Estudo da toxicidade induzida por metilglioxal em células sanguíneas humanas: efeito protetor do Syzigium cumini

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BIOQUÍMICA TOXICOLÓGICA. Alessandro de Souza Prestes. ESTUDO DA TOXICIDADE INDUZIDA POR METILGLIOXAL EM CÉLULAS SANGUÍNEAS HUMANAS: EFEITO PROTETOR DO Syzigium cumini. Santa Maria, RS 2017.

(2) Alessandro de Souza Prestes. ESTUDO DA TOXICIDADE INDUZIDA POR METILGLIOXAL EM CÉLULAS SANGUÍNEAS HUMANAS: EFEITO PROTETOR DO SYZIGIUM CUMINI. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Bioquímica Toxicológica da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Bioquímica Toxicológica. Orientadora: Drª. Nilda B. de Vargas Barbosa. Santa Maria, RS 2017.

(3) Ficha catalográfica elaborada através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Central da UFSM, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).. Prestes, Alessandro de S. ESTUDO DA TOXICIDADE INDUZIDA POR METILGLIOXAL EM CÉLULAS SANGUÍNEAS HUMANAS: EFEITO PROTETOR DO Syzigium cumini / Alessandro de S. Prestes.- 2017. 134 p.; 30 cm Orientadora: Nilda B. de V. Barbosa Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Maria, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica, RS, 2017 1. Células sanguíneas 2. Glicação 3. Metilglioxal 4. Syzygium cumini I. de V. Barbosa, Nilda B. II. Título..

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(5) “Os que se encantam com a prática sem a ciência são como os timoneiros que entram no navio sem timão nem bússola, nunca tendo certeza do seu destino” Leonardo da Vinci. “Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos”. Isaac Newton.

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(7) MEMORIAL DE TRAJETÓRIA ACADÊMICA 1. O INÍCIO Minha relação com a bioquímica começou um pouco antes da graduação, talvez ainda na oitava série do Ensino Fundamental, quando tive a matéria de Ciências com a professora Nilda B. de Vargas Barbosa no Colégio Estadual Tancredo Neves, no bairro Tancredo Neves, em Santa Maria, RS. Nesta escola pública, localizada na zona oeste de Santa Maria, estudei da sexta série do Ensino Fundamental ao terceiro ano do Ensino Médio. Mas qual relação isso tem com a bioquímica? Dois anos antes de prestar concurso vestibular, um fato importante tirou completamente minhas dúvidas sobre qual área eu gostaria de seguir e me especializar: fui selecionado para o curso de férias intitulado “O que Comemos e o que Bebemos”. O públicoalvo eram alunos de escolas públicas e de baixa renda de Santa Maria, e foi idealizado pelo Prof. Dr. João Batista Teixeira da Rocha. Isso aconteceu quando eu cursava o primeiro ano do Ensino Médio, sendo que foram selecionados os alunos com melhores notas de cada turma para participar do curso na Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). O segundo curso para o qual fui selecionado, logo nas férias seguintes, teve como tema “Contração Muscular”. Este curso serviu como base para o prof. João Batista selecionar alguns alunos para realizar um estágio em seu laboratório de pesquisa sob sua orientação. Sendo um dos selecionados, prontamente aceitei e a partir deste momento começou minha trajetória de Iniciação Científica dentro da bioquímica.. 2. INICIAÇÃO CIENTÍFICA (2004-2011) Sendo selecionado para realizar estágio num laboratório de bioquímica quando cursava o segundo ano do Ensino Médio, posso afirmar que minha iniciação científica (IC) começou antes mesmo do curso de Graduação. Durante seis meses tive oportunidade de conviver com os alunos ICs, mestrandos e doutorandos do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica da UFSM. Meus primeiros ensinamentos práticos foram dados pelo, na época doutorando, Juliano Perottoni, atual Professor Adjunto da UFSM/Cesnors em Palmeira das Missões, RS. As técnicas aprendidas ali me acompanharam durante toda a Iniciação Científica realizada durante o curso de Graduação (de 2006 a 2011) sob orientação do prof. Dr. João Batista Teixeira da Rocha, no qual fui bolsista CNPq. Durante este período, sempre fui exigido quanto ao domínio da língua inglesa para leitura e apresentação de artigos científicos por meio de seminários semanais em inglês, o que perdurou até o fim da pós-graduação..

(8) Durante o estágio de IC na graduação, participei de diferentes projetos, os quais envolveram o estudo dos possíveis efeitos benéficos de extratos de plantas medicinais e novos compostos orgânicos de selênio. Nestes trabalhos, tive oportunidade de aprender e aperfeiçoar técnicas in vitro e in vivo visando alcançar alternativas viáveis para o tratamento de diferentes patologias humanas utilizando modelos animais e alternativos. Os projetos de pesquisa dos quais fui participante neste período sob orientação do professor João Batista foram: “Efeito do resveratrol sobre a discinesia orofacial aguda e crônica induzida por flufenazina em ratos”, “Papel do transportador de dopamina na discinesia orofacial induzida por neurolépticos em ratos” e “Farmacologia e Toxicologia de Organocalcogênios”, do qual fui bolsista CNPq pelo Edital-012007 – IC. Sendo integrante destes projetos, tive a oportunidade de colaborar na coautoria de alguns artigos publicados nas revistas “Neurochemical Research” em 2009, “Molecules” e “Pathology, Research and Practice” em 2010, e “Journal of Neural Transmission”, em 2011. Além disso, neste período tive a oportunidade de participar e publicar vários resumos em anais de congressos regionais e nacionais, os quais certamente enriqueceram muito meus conhecimentos e renovaram minha vontade de seguir a carreira na área acadêmicocientífica.. 4. O MESTRADO (2011-2013) No ano de 2011, pouco antes do término do curso de graduação, prestei seleção para dois programas de pós-graduação diferentes: o Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da UNIPAMPA, e o Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Toxicológica (PPGBTox) da UFSM, respectivamente. Fui aprovado em ambos e estava empolgado com a possibilidade de desenvolver um novo projeto num lugar diferente, representado pela UNIPAMPA, em Uruguaiana. Porém, um fato me levou a decidir por realizar matrícula na UFSM: o convite da Profa. Dra. Nilda B. de Vargas Barbosa para ser minha orientadora. A mesma professora que havia aberto as portas da bioquímica para mim no Ensino Médio através dos Cursos de Férias agora se tornaria minha orientadora na Pós-Graduação. Assim, sob orientação da Profa. Nilda, continuei desenvolvendo meu projeto iniciado no último semestre de faculdade, com o Prof. João Batista. Neste projeto fiz a comparação do efeito antioxidante de β-selenoaminas - compostos orgânicos de selênio contendo grupos amina na posição beta de suas estruturas - e suas capacidades de mimetizar diferentes enzimas in vitro. Este trabalho gerou um artigo publicado na revista “Molecular and Cellular Biochemistry”, no ano de 2012. Neste período ainda tive a oportunidade de auxiliar alunos de iniciação científica,.

(9) desenvolver técnicas laboratoriais, padronizar técnicas, apresentar trabalhos em congressos e realizar estágio de docência orientada, onde ministrei aulas de bioquímica para o curso de Enfermagem e Engenharia Florestal, além de outras atividades de grande importância para quem almeja trabalhar com ensino e pesquisa. Ao colaborar com outros colegas da Pós-Graduação, tive oportunidade de publicar mais alguns artigos como coautor. Estes artigos foram publicados na “Molecular and Cellular Biochemistry”, na “Acta Pharmaceutica” e na “Pharmacology, Biochemistry and Behavior”, todos no ano de 2012. Nestes trabalhos aprendi muito sobre a toxicologia, especialmente estudando o composto ditelureto de difenila utilizando ratos como modelo experimental. Pude também auxiliar num trabalho que objetivou estudar a atividade antioxidante in vitro do extrato de uma planta. Já no último trabalho, verificamos e avaliamos o possível efeito farmacológico do resveratrol - polifenol encontrado em grandes concentrações nas sementes da uva - contra o principal efeito colateral causado pelo uso prolongado de flufenazina: os movimentos de mascar vazio (VCM). Neste estudo, foram utilizados ratos Wistar machos e foram avaliados principalmente os VCM, bem como alguns testes bioquímicos. Estes trabalhos aumentaram minha vontade de conhecer novos modelos experimentais e novos testes avaliativos da toxicologia e/ou farmacologia de diferentes sintéticos ou naturais. Assim, segui auxiliando e colaborando com colegas da pós-graduação e comecei a desenvolver o projeto que, posteriormente, tornou-se minha Tese de Doutorado. Este projeto envolve a toxicologia do composto dicarbonila metilglioxal sobre células sanguíneas humanas, bem como o efeito protetor do extrato aquoso das folhas de Syzygium cumini, uma planta amplamente utilizada na medicina popular no combate ao diabetes. Deste projeto, alguns trabalhos foram publicados em congressos científicos nacionais e artigos já estão em fase final de redação.. 5. O DOUTORADO (2013-2017) Pouco antes de defender minha dissertação de mestrado prestei seleção para o Doutorado em Bioquímica Toxicológica do PPGBTox da UFSM. Logo, fui aprovado sob orientação da Profa. Dra. Nilda B. de Vargas Barbosa novamente. Neste período, segui o projeto iniciado no mestrado e continuei auxiliando colegas da pós-graduação, o que gerou trabalhos publicados em anais de congressos internacionais e alguns artigos científicos. Também segui ministrando aulas de bioquímica para o curso de Enfermagem da UFSM em alguns semestres. Além disso, organizei e colaborei com alguns projetos de extensão que objetivaram levar o conhecimento acerca do método científico para alunos do Ensino Fundamental e Médio de diferentes escolas em diferentes cidades do estado do Rio Grande do Sul..

(10) Seguindo a característica de buscar constantemente novas técnicas utilizando diferentes modelos experimentais, colaborei de diversas formas com meus colegas de laboratório. Tive a oportunidade de ser coautor de um trabalho envolvendo a toxicologia de um composto orgânico de telúrio no desenvolvimento embrionário de galinhas. Entretanto, aproveitando minha experiência prévia, segui auxiliando na publicação de alguns artigos utilizando ratos, produtos naturais e compostos organocalcogênicos. Os artigos desse período foram publicados na “Toxicology in vitro”, no ano de 2013, na “Toxicology Mechanisms and Methods”, nos anos de 2013 e 2014, na “EXCLI Journal”, no ano de 2015, e na “Journal of Ethnopharmacology”, no ano de 2017. Atualmente, venho finalizando minhas pesquisas acerca da toxicologia do metilglioxal sobre células sanguíneas humanas. Um artigo dissertando acerca da citotoxicidade, foi publicado na revista “Toxicology Mechanisms and Methods”. Outros dois artigos estão em fase final de redação: um envolvendo os processos oxidativos, de necrose e/ou apoptose e a alteração da expressão de genes relacionados a estas vias de morte celular induzida pelo metilglioxal a leucócitos humanos; e outro artigo mostrando os efeitos benéficos do extrato aquoso das folhas de S. cumini contra os danos induzidos por metilglioxal..

(11) RESUMO ESTUDO DA TOXICIDADE INDUZIDA POR METILGLIOXAL EM CÉLULAS SANGUÍNEAS HUMANAS: EFEITO PROTETOR DO SYZIGIUM CUMINI AUTOR: Alessandro de Souza Prestes ORIENTADORA: Nilda B. de Vargas Barbosa O metilglioxal (MG) é um composto α-oxoaldeído formado principalmente como subproduto da glicólise. Por ser altamente glicante é considerado o principal precursor dos produtos finais de glicação avançada (AGES). Apesar de a metabolização fisiológica ocorrer por diferentes vias, níveis elevados de MG podem ser encontrados em indivíduos com diabetes mellitus e outras patologias como doença de Alzheimer e câncer. Vários trabalhos voltados para a toxicologia do MG mostram que a glicação e o estresse oxidativo são fenômenos envolvidos nos seus efeitos deletérios. No entanto, dados sobre os efeitos tóxicos e alvos moleculares específicos do composto nos diferentes órgãos/tecidos ainda são escassos na literatura. O presente estudo objetivou analisar os efeitos citotóxicos induzidos pelo MG em células sanguíneas humanas, bem como verificar o possível efeito protetor de um agente etnofarmacológico utilizado no tratamento de diferentes patologias, especialmente diabetes mellitus: o extrato aquoso das folhas de Syzygium cumini (Ext). Eritrócitos, leucócitos e plaquetas foram incubados com diferentes concentrações de MG por períodos de tempo que variaram de acordo com o ensaio e tipo celular. Em eritrócitos a exposição ao MG culminou com hemólise, aumento da fragilidade osmótica e diminuição dos níveis de grupos amino (NH3+) livres. Em leucócitos, o composto causou danos ao DNA, aumento dos níveis de produtos glicados fluorescentes e diminuição da viabilidade celular (especialmente dos agranulócitos). Uma diminuição da atividade das enzimas ectonucleotidases, nucleotidases e adenosina desaminase foram observadas nas plaquetas expostas ao MG. O tratamento com o Ext preveniu a maioria dos danos induzidos pelo MG, especialmente os efeitos hemolíticos e genotóxicos. Em um outro conjunto de experimentos realizado com leucócitos, observou-se que a exposição ao MG aumentou os níveis de espécies reativas, aumentou o tamanho e a granulosidade das células e também induziu apoptose/necrose. Em termos de alvos moleculares, esses eventos foram acompanhados por alterações na expressão dos genes responsivos a apoptose (AIF, BAD, BCl-2), ao status redox (enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa-S-transferase e fator de transcrição Nrf2). Um aumento na expressão do receptor de AGES (RAGE) e da enzima glioxalase-1 também foi verificado nestas células. O conjunto de resultados obtidos neste estudo ajudam a compreender mais precisamente os efeitos que o MG pode causar nas células sanguíneas bem como indicam a planta S. cumini como um agente promissor para estudos farmacológicos que visem prevenir/reduzir os efeitos tóxicos do MG. Palavras-chave: Células Sanguíneas. Glicação. Metilglioxal. Syzygium cumini..

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(13) ABSTRACT. STUDY OF THE TOXICITY INDUCED BY METHYLGLYOXAL TO HUMAN BLOOD CELL: PROTECTIVE EFFECT OF Syzigum cumini. AUTHOR: Alessandro de Souza Prestes ADVISOR: Nilda B. de Vargas Barbosa Methylglyoxal (MG) is a α-oxoaldehyde compound formed mainly as co-product from glycolysis. Due its high glicative capacity, it is considered the major precursor of advanced glycation end-products (AGEs). Although the compound is metabolized by different ways, high levels of MG are found in subjects with diabetes melittus, Alzheimer’s disease and cancer. Several works show that the toxicology of MG is related with glycative and oxidative stress. However, data about the precise toxic effects and mechanisms are still scarce in literature. The present study aimed analyze the cytotoxic effects induced by MG in the human blood cells, as well as to verify the possible preventive effect of an ethnopharmacological agent used in the treatment of different pathologies, especially diabetes mellitus: the aqueous leaves extract of Syzygium cumini (Ext). Erythrocytes, leukocytes and platelets were exposed to different concentrations of MG and time exposure. In Erythrocytes, the exposure to MG culminated with hemolysis, increase in osmotic fragility and decrease of the levels of free amino (NH3+) groups. In leucocytes, the compound induced DNA damage, increase in the levels of fluorescent glycated products and decrease in the cell viability (especially of agranulocytes). A significant decrease in the activity of ectonucleotidases, nucleotidases and adenosine deaminase enzymes was verified in the platelets exposed to MG. The Ext treatment prevented most of detrimental effects elicited by MG toward blood cells, especially the hemolytic and genotoxic effects. In another set of experiments performed with leucocytes, the exposure to MG increased the levels of oxygen reactive species, the size and granularity of cells and induced apotosis/necrosis. These events were accompanied by changes in the mRNA expression of genes responsive to apoptosis (AIF, BAD, BCl-2), redox status (enzymes superoxide dismutase, catalase, glutathione-S-transferase and transcript factor Nrf2). An increase in the expression of AGEs receptor (RAGE) and glyoxalase 1 enzyme was also verified in these cells. The set of results obtained in this study will contribute to understand more accurately the effects that MG can cause on blood cells as well as indicate the plant S. cumini as a promising pharmacological agent against the toxic effects of MG. Keywords: Blood Cells. Glycation. Methylglyoxal. Syzygium cumini..

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(15) LISTA DE FIGURAS. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. Figura 1 - Estrutura química do metilglioxal ..........................................................................22 Figura 2 - Rotas de formação e metabolização do metilglioxal ..............................................23 Figura 3 - Formação mitocondrial de radicais livres ...............................................................26 Figura 4 - Integração dos sistemas antioxidantes enzimáticos.................................................27. ARTIGO 1 Figura 1 – Hemolytic effect of MG in human erythrocytes ………………………....……... 49 Figura 2 – Effect of MG on osmotic fragility in erythrocytes ………………................….... 49 Figura 3 – Effect of MG on free NH3+ content from erythrocytes ………….……....……... 49 Figura 4 – Effect of MG on viability from leukocytes …………………………….....…...... 50 Figura 5 – Representative pictures of leukocytes treated with MG ………………..…......... 51 Figura 6 – Effect of MG on DNA-double strand integrity in human leukocytes ……..…..... 51 Figura 7 – Levels of fluorescent glycated products in human leukocytes treated with MG....51 Figura 8 – Activity of ectonucleotidase enzymes of platelets treated with MG ……………. 52. MANUSCRITO (1) Figura 1 – ROS levels in leukocytes exposed to MG ………………………..…….……….. 77 Figura 2 – Size and lumpiness of leukocytes exposed to MG ………………..……….……. 78 Figura 3 – Morphology of leukocytes exposed to MG ………………………..…….……… 79 Figura 4 – Percentage of viable and apoptotic/necrotic cells after MG exposure ……...…... 80 Figura 5 – Correlations among ROS production, morphological changes and cell death in leukocytes exposed to MG ………………………………………….………………………. 81 Figura 6 – Relative transcript levels of antioxidant responsive genes in leukocytes exposed to MG ………………………………………………………………………………….………. 82 Figura 7 – Relative transcript levels of apoptotic and MG signaling responsive genes in leukocytes exposed to MG …………………………………………………………….……. 83.

(16) MANUSCRITO (2). Figura 1 - Representative high-performance liquid chromatography profile of S. cumini .. 104 Figura 2 - Effect of S. cumini extract on the hemolysis induced by MG ……………….… 105 Figura 3 - Effect of S. cumini extract on the cell death induced by MG ……….…………. 106 Figura 4 - Effect of S. cumini extract on comet assay in leukocytes exposed to MG …….. 107 Figura 5 - Effect of S. cumini extract on the activity of ectonucleotidases enzymes from platelets exposed to MG …………………………………………………………………... 108. DISCUSSÃO. Esquema 1 - Resumos dos resultados significativos apresentados nesta tese .....................118.

(17) LISTA DE TABELAS. MANUSCRITO (1). Tabela 1 - Sequencies of qPCR primers ................................................................................. 76. MANUSCRITO (2) Tabela 1 - MG and S. cumini effects on the osmotic fragility in human erythrocytes ……. 109 Tabela 2 - MG and S. cumini effects on the cell viability in human leukocytes …….……. 110 Tabela 3 - MG and S. cumini effects in comet assay ……………….….…………...…....... 111.

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(19) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. ADA ADP AIFM2 ALDH Amg AMP AP ATP AGES ANOVA AR BSA CaCl2 CAPES CASP CAT CEL CEP UFSM CNPq Cu CuZn-SOD DCFH-DA DI DM DNA DHAP DHR eEDTA Endo G Ext FAPERGS Fe Fig. F1,6DP GLO GLUT GPx GSH GSR GSSG G3P H+ HBSS HEPES HepG2 H2O. Adenosina desaminase Adenosina difosfato Fator indutor de apoptose 2 associado à mitocôndria Aldeído desidrogenase Aminoguanidina Adenosina monofosfato Argipirimidina Adenosina trifosfato Produtos finais de glicação avançada Análise de variância Aldeído redutase Albumina sérica bovina Cloreto de cálcio Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Caspase Catalase Nε-(1-carboxietil)-lisina Conselho de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Santa Maria Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Cobre Superóxido dismutase 1 (cobre/zinco superóxido dismutase) 2’7’-diclorofluoresceína diacetato Índice de dano Diabetes mellitus Ácido desoxirribonucleico Fosfato de di-hidroxiacetona Dihidrorodamina-123 Elétrons Ácido etilenodiaminotetracético Endonuclease G Extrato aquoso das folhas da planta Syzygium cumini Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul Ferro Figura Frutose-1,6-difosfato Glioxalase Transportadores de glicose por difusão facilitada Glutationa peroxidase Glutationa reduzida Glutationa-S-redutase Glutationa oxidada Gliceraldeído-3-fosfato Hidrogênio molecular Solução salina balanceada de Hank Ácido-4-(2-hydroxietil)-piperazina-1-etanosulfônico Linhagem celular derivada de hepatócitos humanos Água.

(20) H2O2 IUPAC KCl KH2PO4 LDH MG MG-Hs MgCl2 Mn-SOD MODIC MOLD MPO mRNA NaCl NADP+ NADPH NaHCO3 Na2HPO4 Na+/K+ ATPase NH4Cl NO NF-κB Nrf2 NTPDase O2 O2•OH OH•ONOO PBS pH PI Pi RAGES RNA ROS RS SDS SGLT SOD SSAO TCA TFK THP TNBS Tris. Peróxido de hidrogênio União Internacional de Química Pura e Aplicada Cloreto de potássio Fosfato de potássio monobásico Lactato desidrogenase Metilglioxal Hidroimidazolonas derivadas do metilglioxal Cloreto de magnésio Superóxido dismutase 2 (Manganês superóxido dismutase) Produto da condensação cruzada entre lisina-arginina e metilglioxal Dímero de lisina derivado do metilglioxal Mieloperoxidase RNA mensageiro Cloreto de sódio Fosfato de dinucleotídeo de adenina e nicotinamida oxidado Fosfato de dinucleotídeo de adenina e nicotinamida reduzido Bicarbonato de sódio Fosfato de sódio dibásico Bomba sódio-potássio Cloreto de amônio Óxido nítrico Fator nuclear kappa B Fator nuclear eritróide 2 - relativo ao fator 2 Nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase Oxigênio Radical superóxido Grupo hidroxila Radical hidroxila Peroxinitrito Tampão fosfato-salino Potencial hidrogeniônico Iodeto de propídio Fosfato inorgânico Receptores para produtos finais de glicação avançada Ácido ribonucléico Espécies reativas de oxigênio Espécies reativas Dodecil sulfato de sódio Transportadores de glicose com co-transporte do íon sódio Superóxido dismutase aminoxidase sensível à semicarbazida (SSAO) Ácido tricloroacético Tampão fosfato de potássio Tetraidropirimidinas Ácido 2,4,6-trinitrobenzenosulfônico Tris aminometano.

(21) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 18 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 22 2.1 O METILGLIOXAL .............................................................................................. 22 2.2 METABOLISMO DO METILGLIOXAL ............................................................. 23 2.3 TOXICOLOGIA DO METILGLIOXAL: GLICAÇÃO, AGES E RAGES .......... 24 2.4 METILGLIOXAL x ESTRESSE OXIDATIVO .................................................... 25 2.5 METILGLIOXAL x DOENÇAS CRÔNICAS ...................................................... 28 2.6 METILGLIOXAL x MORTE CELULAR (NECROSE/APOPTOSE) .................. 30 2.7. CÉLULAS. SANGUÍNEAS:. FUNÇÕES. BIOLÓGICAS. E. MODELO. EXPERIMENTAL ........................................................................................................ 32 2.8. Syzygium. cumini. COMO. AGENTE. ANTIGLICANTE,. ANTI-. HIPERGLICÊMICO E ANTIOXIDANTE .................................................................. 35 3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 38 4. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 40 4.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................... 40 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 40 5. ARTIGOS CIENTÍFICOS ................................................................................................ 42 5.1 ARTIGO ................................................................................................................. 44 5.2 MANUSCRITO (1) ................................................................................................ 56 5.3 MANUSCRITO (2) ................................................................................................ 84 6. DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 112 7. CONCLUSÕES................................................................................................................. 120 8. PERSPECTIVAS .............................................................................................................. 122 9. REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 124.

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(23) APRESENTAÇÃO. Esta tese está dividida em alguns itens. No item INTRODUÇÃO é apresentado um referencial teórico sucinto sobre os temas abordados na tese. No item REVISÃO BIBLIOGRÁFICA é apresentada uma revisão da literatura sobre os temas abordados e relacionados à tese. Após, são apresentados uma JUSTIFICATIVA para a realização desta pesquisa bem como os OBJETIVOS, tanto gerais quanto específicos da mesma. A metodologia utilizada e os resultados obtidos estão expostos na forma de artigo científico e manuscritos, os quais se encontram no item ARTIGOS CIENTÍFICOS. Tanto o artigo quanto os manuscritos estão subdivididos nas seções Introdução, Materiais e Métodos, Resultados, Discussão e Referências Bibliográficas. Os itens DISCUSSÃO e CONCLUSÃO, situados na parte final da tese, apresentam interpretações e comentários gerais sobre o artigo e os manuscritos contidos neste trabalho. As REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS se referem somente às citações que aparecem nos itens INTRODUÇÃO, REVISÃO BIBLIOGRÁFICA, DISCUSSÃO e CONCLUSÃO, pois as demais referências bibliográficas estão presentes tanto no artigo quanto nos manuscritos..

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(25) 18. 1. INTRODUÇÃO O metilglioxal (MG) é um composto α-oxoaldeído reativo que além de ser produto do metabolismo animal, é encontrado em alimentos como o café ou bebidas alcoólicas (KALAPOS, 2013). Fisiologicamente pode ser formado por diferentes vias, dentre as quais se destaca a produção a partir da degradação não-enzimática dos intermediários glicolíticos gliceraldeído-3-fosfato e fosfato de diidroxiacetona. Apesar de ser eficientemente metabolizado pelo sistema glioxalase (formado pelas enzimas glioxalase I e glioxalase II), o MG é encontrado em altas concentrações no plasma de indivíduos com hiperglicemia. Além do Diabetes mellitus, os efeitos citotóxicos do MG estão associados com várias doenças crônicas e sistêmicas, incluindo a aterosclerose, o câncer e as doenças neurodegenerativas (MA et al., 2017; RODRIGUES et al., 2017; MÜNCH et al., 2003). Nas condições em que os níveis sanguíneos de MG estão elevados, diversas proteínas podem ser modificadas por glicação. Entende-se por glicação o processo de reação não-enzimática entre o grupo aldeído de compostos carbonílicos, como açúcares redutores, aldeídos e cetonas, com os grupos amino de proteínas, lipídios e ácidos nucléicos adjacentes (CHO et al., 2007), que pode dar origem aos produtos finais de glicação avançada (AGES) (BROWNLEE, 2000; BOURAJJAJ et al., 2003). Os AGES podem agir tanto dentro como fora das células. Como consequência, há alteração das funções proteicas e consequente desregulação do metabolismo celular (KASPER e FUNK, 2001). A nível intracelular, exemplos de componentes modificados pelos AGES são o DNA, enzimas antioxidantes e muitas proteínas citoplasmáticas e de membrana. Fora das células, agem inibindo o crescimento e causando prejuízo no processo de diferenciação celular, bem como na adesão de células ou destas a proteínas extracelulares (PAUL e BAILEY, 1999). Os AGES podem interagir com receptores celulares específicos, denominados receptores de AGES ou RAGES. A interação AGES-RAGE pode ativar cascatas de reações que dão início a respostas proinflamatórias, oxidativas e morte celular (RAMASAMY et al., 2005). Apesar da ativação de RAGES estar envolvida nesses processos, estudos sugerem que outros subtipos de receptores para AGES estão envolvidos em eventos fisiológicos importantes, como no processo de diferenciação celular (KIM et al., 2012). A maioria dos estudos sobre a toxicidade do MG destaca suas propriedades glicantes. No entanto, sabe-se que tanto a formação quanto a decomposição do MG estão relacionados com a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) (DESAI et al., 2010; KALAPOS, 2008), como peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical superóxido (O2•-) (KALAPOS, 2008; DUTRA.

(26) 19. et al., 2001). Assim, como defesa destaca-se o sistema antioxidante composto por enzimas, como a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa S-redutase (GSR), entre outras, bem como os antioxidantes não enzimáticos, cujo principal representante é a glutationa reduzida (GSH). O aumento exacerbado na produção de ROS ou distúrbios na ação dos sistemas antioxidantes são condições que causam um desequilíbrio fisiológico caracterizado pelo estresse oxidativo (GRIFFITHS et al., 2002; REUTER et al., 2010). Além dos danos oxidativos, as ações do MG como indutor de morte celular tanto por apoptose quanto por necrose vem sendo cada vez mais explorada. Em vários trabalhos in vitro utilizando cultura de células, o MG é descrito como um composto pró-apoptótico por diminuir os níveis de proteínas antiapoptóticas e aumentar a expressão de proteínas pró-apoptóticas (LV et al., 2014; LV et al., 2014; ALBERTS, 2010). Os três principais sistemas relacionados com o processo apoptótico são os sistemas iniciados com a ativação dos receptores dos fatores de necrose tumoral (rTNR), o sistema das caspases, e o sistema Bcl-2/Bcl-XL (ALBERTS, 2010). Apesar da maioria dos estudos apontar as possíveis consequências indesejadas provenientes do seu potencial pró-apóptótico, o MG também vem sendo considerado indutor de necrose programada, e por isso já foi citado como possível agente no combate a células tumorais (FAN et al., 2003). No processo de necrose programada estão envolvidos tanto o sistema Bcl-2/BclXL quanto os fatores AIF e a endonuclease G (endo G), que também estão relacionados ao processo de apoptose (FUJIKAWA, 2015). Neste sentido, o conhecimento da ação do MG sobre a expressão gênica de proteínas relacionadas aos processos de morte celular programada apoptose e necrose são importantes para o entendimento dos mecanismos toxicológicos do composto em diferentes tipos de células (LV et al., 2014). Uma série de compostos são investigados com o objetivo de neutralizar os danos causados pelo metilglioxal via geração de AGES, incluindo a aminoguanidina (Amg) (KLAASSEN et al., 2013). Este composto age prevenindo a ligação do MG aos grupos amino livres dos aminoácidos e das proteínas (THEODORE et al., 1994). Contudo, a Amg foi descrita como sendo indutora da formação de peróxido de hidrogênio in vitro (CHEN et al, 2003; OU e WOLFF, 1993). Neste cenário, vêm ganhando destaque a busca por agentes terapêuticos naturais que possam prevenir os danos causados por oxoaldeídos, principalmente plantas utilizadas popularmente no tratamento do diabetes mellitus (SABU, SMITHA e KUTTAN, 2002). No sul do Brasil e da Ásia, a planta Syzygium cumini (L.) Skeels (Sc), da família Mirtácea e conhecida popularmente por jambolão, é amplamente utilizada na medicina popular como.

(27) 20. antidiabetogênica (AYYANAR e SUBASH-BABU, 2012). Etnofarmacologicamente, as pessoas dessas regiões utilizam bastante as folhas da planta na forma de infusão ou decocção (TEIXEIRA e FUCHS, 2006). As células sanguíneas humanas vêm sendo amplamente utilizadas como sistema complementar para investigação de mecanismos toxicológicos/farmacológicos de diferentes compostos. A integridade dos eritrócitos, que pode ser determinada por mudanças na fragilidade osmótica, tem sido aplicada para estudar a toxicidade de agentes naturais e sintéticos sobre a membrana plasmática (DOS SANTOS et al., 2009). Quando há hemólise, ou seja, rompimento da membrana plasmática das hemácias, há aumento na liberação de hemoglobina, que possui coloração vermelha e pode ser detectada espectrofotometricamente (DOS SANTOS et al., 2009). A avaliação dos danos em DNA de leucócitos pode ser utilizada como um modelo simples in vitro para a triagem de agentes potencialmente genotóxicos (HAUSER et al., 2008). As plaquetas, que são células sanguíneas anucleadas com funções singulares, são especialmente afetadas por alterações na atividade de determinadas enzimas, como a família das ectonucleotidases (ZANINI et al., 2012). De forma geral, o presente estudo visa investigar os mecanismos envolvidos na citotoxicidade mediada por MG, usando eritrócitos, leucócitos e plaquetas como células-alvo, bem como o efeito protetor do extrato aquoso da planta S. cumini contra os danos induzidos pelo composto a estas células..

(28) 21.

(29) 22. 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. 2.1 O METILGLIOXAL. O metilglioxal (MG), também chamado de piruvaldeído, acetilformaldeído ou 2oxopropanal (IUPAC), é um composto orgânico de fórmula CH3C(O)CHO e massa molar de 72,06266 g/mol. Possui em sua estrutura química dois grupos carbonila, um grupo cetona e um aldeído, figurando como um composto -oxoaldeído dicarbonila (Figura 1). Este composto dicarbonila é formado principalmente como subproduto da glicólise; ou seja, pela degradação não-enzimática de moléculas de gliceraldeído-3-fosfato e de dihidroxicetona fosfato. Outras fontes secundárias para a formação fisiológica do MG são a autoxidação de moléculas de glicose, o processo de peroxidação lipídica, a degradação de proteínas glicadas, o catabolismo da acetona catalisado pelo citocromo P450 e o catabolismo do aminoácido treonina (Figura 2, adaptada de MAESSEN et al., 2015). Apesar de ser metabolizado fisiologicamente, o MG é encontrado em altas concentrações no plasma de pacientes com diversas patologias incluindo diabetes mellitus e câncer, entre outros (ALEKSANDROVSKI, 2002). Além de possuir toxicidade per se, o MG é o maior precursor dos produtos finais de glicação avançada (AGES), também relacionados com danos teciduais observados em patologias crônicas sistêmicas ou pontuais (BROWNLEE, 2000; BOURAJJAJ et al., 2003).. Figura 1 - Estrutura química do metilglioxal. Fonte: Adaptação de “Methylglyoxal”. In: WIKIPÉDIA: a enciclopédia livre..

(30) 23. 2.2 METABOLISMO DO METILGLIOXAL. A metabolização do MG endógeno ou exógeno pode ocorrer por diferentes vias, incluindo catabolismo enzimático, gerando produtos como piruvato, lactato e hidroxiacetona (Figura 2) (KALAPOS, 2013; MAESSEN et al., 2015). O piruvato é formado quando o composto é metabolizado pela enzima aldeído desidrogenase, enquanto a hidroxiacetona é proveniente da reação catalisada pela enzima aldose redutase (MAESSEN et al., 2015). Entretanto, a maior fonte de metabolização do MG é o sistema glioxalase. Formado pelas enzimas glioxalase-1 (GLO-1) e glioxalase-2 (GLO-2), este sistema ubíquo converte moléculas de MG à ácido láctico em reações dependentes de glutationa reduzida (GSH). Nestas reações, o composto oxoaldeído é convertido primeiramente em S-D-lactoilglutationa pela enzima GLO-1, que utiliza uma molécula de glutationa reduzida (GSH) (MAESSEN et al., 2015). Após, a enzima GLO-2 catalisa a conversão da S-D-lactoilglutationa a ácido láctico, numa reação que regenera a GSH utilizada anteriormente naquela reação catalisada pela GLO-1 (Figura 2).. Figura 2 - Rotas de formação e metabolização do metilglioxal. Legenda: ALDH: aldeído desidrogenase; AP: argipirimidina; AR: aldeído redutase; CEL: Nε-(1-carboxietil)-lisina; DHAP: fosfato de di-hidroxiacetona; G3P: gliceraldeído-3-fosfato; GLO1: glioxalase 1; GLO2: glioxalase 2; GSH: glutationa reduzida; MG-H: hidroimidazolonas derivada do metilglioxal; MODIC: Produto da condensação cruzada entre lisinaarginina e metilglioxal; MOLD: dímero de lisina derivado do metilglioxal; THP: tetraidropirimidina. Fonte: Adaptação de Maessen et al. (2015).

(31) 24. 2.3 TOXICOLOGIA DO METILGLIOXAL: GLICAÇÃO, AGES E RAGES. Nas condições em que há exacerbação dos níveis sanguíneos ou intracelulares de MG, diversas proteínas podem ser modificadas por glicação (BROWNLEE, 2001). Glicação é caracterizada como a reação não-enzimática entre o grupo aldeído de compostos carbonílicos, como açúcares redutores, aldeídos e cetonas, com os grupos amino de proteínas, lipídios e ácidos nucléicos adjacentes (CHO et al., 2007). Ao contrário de outros açúcares (como a glicose, o gliceraldeído e frutose), moléculas que têm uma segunda carbonila nas posições - ou -β, como o MG, possuem reatividade maior, podendo modificar macromoléculas espontaneamente (MAESSEN et al., 2015). Neste contexto, o MG é considerado um dos maiores agentes glicantes fisiológicos conhecidos, sendo aproximadamente 20.000 vezes mais reativo do que a glicose (MAESSEN et al., 2015). Os principais locais de glicação mediada pelo MG são as cadeias laterais lisil e os grupos amino N-terminais de proteínas. Outros locais importantes de glicação mediados pelo MG são as bases guanina dos nucleotídeos e os grupos amino da fosfatidilserina (SCHMITT et al., 2005). Apesar de apresentar alta reatividade e causar dano per se em macromoléculas, partes dos danos atribuídos ao MG são decorrentes da formação dos produtos finais de glicação avançada (AGES) (BROWNLEE, 2000; BOURAJJAJ et al., 2003). A partir do MG e de outros compostos glicantes, os AGES podem ser formados tanto no meio extra como intracelular. Fora das células são descritos como responsáveis pela inibição do crescimento e da diferenciação celular e por causar prejuízos na função e na adesão de proteínas extracelulares (PAUL e BAILEY, 1999). A nível intracelular, alguns exemplos de alvos modificados no processo de formação dos AGES são a hemoglobina, o DNA, enzimas antioxidantes e muitas proteínas de membrana (KASPER e FUNK, 2001, LIN et al., 2016). Assim, a glicação exacerbada de proteínas intracelulares e extracelulares pode culminar com um desequilíbrio tanto celular quanto sistêmico (KASPER e FUNK, 2001). Como previamente descrito, na formação dos AGES, o MG reage primariamente com os resíduos de arginina das proteínas formando as hidroimidazolonas derivadas do MG (MGHs, Figura 2). Estas podem apresentar-se sob três isoformas estruturais: MG-H1, MG-H2 e MG-H3. MG-H1 é o principal AGES derivado do MG, correspondendo a mais de 90% de todos os aductos formados com o MG (RABBANI e THORNALLEY, 2012). Adicionalmente, o MG pode reagir irreversivelmente com resíduos de lisina, para formar a Nε-(1-carboxietil)-lisina (CEL) e o dímero de lisina 1,3-di(Nε-lisino)-4-metil-imidazol (MOLD) (Figura 2). O MG também pode fazer um dímero de condensação cruzada entre resíduos de arginina e lisina para.

(32) 25. formar o 2-amônio-6-{(2-[(4-amônio-5-óxido-5-oxopentil)amino]-4-metil-4,5-dihidro-1Himidazol-5-ilideno)amino}hexanoato (MODIC) (SCHNEIDER et al., 2004; Figura 2). Já foram identificados em grande parte das células humanas receptores específicos para os AGES, também chamados de RAGES. Os RAGES são membros da superfamília das imunoglobulinas (NEEPER et al., 1992). Esses receptores são capazes de reconhecer, além dos AGES, as proteínas anfoterina, calgranulina e os peptídeos beta-amiloides (PIRAS et al., 2016). Quando estimulados, induzem um mecanismo de feedback positivo para a própria expressão, aumentando suas respostas celulares (BIERHAUS et al., 2005). Em um contexto de desequilíbrio do estado redox, a ativação de RAGES está envolvida com o início e a progressão de respostas proinflamatórias e proapoptóticas (RAMASAMY et al., 2005). Sabe-se também que a ativação de RAGES está envolvida na produção acentuada de espécies reativas de oxigênio (ROS); porém, estudos recentes sugerem que estes receptores também podem estar envolvidos em respostas fisiológicas importantes, como o processo de diferenciação celular (KIM et al., 2012). Levando-se em consideração os aspectos toxicológicos apresentados tanto do MG quanto dos AGES, percebe-se que as ações celulares exercidas por estes produtos englobam três principais eventos: permanente alteração funcional e estrutural de proteínas; elevação nos níveis de ROS, e ativação dos RAGES e de cascatas de eventos que culminam com estresse oxidativo e morte celular (LIN et al., 2016).. 2.4 METILGLIOXAL x ESTRESSE OXIDATIVO. Estresse oxidativo é caracterizado por um desequilíbrio entre a geração de compostos oxidantes e a atividade dos sistemas de defesa antioxidantes (BARBOSA et al., 2010). Esse fenômeno pode ser desencadeado tanto pela ação exacerbada de agentes pró-oxidantes exógenos quanto por inibição das defesas antioxidantes naturais endógenas, incluindo a atividade de enzimas-chave e de antioxidantes naturais não-enzimáticos (BARBOSA et al., 2010). Em condições normais, o maior produtor de ROS é a cadeia transportadora de elétrons, que ocorre na membrana interna mitocondrial como processo fundamental para a formação de ATP através da fosforilação oxidativa (SCIALÒ et al., 2017). Na mitocôndria, o O2 é reduzido, resultando na formação de H2O (Figura 3). No processo de redução das moléculas de O2, outras ROS são formadas, incluindo os radicais superóxido (O2•-), hidroxila (OH•-) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Esse processo se dá mediante reações específicas, catalisadas por enzimas e com a participação dos íons ferro e de.

(33) 26. cobre (Figura 3). Além de participar de reações que darão origem ao OH•-, o O2•- pode reagir com o radical óxido nítrico (NO•) para formar a espécie reativa de nitrogênio peroxinitrito (ONOO), potencialmente reativa (BARBOSA et al., 2010) (Figura 3). Os íons ferro (Fe) e cobre (Cu) são potentes catalisadores na formação de radicais livres sendo ativos em reações de oxirredução. A participação desses metais se dá, especialmente, por meio das reações de Fenton e Haber-Weiss (BARBOSA et al., 2010). A primeira diz respeito à geração de radical OH•-, por reação do H2O2 com Fe e Cu. Já a segunda consiste na catálise exercida por esses íons da reação entre o H2O2 e o O2•-, gerando também o radical OH•(BARBOSA et al., 2010; Figura 3).. Figura 3 - Formação mitocondrial de radicais livres. Legenda: Cu: cobre; e-: elétron; Fe: Ferro; H+: hidrogênio molecular; H2O: água; H2O2: peróxido de hidrogênio; NO•: óxido nítrico; O2•: radical superóxido; O2: oxigênio; OH-: radical hidroxila; ONOO-: radical peroxinitrito; SOD: superóxido dismutase. Fonte: Barbosa et al. (2010). Visando a neutralização das espécies reativas, o organismo possui sistemas de defesa antioxidantes que através da ação scavenger e/ou poder redutor previnem ou atenuam os danos causados pela ação deletéria dos radicais livres ou das espécies reativas não-radicalares (BARBOSA et al., 2010). Esses sistemas consistem em um conjunto de moléculas enzimáticas e não-enzimáticas (BARBOSA et al., 2010). Neste cenário, destaca-se as vias de sinalização ativadas pelo fator de transcrição Nrf2 (fator nuclear eritróide-2). O Nrf2 está envolvido com a expressão de uma série de genes que codificam, enzimas antioxidantes, entre outras (NITURE et al., 2014). Dentre as enzimas antioxidantes, encontram-se a superóxido dismutase (SOD), a.

(34) 27. catalase (CAT), a glutationa peroxidase (GPx), a glutationa-S-redutase (GSR), entre outras (NITURE et al., 2014). As SOD são enzimas responsáveis por neutralizar o radical O2•-, convertendo-o em O2 e H2O2 (ZELKO et al., 2002). Está presente nos espaços intracelulares na forma CuZn-SOD, ou SOD1, ou nos espaços mitocondriais na forma Mn-SOD, ou SOD2 (ZELKO et al., 2002). A enzima CAT tem ação complementar às SOD, fazendo a conversão do H2O2 em H2O e O2 (GLORIEUX et al., 2015). Encontra-se nos peroxissomas de animais e plantas, nos glioxissomas das plantas e no citoplasma de procariontes (GLORIEUX et al., 2015). As GPx são um conjunto de enzimas dependentes de glutationa reduzida (GSH) responsáveis pelo metabolismo de todos os peróxidos presentes nas células. Dentre as enzimas deste grupo, destacamos a GPx1, produzida no citoplasma e nas mitocôndrias de todos os tecidos; a GPx2, predominante no trato gastrointestinal com ação relacionada à prevenção de inflamação neste local; e a GPx4, caracterizada por uma menor dependência de GSH e capacidade de prevenir o fenômeno de peroxidação lipídica nas membranas celulares (BRIGELIUS-FLOHÉ e MAIORINO, 2013; AKASAKA et al., 1990; KELNER e MONTOYA, 1990). A GSR é uma enzima responsável por fazer a conversão da glutationa oxidada (GSSG) em GSH, consumindo moléculas de FAD e NADPH (DEPONTE, 2013).. Figura 4 - Integração dos sistemas antioxidantes enzimáticos. Legenda: CAT: catalase; GPx: glutationa peroxidase; Grd: glutationa redutase; GSH: glutationa reduzida; GSSG: glutationa oxidada; H2O: água; H2O2: peróxido de hidrogênio; NADP: fosfato de dinucleotídeo de adenina e nicotinamida oxidado; NADPH: fosfato de dinucleotídeo de adenina e nicotinamida reduzido; OH•-: radical hidroxila; O2•-: radical superóxido; O2: oxigênio; SOD: superóxido dismutase.. Fonte: Adaptação de Barbosa et al. (2010).

(35) 28. Tanto a formação quanto a decomposição do MG estão relacionados com a produção de radicais livres. Por exemplo, na formação de MG a partir da aminoacetona observa-se a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e amônio (NH4+), numa reação catalisada pela enzima aminoxidase sensível à semicarbazida (SSAO) (KALAPOS, 2008). Além disso, o MG pode ser formado não-enzimaticamente a partir da aminoacetona, gerando como produtos além do MG, NH4+ e radical superóxido (O2• -) (DUTRA et al., 2001). A conversão de acetol à MG também produz H2O2, numa reação catalisada pela enzima galactose oxidase (DUTRA et al., 2001). A conversão não enzimática de acetoacetona em MG na presença de oxigênio molecular e mioglobina foi sugerida por Milligan e Baldwin no ano de 1967. Além da mioglobina, manganês, hemoglobina e o citocromo c também foram capazes de catalisar tal reação, mesmo que com uma efetividade menor (MILLIGAN e BALDWIN, 1967). Entretanto, a formação de ROS nestas reações não ficou bem estabelecida. A oxidação da succinilacetona como fonte de MG também é descrita como formadora de radicais livres (ROYER et al, 2004). Com relação às ROS formadas em reações de metabolização ou degradação do MG podemos destacar duas fontes principais: a glioxal oxidase, geradora de H2O2, e a autoxidação e fotólise do MG, que resulta na produção de H2O2 e alguns radicais livres (KALAPOS, 2008).. 2.5 METILGLIOXAL x DOENÇAS CRÔNICAS. Além do diabetes mellitus, sabe-se que o MG está envolvido na patogênese de doenças como a obesidade (GAENS et al., 2013), aterosclerose (HEGAB et al., 2012), câncer (LIN et al., 2016) e desordens neurodegenerativas (ANGELONI et al., 2014). Em condições hiperglicêmicas, devido ao aumento da concentração de glicose na corrente sanguínea, há aumento da captação de glicose pelas células que não dependem de insulina, e consequente aumento da produção de MG (MAESSEN et al., 2015; STEFANO et al., 2016). O transporte da glicose para dentro das células, precedendo a produção intracelular de MG, pode ocorrer por dois mecanismos: transporte facilitado, mediado por transportadores de membrana específicos (GLUT) e o co-transporte com o íon sódio (SGLT), presente apenas na parte apical das células intestinais e nos túbulos proximais renais (BYERS et al., 2017; FERRANNINI, 2017). Partindo da conhecida toxicidade apresentada pelo MG no diabetes mellitus devido a hiperglicemia, estudos utilizando diversas linhagens celulares cancerígenas têm demonstrado efeitos relacionados ao MG em diferentes tipos de câncer (LIN et al., 2016; RABBANI, 2017; THORNALLEY e RABBANI, 2011). Neste sentido, já foi observado que o MG está diretamente relacionado com o crescimento tumoral do câncer de mama bem como na.

(36) 29. metástase. Estes efeitos foram mediados por processos de glicação e ativação de diferentes fatores de transcrição, tais como Hsp90 e do fator de crescimento tumoral e de metástase YAP, ligados à tumorogênese (NOKIN et al., 2016). Além disso, tanto o MG quanto os AGES são considerados fatores promotores de tumor putativos por induzirem estresse oxidativo e inflamação crônica via ativação de mecanismos de sinalização dependentes de RAGES na progressão dos tumores (MA et al., 2017). Além dos efeitos do MG sobre a progressão de tumores, outras patologias crônicas, incluindo obesidade e aterosclerose, vem sendo estudadas. Neste contexto, Rodrigues e colaboradores demonstraram que o MG causa alterações no tecido adiposo, incluindo modificações da arquitetura deste tecido, o que dificulta o fluxo sanguíneo e a expansão vascular, levando à resistência à insulina (RODRIGUES et al., 2017). Evidências em roedores demonstram que uma dieta rica em gordura está diretamente associada ao aumento dos níveis de AGES (SAMPATH et al., 2017). Neste estudo, os danos ao tecido hepático foram acompanhados por inibição de vias associadas ao Nrf2, um fator envolvido na expressão de genes que codificam enzimas antioxidantes, levando a diminuição de agentes antioxidantes. Também foi observado no fígado destes animais, uma inibição da atividade das enzimas heme oxigenasse-1 e glioxalase-1 (GLO-1), responsável pela metabolização do MG (SAMPATH et al., 2017). Outro aspecto marcante é a participação do MG na patogênese de desordens neurodegenerativas. Elevados níveis de AGES derivados do MG são encontrados no plasma e cérebro de pacientes com esclerose múltipla, que é uma doença caracterizada pela perda progressiva da bainha de mielina (WETZELS et al., 2017). Outra patologia diretamente afetada pelos níveis de MG no organismo é a doença de Alzheimer. Isso porque o acúmulo de proteínas insolúveis no cérebro, característico de condições como a doença de Alzheimer, propiciam um maior número de grupos amino livres, que são os principais locais de ligação para que compostos como o MG possam interagir irreversivelmente formando os AGES (MÜNCH et al., 2003). Na doença de Alzheimer, caso os níveis de MG estejam aumentados, dois tipos de agregados proteicos fibrilares que podem ser glicados são encontrados: depósitos extracelulares (placas) consistindo principalmente de peptídeo beta-amiloide, e depósitos intracelulares (emaranhados) compostos predominantemente de microtúbulos associados à proteína tau (MÜNCH et al., 2003). Embora exista uma relação efetiva entre AGES/RAGES e diferentes patologias, há necessidade ainda de compreender a exata participação do MG nesses processos para o desenvolvimento de futuras terapias com alvo nas ações deste composto..

(37) 30. 2.6 METILGLIOXAL x MORTE CELULAR (NECROSE/APOPTOSE). Classicamente, três tipos de morte celular naturais inclusive para o desenvolvimento são descritos: necrose, apoptose e autofagia (CLARCKE, 1990). A autofagia é definida como um processo catabólico celular que dá origem à degradação de componentes da própria célula utilizando os lisossomos. É um processo importante no crescimento celular, diferenciação, e na homeostase, e ajuda a manter um equilíbrio entre a síntese, a degradação e reciclagem dos produtos celulares (KUMA et al., 2004). O processo de necrose é definido como um processo onde ocorre rápida permeabilização da membrana plasmática, e pode ser um processo programado ou não-programado (PROSKURYAKOV et al., 2003). Já a apoptose é um processo complexo de morte celular programada que pode ser desencadeada e regulada por uma série de fatores intrínsecos e extrínsecos à célula, incluindo fatores nucleares, mitocondriais e de membrana (ALBERTS, 2010). Além de ser induzida por condições muito extremas como a radiação, citocinas, isquemia, drogas e patógenos, a necrose também pode ser um evento fisiológico normal e programado (PROSKURYAKOV et al., 2003). Sendo assim, mecanismos de sinalização, como receptores de morte celular, cascatas de quinases, e mitocôndrias, podem participar tanto do processo de apoptose quanto do processo de necrose, e pela modulação destes mecanismos é possível atingir tanto processos de apoptose como de necrose. Sabe-se ainda que moléculas antiapoptóticas como as proteínas da família Bcl-2/Bcl-XL são igualmente efetivas na proteção tanto de apoptose quanto necrose programada. Desta forma, juntamente com a apoptose, a necrose vem sendo aceita como uma forma específica da fase de execução de morte celular programada, que pode ter como exemplos a necrose durante a embriogênese, a renovação normal tecidual, e a resposta imune (PROSKURYAKOV et al., 2003). Além da Bcl-2/Bcl-XL, outros fatores normalmente relacionados ao processo de apoptose, como o AIF (fator indutor de apoptose) e a endonuclease G (endo G), podem participar da via de sinalização desencadeada no processo de necrose. O AIF e a endo G, quando liberados da mitocôndria, ativam eventos que culminam com a clivagem do DNA (KAWA, 2015). Já o processo de apoptose, conhecido também como morte celular programada clássica, requer energia e síntese proteica e está relacionado com a homeostase na regulação fisiológica do tamanho dos tecidos. É um processo essencial para o desenvolvimento de plantas e animais, sendo que algumas funções fisiológicas da apoptose são o desenvolvimento embrionário, a regulação da quantidade de células no organismo, entre outros (FUCHS e STELLER, 2011)..

(38) 31. As principais alterações morfológicas observadas em células apoptóticas são: diminuição da célula com agregação dos componentes celulares; mudança de aspecto do núcleo, com a cromatina se prendendo à carioteca e se condensando, sendo que também pode ocorrer fragmentação do núcleo; e formação de corpos apoptóticos, que são reconhecidos e fagocitados por macrófagos (KACZANOWSKI, 2016). A apoptose é desencadeada e regulada por fatores/vias específicas, onde destaca-se a via extrínseca e intrínseca e a participação das caspases (ALBERTS, 2010). Caspases são um grupo de proteases, que possuem um resíduo de cisteína, capazes de clivar proteínas-alvo num local exatamente após um resíduo de ácido aspártico (SHALINI et al., 2015). Existem duas classes de caspases: as iniciadoras e as efetoras. Caspases iniciadoras, como por exemplo a caspase-9 (CASP-9), clivam proformas inativas de caspases efetoras, ativando-as. Já as caspases efetoras, como por exemplo a caspase-3 (CASP-3), clivam outros substratos proteicos da célula resultando no processo apoptótico. A iniciação da reação em cascata é regulada por inibidores de caspases (POREBA et al., 2016). A via extrínseca consiste na indução de apoptose por uma célula externa a que sofrerá apoptose. A interação entre células ocorre por receptores de membrana pertencentes à superfamília dos receptores dos fatores de necrose tumoral (rTNF) e seus ligantes. Os ligantes, assim como os receptores, são homotrímeros pertencentes à família TNF de proteínas sinalizadoras (NIKOLETOPOULOU et al., 2013). A via intrínseca é aquela em que a própria célula deflagra o início do processo, induzida por fatores como condições ambientais desfavoráveis, erros deletérios no material genético, hipóxia, entre outros. O processo intrínseco é iniciado pela retirada de proteínas do espaço intermembrana da mitocôndria para o citosol, levando a ativação das caspases citoplasmáticas e consequente apoptose celular (ALBERTS, 2010). Essa via é regulada pelas proteínas da família Bcl-2, composta por duas subfamílias: as proapoptóticas e as antiapoptóticas. A subfamília das proteínas proapoptóticas é responsável por estimular o processo apoptótico permitindo a saída de proteínas mitocondriais intermembranares, incluindo o citocromo c. Já a subfamília das proteínas antiapoptóticas tem ação inversa, impedindo que as proteínas intermembranares sejam expulsas para o citosol evitando assim o processo de apoptose celular. Os principais representantes das proteínas proapoptóticas são a BAD e a Bax. Enquanto a Bax fica geralmente dispersa no citosol e só se insere na membrana mitocondrial em casos de disparo apoptótico, a BAD está continuamente inserida nessa membrana (na face citosólica), de forma que, com sinal apoptótico, polimeriza-se e forma os poros para a passagem do.

(39) 32. citocromo (GIBSON e DAVIDS, 2016). Já os principais representantes da subfamília das famílias antiapoptóticas são a Bcl-2 e a Bcl-XL, que ficam localizadas na superfície interna da membrana mitocondrial externa e garantem a integridade da membrana, impedindo a formação de poros (ZHOU et al., 2011). O MG tem sido descrito como um composto tanto pró-apoptótico quanto necrótico. Com relação à sua atividade apoptótica, há evidências de que o composto induziu diminuição nos níveis da proteína antiapoptóticas Bcl-2 em uma linhagem de células microvasculares cerebrais endoteliais humanas (HBMEC), e um aumento na expressão da proteína pró-apoptótica Bax (LV et al., 2014). No mesmo estudo, os autores observaram que o MG causou um aumento na atividade da CASP-3 (LV et al., 2014; ALBERTS, 2010). Outro estudo mostrou a potencialidade do MG em induzir apoptose através da ativação de p38 MAPK em células de Schwann de roedores (FUKUNAGA et al., 2004). Posteriormente, Ota demonstrou que o MG induz apoptose em células de Schwann por induzir a clivagem de CASP-3 nestas células (OTA et al., 2007). Quando células Jurkat foram incubadas com MG, a ativação de um regulador do sinal de apoptose foi associada com a produção de ânion superóxido e subsequentemente com apoptose (DU et al., 2001). Utilizando um modelo experimental com uma linhagem de células sanguíneas, Okado demonstrou que tanto o MG quanto a 3-deoxiglicosona foram capazes de causar morte celular também de macrófagos por apoptose (OKADO et al., 1996). Além da atividade pró-apoptótica, alguns estudos sugerem que o MG pode causar morte celular por necrose programada. Desta forma, poderia servir como agente terapêutico na indução de necrose em células tumorais e outras células que possam causar danos a determinado organismos (FAN et al., 2003). Um exemplo foi a inibição da proliferação e indução de morte de células de glioblastoma multiforme humano expostas ao MG (PAUL-SAMOJEDNY et al., 2016). Apesar da maioria dos resultados neste sentido se resumirem a trabalhos utilizando culturas de células, alguns trabalhos in vivo indicam que, entre outras consequências, a perda de células endoteliais e inflamação induzida por MG contribuem para o desenvolvimento de cardiomiopatia diabética (VULESEVIC et al., 2016).. 2.7 CÉLULAS SANGUÍNEAS: FUNÇÕES BIOLÓGICAS E MODELO EXPERIMENTAL. O sangue é um tecido conjuntivo formado por uma porção líquida, chamada de plasma, e uma porção sólida de natureza diversificada. A porção sólida corresponde a aproximadamente 45% do sangue total em humanos (HOFFBRAND e MOSS, 2012). Desta porção, os principais elementos são os glóbulos vermelhos, os glóbulos brancos, e as plaquetas. Cada elemento.

(40) 33. sanguíneo possui funções específicas que contribuem para a homeostase fisiológica geral. Homeostase é definida como a manutenção do ambiente interno dentro de limites toleráveis para a manutenção da vida de algum organismo (CANNON, 1926). Sendo o sangue o principal fluido corporal dos animais com sistema circulatório fechado, a manutenção de suas condições é essencial para a sobrevivência destes animais, e isto está diretamente relacionado ao correto funcionamento de cada tipo celular presente neste fluído (HOFFBRAND e MOSS, 2012). Os glóbulos vermelhos, também chamados de hemácias ou eritrócitos, são as células sanguíneas mais abundantes do organismo. Assim como as demais células sanguíneas, são produzidas a partir de células-tronco pluripotenciais presentes na medula óssea num processo denominado hematopoiese (ELIAS et al., 2017). Os eritrócitos possuem vida média de aproximadamente 120 dias, e sua principal função é fazer o transporte dos gases O2 e CO2 no organismo (WAGNER, 1977). Estas células não possuem núcleo e o seu citoplasma é rico em hemoglobina. A hemoglobina é uma metaloproteína tetramérica, composto de dois tipos de cadeias de globina. Cada cadeia proteica está ligada a um grupo heme que possui um íon de ferro no seu centro, formando seis ligações coordenadas. O transporte de oxigênio acontece porque essa molécula liga-se ao ferro da hemoglobina, formando a oxihemoglobina. Como apenas uma molécula de oxigênio liga-se ao ferro, cada molécula de hemoglobina liga-se a quatro moléculas de oxigênio. Ao chegar aos tecidos, essa combinação é revertida, e o oxigênio é disponibilizado para as células. Além de transportar o oxigênio, a hemoglobina também remove o dióxido de carbono e garante o equilíbrio ácido-base do organismo. Nessa combinação, que ocorre normalmente nos tecidos, forma-se a carbamino-hemoglobina, que é facilmente revertida (O’NEILL e ROBBINS, 2017). Os leucócitos, também chamados de glóbulos brancos, são as principais células de defesa do organismo. A contagem leucocitária considerada normal varia entre 4 e 12 mil células por milímetro cúbico, sendo que estes valores podem estar alterados em determinadas patologias ou por ação de diferentes drogas (FESSLER et al., 2017). Os leucócitos são normalmente divididos em duas classes: granulócitos e agranulócitos. Os granulócitos são constituídos pelos neutrófilos, eosinófilos, basófilos e mastócitos. Já os agranulócitos são constituídos pelos linfócitos e monócitos (MOHAMMADI et al., 2014). Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes, correspondendo a aproximadamente 65% do total de células brancas em indivíduos adultos normais. Estão envolvidos na defesa contra infecções bacterianas e outros pequenos processos inflamatórios. Os eosinófilos correspondem a uma porcentagem de 2 a 4% do total de leucócitos. Comuns na mucosa intestinal, sua principal.