UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
MÍRIAM CELI DE SOUZA NUNES
CRISES EPILÉPTICAS AGUDAS E PROLONGADAS PROMOVEM DIFERENTES RESPOSTAS MOLECULARES NO CÉREBRO DE ZEBRAFISH
CAMPINAS 2019
MÍRIAM CELI DE SOUZA NUNES
CRISES EPILÉPTICAS AGUDAS E PROLONGADAS PROMOVEM DIFERENTES RESPOSTAS MOLECULARES NO CÉREBRO DE ZEBRAFISH
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências, área de concentração em Genética Médica.
ORIENTADORA: CLÁUDIA VIANNA MAURER MORELLI
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA MÍRIAM CELI DE SOUZA NUNES, E ORIENTADA PELA PROF.ª DR.ª CLÁUDIA VIANNA MAURER MORELLI.
CAMPINAS 2019
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Nunes, Míriam Celi de Souza,
N922c NunCrises epilépticas agudas e prolongadas promovem diferentes respostas moleculares no cérebro de zebrafish / Míriam Celi de Souza Nunes. –
Campinas, SP : [s.n.], 2019.
NunOrientador: Cláudia Vianna Maurer Morelli.
NunTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Nun1. Zebrafish. 2. Estado epiléptico. 3. Crise aguda. 4. Pentilenotetrazol. 5. RNA-seq. 6. miRNA-seq. 7. Integração miRNA-RNAm. I. Maurer-Morelli, Cláudia Vianna, 1966-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Acute and prolonged seizures promote different molecular responses in the zebrafish brain
Palavras-chave em inglês: Zebrafish Status epilepticus Acute seizure Pentylenetetrazole RNA-seq miRNA-seq miRNA-mRNA integration
Área de concentração: Genética Médica Titulação: Doutora em Ciências
Banca examinadora:
Cláudia Vianna Maurer Morelli [Orientador] Danillo Pinhal
Manoel Luís Pereira da Silva Costa Monica Barbosa de Melo
Fábio Rogério
Data de defesa: 29-11-2019
Programa de Pós-Graduação: Ciências Médicas Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-9245-9315 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/7419053204077135
COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
MÍRIAM CELI DE SOUZA NUNES
ORIENTADORA: CLÁUDIA VIANNA MAURER MORELLI
MEMBROS:
1. PROF.ª DR.ª CLÁUDIA VIANNA MAURER MORELLI
2. PROF. DR. DANILLO PINHAL
3. PROF. DR. MANOEL LUÍS PEREIRA DA SILVA COSTA
4. PROF.ª DR.ª MONICA BARBOSA DE MELO
5. PROF. DR. FÁBIO ROGÉRIO
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
Dedico este trabalho aos meus pais, Emanuel e Mercedes, meus exemplos de amor, competência e caráter.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me presenteado com a oportunidade de estar nesse planeta. À mamãe, Mercedes, por nunca ter desistido do seu sonho de estudar, me levando com você diversas vezes para a Faculdade de Letras em Belo Horizonte desde os meus três anos de idade. Mesmo tendo ocorrido em tenra idade, tenho memórias carinhosas de muitos destes momentos, inclusive de sua formatura. Você, professora querida por seus alunos, foi a minha maior inspiração para que me tornasse também professora. E agora, aos 69 anos, você continua me orgulhando, começando seu Mestrado em Filosofia. Go,
girl! O mundo é seu.
Ao papai, Emanuel, sempre tão dedicado em tudo o que faz. Admiro sua inteligência, competência e persistência. Obrigada por ter me empurrado em momentos de desânimo, e também por ter compreendido e me apoiado quando escolhi um caminho diferente daquele que você sonhava para mim.
Aos meus queridos irmãos, Daniel e Cristiane, pela torcida otimista e carinhosa. Aos meus sobrinhos Carolina e Filipe, pelos momentos de pura felicidade que me proporcionam. A titia ama vocês!
À Larissa Raimundo, pela torcida e pelo imprescindível cuidado emocional. À Vanessa Zago, amiga querida, que me ofereceu seu apoio e seu ombro amigo por tantas vezes durante todos esses anos.
Aos amigos e colegas da PUC-Campinas, principalmente Van, Thi, Lu, Ed, Rafa, Rita e Ale, pelo companheirismo e por tornarem o ambiente de trabalho sensacional.
Aos colegas do LabZeb, Gemoca e LGM pela ajuda nos experimentos e pelas frutíferas discussões científicas, ao Welliton do BCBLab pelo apoio nas análises de Bioinformática.
À Cláudia Morelli, pessoa mais paciente, ética, delicada e correta que já tive o prazer de conviver. Obrigada por ter aceitado me orientar. Te admiro!
O presente trabalho foi realizado com apoio das seguintes agências de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), bolsa processo nº 141811/2016-1; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), código de financiamento nº 001; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo nº 2014/15640-8; Brazilian Institute of
“Viver é muito perigoso. Querer o bem com demais força, de incerto jeito, pode já estar sendo se querendo o mal, por principiar. Esses homens! Todos puxavam o mundo para si, para o concertar consertado. Mas cada um só vê e entende as coisas dum seu modo.”
RESUMO
As epilepsias são doenças neurológicas comuns, prevalentes e de diferentes manifestações clínicas, que são caracterizadas por crises epilépticas recorrentes. Uma forma grave de crise epiléptica prolongada é o status epilepticus, que pode resultar em dano cerebral ou até a morte. Apesar do investimento em terapias e procedimentos para melhorar a qualidade de vida dos pacientes, os mecanismos moleculares que permeiam as crises epilépticas ainda precisam de maiores esclarecimentos. Nesse estudo investigamos as características comportamentais, eletrográficas e moleculares de um novo protocolo de crise epiléptica prolongada, que buscou mimetizar a condição de status
epilepticus no zebrafish (Danio rerio). Também foram realizadas análises de
transcriptoma de dois protocolos de crises epilépticas induzidas por pentilenotetrazol (PTZ): crise aguda (AS, do inglês acute seizure) e status epilepticus–like (SE-like), sendo o tempo de exposição ao PTZ de 20 minutos e 3 horas, respectivamente. Larvas de
zebrafish com a idade sete dias pós-fertilização foram submetidas a um dos dois
protocolos de crises epilépticas: AS ou SE-like, além do Grupo Controle (CG, do inglês, control group). Posteriormente, foram realizados os transcriptomas de miRNA e RNAm por sequenciamento de alto rendimento, seguido por etapas de análises de bioinformática para a integração dos dados e encontrar possíveis alvos dos miRNAs diferencialmente expressos. A análise das vias enriquecidas mostrou que os genes com maior expressão estão relacionados à resposta imune no grupo SE-like em comparação com o CG e AS, assim como, as vias de apoptose e do estresse oxidativo foram mais prevalentes no grupo SE-like em relação ao CG. Os miRNAs diferencialmente expressos estavam todos super-expressos, e as análises das vias enriquecidas mostraram que seus alvos preditos fazem parte de processos como desenvolvimento, sobrevivência celular, níveis de energia e oxigênio, remodelação neuronal e morfogênese. Os resultados desse estudo apontam que o protocolo de SE-like mimetiza aspectos eletrográficos, comportamentais e moleculares do status epilepticus relatado em outros modelos animais. Destaca-se que o cérebro do
zebrafish apresentou respostas moleculares diferentes entre os protocolos AS e SE-like.
Estes resultados abrem novas oportunidades de estudos no zebrafish e reforçam este pequeno peixe como um modelo alternativo confiável para investigar os aspectos moleculares que permeiam as crises epilépticas.
Palavras-chave: zebrafish, status epilepticus, crise aguda, pentilenotetrazol, RNA-seq,
miRNA-seq, perfil de transcritos, integração de transcriptomas, vias de sinalização, crises epilépticas, epilepsia.
ABSTRACT
Epilepsy is a common neurological disorder characterized by recurrent seizures with different clinical presentations and consequences. Status epilepticus is a severe form of prolonged seizure that can result in brain damage or even death. Despite the current knowledge, the molecular mechanisms underlying seizures still need clarification. In this study, we aimed to investigate the behavioral, electrographic, and molecular characteristics of a prolonged seizure protocol, which sought to mimic the status epilepticus condition in zebrafish (Danio rerio). Besides, we analyzed the transcriptome of this condition and compared it with the acute seizure protocol (AS). Thus, zebrafish larvae at seven days post-fertilization were submitted to two different protocols of pentylenetetrazol (PTZ)-induced seizures: AS and status epilepticus-like (SE-like), a 20-minute and three-hour PTZ- exposure protocol, respectively. We performed mRNA and miRNA transcriptomes by high-throughput sequencing, followed by a bioinformatics pipeline for mRNA/miRNA transcriptomes integration and in silico analyses to find the target genes for the differentially expressed miRNAs. Gene ontology analysis revealed that upregulated genes were strongly related to the immune response in SE-like compared to the control group (CG) and AS group, as the apoptosis and oxidative stress pathways were very prevalent in SE-like compared to the CG. Statistically significant miRNAs were upregulated, and gene ontology analyses showed the target genes are part of pathways associated with development, cell survival, energy and oxygen levels, neuronal remodeling, and morphogenesis. Our findings suggest that the SE-like protocol mimics electrographic, behavioral and molecular aspects of status epilepticus seen in other models. Besides, our results showed that the zebrafish brain presented a different molecular response between the AS and SE-like protocols. These results open new opportunities for studies in the zebrafish and endorse this little fish as a reliable alternative model for molecular investigations underlying seizures.
Keywords: zebrafish, status epilepticus, acute seizure, pentylenetetrazole, RNA-seq,
miRNA-seq, transcript profile, transcriptome integration, signaling pathways, seizure, epilepsy.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Versão simplificada dos três níveis de análise das epilepsias: tipos de crises epilépticas, tipos de epilepsias, e síndromes epilépticas
17
Figura 2 Etapas da biogênese dos miRNAs 22
Figura 3 Aquários de manutenção de peixes adultos 27
Figura 4 Larvas de zebrafish com idade 7 dias pós-fertilização 28 Figura 5 Fluxograma do experimento de análise quantitativa do nado de larvas 7 dias
pós-fertilização
30 Figura 6 Configuração dos equipamentos utilizados para fazer o registro eletroencefalográfico
(EEG)
34 Figura 7 Fluxograma simplificado mostrando as etapas para obtenção dos transcriptomas de
miRNA e RNAm por sequenciamento de alto desempenho
36 Figura 8 Grupos comparativos feitos para análise da expressão diferencial nos transcriptomas
de RNA mensageiro e miRNA
37 Figura 9 Fluxograma simplificado das etapas de Bioinformática para análise dos dados dos
sequenciamentos
38 Figura 10 Integração dos dados do RNA-seq e miRNA-seq. miRNAs 39 Figura 11 Número de crises completas em três períodos de 30 minutos após a exposição ao PTZ
15 mM.
44 Figura 12 Avaliação do nado de larvas 7 dpf expostas ao PTZ 15 mM por 3 horas. 45 Figura 13 Avaliação comportamental de larvas de zebrafish por 3 dias subsequentes às crises
epilépticas.
46 Figura 14 Análise do perfil de expressão do gene c-fos em larvas de zebrafish com idade 7 dpf
após indução de crises epilépticas por 3 horas utilizando pentilenotetrazol (PTZ)
47 Figura 15 Eletroencefalogramas (EEGs) registrados a partir de um eletrodo posicionado no teto
óptico de larvas de zebrafish com idade de 7 dpf, expostas ao PTZ 15 mM por 3 horas
49 Figura 16 Histograma e diagrama de Venn representando RNAm (A) e microRNA (B)
diferencialmente expressos.
51 Figura 17 Interações entre miRNAs e genes alvo para cada grupo comparativo. 53 Figura 18 Curvas de dissociação para os primers desenhados para as análises de qPCR
utilizando a técnica SyBR Green®
57 Figura 19 Teste de validação por qPCR do miRNA dre-miR-31 (A) e seus genes-alvo ube3a (B),
sema4c (C) e shank3b (D). 58
Figura 20 Teste de validação por qPCR do miRNA dre-miR-99 (A) e seus genes-alvo plxnb3 (B) e sema6d (C).
58 Figura 21 Teste de validação por qPCR do miRNA dre-miR-192 (A) e seus genes-alvo cplx2 (B),
sv2b (C) e vav2 (D). 60
Figura 22 Teste de validação por qPCR do miRNA dre-miR-194a (A) e seu gene-alvo nrcama (B).
60 Figura 23 Teste de validação por qPCR do miRNA dre-miR-459-5p (A) e seu gene-alvo neurod1
(B).
61 Figura 24 Teste de validação por qPCR do miRNA dre-miR-460-3p (A) e seu gene-alvo hip1 (B). 61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Códigos dos ensaios TaqMan para validação dos miRNAs por qPCR 41 Tabela 2 Sequências dos primers forward e reverse desenhados através da ferramenta
Primer3 para cada gene selecionado para validação independente do RNA-seq 41 Tabela 3 miRNAs diferencialmente expressos no cérebro de zebrafish nos dois grupos
comparativos
51 Tabela 4 Processos biológicos e subprocessos mais relevantes para a epilepsia e
epileptogênese identificados com o MetaCore utilizando a lista de genes diferencialmente expressos nos grupos comparativos
55
Tabela 5 Processos biológicos e subprocessos mais relevantes para a epilepsia e epileptogênese encontrados através do MetaCore para os alvos dos miRNAs diferencialmente expressos
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ILAE International League Against Epilepsy, liga internacional contra a epilepsia
ELT, TLE Epilepsia do Lobo Temporal; Temporal Lobe Epilepsy EEG Eletroencefalografia
SE Status epilepticus
SE-like Status epilepticus-like
AS Acute Seizure, crise aguda
CG Control Group, grupo controle
PTZ Pentilenotetrazol
GABA Ácido gama-aminobutírico dpf dias pós-fertilização DNA ácido desoxirribonucléico cDNA DNA complementar RNA ácido ribonucléico
miRNA micro RNA
RNAm RNA mensageiro
NGS Next-Generation Sequencing, sequenciamento de nova geração
RNA-seq Sequenciamento de RNAm miRNA-seq Sequenciamento de miRNA
PCR Polymerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase
qPCR PCR quantitativa ppm partes por milhão
mM milimolar
μVrms tensão quadrática média, em microvolts UCSC University of California, Santa Cruz
BH Benjamini-Hotchberg
TSF Target Scan Fish
3’UTR 3’ untranslated region, região 3’não traduzida
ID código de identificação L2FC Log2 Fold Change
snRNA small nuclear RNA, pequeno RNA nuclear
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 16
1.1. AS EPILEPSIAS ... 16
1.2. O ZEBRAFISH COMO MODELO ANIMAL PARA DOENÇAS HUMANAS ... 18
1.3. O ZEBRAFISH COMO MODELO DE CRISES EPILÉPTICAS ... 19
1.4. MIRNAS E SUA RELAÇÃO COM AS EPILEPSIAS ... 21
1.5. SEQUENCIAMENTO DE ALTO RENDIMENTO,RNA-SEQ E BIOLOGIA DE SISTEMAS ... 23
2. OBJETIVOS ... 26
2.1. OBJETIVOS GERAIS ... 26
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 26
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 27
3.1. OBTENÇÃO E MANUTENÇÃO DOS PEIXES ADULTOS ... 27
3.2. OBTENÇÃO E MANUTENÇÃO DOS EMBRIÕES E LARVAS ... 28
3.3. CARACTERIZAÇÃO DO MODELO STATUS EPILEPTICUS-LIKE (SE-LIKE) ... 28
3.3.1. Caracterização comportamental ... 29
3.3.2. Caracterização molecular ... 31
3.3.3. Caracterização eletrográfica ... 33
3.4. OBTENÇÃO DOS TRANSCRIPTOMAS:RNA-SEQ E MIRNA-SEQ ... 34
3.4.1. Manipulação dos animais ... 34
3.4.2. Extração de RNA e parâmetros de qualidade ... 35
3.5. ANÁLISES DE BIOINFORMÁTICA DOS TRANSCRIPTOMAS ... 36
3.5.1. miRNA-seq: sequenciamento de microRNA ... 36
3.5.2. RNA-seq: sequenciamento de RNA mensageiro ... 37
3.5.3. Integração dos dados do RNA-seq e miRNA-seq ... 38
3.5.4. Análise de vias de sinalização enriquecidas ... 40
3.6. VALIDAÇÃO DOS TRANSCRIPTOMAS POR QPCR ... 40
3.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA PARA QPCR E ESTUDOS DE COMPORTAMENTO ... 42
4. RESULTADOS ... 43
4.1. CARACTERIZAÇÃO DO MODELO SE-LIKE ... 43
4.1.1. SE-like: caracterização comportamental ... 43
4.1.2. SE-like: caracterização molecular ... 47
4.1.3. SE-like: caracterização eletrográfica (EEG) ... 48
4.2. ANÁLISE DE BIOINFORMÁTICA DOS TRANSCRIPTOMAS ... 49
4.2.1. RNA-seq e miRNA-seq ... 49
4.2.2. Integração miRNA-RNAm ... 50
4.3. ANÁLISE DE VIAS DE SINALIZAÇÃO ENRIQUECIDAS ... 52
4.3.1. Análise geral das vias enriquecidas no RNA-seq ... 52
4.3.2. Análise das vias enriquecidas dos alvos dos miRNAs ... 54
4.4. TESTE DE VALIDAÇÃO DOS SEQUENCIAMENTOS POR QPCR ... 54
5. DISCUSSÃO ... 62
5.1. O MODELO DE STATUS EPILEPTICUS NO ZEBRAFISH ... 62
5.2. INVESTIGAÇÕES MOLECULARES:AS E SE-LIKE ... 63
5.2.1. miRNAs diferencialmente expressos e potenciais alvos ... 64
5.2.2. Análise das vias de sinalização enriquecidas no RNA-seq ... 71
6. CONCLUSÕES ... 77 7. REFERÊNCIAS ... 78 8. APÊNDICE ... 107
8.1. LISTA DOS TOP-50 GENES COM EXPRESSÃO AUMENTADA NO GRUPO SE-LIKE VS.CG. ... 107
8.2. LISTA DOS TOP-50 GENES COM EXPRESSÃO DIMINUÍDA NO GRUPO SE-LIKE VS.CG. ... 108
8.3. LISTA DOS TOP-50 GENES COM EXPRESSÃO AUMENTADA NO GRUPO SE-LIKE VS.AS. .... 109 8.4. LISTA DOS TOP-50 GENES COM EXPRESSÃO DIMINUÍDA NO GRUPO SE-LIKE VS.AS. ... 110
9. ANEXOS ... 111
1. INTRODUÇÃO
1.1. As epilepsias
As epilepsias são doenças neurológicas crônicas, caracterizadas por atividade síncrona dos neurônios e descargas elétricas cerebrais incomuns, que causam alterações imprevisíveis e temporárias no estado de consciência do indivíduo (1). Estas alterações podem resultar em diversos quadros epilépticos, como convulsões, movimentos involuntários em algumas partes do corpo ou no corpo inteiro, e também crises de ausência (2). Uma crise epiléptica pode ser definida como uma combinação de eventos comportamentais e elétricos responsáveis por induzir alterações químicas, moleculares e anatômicas no cérebro (3). Durante uma crise epiléptica, o indivíduo poderá sofrer diversas alterações cognitivas, na fala, percepção, atenção, distorções de memória, alterações emocionais e outras sensações, como por exemplo, o déjà vu (4). A frequência das crises epilépticas pode variar desde uma por ano até várias por dia, como ocorre por exemplo na síndrome de Dravet (5), impactando de forma significativa na qualidade de vida e na capacidade produtiva do indivíduo e de sua família. Cerca de 75 milhões de pessoas ao redor do mundo possuem algum tipo de epilepsia, tornando-a uma das doenças neurológicas mais comuns (6,7).
Com o objetivo de padronizar a classificação das epilepsias e tornar a terminologia mais acessível, em 2017 a Liga Internacional de Epilepsia (ILAE do inglês International
League Against Epilepsy), órgão global de referência no estudo das epilepsias, definiu
que as epilepsias podem ser analisadas em três níveis, sendo eles: 1) tipos de crises epilépticas; 2) tipos de epilepsias; 3) síndromes epilépticas (8). Analisando o primeiro nível, as crises epilépticas podem ser focais, generalizadas ou de início desconhecido
(Figura 1). As crises focais levam este nome pois têm um foco conhecido de início das
crises, podendo ocorrer em dois ou mais lugares simultaneamente em um hemisfério cerebral. As crises generalizadas não possuem um lugar de início específico, podendo envolver os dois hemisférios cerebrais. As crises de início desconhecido, como o próprio nome sugere, são aquelas em que não foi possível observar o local de início das crises. Passando para o segundo nível, as epilepsias podem ser classificadas em quatro tipos:
epilepsia focal, epilepsia generalizada, epilepsias generalizadas combinadas com focais,
e epilepsias desconhecidas. As epilepsias focais exibem crises do tipo focais, as epilepsias generalizadas exibem crises epilépticas generalizadas, as epilepsias generalizadas
combinadas com focais exibem crises focais e generalizadas, e nas epilepsias desconhecidas não foi possível determinar a origem das crises, se são focais ou generalizadas. Por último, o terceiro nível de análise das epilepsias refere-se às síndromes epilépticas, que são um conjunto de características que tendem a ocorrer juntas, como o tipo de crise, o padrão eletroencefalográfico (EEG), e as comorbidades associadas, como prejuízos cognitivos e psiquiátricos (8,9). A investigação da etiologia da epilepsia também é importante, uma vez que poderá determinar o tipo de intervenção médica para cada paciente (4,8,10).
Figura 1. Versão simplificada dos três níveis de análise das epilepsias: tipos de crises epilépticas, tipos de
epilepsias, e síndromes epilépticas. Retirado de Parolari, 2019 (11) a partir da figura original do artigo de Scheffer e colaboradores, 2017 (8).
Uma importante forma de crise epiléptica, e que geralmente se constitui como emergência médica, é uma crise epiléptica prolongada chamada estado epiléptico, ou
status epilepticus (SE). Em 2015, a ILAE atualizou a definição de SE como uma
emergência resultante tanto da falha no mecanismo de finalização das crises, quanto da iniciação de mecanismos cerebrais de terminação de crises, resultando em crises anormais e prolongadas (12). Hemorragias, crises de abstinência de medicações antiepilépticas e acidente vascular cerebral são exemplos de condições que podem causar um episódio de SE (13). No estado de SE convulsivo (caracterizado pelas crises tônico-clônicas), após
cinco minutos é caracterizada a crise contínua, e após trinta minutos existe o risco de consequências em longo prazo. Estes dois tempos (5 e 30 minutos) foram determinados a partir de experimentos em modelos animais e pesquisa clínica (14). Nestas condições, as consequências são graves e envolvem morte neuronal, alteração das redes neurais, aumento da resistência aos medicamentos antiepilépticos, ou mesmo a morte do paciente, de acordo com o tipo e a duração das crises (14).
O tratamento para as epilepsias geralmente é realizado por drogas antiepilépticas, mas apenas aproximadamente 70% dos pacientes respondem aos medicamentos convencionais, sendo que os outros 30% são refratários às medicações disponíveis ou tornam-se resistentes a elas (7,15–17). Este fato corrobora a necessidade de novas pesquisas na área para entender os motivos pelos quais alguns pacientes epilépticos não respondem ao tratamento convencional, sofrendo com uma doença de difícil controle.
Uma das formas para se compreender os diversos aspectos fisiopatológicos de doenças humanas e testar novas drogas para tratamento é o emprego de modelos animais, abordagem essa, que tem sido utilizada com sucesso também no caso das epilepsias (3,18,19). Os roedores, como ratos e camundongos, além de possuírem uma boa relação de órgãos, tecidos e homologia genética com o ser humano, são capazes de apresentar diferentes fenótipos epilépticos, o que os tornam ótimos modelos para se estudar os mecanismos epileptogênicos, além de propiciar oportunidades de investigação genética das epilepsias (20). Entretanto, algumas desvantagens desses modelos são: a gestação intrauterina, que dificulta a observação dos estágios iniciais do desenvolvimento; o alto custo de manutenção; e o tempo e condições ótimas para a reprodução (3,21).
1.2. O zebrafish como modelo animal para doenças humanas
Um modelo animal vertebrado para o estudo de doenças humanas que ganhou espaço na ciência pelas inúmeras vantagens que oferece é o zebrafish, ou peixe-zebra (Danio rerio) (22). No aspecto econômico, algumas vantagens importantes deste modelo em relação ao roedores são o baixos custos de manutenção e alimentação; menor necessidade de espaço, pois os peixes são pequenos e permitem manter uma grande quantidade em um aquário pequeno (22–24); curto espaço de tempo entre gerações, fertilidade ao longo de todo o ano; e a produção de prole em grande número, aproximadamente a cada duas semanas (20,25,26). Outra importante característica do
zebrafish é a fecundação e desenvolvimento externos e a transparência de embriões e
larvas, que facilitam a visualização das etapas iniciais do desenvolvimento (22,27). Apesar de ser um organismo vertebrado, existe uma grande diferença evolutiva entre o Danio rerio e o Homo sapiens. Por causa disso, ainda restava uma questão importante a ser respondida: qual é o nível de similaridade entre o genoma do zebrafish e o humano? Em 2013, Howe e colaboradores sequenciaram e publicaram o genoma completo do zebrafish (28), revelando que cerca de 71% dos genes humanos possuem pelo menos um gene ortólogo no zebrafish, e destes, 47% possuem uma relação de um-para-um. Outra descoberta interessante desse trabalho é que vários genes entre as duas espécies mantiveram a sintenia preservada (27).
A proximidade genômica surpreendente entre o homem e o zebrafish o torna um ótimo modelo de estudos genéticos para doenças humanas (29–32), inclusive para as epilepsias. Com a identificação de genes que contribuem para o desenvolvimento da epilepsia em humanos foram criadas linhagens de peixes zebrafish com mutações em vários desses genes, como por exemplo MIB1, do inglês, mindbomb E3 ubiquitin protein
ligase 1 (33), SCN1A, subunidade alfa-1 do canal de sódio voltagem dependente (34), e STX1B, sintaxina 1B (35). Consequentemente, a maioria dessas linhagens exibe fenótipo
epiléptico, favorecendo o estudo dos aspectos das epilepsias nesse modelo. O zebrafish também é um bom modelo de crises epilépticas, fato que está associado à facilidade em induzir as crises nos peixes, processo que consiste em adicionar substância farmacológica pró-convulsivante na água e posteriormente analisar as mudanças comportamentais e moleculares (36).
1.3. O zebrafish como modelo de crises epilépticas
O pentilenotetrazol (PTZ) é uma droga pró-convulsivante que impede a ação do neurotransmissor inibitório ácido gama-aminobutírico (GABA) no sistema nervoso central (15,37,38). Ele funciona como um antagonista competitivo dos receptores ionotrópicos GABAA: ao ligar-se nos receptores, o PTZ impede o influxo de íons cloreto
(Cl-) e permite a entrada de íons cálcio (Ca2+) e sódio (Na+) no citoplasma do neurônio,
ocorrendo portanto a despolarização da membrana e a passagem do potencial de ação (39). Dessa forma, vários neurônios começam a disparar simultaneamente e os impulsos nervosos tornam-se síncronos, culminando em crises epilépticas.
O primeiro trabalho usando o modelo zebrafish para estudos dos mecanismos que permeiam a geração de crises epilépticas foi descrito em 2005 por Baraban e colaboradores (25). O modelo proposto, chamado de modelo de crise aguda (AS, iniciais de acute seizure, em inglês), expôs larvas de sete dias pós-fertilização (dpf) ao PTZ durante 20 minutos. No referido trabalho, os autores reportaram as alterações de comportamento durante as crises epilépticas; o registro eletroencefalográfico (EEG) da atividade cerebral durante a exposição ao PTZ, que revelou um padrão compatível às fases ictais e interictais presentes em outros modelos de crise aguda; e também a caracterização molecular, que detectou o aumento da expressão do gene c-fos nas larvas tratadas, um indicativo de aumento da atividade neuronal das áreas responsáveis pela indução da crise epiléptica (40).
A ocorrência de SE é mais frequente no cérebro imaturo, sendo que grande parte dos casos ocorrem em crianças com até dois anos de idade, e nestas condições, geralmente ocorre dano hipocampal, esclerose mesial-temporal, bem como comprometimento neurológico, cognitivo e comportamental (41–45). Além de estudos clínicos e de imagem em humanos, o emprego de modelos animais tem um papel relevante na investigação do impacto do SE no cérebro imaturo. Nesses estudos, geralmente são utilizados roedores (com idade inferior a 21 dias), os quais são estimulados eletricamente ou administrando substâncias convulsivantes, como o ácido caínico ou pilocarpina, em protocolos bastante similares aos utilizados em animais adultos (46–48).
Resumidamente, no protocolo de indução de SE em ratos usando pilocarpina, os animais são expostos à substância convulsivante e passam por um episódio crise contínua, que após 30 minutos caracteriza-se o status epilepticus convulsivo. Os 15 dias subsequentes ao insulto inicial geralmente são assintomáticos, chamado de período silencioso ou de latência. Nesse período, em que ocorre a epileptogênese, o cérebro dos animais passa por uma intensa reorganização, incluindo processos como morte neuronal, reestruturação da rede sináptica e proliferação de células da glia. Após esse período, os animais começam a apresentar crises epilépticas espontâneas, tornando-se então cronicamente epilépticos (48–50). Estudos dos efeitos agudos e em curto prazo nestes modelos animais indicam dano neuronal no hipocampo, amígdala e no núcleo médio-dorsal do tálamo (51,52).
As crises agudas induzidas em zebrafish por PTZ ou por aumento de temperatura são bastante semelhantes às induzidas nos roedores e nos humanos em termos fisiológicos
e comportamentais (20,25,33,53). Além disso, estudos mostraram que os mecanismos subjacentes à iniciação e terminação de crises são universais para camundongos, humanos e zebrafish (3,25). Porém, ainda não foi comprovado se o cérebro do zebrafish torna-se cronicamente epiléptico, em grande parte devido ao seu alto poder de regeneração, inclusive do cérebro (54–56)
Um estudo recente usando zebrafish adultos expostos ao PTZ 15 mM e, mimetizando o SE, comprovou que as crises epilépticas são iniciadas no telencéfalo (57). Entretanto, nenhum estudo ainda foi feito em larvas de zebrafish mimetizando o SE e explorando suas repercussões moleculares ou comportamentais.
1.4. miRNAs e sua relação com as epilepsias
Um aspecto que ainda permanece pouco explorado no modelo zebrafish e que oferece um ótimo potencial no estudo das epilepsias (58) é a regulação da expressão gênica por meio dos microRNAs (miRNAs), uma classe RNAs não-codificantes, de aproximadamente 19 a 23 nucleotídeos (59), e que se ligam ao RNA mensageiro (RNAm) alvo no citoplasma (Figura 2). Durante a biogênese, os miRNAs são transcritos no núcleo pela enzima RNA polimerase II, formando grandes precursores primários em forma de grampo de cabelo (hairpins), chamados pri-miRNAs. Essas moléculas passam pelas mesmas etapas do processamento pós-transcricional do RNA mensageiro (adição do Cap-5’, cauda poli-A e splicing), catalisadas principalmente pela enzima Drosha. Depois desse processo, o agora chamado pré-miRNA é transportado para o citoplasma e é clivado pela enzima Dicer, que remove a alça do grampo e o torna um miRNA maduro, que neste estágio é uma molécula de fita dupla. Um dos filamentos do miRNA maduro, chamado filamento-guia, associa-se ao complexo RISC (RNA-induced silencing complex) e forma o complexo de silenciamento gênico induzido por RNA. Esse complexo tem a capacidade de ligar-se à região 3’ não-traduzida (3’UTR) de moléculas de RNAm alvo e sua função canônica é diminuir a expressão gênica na célula (60). Seus mecanismos de ação envolvem, por exemplo, a inibição da tradução do RNAm ou a degradação da molécula de RNAm alvo (59,61–64).
Figura 2. Etapas da biogênese dos miRNAs. Os miRNAs são transcritos no núcleo pela enzima RNA
polimerase II, formando os precursores chamados pri-miRNAs, que passam pelas mesmas etapas do processamento pós-transcricional do RNAm, catalisadas principalmente pela enzima Drosha. O pré-miRNA é transportado para o citoplasma e é clivado pela enzima Dicer, que o torna um pré-miRNA maduro, de fita dupla. Um dos filamentos do miRNA maduro, chamado filamento-guia, associa-se à proteína RISC e forma o complexo de silenciamento gênico induzido por RNA. Esse complexo tem a capacidade de ligar-se à região 3’ não-traduzida (3’UTR) de moléculas de RNAm alvo e sua função principal é diminuir a expressão gênica na célula. Retirado de He & Hannon, 2004, doi:10.1038/nrg1379 (65).
Nos eucariotos (66) e especialmente no zebrafish, os miRNAs regulam a expressão gênica em vários estágios do desenvolvimento (67,68), inclusive na morfogênese do cérebro (69). Além disso, os miRNAs atuam em diversos processos celulares importantes, como a morte neuronal e a neurogênese (69–71). Nas epilepsias e
no status epilepticus é sabido que os miRNAs atuam como peças-chave em mecanismos como a epileptogênese (72–74) e na reorganização das redes neurais pela plasticidade sináptica (75–77). Os miRNAs vêm sendo propostos como auxiliares no diagnóstico de algumas formas de epilepsia (78,79) e também como futuros alvos para desenvolvimento de novas drogas e tratamentos (80).
1.5. Sequenciamento de alto rendimento, RNA-seq e biologia de sistemas
Uma maneira de se estudar a expressão de moléculas de RNA de um determinado organismo é o microarray, que consiste em hibridizar o cDNA dos transcritos presentes na amostra com sondas de sequências conhecidas presentes em um chip (81–83). Anteriormente chamada de “padrão ouro” para análise de transcriptomas e, ainda que utilizada nos dias de hoje (84–86), a técnica do microarray possui limitações importantes, como por exemplo a inabilidade de identificação de novas variantes de transcritos, dificuldade em descobrir novas mutações genômicas, hibridização das sondas em múltiplos transcritos, e a dificuldade na normalização e comparação dos resultados quando são testadas várias condições experimentais (87–91).
Uma alternativa que surgiu há cerca de 10 anos para tentar contornar essas limitações e apresentar um método mais abrangente e confiável de análise de transcritos é o sequenciamento de alto rendimento (do inglês high-throughput sequencing). Também chamado de sequenciamento de nova geração (NGS, do inglês next-generation
sequencing), o sequenciamento de alto rendimento tem a função de avaliar a expressão
gênica de um determinado órgão ou tecido (92). Algumas das aplicações do sequenciamento de alto rendimento incluem: analisar variantes genéticas, sequenciar genomas completos – inclusive de novos organismos, e estudar o transcriptoma de organismos, células e tecidos (93,94).
Quando se aplica o sequenciamento de alto rendimento para a análise do transcriptoma, ou seja, o conjunto completo de moléculas de RNA de uma amostra, dá-se o nome de RNA-dá-seq, ou dá-sequenciamento de RNA (95). Além de dá-se tratar de uma técnica de maior confiabilidade e reprodutibilidade em comparação ao microarray (96), outras vantagens e aplicações do RNA-seq são: facilitar a detecção e quantificação dos vários tipos de transcritos produzidos por um determinado gene, incluindo variantes ainda
desconhecidas, e permitir a comparação dos níveis de expressão diferencial de transcritos ao submeter uma célula ou tecido a uma determinada condição experimental (97–101), permitindo assim, a análise dos complexos mecanismos moleculares e fisiológicos subjacentes. A sensibilidade do RNA-seq é tamanha que permite traçar o perfil de transcritos de uma única célula (102). Nos últimos anos, a técnica do RNA-seq abriu caminho para avanços importantes no estudo dos mecanismos moleculares das epilepsias (103,104), e também do SE (105–107). No entanto, ainda existem muitas lacunas a serem preenchidas.
Para o sequenciamento do conjunto completo de microRNAs, dá-se o nome de miRNA-seq. Em se tratando de dois transcriptomas diferentes, miRNA-seq e RNA-seq, como saber quais RNA mensageiros os miRNAs diferencialmente expressos estão regulando? Uma forma de responder a esta pergunta é realizar a integração dos dois transcriptomas (108). Empregada em trabalhos recentes que modelavam doenças humanas em modelos animais (109–111), a integração dos dados das várias “ômicas” proporciona um melhor entendimento sobre como diferentes moléculas se inter-relacionam e se regulam. Nos últimos anos, tem-se observado um maior número de estudos com integração de transcriptomas miRNA-RNAm no modelo zebrafish (112– 115). Porém, essa abordagem ainda não foi utilizada no modelo zebrafish no contexto das epilepsias.
Para ter uma visão mais abrangente do estado interno em que um tecido ou grupo de células exibem ao serem expostos a uma condição experimental, uma abordagem bastante útil é submeter as listas de genes diferencialmente expressos fornecidas pelo RNA-seq em um software de análise de vias de sinalização para investigar quais estão enriquecidas. Essa abordagem, que faz parte da chamada biologia de sistemas (Systems
Biology), é utilizada frequentemente em trabalhos com integração de dados de “ômicas”,
incluindo o transcriptoma (116–118). Nesse sentido, várias ferramentas de uso intuitivo foram desenvolvidas para servir a todos os tipos de públicos, como por exemplo as plataformas gratuitas Gene Set Enrichment Analysis, GSEA (119), Kyoto Encyclopedia
of Genes and Genomes, KEGG (120), The Database for Annotation, Visualization and Integrated Dis- covery, DAVID (121), e as plataformas pagas Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Qiagen™) e MetaCore™ (GeneGo).
Considerando a importância das epilepsias e dos seus mecanismos, ainda há a necessidade de se compreender, com maior abrangência, os aspectos moleculares que
permeiam as crises epilépticas. Tendo isso em vista, este trabalho teve como proposta realizar a caracterização do modelo de crise epiléptica prolongada (SE-like) no cérebro imaturo de zebrafish, por meio da análise comportamental, eletrográfica e molecular, e em especial, por meio de um estudo abrangente e integrado sobre o perfil de expressão de RNAm e miRNA, buscando assim, contribuir para um maior conhecimento sobre a resposta molecular às crises epilépticas, em um modelo que possui muitas vantagens para a investigação experimental.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos Gerais
Caracterizar um modelo de crise epiléptica prolongada que visa mimetizar o status
epilepticus na larva de zebrafish e investigar as respostas moleculares envolvidas nas
crises epilépticas agudas e prolongadas pela análise dos transcriptomas de RNAm e miRNA.
2.2. Objetivos Específicos
• Caracterizar o comportamento, a resposta eletrográfica e molecular do modelo de crise prolongada, SE-like;
• Obter os transcriptomas de RNAm e miRNA dos protocolos SE-like e AS por meio da técnica do RNA-seq;
• Realizar a integração dos dados dos transcriptomas miRNA-RNAm; • Analisar as vias de sinalização enriquecidas no transcriptoma de RNAm; • Validar os dados do RNA-seq e miRNA-seq por meio da técnica da qPCR; • Comparar as respostas moleculares dos modelos AS e SE-like.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Obtenção e manutenção dos peixes adultos
Peixes da espécie Danio rerio (zebrafish) foram obtidos por meio de reprodução natural dos animais do Laboratório de Zebrafish (LabZeb) do Departamento de Genética Médica e Medicina Genômica, FCM, UNICAMP e mantidos em aquários (Figura 3) em um ambiente com luz controlada, sendo 14 horas de claro e 10 horas de escuro. A alimentação por ração flocada (TetraMin®, Tetra, Blacksburg, VA, USA) foi oferecida três vezes ao dia por alimentadores automáticos, além de um suplemento proteico de camarão desidratado (MysisShrimp, BCUK Aquatics, Lincolnshire-UK) oferecido uma vez ao dia. A temperatura da água dentro dos aquários foi controlada por termostatos elétricos, de modo a se manter entre 26 ± 2°C. Outros parâmetros de qualidade da água, como pH (7,0 até 7,5), quantidade de amônia (< 0.1 ppm), nitrito (< 0.2 ppm) e oxigênio dissolvido (4-11 ppm) também foram monitorados a cada sete dias. Todos estes procedimentos estão de acordo com os padrões de manutenção de criações de zebrafish, descritos por Westerfield e colaboradores (122).
Figura 3. Aquários de manutenção de peixes adultos. Observar os alimentadores automáticos no topo dos
aquários contendo ração flocada, os filtros de água, os termostatos para controlar a temperatura da água e os termômetros. Os ambientes foram enriquecidos com plantas aquáticas artificiais e pedras. Os pequenos cilindros de cerâmica acumulados na parte frontal dos aquários têm a principal função de manutenção da microbiota do ambiente. Imagem por Míriam Celi de Souza Nunes (LabZeb).
3.2. Obtenção e manutenção dos embriões e larvas
Os embriões de zebrafish foram obtidos por meio da reprodução natural dos peixes adultos nos aquários. Diariamente, após coletá-los por sifonamento no início do período de luz, os embriões foram lavados e mantidos em incubadora em placas de Petri contendo água de aquário, trocada diariamente. Na incubadora, a temperatura foi mantida constante em 28,5ºC e com o mesmo fotoperíodo do ambiente externo: 14 horas com a luz ligada e 10 horas com a luz desligada. A partir do 5º dia pós-fertilização (dpf), as larvas foram alimentadas com paramécio, cultivado e mantido no Laboratório de
Zebrafish. Todos os procedimentos experimentais descritos neste trabalho foram
conduzidos em larvas na idade de 7 dpf, e sua aparência nesse estágio pode ser vista na
Figura 4. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética sobre o Uso de
Animais (CEUA) da UNICAMP, processos 3045-1 e 4053-1 (Anexos, item 8.1).
Figura 4. Larvas de zebrafish com idade 7 dias pós-fertilização (dpf). À esquerda, visão lateral. À direita,
visão dorsal. Modificada de Kimmel e colaboradores, 1995 (123).
3.3. Caracterização do modelo status epilepticus-like (SE-like)
O protocolo de exposição à solução de PTZ na concentração 15 mM por 20 minutos (crise aguda, AS) está consolidada na literatura e foi descrita por Baraban e colaboradores em 2005 (25). Assim, o primeiro passo do presente estudo foi a descrição da atividade comportamental dos animais expostos a uma solução de PTZ 15 mM por um
período de três horas, o protocolo de SE-like. A escolha de 3h, embora arbitrária, levou em consideração o fato que nesse período a larva passa diversas vezes por todos os estágios da crise epiléptica (estágios de 1 a 3 como descrito em 24), até a perda de postura sem recuperação, no entanto, sem entrar em óbito. Uma vez determinado o tempo, foi realizada a caracterização comportamental, eletrográfica e molecular das crises epilépticas.
3.3.1. Caracterização comportamental
Embriões foram obtidos e mantidos conforme descrito no item 3.2 desta seção. Um total de 32 larvas na idade 7 dpf foram obtidas e divididas em dois grupos: controle (CG, do inglês control group, n=16) e status epilepticus-like (SE-like, n=16). A manipulação das larvas é um fator estressante. O sucesso do experimento de caracterização comportamental depende do nível do estresse das larvas, uma vez que o estresse pode influenciar nos resultados. Para excluir essa possibilidade foi importante fazer uma aclimatação das larvas, que foram deixadas por 30 minutos no local onde seria feita a medição e obtenção dos dados.
Para analisar o nado das larvas foi utilizada uma placa de 96 poços padrão. As larvas foram transferidas da placa de Petri de manutenção para os poços da placa, juntamente com 100 µL de água de aquário. Depois, foi realizada a separação das larvas em dois grupos: CG (n=16) e SE-like (n=16). A Figura 5 traz uma ilustração da placa com a disposição dos grupos. Após a aclimatação como descrita acima, em cada poço referente ao grupo CG, foi adicionado um novo volume de 100 µL de água de aquário com pipeta multicanal, totalizando 200 µL de água de aquário por poço. Em seguida, em cada poço com as larvas do grupo SE-like foram rapidamente adicionados 100 µL de solução de PTZ 30 mM também com pipeta multicanal, para que ao somar-se com o conteúdo de água já presente no poço anteriormente, fosse obtida uma solução final de 200 µL de PTZ 15 mM.
Figura 5. Fluxograma do experimento de análise quantitativa do nado de larvas 7 dias pós-fertilização (dpf)
expostas ao pentilenotetrazol (PTZ) 15 mM. Os grupos controle (CG) e status epilepticus-like (SE-like) possuem cada um n=16 larvas de zebrafish 7 dpf. Imagem por Míriam Celi de Souza Nunes (LabZeb).
As larvas de zebrafish passaram a presentar sinais de agitação após poucos segundos em contato com a solução de PTZ 15 mM. Imediatamente após adicionar as soluções aos poços, a placa foi posicionada no equipamento DanioVision™ (Figura 5) e foi iniciada a gravação. Para a análise dos dados obtidos, o software EthoVision® XT (Noldus Information Technology, The Netherlands) foi configurado por um período de 3 horas, onde foram avaliadas a distância percorrida no poço e a velocidade média do nado das larvas.
Ao completar o tempo de 3h designado para o experimento, as larvas de ambos os grupos foram lavadas duas vezes em água de aquário a fim de remover qualquer resquício de solução de PTZ (Figura 5). Com o intuito de garantir que apenas as larvas vivas fossem mantidas, os animais foram observados por 30 (trinta) minutos, e leves toques foram dados na placa para verificar a responsividade dos animais. Todas as larvas estavam vivas após o experimento. Depois disso, os animais de cada grupo foram
transferidos para placas de Petri contendo água de aquário e mantidos em incubadora para serem monitorados nos próximos dias.
A fim de enriquecer a caracterização do modelo foi realizada também uma análise observacional e descritiva do comportamento das larvas durante a exposição ao PTZ. Para estudos dessa natureza, um conjunto pequeno de animais é suficiente para observar os comportamentos característicos da condição experimental a qual os animais serão expostos. Para tanto, cinco larvas com idade 7 dpf foram transferidas individualmente para uma placa de 96 poços, sendo que em cada poço havia 100 µL de água de aquário. Após o período de 30 minutos de aclimatação, foram adicionados 100 µL de PTZ na concentração de 30 mM para atingir a concentração de 15 mM no poço. Imediatamente após a adição do PTZ foi iniciada uma filmagem com câmera de smartphone modelo iPhone 8 pelas três horas subsequentes (180 minutos), em que o tempo 0 (zero) corresponde ao momento em que iniciou-se a exposição ao PTZ, e o tempo 180 corresponde ao momento em que as larvas foram retiradas do poço e colocadas no primeiro banho. Para esta análise, foram selecionados três períodos de observação contínua, correspondendo aos 30 primeiros minutos de cada hora: i) período 1, 0-30 minutos; ii) período 2, 60-90 minutos; iii) período 3, 120-150 minutos. Parâmetros como latência, que é o tempo até iniciar a primeira crise, e número de crises completas, que são contadas quando as larvas atingem o estágio de perda de postura (124) foram quantificados por animal. Todos os animais sobreviveram ao experimento. Após a filmagem, os animais foram eutanasiados com gelo e descartados conforme instruções do comitê de ética.
3.3.2. Caracterização molecular
A caracterização molecular foi realizada pela expressão do gene c-fos, também chamado fosab no zebrafish, e reconhecido como marcador de atividade neuronal (40). Para isso, um novo conjunto de 50 larvas com 7 dpf foram obtidas e mantidas utilizando o mesmo método descrito na seção 3.2. Os animais foram distribuídos da seguinte forma: grupo CG, n=5; grupo SE-like, n=5, sendo cada n composto por um pool de cinco cabeças de larvas.
Para a indução de crises epilépticas nas larvas, foram separadas duas placas de 96 poços, uma para cada grupo experimental. Na primeira placa, foram pipetados 200 µL de
solução PTZ 15 mM em 30 poços, referentes ao total de larvas deste grupo. Na segunda placa, foi pipetado o mesmo volume de água de aquário também em 25 poços. Depois, as larvas 7 dpf foram transferidas aleatoriamente pelos poços das placas, primeiramente as do grupo CG e depois as do grupo SE-like. As duas placas foram deixadas sobre a bancada em temperatura ambiente (23ºC) por 3h consecutivas. Os animais foram periodicamente observados durante este tempo, e realizada a constatação ocular de que apenas as larvas do grupo SE-like apresentavam o comportamento característico das crises epilépticas.
Ao final do tempo estabelecido, as larvas dos dois grupos foram lavadas duas vezes (banho 1 e banho 2) em água de aquário, utilizando-se placas de Petri separadas, e foram deixadas em observação por 30 minutos para verificar a taxa de sobrevivência. Após constatar que os animais dos grupos CG e SE-like estavam vivos, todos foram anestesiados e eutanasiados utilizando gelo e decapitados. As cabeças foram imediatamente congeladas e guardadas em freezer a -80ºC para posterior extração de RNA.
Terminada a coleta do material biológico, o RNA foi extraído das amostras CG e SE-like utilizando o método do TRIzol®, seguindo as instruções do fabricante. A integridade do RNA foi verificada por eletroforese em gel de agarose a 2%. Ao detectar que o RNA de todas as amostras estava íntegro, procedeu-se com a quantificação do RNA no aparelho Epoch™ Ultraviolet Spectrophotometer (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) por absorbância de luz ultravioleta. A síntese do cDNA foi por meio do kit de transcrição reversa (RT-PCR) High Capacity Reverse Transcription (Applied Biosystems™, Califórnia, USA).
Por último, realizou-se a quantificação do transcrito do gene c-fos apor meio da PCR quantitativa em tempo real (qPCR) utilizando sondas TaqMan® (Thermo Fisher
Scientific). Segundo recomendações do próprio fabricante, os ensaios TaqMan® dispensam validação prévia à utilização na qPCR. Entretanto, para descobrir a melhor concentração de cDNA a ser utilizada nos experimentos, foi feita uma curva padrão do gene c-fos. A validação foi realizada com diluições seriadas de cinco vezes (diluições 1:5), utilizando sete valores de massas diferentes de cDNA, iniciando as diluições com a massa de 200 ng. Com os dados da cinética de amplificação das amostras e utilizando o programa 7500 Real-Time PCR Software (Thermo Fisher Scientific®), construiu-se uma curva padrão. A concentração escolhida foi de 2 ng/µL (4 ng de massa).
A expressão do gene c-fos (código do ensaio: Dr03100809_g1) foi quantificada em relação ao gene de referência (housekeeping gene, gene endógeno) eef1al1 -
elongation factor 1 alpha 1, like 1 (código do ensaio: Dr03432748_m1). Este gene de
referência foi escolhido pois exibe baixa variação da expressão gênica em células de
zebrafish (125). Os experimentos foram preparados utilizando o LuminoCT® qPCR
ReadyMixTM (Sigma-Aldrich, MO, USA) seguindo as instruções do fabricante. As reações foram realizadas no aparelho SDS 7500 Software (Applied Biosystems) e executadas em triplicatas. O cálculo da expressão relativa foi realizado utilizando o método 2-ΔΔCt (126).
3.3.3. Caracterização eletrográfica
O terceiro e último passo para a caracterização do modelo SE-like em zebrafish foi a realização do eletroencefalograma (EEG) para comprovar o padrão de ondas cerebrais compatíveis com o status epilepticus. A Figura 6 mostra os equipamentos utilizados para este experimento. Os registros eletrofisiológicos foram realizados em três larvas de zebrafish na idade 7 dpf, uma por vez, utilizando-se um eletrodo de aço inoxidável 316L de 125 μm de diâmetro, com isolamento de polimida de 10 μm e ponta exposta. O eletrodo terra era semelhante, porém não isolado, contendo cerca de 3 mm de comprimento ao longo do seu eixo. O eletrodo terra foi imerso em solução de agarose
low-melting a 0,8% com PTZ 15 mM durante toda a duração do experimento. O eletrodo
principal foi posicionado utilizando-se um micromanipulador triaxial até tocar o teto óptico da larva, cuja localização fica entre os globos oculares (Figura 6). Os sinais captados pelos eletrodos foram pré-amplificados, multiplicando-os por 10. Foi também aplicado um filtro de 1 a 1.000 Hz para eliminar os ruídos.
O sinal foi novamente amplificado pelo software Intan RHD2000 multiplicando-se o sinal captado por 100, para obter uma amplificação total final de 1.000. A aquisição foi realizada através de um único canal ao longo dos experimentos, a 10 mil amostras por segundo. Os arquivos foram salvos no computador a cada 10 minutos até completar as 3 horas de experimento, por animal. O nível de ruído do sistema foi testado antes de cada experimento e salvo como arquivos de base (baseline). Em média, o nível de ruído ficou em torno de 20 μVrms (tensão quadrática média). A maior parte da atividade de crise apresentou sinais de amplitudes de 100 a 500 μV. A relação sinal-ruído (do inglês,
Signal-to-Noise Ratio) foi, portanto, em torno de 5 (cinco), garantindo que as gravações
pudessem ser analisadas posteriormente. Após a experimentação, todos os animais foram eutanasiados com gelo até a constatação da morte.
As gravações geraram arquivos com extensão rhd, e foram processados e filtrados usando o software MatLab (v.R2016b). Foram extraídos os primeiros 30 minutos de cada uma das três horas para produzir uma amostragem do sinal total e, em seguida, foi selecionado um episódio de crise de cada trecho para amplificar. A escala de tempo foi definida em segundos e a amplitude em microvolts (μV).
Figura 6. Configuração dos equipamentos utilizados para fazer o registro eletroencefalográfico (EEG)
como parte da caracterização do modelo de status epilepticus em larvas de zebrafish. No detalhe, o eletrodo posicionado no teto óptico da larva. Imagens do acervo do Laboratório de Zebrafish/Unicamp.
3.4. Obtenção dos transcriptomas: RNA-seq e miRNA-seq
3.4.1. Manipulação dos animais
Nossa proposta neste projeto foi de utilizar a tecnologia de sequenciamento de alto desempenho para obter os transcriptomas de RNA mensageiro (RNA-seq) e microRNA (miRNA-seq), após a indução de crises epilépticas pelos protocolos de crise
aguda e prolongada. Foram definidos três grupos experimentais: AS, acute seizure (crise aguda), animais expostos ao pentilenotetrazol (PTZ) 15 mM por 20 minutos, total 60 larvas, sendo que um pool de 20 cabeças compunha n=1, totalizando n=3; SE-like, status
epilepticus-like, expostos ao PTZ 15 mM por 3 horas, total 60 animais, n=3; CG, controle,
expostos à água de aquário por 3 horas, total 60 animais, n=3.
3.4.2. Extração de RNA e parâmetros de qualidade
O RNA total das amostras de todos os grupos foi extraído com o reagente TRIzolTM (ThermoFisher Scientific®), seguindo as recomendações do fabricante. Na
etapa de precipitação do RNA foi adicionada acrilamida linear (4 µL por amostra) para captura de pequenos RNAs, que incluem os miRNAs (127,128). A quantificação das amostras foi por meio do aparelho Epoch™ Ultraviolet Spectrophotometer (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). A integridade do RNA foi verificada pelo kit
Agilent RNA 6000 Nano no aparelho Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies,
Santa Clara, CA, USA).
As bibliotecas foram preparadas utilizando os kits TruSeq Stranded mRNA LT
Sample Prep Kit para os RNA mensageiros, e TruSeq Small RNA Sample Prep Kit para
os miRNAs (Illumina®, San Diego, CA, USA), seguindo as informações da fabricante e utilizando as mesmas amostras. O controle de qualidade das bibliotecas foi feito utilizando-se o kit High Sensitivity DNA no equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). O número de moléculas amplificáveis foi determinado por quantificação por qPCR, utilizando o KAPA SyBR® FAST Universal qPCR Kit (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA). As amostras passaram em todos os parâmetros de checagem.
Após normalização da concentração, as amostras foram sequenciadas pela plataforma Illumina® HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA, USA), localizada no Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida, da Unicamp (LaCTAD). Os perfis de expressão de miRNA e RNAm obtidos a partir do mesmo tecido e condição proporcionarão uma visão global da regulação de miRNAs baseados em dados funcionais, e não apenas em dados in silico, para cada uma das condições estudadas. A Figura 7 apresenta, de forma geral, as etapas realizadas para obtenção dos transcriptomas.
Figura 7. Fluxograma simplificado mostrando as etapas para obtenção dos transcriptomas de miRNA
(miRNA-seq) e RNA mensageiro (RNA-seq) através de sequenciamento de alto desempenho. Imagem por Míriam Celi de Souza Nunes (LabZeb).
3.5. Análises de bioinformática dos transcriptomas
3.5.1. miRNA-seq: sequenciamento de microRNA
As sequências brutas das leituras obtidas pelo sequenciamento dos microRNAs passaram por um controle de qualidade inicial no pacote Rqc (129), que consistiu na inspeção visual dos gráficos obtidos por esta ferramenta. Então, as sequências brutas das leituras foram recortadas e filtradas utilizando o software TrimGalore! versão 0.5.0 (130). Nesta etapa, foi detectado que uma das amostras do grupo AS apresentou resultados insatisfatórios e foi removida da análise final, sendo assim, esse grupo ficou com uma amostragem de n=2 (131). As sequências filtradas foram alinhadas no genoma de referência do zebrafish (UCSC danRer7) utilizando-se o alinhador Bowtie versão 1.2.2 (132), permitindo dois caracteres não correspondentes (mismatches) na sequência seed na extremidade 5’ do miRNA, visto que algumas das sequências em nossas amostras continham regiões não identificadas e dessa forma, potencializamos a identificação de uma maior número de alvos. A sequência seed é o que determina em qual RNAm-alvo o miRNA se ligará.
Em seguida, as leituras alinhadas foram agregadas e as características contadas pelo pacote featureCounts versão 1.6.2 (133) utilizando como dados de entrada as anotações de miRNAs de zebrafish presentes no banco de dados público miRBase versão 21 (134). A expressão diferencial entre os grupos SE-like vs. CG e SE-like vs. AS
(Figura 8) foi calculada pelo pacote DESeq2 versão 1.20.0 (135) ajustando o valor de p
para múltiplas comparações (p-ajustado) pelo método Benjamini-Hotchberg (BH), sendo considerados estatisticamente significativos os miRNAs com valor de p-ajustado ≤ 0,01.
Figura 8. Grupos comparativos feitos para análise da expressão diferencial nos transcriptomas de RNA
mensageiro e miRNA: SE-like vs. CG e SE-like vs. AS. Imagem por Míriam Celi de Souza Nunes (LabZeb).
3.5.2. RNA-seq: sequenciamento de RNA mensageiro
Os dados brutos do sequenciamento de RNAm foram encaminhados para o Laboratório de Biologia Computacional e Bioestatística da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP (BCBLab). As etapas do processamento dos dados foram as seguintes: em primeiro lugar, o controle de qualidade das leituras (reads) brutas foi realizado utilizando o pacote Rqc (129), seguido das etapas de purificação e recorte para remoção dos adaptadores e bases de baixa qualidade, utilizando o software TrimGalore! versão 0.5.0 (130). Nessa etapa, a mesma amostra do grupo AS repetiu os resultados insatisfatórios de qualidade no miRNA-seq e foi excluída da análise, ficando este grupo novamente com n=2. Em seguida, as leituras foram alinhadas com o genoma de referência do zebrafish (Ensembl Zv9) utilizando o STAR versão 2.5.3a (136). As leituras foram contadas quanto aos genes conhecidos (Ensembl Zv9) utilizando o HTSeq-Count versão 0.9.1 (137), etapa que no inglês é chamada de feature counts, contagem de características.
A expressão diferencial foi calculada pelo pacote DESeq2 versão 1.20.0 (135) para dois grupos comparativos: grupo 1) SE-like vs. CG, em que a expressão dos RNAm no grupo SE-like seria vista em comparação ao grupo controle; grupo 2) SE-like vs. AS,
em que a expressão dos RNAm no grupo SE-like seria vista em comparação ao grupo crise aguda (Figura 8). Para cada um dos dois grupos comparativos, a ferramenta reportou uma lista de genes diferencialmente expressos. Os valores de p foram ajustados (p-ajustado) para comparações múltiplas pelo método de Benjamini-Hochberg (BH) e considerados significantes quando p-ajustado foi ≤ 0,01. Um fluxograma resumindo as etapas da análise bioinformática do RNA-seq pode ser encontrado na Figura 9.
Figura 9. Fluxograma simplificado das etapas de Bioinformática para análise dos dados dos
sequenciamentos de RNAm e miRNA. Imagem por Míriam Celi de Souza Nunes (LabZeb) e Welliton Souza (BCBLab).
3.5.3. Integração dos dados do RNA-seq e miRNA-seq
Uma vez obtidos os dados de expressão diferencial dos transcriptomas, o próximo passo para a realização da integração foi pesquisar os genes-alvo dos miRNAs diferencialmente expressos. Para isso, foi utilizada a ferramenta de predição de alvos de miRNAs on-line gratuita Target Scan Fish (TSF), versão 6.2 (138,139). O TSF prediz quais possíveis RNAm-alvo possuem complementaridade de sua região 3’UTR (região 3’ não-traduzida, do inglês 3’ untranslated region) com a sequência seed (semente) 5’ do miRNA.
No site do banco de dados miRBase, versão 21 (134) (http://mirbase.org), encontram-se todos os miRNAs conhecidos, e cada um possui seu respectivo código de identificação, chamado ID (ex: o ID MIMAT0003347 é referente ao dre-miR-31). Para a integração foi gerada uma lista com os IDs dos miRNAs diferencialmente expressos nos dois grupos comparativos e os respectivos valores de expressão diferencial (Log2FoldChange, L2FC) e p-valor ajustado (p-ajustado). A identificação dos RNAm foi realizada de modo parecido, utilizando-se o ID fornecido pelo banco de dados Ensembl, versão 86 (140) (http://ensembl.org). Uma lista com os IDs dos genes diferencialmente expressos foi gerada com seus respectivos valores de L2FC e p-ajustado. Depois, foi gerada uma lista dos alvos de cada um dos miRNAs através do TSF. A Figura 10 traz um fluxograma simplificado do método da integração dos dados.
Figura 10. Integração dos dados do RNA-seq e miRNA-seq. miRNAs conhecidos são identificados pelo
seu respectivo ID, obtido pelo site do miRBase, e a identificação dos RNAm (genes) é feita pelo ID do Ensembl. Em seguida, gerou-se uma lista dos alvos de cada miRNA através do TargetScanFish. O valor de expressão diferencial (Log2FoldChange) é utilizado para garantir a seleção dos pares miRNA-RNAm com valores de expressão inversos. Por último, foi feito o cruzamento dos dados: para um dado miRNA, quais dos seus alvos preditos aparecem na lista do RNA-seq? E a partir disso, foi gerada uma lista final de potenciais genes de interesse. Imagem por Míriam Celi de Souza Nunes (LabZeb) e Welliton Souza (BCBLab).
3.5.4. Análise de vias de sinalização enriquecidas
As listas de genes diferencialmente expressos geradas tanto no RNA-seq quanto na integração dos dados do miRNA-RNAm foram analisadas separadamente quanto às vias de sinalização enriquecidas. Para tanto, utilizou-se o software MetaCore™ (versão 6.35; GeneGo) comparando com o banco de dados de homólogos humanos.
3.6. Validação dos transcriptomas por qPCR
Para realizar a validação dos resultados dos sequenciamentos foram utilizadas amostras independentes das utilizadas para os transcriptomas. Os novos animais, de mesma idade dos anteriores (7 dpf) foram submetidos às mesmas condições experimentais. Os três grupos, SE-like, AS e CG foram manipulados como descrito no item 3.4.1. Porém, nesta análise, cada grupo contou com n=5 amostras, sendo que cada amostra (n) foi composta por um pool de cinco cabeças de larvas. Com essa quantidade de material obteve-se RNA suficiente, e por isso decidiu-se reduzir o número de animais utilizados de 20 para 5 para compor um n=1. A extração do RNA, verificação dos padrões de qualidade e a obtenção do cDNA foram feitos como descrito no item 3.3.2.
Para a quantificação da expressão dos miRNAs (qPCR), foi feito um pedido personalizado dos assays TaqMan® para cada miRNA pela página da fabricante Thermo
Fisher Scientific® (Tabela 1). As placas foram preparadas com o LuminoCT® qPCR
ReadyMix™ (Sigma-Aldrich, MO, USA) seguindo as instruções do fabricante, em triplicatas técnicas, e utilizando como referência o U6 snRNA. As reações foram feitas no aparelho SDS 7500 Software (Applied Biosystems), e os resultados analisados através do método 2-ΔΔCt (126).
Para a validação dos RNAm foi escolhida a técnica SyBR Green®. Os primers
para amplificação de cada gene foram desenhados com o algoritmo do Primer3 v.4.1.0
(http://bioinfo.ut.ee/primer3/) e posteriormente foram testados quanto à especificidade no
Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), observando se os
primers desenhados poderiam amplificar outros genes da mesma espécie, o que poderia
causar resultados inespecíficos. Todos os primers passaram nos testes de qualidade, e estão listados na Tabela 2.
