (E-SPE) .. 62
A) Avaliação dos parâmetros de extração e eletrocromatográficos nos procedimentos de E-SPE ... 62
A.1) Avaliação do pH da solução tampão utilizada nos procedimentos de E-SPE ... 63
A.2) Avaliação do tipo e composição de modificador orgânico utilizado na solução tampão para os procedimentos de E-SPE ... 66
A.3) Avaliação da potência aplicada nos procedimentos de E-SPE ... 67
A.4) Avaliação do clean-up do extrato de amostra branco de ovo com a aplicação de potencial elétrico em E-SPE. ... 69
III.4 – Conclusões parciais ... 72
CAPÍTULO IV - AVALIAÇÃO DA E-SPE NA DETERMINAÇÃO DE FLUOROQUINOLONAS EM OVOS POR HPLC-FLD ... 73
IV.1 – Considerações gerais ... 75
IV.2 – Parte experimental ... 76
IV.2.1 – Reagentes e padrões ... 76
IV.2.2 – Material ... 76
IV.2.3 – Equipamentos ... 77
IV.2.4 – Métodos ... 78
IV.2.4.1. Preparo das soluções ... 78
A) Solução estoque ... 78
B)Soluções de trabalho ... 78
xiv
IV.2.4.2. Amostras ... 79 IV.2.4.3. Otimização das Condições cromatográficas para a separação das
fluoroquinolonas ... 79 A) Avaliação das colunas cromatográficas, composição da fase móvel e
modo de eluição ... 79 B) Linearidade, faixa de aplicação e sensibilidade ... 81 IV.2.4.4. Testes preliminares para a aplicação de potencial elétrico nos
procedimentos de extração em fase sólida (E-SPE) ... 82 A) Avaliação da E-SPE em amostras de solução tampão fortificada com
fluoroquinolonas ... 83 A.1- Avaliação de diferentes sorventes nos procedimentos de E-SPE ... 83 B) Avaliação da E-SPE em extrato de amostras branco de ovo ... 84 IV.2.4.5 Extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico (E-SPE) .. 85
A) Avaliação dos parâmetros de extração e parâmetros
eletrocromatográficos nos procedimentos de E-SPE ... 86 A.1 - Avaliação do tipo de modificador orgânico utilizado na solução
tampão para os procedimentos de E-SPE ... 87 A.2 - Avaliação da porcentagem de modificador orgânico utilizado na
solução tampão para os procedimentos de E-SPE. ... 87 A.3 - Avaliação do potencial elétrico aplicado na etapa de limpeza nos
procedimentos de E-SPE ... 88 A.4 - Avaliação do pH da solução tampão utilizada nos procedimentos de E-SPE ... 88 IV.3– RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 89
IV.3.1 Otimização das Condições cromatográficas para a separação das
fluoroquinolonas ... 89 A) Avaliação das colunas cromatográficas, composição da fase móvel e
modo de eluição ... 89 B) Linearidade, faixa de aplicação e sensibilidade ... 92 IV.3.2 Testes preliminares para a aplicação de potencial elétrico nos
procedimentos de extração em fase sólida (E-SPE) ... 93 A) Avaliação da E-SPE em amostras de solução tampão fortificada com
fluoroquinolonas ... 93 A.1- Avaliação de diferentes sorventes nos procedimentos de E-SPE ... 93
xv
B) Avaliação da E-SPE em extrato de amostras branco de ovo ... 97
IV.3.3 Extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico (E-SPE) ... 98
A) Avaliação dos parâmetros de extração e parâmetros eletrocromatográficos nos procedimentos de E-SPE ... 98
A.1 - Avaliação do tipo de modificador orgânico utilizado na solução tampão para os procedimentos de E-SPE ... 98
A.2 - Avaliação da porcentagem de modificador orgânico utilizado na solução tampão para os procedimentos de E-SPE ... 101
A.3 - Avaliação do potencial elétrico aplicado na etapa de limpeza nos procedimentos de E-SPE ... 104
A.4 - Avaliação do pH da solução tampão utilizada nos procedimentos de E-SPE ... 107
IV.4 – Conclusões parciais ... 112
CAPÍTULO V - AVALIAÇÃO DA E-SPE NA DETERMINAÇÃO DE SULFONAMIDAS E FLUOROQUINOLONAS POR UHPLC-MS/MS ... 113
V.1 – Considerações gerais ... 115 V.2 – Parte experimental ... 117 V.2.1 – Reagentes e padrões ... 117 V.2.2– Material ... 117 V.2.3 – Equipamentos ... 118 V.2.4 – Métodos ... 119
V.2.4.1. Preparo das soluções ... 119
A) Solução estoque ... 119
B)Soluções de trabalho ... 119
C) Soluções tampão ... 119
V.2.4.2. Amostras ... 120
V.2.4.3. Otimização das condições cromatográficas e espectrométricas do UHPLC-MS/MS para a determinação das fluoroquinolonas e sulfonamidas .... 120
V.2.4.4 Extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico (E-SPE) . 121 V.2.4.5 Avaliação do efeito matriz no MS/MS com o emprego da extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico (E-SPE) ... 122
A) Avaliação do efeito matriz por método de fortificação pós preparo de amostras. ... 123
xvi
B) Avaliação do efeito matriz por método de infusão pós-coluna. ... 124
V.2.4.6 Validação do método de E-SPE UPLC-MS/MS ... 124
A) Linearidade, faixa de aplicação e sensibilidade ... 125
B) Precisão intra e inter-ensaios ... 125
C) Exatidão ... 126
V.3 – Resultados e discussão ... 127
V.3.1. Otimização das Condições cromatográficas e espectrométricas do UHPLC-MS/MS para a determinação das fluoroquinolonas e sulfonamidas .... 127
V.3.2 Extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico (E-SPE) .... 131
V.3.3 Avaliação do efeito matriz com o emprego da extração em fase sólida com e sem aplicação de campos elétricos (E-SPE(0) e E-SPE(+/-)) ... 135
A) Avaliação do efeito matriz por método de fortificação pós preparo de amostras. ... 136
B) Avaliação do efeito matriz por método de infusão pós-coluna. ... 137
V.3.4 - Validação do método de E-SPE(+/-) UPLC-MS/MS ... 139
A) Linearidade, faixa de aplicação e sensibilidade ... 140
B) Precisão intra e inter-ensaios ... 141
C) Exatidão ... 144
V.4 – Conclusões parciais ... 146
CAPÍTULO VI - CONCLUSÕES ... 147
CAPÍTULO VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 151
xvii
À minha família e esposo.
À vocês não necessitaria escrever; seriam vossos a dedicatória,
o prólogo, as linhas, vírgulas, pontos finais, acentos e o resto. O todo.
Pois sem vocês não haveria nada, não haveria o amor.
xix
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus qυе é o mestre dos mestres e permitiu qυе tudo isso acontecesse.
Ao meu orientador Prof Dr Felix Guillermo Reyes Reyes, pela generosidade em me acolher em seu grupo de pesquisa e pelo aceite em desenvolver algo inovador.
À minha coorientadora, amiga e incentivadora, Profa Dra Susanne Rath, que desde o princípio acreditou na minha capacidade e sempre esteve pronta a me auxiliar em tudo o que fosse preciso, permitindo que meu trabalho pudesse ser desenvolvido em sua companhia, orientação e em seu laboratório.
À minha família, alicerce de tudo o que sou. À minha maior torcida, meus pais João e Irene, que sempre estiveram ao meu lado desde o primeiro passo na caminhada e ao meu amado irmão João Felipe.
Ao meu querido e amado esposo Ricardo, pelo auxílio, paciência, incentivo, amor e dedicação em todos os anos dessa jornada. Sem você este trabalho não teria sido possível, literalmente, já que a E-SPE nasceu da sua imensa capacidade inventiva, do seu espírito inovador e da sua dedicação e amor à ciência.
À todos os meus amigos, colegas e companheiros de laboratório, pelas alegrias, tristezas e dores compartilhadas. A companhia de vocês tornou as pausas, entre um parágrafo e outro desta produção, muito mais divertidas.
À Universidade Estadual de Campinas, especialmente à Faculdade de Engenharia de Alimentos e ao Instituto de Química, por toda a infraestrutura disponibilizada para a realização deste trabalho.
Ao Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL), em especial ao Centro de Tecnologia de Carnes e ao técnico Eduardo Orlando, pela disponibilização do laboratório, uso do equipamento e auxílio.
xx
À todos os funcionários e técnicos, em especial à técnica Andreza, por todo o apoio,paciência, atenção e suporte dedicado ao longo de todos esses anos.
À FAPESP pela bolsa de estudo e auxílio concedidos para a execução deste trabalho.
E por fim, e não menos importante, à todas as pessoas que , direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.
"Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, eu não teria saído do
lugar. As facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo as críticas nos auxiliam muito."
xxi
LISTA
DE
FIGURAS
Figura I.1 - Configuração empregada para montagem dos cartuchos e eletrodos de E- SPE... 14 Figura I.2 - Esquematização do sistema para monitoramento e controle dos parâmetros eletrocromatográficos (potencial elétrico, corrente elétrica e vazão) empregado durante os procedimentos de E-SPE com e sem aplicação do campo elétrico ... 14 Figura I.3 - Exemplos dos efeitos esperados de um possível modo de utilização da E-SPE.. ... 15 Figura III.1- Etapa de precipitação proteica adaptada de Mamani (2007). ... 32 Figura III.2 - Etapas e condições empregadas no procedimento de SPE para as amostras de ovos. ... 33 Figura III.3 - Etapas e condições empregadas no procedimento de E-SPE para as amostras de ovos. ... 35 Figura III.4 - Condições empregadas nas etapas do procedimento de precipitação da amostra de ovo. ... 37 Figura III.5 - Etapas de precipitação proteica e E-SPE empregadas para as amostras de ovos nos estudos sistemáticos para sulfonamidas. ... 41 Figura III.6 - Sistema de monitoramento e controle dos parâmetros eletrocromatográficos. ... 42 Figura III.7 - Cromatograma obtido para separação dos padrões de sulfonamidas. 49 Figura III.8 -. Cromatograma obtido para as amostras branco de ovo de 2 g e 5 g . 52 Figura III.9 - Cromatogramas obtidos para 2g de amostras branco de ovo em procedimentos de SPE utilizando Sepra C18-E, Strata C18-U, Strata C8 e Sepra Phenyl sobrepostos a um obtido por uma solução de SULFAS na concentração de 200 ng mL-1 ... 54
Figura III.10 - Cromatogramas nas condições otimizadas obtidos pela extração de extrato de amostras branco de ovo empregando o procedimento de E-SPE com e
xxii
sem aplicação de potencial elétrico com sorvente C18 e fenil e cromatogramas ampliados mostrando apenas a região de detecção das sulfonamidas. ... 56 Figura III.11 - Valores de recuperação média para as sulfonamidas obtidos nos procedimentos de E-SPE com e sem aplicação de potencial elétrico em amostras branco de ovo fortificadas com 50 ng g-1 de cada sulfonamida ... 58 Figura III.12 - Comparação dos cromatogramas apenas da região de retenção das sulfonamidas obtidos nos procedimentos de E-SPE(0) de amostras branco de ovo
fortificadas com 50 ng g-1 de cada sulfa empregando o sorvente Sepra-Phenyl,
quando utilizado tampão de limpeza ACF 10/20 + 15% MeOH pH 4 e tampão ACF 10/20 + 15% de ACN pH 4,0. ... 59 Figura III.13 - Gráfico da corrente e potencial elétrico, monitorados durante as etapas de aplicação da amostra (33 mA) e limpeza (25 mA) no procedimento de E-SPE(-) para avaliação da condutividade da amostra ... 62 Figura III.14 - Valores de recuperação média para as sulfonamidas obtidos nos procedimentos E-SPE(-) em amostras branco de ovo fortificadas com 50 ng g-1 no estudo do pH do tampão ACF 10/20 empregado. ... 64 Figura III.15 - Comparação dos cromatogramas apenas da região de retenção das sulfonamidas obtidos por procedimentos de E-SPE(-) de amostras branco de ovo
fortificadas com 50 ng g-1 de cada sulfa empregando o sorvente Sepra-Phenyl, nos
estudos do pH do tampão ACF 10/20 ... 65 Figura III.16 - Valores de recuperação média para as sulfonamidas obtidos nos procedimentos E-SPE(-) em amostras branco de ovo fortificadas com 50 ng g-1 no estudo da porcentagem de ACN e MeOH utilizada no tampão ACF 10/20 pH 4,0 empregado. ... 66 Figura III.17 - Valores de recuperação média para as sulfonamidas obtidos nos procedimentos E-SPE(-) em amostras branco de ovo fortificadas com 50 ng g-1 no estudo da potência elétrica aplicada. ... 68
xxiii
Figura III.18 - Gráfico da corrente e potencial elétrico típicos, monitorados durante as etapas de aplicação da amostra (32 mA) e limpeza (15 mA) no procedimento deE-SPE na condição otimizada. ... 69 Figura III.19 - Cromatogramas obtidos nos procedimentos de E-SPE(-) e SPE(0) de amostras branco de ovo em sorvente Sepra-Phenyl., nas condições cromatográficas otimizadas e no comprimento de onda de detecção: 270 nm. ... 70 Figura III.20 - Cromatogramas obtidos nos procedimentos de E-SPE(0) das oito amostras branco de ovo em sorvente Sepra-Phenyl, nas condições cromatográficas otimizadas e no comprimento de onda de detecção: 270 nm. ... 71 Figura IV.1 - Etapas e condições empregadas no procedimento de E- SPE para a determinação das fluoroquinolonas ... 83 Figura IV.2 - Etapa de precipitação proteica empregada para os procedimentos de E- SPE para determinação de fluoroquinolonas... 84 Figura IV.3 - Etapas de precipitação proteica e E-SPE empregadas para as amostras de ovos nos estudos sistemáticos. ... 86 Figura IV.4 - Cromatograma obtido para separação dos padrões de fluoroquinolonas na concentração 400 ng mL-1 ... 91 Figura IV.5 - Valores de recuperação média para as fluoroquinolonas obtidos nos procedimentos de E-SPE com e sem aplicação de potencial elétrico na avaliação dos diferentes tipos de sorventes ... 95 Figura IV.6 - Valores de recuperação média para as fluoroquinolonas obtidos nos procedimentos de E-SPE(0) para extrato de amostra branco de ovo fortificado com 100 ng g-1 de cada fluoroquinolona ... 97 Figura IV.7 - Valores de recuperação média para as fluoroquinolonas obtidos nos procedimentos de E-SPEcom e sem aplicação de potencial elétrico em extrato de amostra branco de ovo fortificado com 100 ng g-1 ... 99 Figura IV.8 - Comparação dos cromatogramas obtidos nos procedimentos de E-SPE(0) de amostras branco de ovo fortificadas com 100 ng mL-1 de cada FQ
xxiv
empregando o sorvente Sepra C18-E, quando utilizado tampão de limpeza ACF 10/20 pH 4 adicionado de 8% de ACN ou de MeOH ou de THF ... 100 Figura IV.9 - Valores de recuperação média para as fluoroquinolonas obtidos nos procedimentos de E-SPE com e sem aplicação de potencial elétrico em extrato de amostra branco de ovo fortificado com 100 ng g-1 na avaliação da porcentagem de modificador orgânico em pregado no tampão ACF ... 102 Figura IV.10 - Gráficos da corrente elétrica, monitorados durante a etapa de limpeza (50 V) no procedimento de E-SPE(-) na avaliação da porcentagem de THF
(4, 6 e 8%) empregado no tampão ACF 10/20 pH 4,0 ... 103 Figura IV.11 - Valores de recuperação média para as fluoroquinolonas obtidos nos procedimentos de E-SPE com e sem aplicação de potencial elétrico em extrato de amostra branco de ovo fortificado com 100 ng g-1 na avaliação da potência elétrica aplicada ... 105 Figura IV.12 - Gráfico da corrente elétrica, monitorados durante a etapa de limpeza no procedimento de E-SPE(-) na avaliação do potencial elétrico aplicado (30, 35, 40 e 50 V) empregado no tampão ACF 10/20 pH 4,0. ... 106 Figura IV.13 - Valores de recuperação média para as fluoroquinolonas obtidos nos procedimentos de E-SPE com e sem aplicação de potencial elétrico em extrato de amostra branco de ovo fortificado com 100 ng g-1 na avaliação do pH do tampão
ACF empregado ... 109 Figura IV.14 - Gráfico da corrente elétrica, monitorados durante a etapa de limpeza no procedimento de E-SPE(-), na avaliação do pH (4, 6 e 8) empregado nos tampões dos procedimentos de extração ... 111 Figura V.1 - Etapas de precipitação proteica e E-SPE empregadas para as amostras de ovos na determinação de sulfonamidas e fluoroquinolonas ... 122 Figura V.2 - Esquema geral do método de infusão pós-coluna para avaliação do efeito matriz no LC-MS/MS. ... 124 Figura V.3 - Cromatograma UPLC-MS/MS das transições dos padrões de SULFAS e FQ na concentração 100 ng mL-1 ... 130
xxv
Figura V.4 - Valores de recuperação média para as SULFAS e FQ obtidos nos procedimentos de E-SPE(0) , E-SPE(-/+) e E-SPE(+/-) para amostras de branco de ovo fortificado com 50 ng g-1 de cada analito. ... 133 Figura V.5 - Cromatogramas de íons totais da infusão de FQ e SULFAS durante a injeção de fase móvel e amostras branco de ovo extraídas por E-SPE(+/-) e E-SPE(0) mostrando a variação do sinal analítico devido à presença dos componentes da matriz. ... 138
xxvii
LISTA
DE
TABELAS
Tabela I.1 - Composição média de ovos de galinha. ... 4 Tabela I 2 - Estrutura química e propriedades físico-químicas das SULFAS em estudo. ... 7 Tabela I.3 - Estrutura química e propriedades físico-químicas das fluoroquinolonas em estudo. ... 9 Tabela III 1 - Modo de eluição e composição da fase móvel empregados na avaliação das colunas cromatográficas na separação das SULFAS. ... 30 Tabela III.2 - Condições empregadas na avaliação do ajuste da condutividade do extrato da amostra de ovo em cada etapa da estratégia 1. ... 38 Tabela III.3 - Condições empregadas na avaliação do ajuste da condutividade do extrato da amostra de ovo em cada etapa da estratégia 2. ... 39 Tabela III.4 - Tipo e porcentagem de modificador orgânico empregados nos procedimentos de E-SPE. ... 44 Tabela III.5 - Valores de potência empregados nos procedimentos de E-SPE... 45 Tabela III.6 - Parâmetros cromatográficos na separação das SULFAS para a coluna XBridgeTM. ... 49
Tabela III.7 - Parâmetros de linearidade e sensibilidade para as sulfonamidas. ... 50 Tabela III.8 - Valores de pka’s das SULFAS em estudo ... 63 Tabela IV.1 - Modo de eluição e composição da fase móvel empregados na avaliação das colunas cromatográficas. ... 81 Tabela IV.2 - Parâmetros cromatográficos na separação das FQ em coluna Zorbax Eclipse Plus ... 91 Tabela IV.3 - Parâmetros de linearidade e sensibilidade para as FQ. ... 92 Tabela IV.4 - Valores de pka’s das FQ em estudo. ... 107 Tabela V.1 - Condições do MS/MS e intervalos de detecção das SULFAS e FQ. .. 129 Tabela V.2 - Gradiente de eluição empregado na separação das SULFAS e FQ. . 130
xxviii
Tabela V.3 - Valores de efeito matriz para SULFAS e FQ em amostras de ovos. .. 136 Tabela V.4 - Parâmetros de validação das FQ e SULFAS. ... 141 Tabela V.5 - Valores de precisão intra e inter-ensaio para FQ e SULFAS. ... 143 Tabela V.6 - Valores de exatidão para FQ e SULFAS em estudo. ... 145
xxix
LISTA
DE
ABREVIATURAS
ACF Solução tampão composta pela mistura de solução de ácido cítrico e fosfato de sódio bibásico em diferentes concentrações e pH
ACN Acetonitrila
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária do Brasil
APCI Ionização química à pressão atmosférica (Atmospheric pressure chemical
ionization)
ATCA Ácido tricloroacético
C18 Sorvente a base de sílica modificada com grupos octadecil C4 Sorvente a base de sílica modificada com grupos butil C8 Sorvente a base de sílica modificada com grupos octil CE Eletroforese capilar (Capillary eletrophoresis)
CEC Eletrocromatografia capilar (Capillary electrochromatography)
Cipro Ciprofloxacino
CV Coeficiente de variação
DAD Detector por arranjo de diodos (Diiode array detector)
Dano Danofloxacino
EC Comunidade européia (European Comunity)
EC Eletrocromatografia em coluna (Column electrochromatography)
EM Efeito matriz
Enro Enrofloxacino
ESI Ionização por eletronebulização (Electrospray ionization) E-SPE Extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico
E-SPE (-) Extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico com polaridade negativa sobre o eletrodo superior
E-SPE (-/+) Extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico com polaridade negativa sobre o eletrodo superior durante a limpeza e positiva durante a eluição
E-SPE (+) Extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico com polaridade positiva sobre o eletrodo superior
xxx
polaridade positiva sobre o eletrodo superior durante a limpeza e negativa durante a eluição
E-SPE (0) Extração em fase sólida sem aplicação de potencial elétrico
FAO Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (Food
and Agriculture Organization of the United Nations)
FLD Detector por fluorescência (Fluorescence detector)
FQ Fluoroquinolonas
HAc Ácido acético
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência (High performance liquid
chromatography)
HPLC-DAD Cromatografia líquida e alta eficiência acoplada ao detector por arranjo de diodos
HPLC-FLD Cromatografia líquida e alta eficiência acoplada ao detector por fluorescência
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística LC Cromatografia líquida (Liquid chromatography)
LC-DAD Cromatografia líquida acoplada ao detector por arranjo de diodos
LC-MS/MS Cromatografia líquida acoplada ao detector de espectrometria de massas sequencial
GIA Grupo de Instrumentação e Automação em Química Analítica LLE Extração líquido-líquido (Liquid-liquid extraction)
LMR Limite máximo de resíduo
m/z Relação massa/carga
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento do Brasil
Marbo Marbofloxacino
MeOH Metanol
MRC Material de referência certificado MRM Monitoramento de reações múltiplas
MS Espectrometria de massas (Mass spectrometry)
MS/MS Espectrometria de massas sequencial ( Mass spectrometry in tandem) MSPD Dispersão da matriz em fase sólida (Matrix solid phase dispersion)
xxxi
Nor Norfloxacino
Ph Sorvente a base de sílica modificada com grupos fenil PNCRC Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes PTFE Politetrafluoretileno
Q Quadrupolo
QqQ Triplo quadrupolo
QuEChERS Rápido, Fácil, Econômico, Efetivo, Robusto e Seguro (Quick, Easy,
Cheap, Effective, Rugged and Safe)
Sara Sarafloxacino
SDA Sulfadiazina
SDM Sulfadimetoxina
SMX Sulfametoxazol
SMZ Sulfametazina
SPE Extração em fase sólida (Solid phase extraction)
SQX Sulfaquinoxalina
STZ Sulfatiazol
SULFAS Sulfonamidas
THF Tetraidrofurano
UBABEF União Brasileira de Avicultura
UE União Européia
UHPLC Cromatografia líquida de ultra eficiência (Ultra performance liquid
chromatography)
UHPLC-ESI-MS/MS
Cromatografia líquida de ultra eficiência com ionização por eletronebulização acoplada ao espectrômetro de massas sequencial UPLC-MS/MS Cromatógrafo de ultra eficiência, da marca Waters, acoplado ao
espectrômetro de massas sequencial
1
Capítulo I Introdução
3
I.1 – PRODUÇÃO, CONSUMO E COMPOSIÇÃO DOS OVOS
No ano de 2011 a produção mundial de ovos foi de aproximadamente 1,22 trilhões de unidades, e o Brasil participou com 3,34% da produção total segundo a FAO (Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura) (Anualpec, 2013). São Paulo é o principal estado produtor, com mais de 32,0% do total nacional, segundo a Pesquisa Trimestral de Ovos de Galinha do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2011).
Segundo a União Brasileira de Avicultura (UBABEF, 2011) o consumo médio nacional de ovos de galinha foi de 7,4 kg/habitante/ano. O consumo pode ser de forma direta ou indireta, pois o ovo é utilizado como ingrediente em diversas formulações alimentares.
Os ovos são considerados uma excelente fonte de nutrientes para o ser humano, por apresentarem diversos componentes como proteínas de alto valor biológico e vitaminas A, D e B. Os ovos têm pouca gordura saturada, no entanto, seu alto conteúdo de colesterol em determinadas situações, limita o seu consumo diário (Martin, 2002).
A composição do ovo depende de vários fatores tais como: tamanho, alimentação, estado sanitário das aves. A idade influencia apenas no tamanho do ovo e não na composição dele.
Um ovo consiste em aproximadamente 63,0% de albúmen, 27,5% de gema e 9,5% de casca. Os principais componentes são: água (75%), proteínas (12%), lipídeos (12%), além dos carboidratos, minerais e vitaminas. Um ovo grande contém aproximadamente 74 kcal, 6,0 g de proteínas, 4,5 g de gorduras totais e 0,212 g de colesterol (Mazzuco, 2006).
A alimentação das aves influencia na composição da proteína, ácidos graxos e no colesterol da gema. A gema é constituída de quase 50% de água sendo também muito rica em gorduras e proteínas e pobre em carboidratos. A gordura da gema é composta por colesterol, 5% do total gorduroso, e, sobretudo, por triacilgliceróis e fosfolipídios. A composição pode variar significativamente, dependendo do tipo de alimentação da ave sendo que a composição média de ovos de galinha está apresentada na Tabela I.1.
Capítulo I Introdução
4
Tabela I.1– Composição média de ovos de galinha.
Componentes Gema Clara
Umidade (%) 51,0 – 52,0 87,0 – 88,0
Gorduras (%) 30,0 – 34,0 0,1 – 0,2
Proteínas (%) 16,0 – 17,0 10,6 – 10,9
Carboidratos (%) 1,0 – 1,5 0,8 – 1,5
Sais minerais (%) 1,5 – 2,0 0,6 – 0,9
Valor calórico (cal/100g) 360,0 50,0
Fonte: (Madrid et al., 1996).
I.2–MEDICAMENTOS VETERINÁRIOS NA AVICULTURA
Diversos medicamentos veterinários de diferentes classes, como as sulfonamidas, tetraciclinas, quinolonas e penicilinas, vêm sendo utilizados em grande escala na produção de ovos devido às práticas avícolas modernas. A maioria destes medicamentos é administrada como aditivos em ração ou na água de beber para prevenir patologias, melhorar o crescimento dos animais, ou ainda como agentes terapêuticos (Aerts et al., 1995).
O uso de medicamentos veterinários em aves pode afetar a saúde da população e o comércio internacional de alimentos, devido à persistência de resíduos desses fármacos ou de seus metabólitos em produtos comerciais como ovos e carnes (Aerts et al., 1995).
Os principais fatores que determinam a ocorrência de resíduos de fármacos veterinários em ovos são: o não cumprimento do tempo de carência (período entre a última administração do medicamento e a coleta do ovo); via de administração, contaminação da ração ou água; as propriedades físico-químicas e a biotransformação do fármaco, além das condições físicas da ave poedeira (Aerts et al., 1995; Kan e Petz, 2000).
A quantidade de resíduo presente no alimento, considerada segura, é derivada de estudos toxicológicos. Na prática são estabelecidos os Limites Máximos de Resíduos (LMR) que são harmonizados internacionalmente ou, são determinados
Capítulo I Introdução
5
pelo próprio país por meio de estudos do tempo de depleção do fármaco e a presença de metabólitos no produto de origem animal. Os valores são determinados pelos órgãos regulamentadores de cada país considerando o tipo de animal, suas partes e derivados como mel, leite e ovos.
A disponibilidade de métodos analíticos capazes de monitorar os produtos animais, quanto à presença de resíduos de fármacos veterinários, é essencial, uma vez que há uma grande quantidade de formulações comerciais de inúmeras substâncias ativas diferentes, o que dificulta o monitoramento de todos os fármacos nos diversos tipos de alimentos (Jiménez, et al., 2011).
I.3–RESÍDUOS DE FÁRMACOS EM OVOS COMERCIAIS
Resíduos de medicamentos veterinários incluem os compostos ativos e/ou seus metabólitos presentes em qualquer alimento de origem animal, assim como os resíduos de impurezas relacionadas com o medicamento veterinário correspondente, e sua presença pode representar perigo à segurança alimentar em função de seus níveis estarem acima do LMR permitido. O LMR é definido como a concentração máxima (expressa em mg kg-1, µg kg-1, mg L-1 ou µg L-1) que é permitida pela legislação ou que se reconheça como admissível em um alimento (Anvisa, 2003).
A depleção dos fármacos veterinários em ovos depende da concentração plasmática dos fármacos nas aves. Os fármacos, que são rapidamente eliminados do organismo, desaparecem da clara em dois a três dias após cessar a exposição, enquanto que na gema o desaparecimento leva cerca de 10 dias (Donoghue et al., 1997; Donoghue e Myers, 2000). Entretanto, se o nível de exposição for acima do preconizado, podem-se detectar fármacos em folículos de estágio intermediário e com isso, encontrar resíduos, mesmo transcorridos 70 dias da exposição (Kan e Petz, 2000).
Alguns fármacos são encontrados em maior concentração na clara, como as sulfonamidas, espiramicina, oxitetraciclina e a sulfamonometoxina (Donoghue e Myers, 2000; Furusawa, 1999).
Capítulo I Introdução
6 I.4–ANTIMICROBIANOS NA AVICULTURA
Dentre as diversas classes de antimicrobianos empregadas em medicina veterinária, as sulfonamidas e fluoroquinolonas vêm sendo amplamente utilizadas em avicultura na prevenção e controle de doenças. (Garrido Frenich et al., 2010; Forti e Scortichini, 2009).
I.4.1 – Sulfonamidas
As sulfonamidas (SULFAS) são fármacos sintéticos amplamente utilizados para tratamento de infecções bacterianas, causadas por microrganismos gram-positivos e gram-negativos (Pastor-Navarro et al., 2007). Estes compostos são derivados do p-aminobenzenosulfonamida, caracterizados por um grupo arila contendo um grupo amino e um grupo sulfonamida em posição para.
Vários parâmetros físico-químicos têm sido correlacionados com a atividade quimioterápica das SULFAS, tais como, pKa, ligação com proteínas e distribuição da carga eletrônica (Martínez et al., 2003). As estruturas químicas e propriedades físico-químicas das SULFAS, objeto de estudo neste trabalho, estão apresentadas na Tabela I.2.
As SULFAS de maior uso na avicultura são: sulfadimetoxina, sulfametazina, sulfaquinoxalina, sulfamerazina, sulfatiazol e sulfadiazina . Estes compostos têm sido empregados principalmente no controle de coccidiose, pulorosi, tifo aviário, cólera aviária e coriza infecciosa em galinhas. A associação de diaminopirimidinas com sulfonamidas (trimetoprima e congêneres) tem sido utilizada no controle de infecções por E.coli, Haemophilus paragalinarum, cólera aviária (Pasteurella multocida) e salmoneloses (Wassenaar, 2005).
A principal via de administração em aves das SULFAS e suas associações é a via oral, através da água de bebida e ração.
O LMR estabelecido pela Comunidade Europeia para o somatório de SULFAS em músculo, fígado, rim e leite é de 100 µg kg-1 (EC, 2002). Apesar da Comunidade Europeia não estabelecer LMR para SULFAS em ovos, o Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC) estabeleceu 100 µg kg-1 como LMR total de SULFAS em ovos (MAPA, 2010).
Capítulo I Introdução
7
Tabela I 2 – Estrutura química e propriedades físico-químicas das SULFAS em estudo.
Sulfonamida/abreviação Estrutura Massa Molar pKa1 pKa2 Sulfadiazina/SDA N H2 S NH N N O O 250,28 1,57 a 6,5 Sulfametazina/SMZ N H2 S NH N N O O CH3 CH3 278,33 2,79 a 7,59 Sulfametoxazol/SMX N H2 S NH O O N O CH3 253,28 1,57 a 6,40 Sulfadimetoxina/SDM N H2 S NH N N O O O O CH3 CH3 310,33 1,9 b 6,1 Sulfaquinoxalina/SQX N H2 S NH O O N N 300,34 2,34 a 5,97 Sulfatiazol/STZ N H2 S NH O O N S 255,32 2,4 a 7,1
Capítulo I Introdução
8 I.4.2–FLUOROQUINOLONAS
As fluoroquinolonas (FQ) são agentes antimicrobianos sintéticos, de amplo espectro de ação, largamente empregadas no tratamento de infecções, tanto em medicina humana como veterinária. Podem ser classificadas como de primeira, segunda ou terceira geração dependendo do seu espectro de ação, potência e farmacologia, constituindo o grupo mais importante de antimicrobianos sintéticos desde a descoberta das sulfonamidas. A ação antimicrobiana se dá pela inibição da enzima DNA-girase responsável pela replicação do DNA (Barron et al., 2001; Jiménez et al., 2011).
As estruturas químicas e propriedades físico-químicas das FQ, objeto de estudo neste trabalho, estão apresentadas na Tabela I.3.
O uso indiscriminado das quinolonas nas últimas décadas levou a um importante aumento da resistência bacteriana e por isso, medidas de controle e emprego foram estabelecidas pela União Europeia (UE) a fim de evitar riscos à saúde humana decorrentes da exposição a essas substâncias. Os valores de LMR para esses antimicrobianos foram estabelecidos de acordo com a espécie animal e o tipo de tecido analisado, e as quinolonas listadas foram a danofloxacino, enrofloxacino (expresso pelo somatório de enrofloxacino e ciprofloxacino), marbofloxacino, sarafloxacino, flumequina, difloxacino e ácido oxolínico (CR, 2010).
Apesar do uso das quinolonas, com exceção da marbofloxacino, ser permitido em aves, o seu uso em galinhas poedeiras foi banido na UE, pois há evidências que demonstram que resíduos destas substâncias podem estar presentes e se acumular nos ovos (Jiménez et al., 2011).
No Brasil, o Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes (PNCRC) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) estabelece através da Instrução Normativa n° 17 de maio de 2013, o valor de 10 µg kg-1 como Limite de Referência para Tomada de Ação Regulatória apenas para enrofloxacino e ciprofloxacino em ovos.
Capítulo I Introdução
9
Tabela I.3 – Estrutura química e propriedades físico-químicas das fluoroquinolonas em estudo.
Fluoroquinolona/abreviação Estrutura Massa Molar pKa1 pKa2 Marbofloxacino/Marbo F N O O OH N O N N C H3 CH3 362,36 5,51 8,38 Norfloxacino/Nor O O H N F O N N H C H3 319,34 6,32 8,42 Ciprofloxacino/Cipro F N N H N O O O H 331,34 6,33 8,84 Danofloxacino/Dano O OH N N N C H3 F O H H 357,38 6,32 8,73 Enrofloxaciono/Enro O OH N N N C H3 F O 359,39 6,09 7,91 Sarafloxacino/Sara F N F O O O H N N H 385,36 5,87 8,88 Fonte:(Jiménez-Lozano et al., 2002)
Capítulo I Introdução
10
I.4.3–DETERMINAÇÃO DE SULFONAMIDAS E FLUOROQUINOLONAS EM OVOS
Diversos métodos para a determinação de SULFAS e FQ em ovos têm sido reportados na literatura, principalmente empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada à detecção por ultravioleta (UV) (Hela et al., 2003; Garcia
et al., 2004; Christodoulou et al., 2007; Huang et al., 2006), fluorescência (FLD)
(Maudens et al., 2004; Salisbury et al., 2004; Zeng et al., 2005; Hassouan et al., 2007) ou à espectrometria de massas (MS) (Won et al., 2011; Garrido Frenich et al., 2010; Shen et al., 2008; Heller et al., 2006).
A HPLC-DAD tem sido utilizada na determinação de SULFAS em diversas matrizes biológicas como ovos porém, como estes antimicrobianos são detectados em comprimentos de onda em torno de 270 nm, a presença de interferentes é frequente, apresentando assim baixa seletividade. Além disso, as SULFAS são compostos que apresentam baixos coeficientes de absortividade molar (ε) o que torna a presença de interferentes ainda mais significativa para a sua quantificação, já que pequenas quantidades destes promoveriam grande influência na resposta. Apesar destas limitações, o detector DAD é capaz de fornecer dados qualitativos como pureza dos picos, além de custo menos elevado e maior facilidade de operação quando comparado aos espectrômetros de massas.
Mesmo apresentando custo mais elevado, a cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) é uma importante ferramenta para o monitoramento de resíduos de fármacos veterinários em alimentos de origem animal (Heller et al., 2002), sendo normalmente utilizada em análises confirmatórias de identidade.
Os espectrômetros de massas variam quanto ao tipo de analisador de massas empregado, podendo ser simples, como o quadrupolo (Q), ou combinados (MS/MS) e a seleção do analisador a ser utilizado no método depende, entre outros fatores, dos objetivos a serem alcançados pela análise além da detectabilidade e seletividade requeridas.
Nas técnicas de MS/MS o analisador triplo quadrupolo (QqQ) é o mais amplamente utilizado para análises de rotina de fármacos veterinários em alimentos
Capítulo I Introdução
11
(Cherlet et al., 2003; Andersen et al., 2005; Toussaint et al., 2005; Pozo et al., 2006; Rubies et al., 2007). Apesar deste tipo de configuração apresentar vantagens como alta detectabilidade e seletividade, esta combinação apresenta limitações em relação à elucidação estrutural dos analitos (Lacorte e Fernandez-Alba, 2006).
Dentre as fontes de ionização desenvolvidas, as mais empregadas em LC-MS/MS são a ionização por eletronebulização (ESI) e a ionização química à pressão atmosférica (APCI) (Chiaradia et al., 2008).
Mesmo apresentando alta seletividade, o espectrômetro de massas pode sofrer alteração do sinal do analito devido à presença de interferentes da matriz . A presença desses interferentes pode ocasionar a supressão ou o incremento da ionização do analito de interesse modificando a resposta obtida, fenômeno este denominado efeito matriz. Este efeito é observado de maneira mais frequente na fonte de ionização ESI (Van Eeckhaut et al., 2009).
Os efeitos da matriz sobre a ionização ocorrem, teoricamente, tanto em fases aquosas como gasosas e a principal causa é a mudança nas propriedades das partículas em solução causada pela presença de solutos não voláteis ou de baixa volatização. Isto acaba por afetar a quantidade de íons formados que chegam ao módulo de detecção de íons do espectrômetro (Van Eeckhaut et al., 2009).
Apesar da LC-MS/MS estar sendo empregada com sucesso na determinação de antimicrobianos em ovos, a complexidade da matriz ainda representa um grande desafio com relação ao preparo de amostras, uma vez que a presença de grandes quantidades de interferentes prejudicam a quantificação dos analitos presentes em níveis muitas vezes abaixo de µg kg-1. Os altos teores de proteínas, lipídeos e sais
presentes em ovos podem sofrer uma retenção irreversível na coluna cromatográfica e isso levaria a uma degradação da fase estacionária causando distorção do pico cromatográfico ou entupimento das colunas cromatográficas.
Em geral, o efeito matriz está relacionado diretamente a uma limpeza (clean-up) insuficiente durante o preparo de amostra, portanto uma limpeza adequada é um fator de primordial importância.
Capítulo I Introdução
12
I.5–PRINCÍPIOS E APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE PREPARO DE AMOSTRAS
Diversas são as técnicas empregadas no preparo de amostras e a maioria têm por finalidade básica recuperar e concentrar o analito, além de promover a eliminação de compostos que possam interferir na análise.
O preparo de amostras ideal deve apresentar poucas etapas e consistir de procedimentos rápidos, de baixo custo e que empreguem a menor quantidade de solventes possível, sendo capaz de fornecer recuperações do analito e limpeza adequadas (Orlando, 2011).
Por tratar-se de uma etapa crítica, a escolha da técnica de preparo de amostras a ser empregada torna-se um desafio e é realizada de acordo com as características físico-químicas da matriz e do analito, além do equipamento de análise a ser utilizado.
No que se refere à extração e/ou remoção dos interferentes, diferentes abordagens têm sido avaliadas para análise de SULFAS e FQ em ovos, incluindo QuEChERS, dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) e extração em fase sólida (SPE) (Jiménez et al., 2011).
Às amostras complexas como ovo, que possuem alto teor de proteínas, emprega-se de modo geral a extração líquido-líquido (LLE) como etapa prévia ao
clean-up, utilizando acetonitrila (acidificada ou não) como agente precipitante de
proteínas (Gajda et al., 2012).
A SPE é uma técnica bastante empregada em matrizes complexas e utiliza os mesmos mecanismos de retenção e materiais sorventes (derivados de sílica e poliméricos) empregados em cromatografia líquida, podendo ser dividida em modo reverso, normal, troca-iônica, exclusão e bioafinidade (Orlando, 2011).
Diversos dispositivos podem ser empregados na SPE sendo que os mais utilizados são os cartuchos, com os quais geralmente se utilizam sistemas extratores com vácuo para aumentar a velocidade da análise simultânea de várias amostras.
Apesar de toda a evolução da técnica de SPE, os dispositivos ainda baseiam-se na retenção diferencial dos constituintes da amostra como ocorre na cromatografia. O uso de campos elétricos em cartuchos de SPE é uma nova
Capítulo I Introdução
13
abordagem em preparo de amostras e teve seu desenvolvimento e possíveis aplicações publicados recentemente (Orlando et al., 2014).
I.6–APLICAÇÃO DE POTENCIAL ELÉTRICO EM SPE
Visando melhorar o desempenho da SPE no preparo de amostras Orlando (2011) propôs o uso de campos elétricos em procedimentos de SPE empregando cartuchos.
A aplicação de potenciais elétricos em SPE, aqui denominada E-SPE, foi patenteada por Orlando & Rath (2007/BR18070059427) e aperfeiçoada no Laboratório de Bioanalítica Paracelsus com o apoio do Dr. Jarbas J.R. Rohwedder do Grupo de Instrumentação e Automação em Química Analítica (GIA) do IQ, Unicamp.
Para a SPE, o uso da força de um potencial elétrico para induzir a eletromigração de compostos carregados em solução poderia atribuir diversas vantagens ao procedimento padrão, onde mecanismos eletroforéticos seriam associados aos cromatográficos conferindo maior seletividade. Esta aplicação de potenciais elétricos em SPE utilizando cartuchos e discos não apresentaria tantas limitações quanto os sistemas cromatográficos de alta eficiência utilizando colunas recheadas, pois a SPE pode ser um procedimento aberto que permite a saída dos gases formados durante o processo. Outra característica importante é que na SPE a vazão é relativamente maior o que facilitaria a dissipação de calor e, além disso, a extensão do leito do recheio extrator, consideravelmente mais curta do que nas colunas analíticas, permitiria a obtenção de campos elétricos mais fortes com aplicação de diferenças de potenciais menores.
Para que a aplicação de potenciais elétricos em cartuchos nos procedimentos de E-SPE fosse possível, Orlando (2011) adaptou cartuchos comerciais e confeccionou os eletrodos a serem utilizados. No interior do cartucho foram introduzidos dois eletrodos de aço (Figura I.1) e a estes são aplicadas as polaridades para a formação do campo elétrico através da ligação a uma fonte de potencial elétrico de corrente contínua estabilizada.
Capítulo I Introdução
14 4 2 3 1 5 6Figura I.1 - Configuração empregada para montagem dos cartuchos e eletrodos de E- SPE.
Onde: 1= eletrodo inferior; 2 = frit de PTFE; 3 = sorvente; 4 = frit de PTFE; 5 = eletrodo superior e 6 = contato elétrico. Fonte: Modificado de Orlando, 2011.
Para que os estudos de E-SPE gerassem dados confiáveis e que permitissem avaliar os fenômenos envolvidos, Orlando (2011) também desenvolveu um sistema para monitoramento e controle dos parâmetros eletrocromatográficos conforme esquema apresentado na Figura I.2.
Figura I.2 - Esquematização do sistema para monitoramento e controle dos parâmetros eletrocromatográficos (potencial elétrico, corrente elétrica e vazão) empregado durante os procedimentos de E-SPE com e sem aplicação do campo elétrico. Onde: 1A = cartucho de extração adaptado com eletrodo superior 1B e inferior 1C; 2 = dispositivo tipo “manifold” para múltiplas extrações; 3 = bomba peristáltica; 4 = fonte de eletroforese; 5A e 5B = multímetros; 6 =
Capítulo I Introdução
15 N + -Aplicação da amostra Limpeza Eluição Eluato final N -N + + + + + + N N N N + + + + -N N + + + + + + N + + + + N N N N -N + + + + + + + + + +microcomputador contendo duas portas seriais RS-232 (6A e 6B) e 7 = tubos para coleta do eluato. Fonte: Modificado de Orlando, 2011.
A SPE é um procedimento de basicamente quatro etapas: condicionamento do cartucho, aplicação da amostra, limpeza para retirada de interferentes e eluição do analito. Todas essas etapas visam dois objetivos principais: eliminação de interferentes e concentração do analito.
Nos procedimentos de E-SPE os potenciais elétricos podem ser aplicados a qualquer uma das etapas, com exceção do condicionamento que não representa uma etapa significativa em relação à perda do analito ou eliminação de interferentes.
Várias combinações de polaridades aplicadas nos procedimentos de E-SPE podem ser realizadas de maneira a conferir maior seletividade e eficiência aos procedimentos de extração, onde compostos carregados podem ter a sua saída do cartucho favorecida ou reduzida. A Figura I.3 mostra uma das possibilidades de emprego da E-SPE.
Figura I.3 - Exemplos dos efeitos esperados de um possível modo de utilização da E-SPE. Sinais “+” e “-” sobre os frits indicam as polaridades positivas e negativas dos eletrodos.
Onde: compostos com carga positiva; compostos com carga negativa e compostos neutros.
Os primeiros estudos empregando a E-SPE foram realizados com compostos modelos, em particular corantes catiônicos e aniônicos.Dentro do limite do nosso conhecimento, esta é a primeira vez que estudos sistemáticos controlados foram realizados usando este sistema no preparo de amostras de ovos visando a
Capítulo I Introdução
16 determinação de resíduos de SULFAS e FQ.
As SULFAS e FQ são zwiteriônicas apresentar-se nas formas catiônicas, aniônicas ou com balanço de carga nulo, dependendo do pH do meio (Jimenez-Lozano et al.,2002; Lin et al.,1997).
Sendo assim, essas duas classes de antimicrobianos representaram um modelo adequado para o estudo onde, de acordo com o pH do meio o potencial elétrico pode favorecer a saída dos interferentes carregados e ao mesmo tempo reduzir a eluição dos analitos.
17
Capítulo II Objetivos
19
O objetivo geral deste trabalho compreendeu comparar o preparo de amostra baseado na extração em fase sólida convencional com o procedimento utilizando aplicação de potencial elétrico (E-SPE) para a determinação de resíduos de sulfonamidas (SULFAS) e fluoroquinolonas (FQ) em ovos por cromatografia líquida de alta e ultra eficiência.
Os objetivos específicos consistiram em:
(1) Desenvolver método para a separação e detecção das SULFAS e FQ por HPLC-DAD e HPLC-FLD, respectivamente.
(2) Avaliar a influência de parâmetros de extração como: pH, concentração salina, aditivos orgânicos entre outros na retenção das SULFAS e FQ, bem como na eliminação de interferentes por E-SPE com e sem aplicação de potencial.
(3) Avaliar parâmetros de desempenho de extração como: precisão, robustez, eficiência de extração, eliminação de interferentes por E-SPE com e sem aplicação de potencial.
(4) Avaliar o efeito da aplicação de potencial elétrico em fases poliméricas em comparação com fases a base de sílica (fenil e octadecil).
(5) Desenvolver e validar método para a determinação de resíduos de SULFAS e FQ por UHPLC-ESI-MS/MS.
(6) Avaliar o efeito matriz empregando E-SPE com e sem aplicação de potencial na determinação de resíduos de SULFAS e FQ em ovos por UHPLC-ESI-MS/MS.
Capítulo II Objetivos
21
CAPÍTULO III - AVALIAÇÃO DA E-SPE NA DETERMINAÇÃO DE
SULFONAMIDAS EM OVOS POR HPLC-DAD
Capítulo III Considerações Gerais
23 III.1–CONSIDERAÇÕES GERAIS
A determinação de resíduos de sulfonamidas em ovos por métodos cromatográficos requer um preparo de amostra anterior à quantificação, uma vez que se trata de uma matriz complexa composta basicamente de proteínas e gorduras.
No entanto, cabe destacar, que o preparo de amostras deve levar em consideração o sistema de detecção empregado. Enquanto que detectores mais seletivos como o espectrômetro de massas, em algumas ocasiões, podem requerer um preparo de amostras mais simples, detectores menos seletivos, como o arranjo de diodos empregado neste estudo necessitam de um preparo de amostras mais elaborado visando uma remoção maior de interferentes.
O sistema de extração em fase sólida com aplicação de potencial elétrico (E-SPE), assim como a SPE, tem como finalidade promover uma concentração dos analitos e eliminação dos interferentes durante o preparo de amostras. Porém, a associação de mecanismos eletroforéticos aos cromatográficos podem conferir maior seletividade quando comparado aos procedimentos convencionais de SPE.
No entanto, a E-SPE é uma técnica nova e os mecanismos envolvidos ainda não foram totalmente esclarecidos ou comprovados e diversos estudos adicionais devem ser realizados na tentativa de explicar os fenômenos envolvidos. A técnica não requer nenhum procedimento ou solvente adicional do que os já empregados na extração em fase sólida convencional. O diferencial é o uso de força eletromotriz para melhorar a seletividade e a eficiência de extração.
Sendo este o primeiro estudo sistemático da aplicação de campos elétricos em procedimentos de extração em fase sólida para a recuperação de sulfonamidas em amostras de ovos, o procedimento de E-SPE necessitou ser otimizado. Para tanto, diversos parâmetros foram avaliados, como: concentração e pH da solução tampão empregada, porcentagem e tipo de modificador orgânico a ser adicionado à solução tampão, potencial a ser aplicado, condutividade das amostras e soluções, tipo de sorvente, entre outros.
Estudos preliminares foram necessários para que a aplicação de potencial elétrico em amostras de ovos fosse possível, e assim se estabelecesse uma
Capítulo III Considerações Gerais
24
condição inicial para realizar os estudos sistemáticos de E-SPE para a determinação de sulfonamidas em ovos.
Estabelecida a condição inicial, foram realizados estudos sistemáticos de E-SPE em amostras de extrato de branco de ovo onde os parâmetros de extração foram avaliados de modo univariado.
Para os estudos dos parâmetros de extração nos procedimentos de E-SPE, a fortificação foi realizada no sobrenadante (extrato da amostras branco de ovo). Desta forma, perdas das sulfonamidas relacionadas com a etapa de precipitação seriam evitadas e não influenciariam na avaliação dos efeitos eletroforéticos sobre os resultados obtidos por E-SPE.
