TESE_Alterações fisiológicas e bioquímicas durante a germinação de sementes de café (coffea arabica L.) cv. Rubi

ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS E

BIOQUÍMICAS DURANTE A GERMINAÇÃO

DE SEMENTES DE CAFÉ (Coffea arabica L. )

CV. RUBI.

MARIA DE LOURDES RESENDE

MARIA DE LOURDES RESENDE

ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE

CAFÉ (Coffea arabica L.) CV. Rubi.

Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração Fitotecnia, para obtenção do título de "Doutor".

Orientador

Prof. Dr. Renato Mendes Guimarães

LAVRAS

MINAS GERAIS - BRASIL 2006

Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca Central da UFLA

Resende, Maria de Lourdes

Alterações fisiológicas e bioquímicas durante a germinação de sementes de café (Coffea arabica L.) CV. Rubi / Maria de Lourdes Resende. – Lavras: UFLA, 2006.

108 p. : il.

Orientador: Renato Mendes Guimarães. Tese (Doutorado) – UFLA.

Bibliografia.

1. Café. 2. Semente. 3. Germinação. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título.

MARIA DE LOURDES RESENDE

ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE CAFÉ (Coffea arabica L.) CV. Rubi.

Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração Fitotecnia, para obtenção do título de "Doutor".

APROVADA em 07 de agosto de 2006.

Pesq. Dr. Edvaldo Aparecido Amaral da Silva PRODOC CAPES Pesq. Dr. Antônio Rodrigues Vieira EPAMIG

Profa. Dra. Édila Vilela de Resende Von Pinho UFLA

Pesq. Dra. Kalinka Carla Padovani de Carvalho Salgado PRODOC FAPEMIG

Prof. Dr. Renato Mendes Guimarães UFLA

(Orientador) LAVRAS

Aos meus pais, Ézio Resende e Josina Aparecida Resende, pelo exemplo e apoio em todas as etapas de minha vida.

Aos meus irmãos pelo carinho e amizade.

DEDICO

Aos meus filhos Marcos e Isabela, meu estímulo a cada minuto. E, ao meu esposo Adauton, pelo amor e companheirismo.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela graça de realizar esse trabalho.

À Universidade Federal de Lavras e ao Departamento de Fitotecnia, pela oportunidade de realização do curso.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de estudos.

Ao Setor de Sementes pela oportunidade de realização do curso.

Ao Professor Renato Mendes Guimarães, pela excelente orientação, dedicação e amizade demonstrada durante o curso.

Aos Professores João Almir de Oliveira pela coorientação e Édila Vilela Resende Von Pinho, pela amizade, participação e contribuições.

Ao Pesquisador Edvaldo Aparecido Amaral da Silva, do Departamento de Ciências Florestais pela amizade, participação e coorientação.

À Professora Maria Laene Moreira de Carvalho, pela amizade e colaboração. Aos colegas de curso Carlos Eduardo e André pelas contribuições.

À Pesquisadora Kalinka Carla Padovani pela amizade e valiosas contribuições. Às amigas: Dinara, Mariney e Solange pelo convívio e amizade.

Às Mestrandas Tanismare e Priscila pela amizade e inúmeras contribuições durante a realização desta pesquisa.

Às amigas do Setor de Sementes: Dona Elza, Dalva, Andréia e Lenir pela amizade, convívio e ajuda durante a condução do experimento.

À laboratorista Maria Aparecida, pela ajuda e amizade na quantificação dos açúcares.

À Mestranda Maria Leandra, minha irmã, pela dedicação aos meus filhos e contribuições durante o curso.

A todos amigos do setor de sementes, que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.

SUMÁRIO

2. 2 Germinação de sementes de cafeeiro... 4

2.3 Hidrólise e mobilização de reservas na germinação ... 13

2.4 Aspectos de substâncias de reservas e tolerância à dessecação em sementes... 16

2.5 Polifenoloxidase e polifenóis... 23

3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 27

CAPÍTULO 2... 40

INFLUÊNCIA DA LUZ E GIBERELINA NA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE CAFEEIRO (Coffea arabica, L.)... 40

1 RESUMO... 41

2 ABSTRACT ... 43

3 INTRODUÇÃO ... 45

4 MATERIAL E MÉTODOS ... 47

4.1 Ensaio I: Giberelina e luz na germinação de sementes de café. ... 47

4.1.1 Procedimento estatístico ... 48

4.2 Ensaio II: Giberelinas endógenas na germinação de sementes de cafeeiro. ... 49

4.2.1 Procedimento estatístico ... 49

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 51

5.1 Ensaio I: Giberelina e luz na germinação de sementes de cafeeiro. ... 51

5.1.1 Índice de velocidade de germinação... 51

5.1.2 Porcentagem de germinação ... 53

5.1.3 Tempo para 50% de protrusão ... 55

5.2 Ensaio II: Giberelinas endógenas na germinação de sementes de cafeeiro. ... 55

6 CONCLUSÕES ... 66

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 67

CAPÍTULO 3... 69

ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE CAFÉ ... 69

1 RESUMO... 70

3 INTRODUÇÃO ... 74

4 MATERIAL E MÉTODOS ... 76

4.1.Procedimento estatístico ... 77

4.2 Avaliações... 77

4.2.1 Análise eletroforética de enzimas ... 77

4.2.2 Análise eletroforética de proteínas resistentes ao calor ... 78

4.2.3 Atividade da enzima endo-β-mananase ... 78

4.2.4 Conteúdo de açúcares ... 80

4.2.5 Polifenóis ... 81

4.2.6 Polifenoloxidase... 81

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 82

5.1 Análise enzimática... 82

5.2 Análise de proteínas resistentes ao calor ... 86

5.3 Atividade da endo-β-mananase... 88 5.4 Teor de açúcares ... 90 5.5 Polifenóis ... 96 5.6 Atividade da polifenoloxidase ... 98 6 CONCLUSÕES ... 100 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 101 ANEXOS ... 105

RESUMO

RESENDE, Maria de Lourdes. Alterações fisiológicas e bioquímicas durante

a germinação de sementes de café (Coffea arabica L.) cv. Rubi. 2006. 108 p.

Tese (Doutorado em Fitotecnia) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.∗

A propagação do cafeeiro é realizada por meio de mudas provenientes de sementes, porém a germinação das sementes é lenta e desuniforme. Objetivou-se, com esta pesquisa estudar os aspectos da fisiologia da germinação das sementes de cafeeiro da cultivar Rubi. Foram avaliados os efeitos da luz, giberelina e do paclobutrazol (bloqueador de giberelina) sobre a germinação de sementes. Sementes submetidas aos diferentes tratamentos envolvendo luz, giberelina e paclobutrazol foram submetidas à análise eletroforética de proteínas resistentes ao calor (LEA proteína) e de enzimas (catalase, superóxido dismutase e peroxidase), determinação do teor de açúcares (sacarose, manose, glicose, frutose, galactose, rafinose e estaquiose), da atividade da enzima endo-β-mananase, da enzima polifenoloxidase e porcentagem de polifenóis em cada tempo de embebição. A velocidade de germinação das sementes de cafeeiro, foi reduzida na presença de giberelina. O paclobutrazol reduz a velocidade de germinação de sementes de cafeeiro, mas não reduz o efeito da luz. Maior velocidade de germinação em sementes de cafeeiro foi observada na ausência de luz. Quanto aos padrões isoenzimáticos e de proteínas ocorrem modificações durante a germinação de sementes de cafeeiro. Os açúcares sacarose e manose atuam durante a germinação. A enzima endo-β-mananase aumenta nas sementes embebidas na presença de luz e giberelina. A enzima polifenoloxidase reduz durante os processos de germinação e os polifenois aumentam.

∗ _{Comitê Orientador: Dr. Renato Mendes Guimarães - UFLA (Orientador), Dr.}

Edvaldo Aparecido Amaral da Silva - UFLA, Dr. João Almir de Oliveira - UFLA.

ABSTRACT

RESENDE, Maria de Lourdes. Physiological and biochemical changes during

coffee seed germination (Coffea arabica L.) cv. Rubi. 2006. 108 p. Thesis

(PhD. in Plant Science) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.*

Coffee propagation is performed through seedlings from seeds. However, germination in coffee seed is slow and uneven. Therefore, this work had the objective of studding the physiological aspects of seed germination in Coffea arabica cv. Rubi. There were evaluated effect of light, gibberellins and paclobutrazol (inhibitor of gibberellins biosynthesis) during seed germination. Seeds after treatment with light, gibberellins and paclobutrazol were subjected to electrophoresis analysis of proteins resistant to heat( LEA proteins) and the enzymes (catalase, superoxide dismutase and peroxidase), determination of sugar content (sucrose, mannose, glucose, fructose, galactose, raffinose and staquiose), the activity of endo-b-mannanase, the enzyme polyphenoloxidase and percentage of polyphenols in each time of imbibition. The speed of seed germination was inhibited in seeds treated with gibberellins. The paclobutrazol decreased speed of seed germination did not decrease the effect of light. Higher speed of germination was observed under absence of light. Regarding the patterns of isoenzymes and proteins there were changes during seed germination. Sucrose and mannose act during seed germination. The enzyme end-b-mannanase increased its activity in seeds imbibed under the presence of light and gibberellins. The enzyme polyphenoloxidase decreased its activity whereas polyphenols increased during germination.

_________________

* Guidance Committee: Prof. Dr. Renato Mendes Guimarães – UFLA (Major Professor); Dr. Edvaldo Aparecido Amaral da Silva – UFLA; Prof. Dr. João Almir de Oliveira – UFLA.

1 INTRODUÇÃO GERAL

O interesse pelo setor cafeeiro no Brasil tem aumentado significativamente devido a sua importância sócio-econômica, estando sua produção ligada ao desenvolvimento e à industrialização do país. Como essa importância econômica vem aumentando gradativamente, há necessidade de pesquisas e difusão de tecnologias específicas, uma vez que o nível de tecnologia tem aumentado nas regiões onde a cafeicultura se instala. Atualmente, o Brasil é considerado o maior produtor e exportador mundial de café.

Entretanto, essa evolução tecnológica, não tem ocorrido de maneira uniforme em todas as etapas de produção. Uma etapa critíca é durante a formação de mudas, sendo este período demasiadamente longo, o qual pode ser atribuída à lenta e desuniforme germinação das sementes de cafeeiro. Esses fatos têm causado diversos prejuízos no processo de formação de mudas e de instalação da lavoura cafeeira, tanto no que se refere ao custo de produção das mudas, quanto em relação à época de seu plantio. Conseqüentemente, impede que as mudas sejam levadas ao campo na época ideal para o plantio, que coincide com o início da estação das chuvas.

Vários trabalhos relativos ao armazenamento, secagem, tolerância à dessecação e fisiologia da germinação das sementes de cafeeiro condizentes com as demandas geradas pelo alto nível tecnológico da cultura têm sido publicados.

Contudo, ainda são escassas as pesquisas referentes à fisiologia e germinação destas, havendo necessidade de mais estudos nesta área, principalmente no que se referem aos fatores, como: presença e ausência de luz e interação dos hormônios como a giberelina.

Sendo assim, o objetivo neste trabalho foi estudar os aspectos da fisiologia da germinação das sementes de cafeeiro.

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Sementes de cafeeiro

O fruto de cafeeiro é uma drupa elipsóide, formada pelo exocarpo (casca), mesocarpo (mucilagem) e o endocarpo coriáceo (pergaminho), contendo dois lóculos e duas sementes envolvidas separadamente pelo pergaminho. Estas sementes têm formato plano-convexas, elípticas ou ovais, contendo um sulco longitudinal na face plana. As sementes de cafeeiro são constituídas de embrião, endosperma, película prateada ou espermoderma e endocarpo (Dedeca, 1957; Illy & Viani, 1995; Rena & Maestri, 1986).

O endosperma garante as reservas de energia necessárias nos processos de germinação e emergência, sendo composto basicamente de carboidratos (Silva, 2002). Este se divide em endosperma cap, o qual envolve a radícula e endosperma lateral, ou seja, o restante do endosperma, no qual ficam armazenadas as substâncias de reservas da semente. O embrião é localizado na base da semente, composto de eixo hipocótilo/radícula e dois cotilédones (Costa, 2003).

2. 2 Germinação de sementes de cafeeiro

De acordo com Bewley & Black, (1994) a germinação engloba eventos que se iniciam com absorção de água pela semente e termina com a elongação do eixo embrionário. Sendo assim, fisiologicamente, o processo germinativo pode ser dividido em fases, como embebição, alongamento celular e divisão celular após protrusão radicular. Outra classificação mais afinada desse processo germinativo ocorre no nível fisiobioquímico, sendo dividido em fases como: a reidratação, aumento da respiração, formação de enzimas, digestão enzimática

de reservas, mobilização e transporte de reservas, assimilação metabólica, crescimento e diferenciação dos tecidos (Popinigis, 1985).

A embebição das sementes de cafeeiro acontece, segundo um padrão trifásico comum, como descrito para muitas outras espécies (Silva, 2002). De acordo com esse autor, durante a embebição da semente, a uma temperatura de 30°C, no escuro, o embrião cresce dentro do endosperma. Os cotilédones crescem em comprimento por volta de 35% e o eixo embrionário em torno de 40%, levando a ocorrência da protuberância na região do endosperma cap. A protrusão da radícula dessas sementes inicia-se em torno do quinto dia de embebição, sendo que no décimo dia pode-se observar a protrusão da radícula em 50% das sementes. Posteriormente, no décimo quinto dia, ocorre protrusão da radícula na maioria das sementes (Silva, 2002). Este autor observou ainda aumento no potencial de pressão do embrião até o quinto dia de embebição, seguido pela liberação do turgor, sugerindo relaxamento das paredes celulares das células do embrião. Assim, no início da embebição, as células do eixo embrionário têm crescimento isodiamétrico, seguido por crescimento longitudinal. Em sementes de cafeeiro, o processo germinativo é considerado lento e desuniforme Válio (1976). São vários os fatores que podem estar relacionados a esta lentidão da germinação. O endocarpo ou pergaminho presente nas sementes de cafeeiro impede a absorção da água e O2, sendo

necessária a sua retirada, para acelerar o processo da germinação (Guimarães, 1995). Rena & Maestri (1986) relataram que o pergaminho presente nas sementes também reatarda a germinação, principalmente em baixas temperaturas.

O espermoderma película prateada contribui para lenta germinação de sementes desta espécie, sendo este efeito atribuído à presença da cafeína, o qual é considerado inibidor natural (Pereira et al., 2001). Estes resultados corroboram

as afirmações feitas por Suzuki & Waller (1987), os quais demonstraram que as sementes liberam cafeína durante a germinação, inibindo a mesma.

Outro fator que também atua durante a germinação é a alteração hormonal (Válio, 1976). Em geral, a germinação das sementes é determinada por uma malha de efeitos múltiplos de hormônios, as quais sugerem a presença de uma interação entre giberelina, ácido abscísico (ABA), citocinina, etileno e auxina (Salgado et al., 2006).

O ácido giberélico é considerado o mais abundante, agindo na extensibilidade da parede celular, na atividade enzimática, na variação em potencial osmótico, interferindo, portanto, diretamente na germinação, mobilização de açúcares (Guardiã & Benlloch, 1980; Metraux, 1987) e na superação de dormência (Karssen, 1995; Metivier, 1985). Dependendo da espécie as giberelinas podem ser necessárias à expansão foliar, elongação do caule, à indução floral, ao desenvolvimento da semente e à biossíntese de antocianinas (Stephen et al., 1997), uma vez que está presente em toda a planta. Pode ser detectada em folhas, caules, raízes, sementes, embriões e pólen (Weaver, 1972). Tem sido sugerido que a giberelina tem ação importante na germinação das sementes, uma vez que atua no endosperma e no embrião destas (Karssen et al., 1989).

A aplicação exógena das giberelinas, além de contrabalançar a inibição imposta pelo ácido abscísico, induz o crescimento do embrião e estimula os processos germinativos, confirmando sua participação na superação de dormência das sementes (Wang et al., 1998). Também, Bewley (1997), relatou que as giberelinas exógenas proporcionam um papel importante, que estimula a germinação. Este fato pode ser esclarecido por mutantes deficientes em giberelina em Arabidopsis e tomate (Groot Karssen, 1987; Koornneef & Van der Veen, 1980), cujas sementes não germinaram na ausência das giberelinas

exógenas. Em sementes de algumas espécies de gramíneas, a aplicação exógena da giberelina pode aumentar a atividade da α-amilase na camada de aleurona.

As giberelinas têm papel chave na germinação de sementes de muitas espécies. Todavia, em sementes de cafeeiro (Válio, 1976), e de Stylosanthes humilis (Burin, 1979) não foi observado efeito das giberelinas exógenas sobre a germinação como ocorre para a maioria das espécies. Também, Maestri & Vieira (1961) relataram resultados controversos, em relação ao efeito das giberelinas sobre a germinação de sementes de cafeeeiro. Estes autores trabalhando com essa espécie concluíram que a aplicação de ácido giberélico nas concentrações de 0, 10, 100 e 1000 mg/L, às sementes, por 48 horas, reduziu a germinação, à medida que a concentração era elevada. Maestri &Vieira (1961) concluíram que a giberelina pode causar toxidez às sementes de café, ocasionando a morte ou inibindo a germinação das sementes, ocasionando a morte destas, em virtude de uma permanência demasiadamente longa na sementeira. Resultado semelhante foi encontrado por Takaki et al. (1979), indicando que sementes de cafeeiro tratadas com ácido giberélico tiveram redução na germinação. De acordo com esses autores, o fato deveu-se ao aumento na atividade de enzimas como a celulase, proporcionado pelo regulador, que neste caso atuou, degradando a parede celular do embrião.

Silva et al. (2005) observaram valores de germinação de 30% em sementes de cafeeiro, embebidas numa solução de 1000 µM de giberelinas exógenas, em contrapartida quando as sementes foram embebidas numa solução de 1µM deste hormônio houve germinação de 75%. De acordo com esses autores há dois pontos de resposta positiva à giberelina exógena: entre 0 e 1 µM e outro, mais elevado entre 10 e 100 µM. Estes autores concluíram que esta inibição da protrusão radicular somente foi observada em sementes de cafeeiro e, que a germinação destas sementes depende de nova síntese de giberelina. Os autores também relataram que nas sementes de cafeeiro e outras espécies (Burin,

1979), nas quais há inibição pelas giberelinas, esse fato provavelmente ocorre, em função da concentração utilizada, a qual interfere nos processos fisiológicos da germinação (Silva et al., 2005).

Carvalho et al. (1999) concluíram que a pré-embebição das sementes de cafeeiro em água ou em solução de giberelina não acelerou a velocidade de emergência e nem o desenvolvimento das mudas. O ácido giberélico promove o crescimento de embriões somáticos na maioria das espécies (Evans et al., citado por Carvalho et al., 1999), todavia, em sementes de cafeeiro pode-se inibir a formação destes. A giberelina é considerada como um dos grupos de reguladores de crescimento capaz de atuar no embrião de café, induzindo o aumento de pressão (Silva et al., 2004).

É sabido que as giberelinas endógenas são importantes para a germinação das sementes da espécie em estudo. Válio (1976), relatou que as giberelinas endógenas foram detectadas no endosperma e no embrião e, que estas, também atuam durante a germinação das sementes de cafeeiro. Silva et al. (2005) observaram que em sementes de café Coffea arabica, da cultivar Rubi a protrusão da radícula depende da síntese de giberelinas endógenas e que essas foram importantes para promover a elongação das células do embrião e para o enfraquecimento do endosperma cap. De acordo com Válio (1976), o efeito da giberelina endógenadecresce com o armazenamento das sementes de café.

Conforme Bewley & Black (1994), as giberelinas induzem a expressão de enzimas hidrolíticas, as quais disponibilizam reservas para o embrião em certas gramíneas. Durante a germinação de gramíneas, o ácido giberélicosai do embrião, para induzir a síntese, ativação e secreção de enzimas hidrolíticas, pelas células na camada aleurona, seguidas pela hidrólise de polissacarídeos de reserva, proteínas, lipídeos citado por (Faria et al., 2003). A enzima α-amilase é considerada importante para os cereais, uma vez que hidrolisa os

polissacarídeos, que fornecem energia para o desenvolvimento do embrião (Faria et al., 2003).

Algumas enzimas são consideradas essenciais no processo de germinação de sementes. Em sementes de cafeeiro a germinação é limitada pelo endosperma, necessitando do amolecimento deste na região micropilar ou (endosperma cap), para que ocorra a emergência da radícula (Silva et al., 2004). De acordo com estes autores o processo de amolecimento é desempenhado por várias enzimas, principalmente, a endo-β-mananase, que está presente no endosperma das sementes desta espécie e que fica na região próxima à radícula, a qual inibe a força de pressão. Desta forma, o amolecimento é considerado uma conseqüência das atividades das enzimas, que hidrolisam a parede celular, sendo muito investigado nas sementes de tomate, café e alface, nas quais o amolecimento do endosperma correlaciona-se com o aumento da atividade da enzima endo-β-1,4-mananase (Groot et al., 1988; Nonogaki et al., 1992).

A atividade da enzima endo-β-mananase aumenta antes da protrusão radicular (Silva et al., 2002). Entretanto, Takaki & Dietrich (1980) observaram que a atividade da mananase em sementes de cafeeiro foi aumentada somente 10 dias após a embebição. A enzima endo-β-mananase é sintetizada pelas células do endosperma em sementes de cafeeiro. Giorgini et al. (1996) observaram em experimento realizado durante a germinação das sementes de cafeeiro, que a atividade da enzima endo-β-mananase é controlada em parte pelas giberelinas. Esses autores concluíram que a atividade desta enzima e a mobilização de galactomanano na semente de cafeeiro são consideradas fenômenos essencialmente pós-germinativos e que podem ser totalmente controlados pelo embrião.

Silva et al. (2005) relatram que durante a germinação das sementes de cafeeiro os mananos são degradados pela ação da primeira enzima endo-β-mananase, resultando no enfraquecimento das paredes celulares do endosperma.

De acordo com Wolfrom et al. (1961), a inibição da germinação de sementes de cafeeiro pelas giberelinas pode ser causada pela liberação em excesso de manose, provavelmente inibindo o crescimento do embrião, uma vez que a parede celular do endosperma dessas sementes é composta essencialmente de mananas. Já Silva (2002), sugeriu que a inibição da germinação por giberelina exógena provavelmente seja causada pelo excesso desta, liberada durante ou após o enfraquecimento do endosperma e que, conseqüentemente, pode atingir o embrião, causando a morte das células do eixo embrionário. Este autor ainda acrescentou que a giberelina exógena acelerou a degradação deste endosperma.

Bewley et al. (1997) clonaram o gene que codifica para uma endo-β-mananase em sementes de tomate. Estes autores encontraram baixa homologia com mananase de fungos (28-30%) e observaram que sua expressão é exclusiva do endosperma, sendo ausente em outras partes da planta. De acordo com esses autores esta seqüência gênica é considerada uma ferramenta valiosa para se estudar o controle da produção da endo-β-mananase e, especificamente, compreender como a giberelina e o ácido abscísico afetam o catabolismo dos mananos.

A β-manosidase é considerada outra enzima que atua nos processos de germinação em sementes de cafeeiro. Silva (2002) observou que esta enzima tem sido pouco monitorada nas diferentes partes das sementes, nas quais, sua atividade é aumentada, principalmente no endosperma cap antes de ocorrer a protrusão. Durante a germinação a β-mananase quebra a cadeia de mananos, liberando 4 resíduos, de manose e a β-manosidase quebra esses resíduos liberando uma manose (Bewley & Black, 1994), as quais tem sido caracterizadas em diversas espécies. Silva et al. (2005) observaram acréscimo da enzima β-manosidase no endosperma cap aos 11 dias de embebição em água. Esses autores, ainda observaram que essa enzima atua no enfraquecimento do endosperma cap. Esses mesmos autores, também observaram que, quando as

sementes foram embebidas numa concentração de 100 µM de giberelina a atividade da β-manosidase foi mais alta aos oito dias de embebição.

A luz representa outro fator ambiental, com efeito, sobre o processo germinativo, podendo estimulá-lo ou inibi-lo. As sementes podem ser consideradas fotoblásticas positivas, quando dependem da luz para promoverem a germinação; fotoblásticas negativas, quando a germinação é reduzida ou inibida na presença de luz e fotoblásticas independentes, quando germinam indiferentemente à condição de luz (Marcos Filho, 2005). Em muitas espécies fotoblásticas positivas, a necessidade de luz para a germinação pode ser substituída pela aplicação exógena de giberelinas (Grubisic et al., 1988).

A ativação das sementes pela luz está relacionada a um pigmento denominado fitocromo, o qual ao absorver luz num determinado comprimento de onda, muda de estrutura bioquímica, permitindo ou não resposta fotomorfogenética (Borges & Reno, 1993). O fitocromo está sempre associado ao funcionamento das membranas biológicas, regulando, provavelmente, sua permeabilidade e, controlando dessa maneira, o fluxo de inúmeras sustâncias dentro das células e entre elas (Taiz & Zeiger, 2004).

Outro fator que pode inibir a germinação de sementes de cafeeiro é a luz. Válio (1976) descreveu que a inibição por esse fator é devido aos processos enzimáticos que ocorrem no endosperma. Esse autor ainda relata que, possivelmente, o efeito inibitório da luz seja devido à síntese ou liberação de giberelinas, embora a luz e giberelina não inibam o crescimento do embrião. Desta forma, é provável que o efeito inibitório do ácido giberélico sobre a germinação das sementes de cafeeiro seja indireto, causado pela manose, que é o produto de reações enzimáticas ativadas no endosperma. Já Takaki & Dietrich (1980) observaram em sementes de café que a luz somente adia o processo de germinação.

Silva et al. (2005) observaram que a semente de cafeeiro, embebida em água, no escuro, teve germinação de quase 100%, em contrapartida, quando realizada no claro e em água, a germinação foi de apenas 75%. Também, Válio (1976) observou que a giberelinanuma concentração de 0.1 µM no escuro inibiu a germinação de sementes da espécie em estudo. Esse autor revelou que este efeito é mais evidente, quando as sementes são embebidas na luz, pois estas sementes são sensíveis à luz. Desta forma, a germinação das sementes de cafeeiro no escuro é mais rápida do que no claro.

Outro fator associado ao processo de germinação de sementes é referente aos retardantes de crescimento, que podem atuar no controle da germinação, crescimento e florescimento. Um dos retardantes bastante utilizado é o paclobutrazol ou PBZ (C15H20OCIN3O ), pertencente ao grupo químico dos

triazoles, com atividade sobre o retardamento do crescimento de plantas (Greabe, 1987). Este regulador é absorvido pelas raízes com mais eficiência do que pelos ramos, sendo considerado um inibidor da biossíntese das giberelinas endógenas (Rademacher, 2000 e Silva, 2005). Ele reduz a divisão e o alongamento das células (Albuquerque et al., 1999) e, também, pode melhorar a germinação das sementes em algumas espécies (Karssen et al., 1989; Rademacher, 2000). Várias espécies têm sido tratadas com este regulador e, em geral, os efeitos parecem comuns, contudo, pouco se conhece sobre seus efeitos nos processos fisiológicos das plantas (Wample & Culver, 1983).

O principal efeito bioquímico do paclobutrazol é a supressão da formação de giberelina pela inibição da oxidação do caurene para ácido caurenóico no metabolismo biossintético. Esses inibidores de crescimento têm tido grande potencial de utilização na agricultura, em função de seus efeitos sobre diferentes processos fisiológicos das plantas (Resende et al., 2001).

Conforme resultados obtidos por Debeaujon & Koornneef (2000), a adição de giberelinas exógenas em sementes de Arabidopsis reverteu

completamente o efeito dos inibidores como o paclobutrazol ou tetraciclasis que podem causar a esta espécie. De acordo com este autor este fato ocorreu, porque as giberelinas são sintetizadas de novo durante a germinação. Também, Silva et al. (2004) observou que a adição de 100 µM de giberelinas exógenas às sementes de Tabebuia impetiginosa aumentou o tamanho da radícula. Entretanto, a germinação foi totalmente inibida, quando estas sementes foram embebidas numa solução 100 µM de paclobutrazol. Este fato pode ser explicado, uma vez que as giberelinas exógenas superam a inibição da germinação imposta pelo paclobutrazol, confirmando que a as giberelinas são sintetizadas de novo durante a germinação. Os autores também concluíram que as giberelinas são consideradas importantes reguladores do processo de germinação em Tabebuia impetiginosa.

Em pesquisa realizada com sementes de cafeeiro, Silva et al. (2005) observaram que a geminação foi completamente inibida, quando as sementes foram embebidas numa concentração de 300 µM de paclobutrazol. No entanto, esses autores ressaltaram que com a aplicação de 2 µM de giberelina na solução de paclobutrazol às sementes, houve uma germinação de 70%. Esse fato, provavelmente ocorreu devido ao requerimento da biossíntese de giberelina, na germinação de sementes de cafeeiro. Assim, embora a giberelina exógena iniba a germinação, há necessidade de giberelina endógena para ocorrer a germinação. 2.3 Hidrólise e mobilização de reservas na germinação

As substâncias de reservas (carboidratos, lipídeos e proteínas) armazenadas nas sementes são mobilizadas após a germinação, durante o desenvolvimento das plântulas e seus produtos de degradação são usados para diferentes propósitos, como a geração de energia e a produção de matéria prima (proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídeos), para a construção de novos tecidos e células (Mayer & Poljakoff-Mayber, 1975). Estas substâncias de

reservas não podem ser transportadas de uma célula para outra, até os pontos de crescimento do embrião e, tão pouco, serem utilizadas na formação de novos tecidos e paredes celulares, antes de serem simplificados. Desta forma, o processo de hidrólise das reservas e sua transformação em substâncias solúveis e difusíveis, sob controle enzimático, caracteriza a digestão das reservas (Marcos Filho, 2005).

Durante a germinação das sementes o processo de hidrólise das reservas, é realizado por várias enzimas hidrolíticas, que atuam numa determinada substância de reserva.

Os galactomananos como compostos de reservas foram detectados em sementes de pimenta (Watkins et al., 1985), aipo (Jacobson & Pressmann, 1979), tomate (Groot et al., 1988), alface (Halmer & Bewley, 1979) e no café tem os mananos como compostos de reserva (Wolfrom et al., 1961).

As sementes de cafeeiro possuem muito pouco amido e alto conteúdo de polissacarídeos associados à parede celular (Wolfrom & Patin, 1964). Destes, a celulose e hemicelulose são encontradas em maior quantidade em sementes dessa espécie. Os mananos e galactomananos são considerados os principais hemiceluloses, os quais são insolúveis em água, contendo aproximadamente 2% de galactose (Bewley & Black, 1994), e também podem servir como reserva, para o desenvolvimento das plântulas (Reid, 1985). Desta forma, esses polissacarídeos que são depositados como fonte de reservas na semente, são degradados durante a germinação pelas enzimas hidrolíticas, principalmente endo-β-mananase, β-manosidase, galactosidase e celulase, resultando no enfraquecimento das paredes celulares do endosperma (Silva et al., 2004). O embrião das sementes de cafeeiro é muito pequeno e tem poucas reservas depositadas, dependendo totalmente do endosperma para se desenvolver. As paredes celulares são degradadas durante a germinação, para prover de energia necessária ao crescimento da plântula (Marcos Filho, 2005). A degradação do

resto do endosperma e a mobilização das reservas ocorrem na fase II da germinação das sementes de café, onde as reservas vão suprir o crescimento do embrião (Silva, 2002).

O galactomanano é degradado em seus monossacarídeos constituintes, como a manose e galactose, sendo que ao mesmo tempo ocorre produção de sacarose (Buckeridge et al., 2000). Assim, a sacarose é considerada o açúcar de transporte, que levará os produtos da mobilização de reserva até o embrião em crescimento. Paralelamente à degradação do galactomanano no endosperma, o amido é produzido temporariamente nos cotilédones (Buckeridge & Dietrich, 1996; Reid, 1971). Assim, Dirk et al. (1999), observaram que a degradação de reservas de parede celular e a síntese de amido poderiam estar bioquimicamente relacionadas.

Ao final do processo de mobilização há uma grande quantidade de açúcares livres e, ao mesmo tempo se estabelece a relação fonte-dreno entre o órgão de reserva e o eixo embrionário. No entanto, a utilização de amido ou de açúcares solúveis é variável, dependendo da espécie, podendo ocorrer durante a germinação ou no estádio de plântula. Suda & Giorgini (2000) observaram que o acúmulo de açúcares solúveis ocorreu no embrião de Euphorbia heterophylla durante a germinação.

Em sementes de cafeeiro, a celulose encontra-se associada aos polissacarídeos, como a hemicelulose, pectina e, lignina, dificultando a sua degradação citado por (Sales et al., 2003). È considerada um componente básico da parede celular e um dos compostos mais abundantes na natureza (Marcondes et al., 1983). A celulase foi pesquisada em sementes de cafeeiro e foi verificado que o aumento da atividade desta enzima ocorre no período de pós-emergência, estando presente em toda a região do endosperma (Takaki & Dietrich, 1980). Esses autores verificaram que a atividade da celulase é aumentada mais precocemente nas sementes incubadas com giberelina. Sales et al. (2003)

observaram em sementes de café cultivar Acaiá, Coffea arabica com pergaminho, embebidas em diferentes concentrações de celulase de Aspergillus niger, maior índice de velocidade de protrusão radicular e porcentagem de germinação, entretanto não foi observado ganho representativo nos valores de emergência. Segundo esses autores o resultado alcançado, provavelmente ocorreu devido à ação dos microrganismos presentes no substrato (solo), que aceleraram o processo de degradação do pergaminho das sementes, conforme descrito por (Guimarães, 1995).

A síntese de proteínas se inicia após completada a hidratação das células nas sementes, sendo que o tempo requerido para o seu início varia de acordo com a espécie, podendo ocorrer dentro de poucos minutos ou demorar várias horas; citado por (Silva et al., 1998). As proteases são enzimas que hidrolisam proteínas de reserva em seus aminoácidos constituintes. Segundo Bewley & Black (1994), as sementes também armazenam triacilgliceróis como fonte de reserva para germinação e crescimento pós-germinativo das plântulas. Os carboidratos, além de serem materiais de reserva em sementes, também vêm sendo associados à tolerância à dessecação.

2.4 Aspectos de substâncias de reservas e tolerância à dessecação em sementes.

São muitos os mecanismos que envolvem a aquisição e manutenção da tolerância à dessecação, as quais conferem proteção contra as conseqüências da perda de água. Brandão Júnior (2000) relatou que as sementes de cafeeiro são classificadas como intermediárias e que a tolerância à dessecação reduz durante o processo de germinação das sementes. Guimarães (2000) verificou redução no vigor e viabilidade das sementes de C. arabica cv. Rubi, colhidas nos estádios verde, verde cana e cereja, quando submetidas a qualquer tipo de secagem. Isso demonstra o caráter de intolerância à dessecação das sementes de cafeeiro.

A aquisição da tolerância à dessecação ocorre durante a maturação, antes que as sementes passem por uma severa redução no seu teor de água. Porém, não se pode determinar se a tolerância é adquirida antes ou em resposta à perda de água durante a maturação (Bewley, 1979). De acordo com Guimarães (1999), as sementes, quando secas, dispõem de alguns mecanismos de proteção capazes de manter estruturados os sistemas de membrana das células, bem como as estruturas das macromoléculas. Após a embebição essas membranas e macromoléculas recuperam suas funções fisiológicas. O desenvolvimento desses mecanismos depende de características genéticas das espécies, que determinam a presença de substâncias, tais como: açúcares solúveis, antioxidantes, enzimas que atuam contra o sistema de oxidação lipídica e, também, as proteínas LEA (late embryogenesis abundant proteins).

O acúmulo de açúcares não redutores tem sido associado à aquisição de tolerância à dessecação. Os açúcares específicos têm se destacado como substitutos da água, os quais podem prevenir os efeitos severos que ocorrem durante a dessecação em sementes, por estabilizarem membranas e proteínas, ou ainda, pela formação de vidro no citoplasma (Leprince et al., 1993). Os tecidos tolerantes são caracterizados por conterem alta quantidade de sacarose e oligossacarídeos, como estaquiose e rafinose e, ainda, por conterem pequena quantidade de monossacarídeos redutores, como: a galactose, manose, frutose e glicose (Kuo et al., 1998 e Leprince et al., 1992). Segundo Brenac et al. (1997), os oligossacarídeos estão distribuídos em muitas espécies de sementes, localizados em tecidos que permanecem viáveis após a dessecação, incluindo o embrião e a camada de aleurona.

As sementes de cafeeiro contêm muitos carboidratos que são divididos em grupos distintos, de acordo com seus pesos moleculares. Os polissacarídeos são considerados constituintes importantes em sementes de cafeeiro e estão em quantidades que variam de 40% a 50% (Clark & Macrae, 1985). Os teores de

carboidratos em Coffea arabica variam de 55% a 65%, dos quais 6% a 12,5% são de carboidratos solúveis; 34% a 53%, de insolúveis e 15 a 3%, de lignina (Rinantonio, 1987).

A sacarose destaca-se como sendo o açúcar encontrado em maior quantidade na semente de cafeeiro. Os teores de sacarose dependem da espécie, variedade, estádio de maturação das sementes e das condições de processamento e armazenamento (Clark & Macrae, 1985). Abraham (1992) encontrou porcentagem de sacarose, em base seca, de 6% a 10%. Estes resultados corroboram com os encontrados por Rotemberg & Iachan (1972), onde a porcentagem deste açúcar foi 7,2% e, também, aqueles encontrados por (Guimarães, 2000), que observou teores médios de 5,99% de sacarose em embriões de sementes de cafeeiro. Também Lima (2005) observou que a sacarose foi o açúcar encontrado em maior porcentagem nas sementes de cafeeiro, em torno de 6,1%.

Segundo Rogers et al. (1999), a glicose e a frutose são classificadas como açúcares redutores encontrados em maior quantidade em sementes da espécie em estudo, no início da maturação dos frutos.

Durante a maturação das sementes, além das mudanças que ocorrem no conteúdo de açúcares, há, também, aquelas que ocorrem nas proteínas como as LEA. Estas proteínas são consideradas coadjuvantes de importância nos mecanismos que previnem os danos provenientes da remoção de água dos tecidos, que são acumuladas durante os estádios mais tardios do desenvolvimento, antes ou durante a secagem. Essas proteínas conferem às sementes capacidade de germinarem após secagem e subseqüente reidratação (Bewley & Black, 1994; Faria et al., 2003; Guimarães, 2000). As proteínas LEA têm função protetora e são induzidas por ABA (Leprince et al., 1993), sendo que sua expressão cessa rapidamente após embebição das sementes (Blackman et al., 1991; Blackman et al., 1992).

Guimarães et al. (2002), trabalhando com sementes de café cv. Rubi, colhidas em diferentes estádios de desenvolvimento observou aumento de proteínas LEA e também que estas podem contribuir para a tolerância à dessecação em sementes de cafeeiro.

As proteínas LEA têm alta solubilidade e estabilidade em água, mesmo em ebulição, sendo esta característica atribuída à proporção de aminoácidos hidrofílicos, principalmente glutamina e glicina (Walters et al., 1997). Além da função protetora, esta pode atuar na formação de pontes de água e substituição de àgua, ajustamento osmótico e, ainda, podem atuar como agentes protetores de componentes celulares, principalmente pela habilidade de formar espirais amorfas, com o objetivo de protegê-las contra danos de rompimento na ausência de água (Black et al., 1999; Kermode, 1997). Estas proteínas resistentes ao calor foram primeiramente descobertas em embriões de algodão e, mais tarde, detectadas em outras espécies, como: ervilha, soja, arroz, cenoura, mamona, beterraba, Arabidopsis e cereais, atuando em estádios tolerantes à dessecação, durante o desenvolvimento das sementes ou após o início de embebição (Blackman et al., 1992; Koornneef et al., 1989).

Walters et al. (1997) sugerem que as proteínas LEA podem ligar íons e água, podendo estar associadas aos açúcares, controlando a taxa de perda de água, mantendo assim, a viabilidade das sementes ortodoxas em seu estado seco. Estas proteínas são extraídas em condições de alta temperatura e não possuem atividade catalítica aparente.

As deidrinas, consideradas o grupo mais importante de LEA, acumuladas durante a fase final da embriogênese, são produzidas pelas partes vegetativas das plantas, em resposta às baixas temperaturas, à aplicação do ABA ou, ainda, por condições que impõe um estresse hídrico. No entanto, estas proteínas, devido a sua natureza anfipática são capazes de inibir a desnaturação de macromoléculas e, ainda, estabilizar estruturas intracelulares, sob condições

de estresse, incluindo estresse hídrico severo (Blackman et al., 1995; Close, 1997).

As proteínas de choque térmico (Heat Shock Proteins-HSPs) constituem uma classe de proteínas resistentes ao calor, que são expressas durante o desenvolvimento das sementes, em respostas ao calor e outros estresses, amenizando os problemas causados pela agregação e má estruturação de proteínas.

Segundo Vertucci & Farrant (1995), a função das HSPs está relacionada à preservação e ao reparo das estruturas macromoleculares durante a desidratação ou reidratação. Estas proteínas têm, geralmente, seu peso molecular conhecido e é representado em kDa, como as Hsp 60; Hsp 70; Hsp90 e Hsp100 (Gurley, 2000). Dentre elas, as “small Heat Shock Proteins-sHSPs,” são as que mais ocorrem em plantas (Mansfield, 1987) e apresentam baixo peso molecular, variando de 15 a 28 kDa (Sun et al., 2002; Vierling, 1991).

Gallardo et al. (2001) observaram que a quantidade de algumas proteínas LEA e Hsp 70 reduziram com o final do processo de germinação, ao passo que outras permaneceram constantes, durante todo esse processo, indicando que algumas LEA e HSPs podem exercer uma função protetora, não somente durante a maturação das sementes, mas também ao longo de todo o processo germinativo.

Outros mecanismos que conferem proteção às sementes são os antioxidantes e as enzimas, que atuam contra o sistema de oxidação lipídica. Os antioxidantes são moléculas removedoras de radicais livres, dentre eles os lipossolúveis, como: tocoferol (vitamina E e β-carotenos, flavonóides) e os solúveis em água (ácido ascórbico, vitamina C, glutationa). Os tocoferóis são considerados bloqueadores da peroxidação de lipídeos. As sementes contêm altas concentrações dessas substâncias, variando conforme os diferentes tecidos e sementes (Franzen & Haas, 1991).

Segundo Gorecki & Harman (1987), os antioxidantes reduzem a velocidade de envelhecimento de sementes, uma vez que alguns processos oxidativos podem ser importantes na deterioração. Wilson Júnior & Mcdonald Júnior (1986), relataram que estas substâncias podem ter um papel importante nas pesquisas no intuito de aumentar o período de armazenabilidade das sementes. Os antioxidantes como a vitamina C, E e β carotenos auxiliam no controle da oxidação dos ácidos graxos, ligando-se ao oxigênio ativado. Essas substâncias evitam que o oxigênio se ligue ao ácido graxo insaturado e provoque a quebra dos mesmos, os quais gerariam radicais livres e peróxidos instáveis, que são prejudiciais às sementes de cafeeiro.

A redução na atividade das enzimas removedoras de peróxidos podem contribuir com o processo de deterioração. Basavarajappa et al. (1991) concluiu que a redução na atividade dessas enzimas faz com que as sementes se tornem mais sensíveis aos efeitos do O2 e radicais livres. Segundo Mcdonald (1999), a

produção de radicais livres afeta a formação de várias enzimas e degrada a síntese de novas proteínas, que ocorrem durante a germinação.

Os radicais livres são produzidos durante o metabolismo da planta, particularmente em cloroplastos e mitocôndrias (Puntarulo et al., 1991). O dioxigênio (O2) é considerado não reativo (não ativo) e não tóxico, porém,

devido à estrutura instável dos elétrons na sua camada externa pode dar origem a estados excitados, como os radicais livres, com reatividade muito maior (Rice-Evans et al., 1991; Scandalios, 1993). O O2 é um elemento essencial à vida dos

organismos superiores, todavia em excesso pode tornar-se perigoso. Desta forma, se a produção de radicais livres não for controlada, esses podem tornar-se destrutivos para as células e tecidos, podendo reagir com ácidos graxos insaturados das membranas e alterar a sua funcionalidade, diminuir a capacidade de fixação de carbono em cloroplastos, promover peroxidação de lipídios,

inativação de enzimas e degradação de ácidos nucléicos (Goodman, 1994; Rice-Evans et al., 1991; Scandalios, 1993).

Os radicais livres são formados por fatores estressantes como radiações ultravioletas, iônicas, campos magnéticos, fatores químicos (desordem nutricional e redistribuição de íons metálicos), fatores mecânicos (impacto osmótico, mudanças drásticas de temperatura e pressão) e influências biológicas, que induzem a ativação dos processos oxidativos e antioxidativos (Goodman, 1994; Rice-Evans et al., 1991).

Em estudos sobre o papel de antioxidantes durante a germinação foi observado que os mecanismos protetores contra o oxigênio ativado são predominantemente enzimáticos. Estes sistemas incluem as enzimas: superóxido dismutase (SOD), catalase, peroxidase, glutatione redutase (Leprince et al., 1990; Puntarulo et al., 1991), a ascorbato peroxidase e o sistema de reciclagem do ascorbato (Cakmak et al., 1993). Estas enzimas envolvem o sistema de proteção contra a deterioração. De acordo com Jeng & Sung (1994), a presença da enzima SOD em sementes secas poderá ter papel na restrição de dano de peroxidação, após a embebição destas. Isso pode ser explicado pelo fato destas sementes serem incapazes de sintetizar ou ativar essa enzima após a embebição.

A peroxidase é uma enzima removedora de peróxido e a redução de sua atividade faz com que as sementes fiquem mais sensíveis aos efeitos de O2 e

radicais livres sobre ácidos graxos insaturados de membrana, provocando a degeneração das membranas e, assim, comprometendo o vigor (Brandão Júnior, 1996).

A catalase é uma enzima que está envolvida na remoção de peróxido de hidrogênio Fridovich (1986) e que pode desempenhar o controle desses peróxidos, por meio do ciclo de oxidorredução. Nkang et al. (2000) observaram um decréscimo em atividades de catalase e superóxido dismutase, importantes mecanismos de defesa celular, associado aos aumentos, em níveis de

hidroperóxidos, durante o processo de secagem de sementes de Telfairia occidentalis, sensíveis à dessecação. Já, Brandão Junior et al. (2002) observaram que as funções metabólicas da enzima catalase sugeram aumento da tolerância à dessecação com a evolução das sementes. Li & Sun (1999) observaram aumentos em peroxidação de lipídios em eixos embrionários de Theobroma cacao, durante dessecação e um associado decréscimo em sistemas enzimáticos de proteção. Segundo os autores, esses resultados sugerem um aumento no teor de radicais livres oxidativos, embora não quantificados, os quais podem causar danos em membranas, confirmados pelo aumento em lixiviação de eletrólitos e perda de viabilidade das sementes intolerantes resultando em danos oxidativos. 2.5 Polifenoloxidase e polifenóis

A polifenoloxidase (PPO) é uma enzima cúprica (Robinson & Eskin, 1991), largamente distribuída na natureza. Está relacionada com o escurecimento enzimático de frutos e vegetais e, também, com a qualidade da bebida em café (Amorim, 1978; Carvalho et al., 1997). Esta enzima foi detectada em várias partes do fruto de café e se encontra ligado às membranas celulares. No entanto, quando estas membranas sofrem danos, liberam as PPO que são ativadas, podendo reagir com substratos fenólicos intra e extracelulares, oxidando-os a quinonas (Amorim, 1978). As quinonas inibem a atividade da polifenoloxidase (Whitaker, 1972). Eskin (1990) relatou que esta enzima é intracelular e encontra-se localizada principalmente na membrana dos cloroplastos, participando dos processos de respiração, resistência a infecções e biossíntese de certos constituintes vegetais, como os flavonóides e quinonas.

Diversos fatores como tipo de cultivo, processamento e condições de armazenamento, contribuem para a redução na atividade da PPO (Oliveira et al., 1976; Valência, 1972). Contudo, outros fatores, como por exemplo, o uso de inseticidas, pode diminuir a qualidade da bebida, sem reduzir a atividade da PPO

(Oliveira et al., 1979). De acordo com Amorim (1978), o mecanismo de oxidação de polifenóis pela enzima PPO é considerado como uns dos principais eventos bioquímicos indutores da depreciação da qualidade da bebida do café.

Carvalho et al. (1994) observaram que há variações na atividade de polifenoloxidase, as quais permitem separar as classes de bebida de café, sendo que cafés de bebida inferior apresentaram baixa atividade (55,99u/min/g) e cafés de bebida superior apresentaram maior atividade na amostra de (67,66 a 74, 66u/min/g). A redução na atividade desta enzima está relacionada à integridade de membranas, onde há comprometimento da estrutura celular, pela alteração nas membranas. Essa enzima, que é exclusiva de palstídeos, entra em contato com os compostos fenólicos, armazenados no vacúolo. Assim, durante o processamento haveria a oxidação de fenóis, que convertidos a quinonas reagiriam com as proteínas.

Lima (2005) observou um aumento na atividade da enzima polifenoloxidase nas sementes de café cultivar Robusta Tropical secas à sombra. Esse autor observou que esses resultados podem ser confirmados pelos menores valores de condutidade elétrica e melhor qualidade fisiológica nos testes de germinação, emergência de plântulas e índice de velocidade de emergência. Segundo Amorim (1978), sementes que apresentam atividade desta enzima mais elevada são aquelas que tem maior integridade no sistema de membranas.

Segundo Carvalho et al. (2001 b), os polifenóis são facilmente oxidáveis, pelas enzimas vegetais por metais como ferro e manganês, luz, calor e, também pelo meio alcalino, ocasionando o escurecimento de suas soluções ou de compostos isolados. Os polifenóis podem ser encontrados em quase todos os vegetais. Têm estruturas químicas relativamente simples ou complexas, como taninos e ligninas. Estes são responsáveis pela adstringência dos frutos e, principalmente no café, interferem no sabor e aroma (Menezes et al., 1990).

Dentre os polifenóis, os ácidos clorogênicos são considerados produtos secundários nas plantas e têm como função principal controlar os níveis de ácido indol acético. Segundo Carvalho et al. (2001 b) as concentrações desses ácidos no café são maiores do que na maioria das plantas. Os ácidos clorogênicos proporcionam outras funções como: proteção ao ataque de insetos, pássaros e mamíferos predatórios, contra a invasão de microrganismos, atua como precursor da camada inicial de proteção aos danos físicos sofridos pela planta, precursores na biossíntese da lignina e, também, atua na formação dos pigmentos verdes do grão (Clifford, 1985).

Os polifenóis também apresentam outra função como antioxidantes e protetor dos aldeídos, destacando-se entre eles os ácidos clorogênico e caféico (Amorim & Silva, 1968). Assim, quaisquer condições adversas que ocorram ao grão, tais como, colheita inadequada, problemas no processamento e/ou no armazenamento, podem ativar as enzimas polifenoloxidases, que irão agir sobre os polifenóis, reduzindo sua ação antioxidante sobre os aldeídos, conseqüentemente, afetando o sabor do café e reduzindo o conteúdo desse composto nas sementes. Lima (2005) observou menores teores de polifenóis nas sementes de café secas, em terreiro suspenso, desmucildas em água, com hidróxido de sódio sem armazenamento e, também, naquelas secas à sombra aos oito meses de armazenamento. Segundo esse autor esse resultado provavelmente ocorreu devido à maior atividade da enzima polifenoloxidase e, conseqüentemente, maior oxidação dos polifenóis, que constituem seu principal substrato.

Ohiokpehai et al. (1982) observaram que sementes velhas de cafeeiro possuem menor atividade de polifenoloxidase e baixas quantidades de ácido clorogênico extraível. No entanto, Amorim et al. (1974) observaram que em sementes novas de cafeeiro, há menores teores de ácido clorogênico em cafés com qualidade superior. Illy & Viani (1995) relataram que há variações nos

teores desses ácidos entre as espécies comerciais, sendo que o Coffea robusta contém 7 a 10 %, enquanto o Coffea arabica 5 a 7,5 %.

Em sementes de arroz, a restrição à entrada de oxigênio deve-se principalmente à presença de compostos fenólicos na casca, embora estes possam ocorrer também no embrião (Edward 1973, Vieira 1991). Estes compostos fixam o oxigênio que está sendo absorvido, sendo que, a quantidade de gás que chega à semente não é suficiente para que ocorra a germinação. Segundo Amorim (1968), os compostos fenólicos interferem no balanço entre promotores e inibidores da germinação, conseqüentemente, podem ser uma barreira à difusão de gases em sementes umedecidas. Cícero (1986) atribui o consumo de oxigênio pelo tegumento em algumas espécies, à oxidação de vários compostos fenólicos, tais como: floridizin, ácido clorogênico, e ácido para-cumaril-químico, presentes na casca.

Pelo exposto, observa-se que são vários os fatores que interferem na qualidade fisiológica de sementes de cafeeiro, envolvendo a participação de hormônios, enzimas específicas, proteínas específicas e açúcares, sendo que muitos desses fatores não se encontram elucidados.

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