TÍTULO: INTERAÇÃO PARÁCRINA VESÍCULAS EXTRACELULARES ENTRE AS CÉLULAS MESANGIAIS E ENDOTELIAIS EM HIPÓXIA
TÍTULO:
CATEGORIA: EM ANDAMENTO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: Biomedicina SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL - UNICSUL INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): CAMILA FERREIRA CAVALHEIRO AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): FERNANDA TEIXEIRA BORGES ORIENTADOR(ES):
Projeto de Pesquisa
Interação parácrina vesículas extracelulares entre as células mesangiais e endoteliais em hipóxia e sua contribuição para fibrose.
Paracrine interaction mediated by extracellular vesicles between mesangial and endothelial cells in hypoxia and its contribution to fibrosis.
Aluno: Camila Ferreira Cavalheiro
Orientadora: Dra Fernanda Teixeira Borges
São Paulo 2018
Resumo
Na hipóxia é observada tanto a injúria tubulointersticial quanto a glomerular. As células endoteliais são uma das primeiras células sujeitas a isquemia e, no glomérulo, a células mesangiais interagem com as células endoteliais. Pode ocorrer a comunicação intercelular, principalmente em condições lesivas, como na hipóxia. O objetivo deste trabalho é analisar a comunicação in vitro entre células endoteliais e mesangiais através de vesículas extracelulares em condições de hipóxia.
Células endoteliais humanas (HUVEC) foram submetidos a hipóxia (1%O2, 5%CO2) e normóxia (21%O2 e 5%CO2) durante 48h. Exossomos (50
µg/ml) foram extraídos para caracterização e utilização no tratamento das células endoteliais durante 48h.
Os exossomos extraídos meio de cultura em normóxia, mostraram moda de 139 nm e concentração de 9,5 1010 partículas/ml, condizente com exossomos. A análise por western blot mostrou que os exossomos expressam marcadores específicos como CD63 e CD81. Adicionalmente, a dosagem de lactato no meio de cultura mostrou que as células em hipóxia produziram mais lactato que as células em normóxia, condizente com as condições de baixa pressão de O2. Resultados posteriores são necessários para avaliar a interação
1. Introdução
O tecido renal é bastante susceptível a eventos isquêmicos. A hipóxia é uma das causas da injúria renal aguda (IRA) (1, 2), da doença renal crônica (DRC) e é o evento comum final na doença renal de estágio final (3). Tanto o segmento tubular, quanto o glomérulo são susceptíveis a injúria por isquemia/hipóxia. Entretanto a injúria túbulo-intersticial é mais severa e consequentemente mais estudada, enquanto a injúria glomerular mais moderada na isquemia/hipóxia tem sido negligenciada. Apesar disso, a isquemia pode causar glomeruloesclerose e fibrogênese (4).
O glomérulo é uma estrutura complexa, formada por diferentes tipos celulares com funções especializadas e pela membrana basal glomerular. Para que o processo de filtração ocorra de maneira adequada é essencial a integridade desta estrutura, principalmente da barreira de filtração, que seleciona os componentes do sangue que serão filtrados de acordo com o tamanho e a carga.
A barreira de filtração é constituída, a partir da luz do capilar glomerular para o espaço de Bowman, pelo endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e os prolongamentos dos podócitos, os pedicelos. A célula endotelial é a primeira célula afetada durante a diminuição da perfusão sanguínea, por isso ela é suscetível à injúria por hipóxia (Figura 1) quando o fluxo sanguíneo renal está comprometido.
A célula mesangial intraglomerular é uma célula especializada do glomérulo. Dentre as várias funções da célula mesangial estão a fagocitose, a contração que diminui a superfície de filtração, a produção de agentes vasoconstritores, que controlam o processo de filtração glomerular por meio da
regulação do diâmetro das arteríolas aferentes e eferentes e a produção de proteínas de matriz como colágeno I e fibronectina em reposta a própria angiotensina II e ao TGF-β1 (5, 6). A célula mesangial é capaz de responder à isquemia/hipóxia acumulando o fator induzido por hipóxia (HIFα), mas também o acumula de maneira independente, por indução da angiotensina II, pró-fibrogênica (7).
Em condições de normoxia, a cadeia α do HIF é eliminada pela atividade das subunidades da prolil-hidroxilase (PHD), permitindo a sua interação com o fator von Hippel-Lindau (VHL), ubiquitinação e degradação proteassômica. Em condições de hipóxia, a atividade da PHD é inibida, estabilizando o HIFα que migra ao núcleo (14), agindo como um fator de transcrição. Entre os genes induzidos pelo HIF é o PDGF-B, fator produzido pela célula endotelial que age em seu receptor expresso em pericitos e células mesangiais. Em camundongos, a delação das células mesangiais leva a formação de uma única alça capilar (8). Outro possível mecanismo de comunicação é mediado pela integrina αvβ8, produzida pelas células mesangiais e age sequestrando o TGF-β1. A inibição da integrina, leva ao aumento na via do TGF-β1 com apoptose de células endoteliais e consequente albuminúria e glomerulopatia (9).
Figura 1. Comunicação intercelular entre células presentes no corpúsculo renal. (1) Interação entre células mesangiais (M) e a matriz mesangial, (2) interação entre células mesangiais e podócitos (P), separados pela membrana basal glomerular, (3) interação entre células endoteliais (E) dos capilares glomerulares e células mesangiais, (4) interação entre podócitos e células endoteliais. Observar a interação entre podócitos por meio da fenda diafragmática. A seta indica o sentido do ultrafiltado. Retirado de Schlöndorff&Banas, 2009 (10).
Durante o processo de filtração glomerular, o ultrafiltrado flui da luz dos capilares, por entre as fendas diafragmáticas, para o espaço de Bowman onde se localizam as células mesangiais. Adicionalmente, como as células mesangiais e as endoteliais estão em sentidos opostos, é possível que ocorra comunicação por meio de fatores parácrinos, especialmente em condições patológicas (11, 12).
São crescentes os trabalhos na literatura que analisam o mecanismo de comunicação parácrino mediado por vesículas extracelulares (VE). Os principais tipos de VE são os exossomos e as microvesículas que diferem pela origem, diâmetro e mecanismo de extração in vitro (13). Os exossomos apresentam de 40-150nm de diâmetro, são produzidos nos corpos multivesiculares em respostas a alterações no microambiente. Em um trabalho anterior, mostramos que células epiteliais submetidas a hipóxia, mas não as células em normóxia, liberaram exossomos que foram capazes de induzir a ativação de fibroblastos em miofibroblastos produtores de TGF-β1 (14).
Outro trabalho do nosso grupo analisou células mesangiais expostas a alta glicose e observou que os exossomos extraídos destas células foram capazes de induzir efeitos semelhantes ao da glicose em células mesangiais controle (15).
Assim este trabalho tem como objetivo analisar a comunicação parácrina, mediada por exossomos, entre células endoteliais e células mesangiais em condições de hipóxia.
2. Objetivo
Esse trabalho tem como objetivo analisar a comunicação parácrina, mediada por exossomos, entre células mesangiais e endoteliais em condições de hipóxia, analisando os possíveis mediadores da comunicação intercelular carreados por exossomos.
3.1 Cultura celular
Células endoteliais embrionárias humanas imortalizadas (HUVECs) foram cultivados em meio EGM completo suplementado com ECGS (endotelial cell growth supplement) e FBS a 10%, 100 U/ml de penicilina, 100ug/ml de estreptomicina (Gibco, USA) a 37 °C.
O tratamento hipóxico foi realizado em uma incubadora de hipóxia obtida comercialmente (Forma 3131, ThermoScientific, Waltham, MA, EUA) na presença de uma mistura gasosa de 1% de oxigênio e 5% de CO2 e 94% de N2
durante 48h. As células HUVEC em normóxia serão submetidas às condições de cultura (21%O2 e 5%CO2) durante 48h.
Células mesangiais humanas imortalizadas (CMHi), gentilmente cedidas pelo prof. Dr Bernhard Bana (Universidade de Regenburg, Alemanha), foram cultivadas em garrafas de cultura de 25 cm2 ou em placas de 6 poços, de acordo com o protocolo experimental, em meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle`s Medium) suplementado com soro fetal bovino (SFB 10% v/v para 3T3), NaHCO3 2,0 g/L, HEPES 2,6 g/L, penicilina 10 000 IU/L, estreptomicina 50 mg/L e neomicina 100 mg/L e mantidas na incubadora a 37 ºC.
Ao atingirem 80 % de confluência, as células foram destacadas da placa ou garrafa de cultura por tripsinização e a atividade da tripsina foi neutralizada com DMEM contendo SFB. As células foram utilizadas na manutenção das culturas ou na realização dos protocolos experimentais (Figura 2), sendo que cada protocolo foi repetido pelo menos 4 vezes.
Figura 2. Esquema do protocolo experimental mostrando os grupos experimentais e os métodos a serem realizados.
3.2 Extração e caracterização de exossomos
Os exossomos foram isolados como descrito anteriormente (16). O meio condicionado por podócitos mantidos em condições de normóxia e hipóxia por 48h foi coletado, submetido à centrifugação a 800g por 5 minutos e 2000g por 10 minutos. Após este período, o sobrenadante foi filtrado em filtro com poros de 0,22 um, a fim de reter vesículas com diâmetro acima de 200nm, e submetidos a ultracentrifugação 100.000 g por 1h. Na caracterização dos exossomos, o precipitado foi ressuspenso em PBS estéril e submetido novamente à centrifugação em 100.000 g.
O precipitado foi utilizado para tratamento das células mesangiais em cultura, ou para caracterização dos exossomos por western blot para marcadores de exossomos CD9, CD63 e CD81 e pela análise de rastreamento de nanopartículas.
3.3 Grupos experimentais
As células mesangiais cultivadas em placas de 6 poços ou de 96 poços, ao atingirem 80% de confluência, foram divididas nos seguintes grupos experimentais:
Grupo controle (CTL): meio de cultura trocado por meio DMEM com 5% SFB.
Grupo CMHi+Ex-Hx: exposição a 50 ug/ml de exossomos extraídos de células endoteliais mantidas em Hipóxia (Hx) durante 48h.
Grupo CMHi+Ex-Nx: células mesangiais expostas a 50 ug/ml de exossomos extraídos de células endoteliais mantidas em meio Normóxia (Nx) por 48h.
3.4 Análise da síntese proteica por western blot
Células mesangiais submetidas aos tratamentos citados anteriormente ou exossomos extraídos da cultura celular foram extraídos em tampão RIPA, a concentração protéica foi quantificada por meio do método do folin fenol (Biorad) (17), e a concentração de proteína das amostras em estudo foi calculada plotando-se as absorbâncias das amostras com a curva padrão de albumina (BSA).
Cinquenta microgramas de proteína total foram misturados com tampão de desnaturação (120 mM tris-HCI, 4% SDS, 20% glicerol, 0,1% azul de bromofenol, 0,72 mM β-mercaptoetanol) e desnaturados a 95°C durante 5 minutos, sendo posteriormente resfriados em gelo por 5 minutos. As amostras de proteínas do extrato celular foram submetidas à eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE). A eletroforese foi realizada com voltagem constante de 100 volts por aproximadamente uma hora e meia.
Após a eletroforese, o gel de separação foi submetido a transferência em tampão Tris/glicina (20% metanol, 15,6 mM tris-base e 120 mM glicina, pH 8,1 a 8,4). O gel de eletroforese foi alinhado com a membrana de nitrocelulose e colocado entre as esponjas e os papéis de filtro por ambos os lados. Este complexo foi colocado em um suporte e mergulhado em uma cuba de transferência contendo tampão de transferência gelado. A transferência foi realizada com voltagem constante de 100 volts durante 1h. Após a transferência, o complexo foi desfeito e a membrana foi exposta aos anticorpos de interesse para extrato proteico de exossomos (CD9, CD63 e CD81) e de células mesangiais (fibronectina, colágeno 1, TGF-β1, obtidos da ABCAM, MA), durante pelo menos 18h.
A membrana foi lavada em tampão de lavagem TBST e submetida ao anticorpo secundário durante 2h. Após realizadas novas lavagens, a membrana foi submetida a solução do kit de revelação ECL. Após o período de incubação, a quimioluminescência foi detectada por um fotodocumentador Uvitec (Cambridge, UK). A massa molecular das proteínas detectadas foi determinada por comparação com a migração das proteínas padrão (All Blue, BioRad, EUA).
3.5 Tecnologia de análise de rastreamento de nanopartículas
A análise da concentração e o tamanho dos exossomos foram analisadas pelo aparelho NanoSight (18).
A técnica mede o tamanho de cada partícula a partir de observações diretas de difusão. Esta metodologia analisa partícula a partícula fornecendo uma distribuição de tamanho das partículas de alta resolução considerando-se que estejam sob movimento browniano, que é definido como o movimento das partículas em um fluido ao colidirem com átomos e outras moléculas.
Resumidamente, as amostras de exossomos extraídos foram ressuspendidas em PBS e inseridas por meio de uma seringa acoplada ao aparelho para análise. O aparelho mede a concentração das partículas em solução, a distribuição do tamanho das partículas e fornece um vídeo das partículas em movimento.
3.6 Análise Estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (X EP) e analisados através do método One-Way ANOVA; as diferenças foram consideradas significantes quando p< 0,05, confirmados pelo teste Student-Newman-Keuls para variáveis paramétricas e correção de Dunn para variáveis não paramétricas.
4. Resultados Parciais
Inicialmente realizamos a caracterização dos exossomos extraídos do meio de cultura de células em normóxia pela técnica de NTA (análise de rastreamento de nanopartículas). Pela análise observamos que a moda das partículas analisadas foi de de 139 nm, enquanto a concentração foi de 9,5 1010 partículas/ml.
A B Moda: 139 nm Concentração: 9,5 1010 partículas/ml C
Figura 1. Análise de rastreamento de nanopartículas (A) histograma, (B) dot plot e (C) “heat map” de concentração pelo diâmetro nos exossomos extraídos de células em normóxia.
As células em normóxia foram posteriormente caracterizadas por marcadores específicos para exossomos, mostrando a marcação tanto para o CD63, quanto para o CD81, ambos marcadores específicos de exossomos.
Moda: 139 nm
Concentração: 9,5 1010 partículas/ml
Figura 2. Caracterização dos exossomos extraídos do meio de cultura em normóxia por marcadores específicos CD63 e CD81.
A hipóxia foi comprovada pela quantificação do lactato no meio de cultura celular. Após 48h de exposição em câmara de hipóxia, observamos que as células que estavam em condições de hipóxia, com 1% de O2 e 5% CO2
apresentaram níveis significativamente elevados de lactato (87,3±1,6 mg/dl) em comparação às células em normoxia (38,8±0,5 mg/dl), comprovando que as células foram mantidas em meio de hipóxia.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Exnormoxia Exhipóxia L a c ta to ( m g /d l)
Figura 3. Gráfico da quantificação dos níveis de lactato no meio de cultura das células em condições normais de Oxigênio (Exnormóxia) e com a diminuição da taxa de Oxigênio (Exhipóxia).
5. Discussão
Os dados apresentados neste relatório mostram a caracterização dos exossomos por meio de técnicas de western blot para marcadores específicos de exossomos (CD63 e CD81), além da caracterização por meio da tecnologia de NTA.
Nossos resultados comprovam que as partículas extraídas do meio de cultura em normóxia eram realmente exossomos. Os exossomos apresentaram moda de 139nm, condizente com estas vesículas extracelulares e concentração de 9,5 1010 partículas/ml. (13)
A hipóxia foi comprovada pela quantificação do lactato no meio de cultura celular. Nosso método se mostrou eficiente uma vez que observamos um aumento na produção de lactato no meio de cultura celular, porque em condições de deficiência de O2, a célula prioriza a respiração anaeróbica, por
meio da fermentação lática, o que aumenta a produção de lactato no meio de cultura. Os achamos mostrados no presente trabalho estão de acordo com outros resultados apresentados na literatura que estudaram o efeito da hipóxia na produção de exossomos (14)
Entretanto, resultados posteriores são necessários para avaliar a interação entre as células endoteliais e as mesangiais em cultura.
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