Farmacogenética em toxicologia forense : estudo do gene CYP2D6 em amostras post mortem com tramadol

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UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE MEDICINA DE LISBOA

Farmacogenética em Toxicologia Forense:

Estudo do gene CYP2D6 em amostras post mortem com tramadol

Suzana de Morais Valente Martins da Fonseca

Orientador: Mestre Mário João Dias

Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P.

Co-Orientador: Prof. Doutor Jorge Costa Santos

Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Dissertação especialmente elaborada para obtenção do grau de Mestre em Medicina Legal e Ciências Forenses

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Todas as afirmações contidas neste trabalho são da exclusiva responsabilidade do seu autor, não cabendo à Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa qualquer responsabilidade pelos conteúdos apresentados.

A impressão desta dissertação foi aprovada pelo Conselho Científico

da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa em reunião de

19 de janeiro de 2016.

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Divulgação Científica

Os resultados obtidos com este trabalho foram submetidos para publicação sob a forma de artigo científico com o título “Sequencing CYP2D6 for the detection of

poor-metabolizers in post-mortem blood samples with tramadol” na revista Forensic Science International, estando à data em fase de revisão.

O trabalho desenvolvido foi também alvo de divulgação na comunidade científica através de comunicações orais e comunicações em painel (“poster”), em encontros nacionais e internacionais.

Comunicações orais:

Sequencing CYP2D6 in post-mortem blood samples with high concentration of tramadol for the detection of *3, *4, *6, *8, *10 and *12 alleles, 53rd TIAFT Meeting, 31 - 4 agosto, 2015, Florença, Itália.

Farmacogenética em toxicologia forense aplicação a amostras post mortem para interpretação de resultados em casos de tramadol; II Jornadas Ibéricas de Toxicologia, 13-15 de Novembro de 2014, Covilhã, Portugal.

Patologia molecular: aplicação da farmacogenética na interpretação de resultados toxicológicos de amostras post mortem; I Conferência do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, 30 a 31 de Outubro de 2014, Coimbra, Portugal.

Comunicações em painel:

Pharmacogenetics application to forensic toxicology: Sequencing CYP2D6 in post-mortem blood samples with high concentration of tramadol for the detection of *3, *4, *6, *8, *10 and *12 alleles; 9th ISABS Conference on Forensic and Anthropologic Genetics, June 22-26, 2015, Republic of Croatia Pharmacogenetics application to forensic toxicology: Sequencing CYP2D6 in

post mortem blood samples with high concentration of tramadol; SPGH 18th annual reunion, 19 – 21 November, 2014, Lisbon, Portugal.

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Agradecimentos

Ao meu orientador, Mestre Mário João Dias, o meu profundo reconhecimento por me ter dado esta oportunidade, pela inspiração quer na escolha do tema quer na pessoa que é, pelos conselhos e críticas que me permitiram fazer mais e melhor, e acima de tudo por acreditar em mim.

Aos meus orientadores Mestre António Amorim e Mestre Heloísa Afonso Costa pela disponibilidade, incentivo, confiança e por todos os conhecimentos científicos que me transmitiram, guiando os meus passos na descoberta desse “mundo novo” da Genética Forense.

Ao meu orientador Professor Jorge Costa Santos por toda a disponibilidade, aconselhamento e apoio prestado.

À Mestre Maria João Porto, na qualidade de Diretora do Serviço de Genética e Biologia Forenses, e também à Dra. Teresa Ribeiro, na qualidade de Coordenadora da Unidade Funcional da delegação Sul, por me permitirem a realização do projeto nas instalações deste Serviço e disponibilização dos meios necessários à sua concretização. Também um sincero agradecimento a toda a equipa do laboratório de Genética, bem como colegas de estágio e mestrandas, pelas ajudas técnicas, apoio e boa disposição.

Ao Mestre João Miguel Franco, na qualidade de Director do Serviço de Química e Toxicologia Forenses, mas também na qualidade de colega e amigo, com quem muito aprendi desde que entrei no, então, IMLL.

Aos meus colegas e amigos do SQTF, companheiros de venturas e desventuras deste e de outros projetos: Carla Mustra, Mário Barroso, Suzel Costa, Nuno Gonçalves, Francisco Vale, Susana Simões, António Castañera, Elsa Rodrigues, Luísa Almeida e Paula Rodrigues. Também à Catarina Mourato, à Rita Garção, ao David Pereira e à Alexandra Gonçalves pelo incentivo e pela troca de ideias.

Aos Amores da minha vida: Gabriel Morais Gonçalves, Joana Morais Gonçalves, Miguel Costa, Célia Figueira, Tiago Martins da Fonseca e José Martins da Fonseca, que são o meu suporte, a minha força e estão sempre a meu lado.

À restante família e amigos e a todos os que de uma forma ou de outra estiveram presentes e me ajudaram neste percurso.

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Desloquei-me para tudo ver de um outro lado:

Levei o meu olhar, o desejo de um princípio infinitamente retomado. Ganhei sonoridade nas vozes que me habitavam silenciosamente.

Entre mar e terra eu preferia ser espuma, ter raiz e poente entre oceano e continente.

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Suzana Fonseca Página 1

Índice

Índice ... 1 Índice de Anexos ... 4 Índice de tabelas ... 5 Índice de figuras ... 7 Abreviaturas e Siglas ... 9 2 Resumo ... 13 Abstract ... 15 3 Introdução ... 17

3.1 A Medicina Legal em Portugal ... 17

3.2 Interpretação de resultados post mortem ... 20

3.3 Farmacocinética ... 24

3.4 Farmacogenética ... 28

3.4.1 Resumo histórico ... 28

3.4.2 Aplicação da farmacogenética ... 30

3.4.3 Genótipo e Fenótipo ... 31

3.4.4 Farmacogenética em contexto forense ... 33

3.5 CYP2D6 ... 35 3.5.1 Enzima CYP2D6 ... 39 3.5.2 Gene CYP2D6 ... 41 3.5.3 Variantes genéticas ... 42 3.5.4 Diferenças populacionais ... 43 3.5.5 Casos publicados ... 45 3.6 Tramadol ... 46

3.7 Técnicas e métodos de genotipagem ... 52

4 Objetivos ... 55

5 Materiais e Métodos ... 57

5.1 Amostragem ... 57

5.2 Metodologia de análise genética ... 58

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5.2.2 Extração de ADN ... 59

5.2.3 Quantificação ... 60

5.2.4 Seleção dos alelos ... 60

5.2.5 Amplificação por PCR ... 61

5.2.6 Purificação dos produtos amplificados ... 64

5.2.7 Verificação em gel de poliacrilamida ... 64

5.2.8 Sequenciação ... 64

5.2.9 Detecção por eletroforese capilar ... 66

5.2.10 Análise dos resultados ... 67

5.3 Validação do método de análise genética ... 67

5.3.1 Especificidade e Exatidão ... 68

5.3.2 Limiares analíticos ... 70

5.3.3 Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade ... 70

5.3.4 Qualidade média dos resultados. ... 71

5.4 Metodologia de quantificação de tramadol e metabolitos ... 71

5.4.1 Preparação das amostras ... 72

5.4.2 Extração em fase sólida ... 72

5.4.3 Análise por GC/MS ... 73

5.4.4 Avaliação dos resultados ... 73

5.5 Validação do método de quantificação de tramadol e metabolitos ... 74

5.5.1 Especificidade/seletividade, capacidade de identificação e avaliação de interferentes ... 75

5.5.2 Eficiência da extração ... 76

5.5.3 Limiares analíticos: Limite de Detecção e Limite de Quantificação ... 76

5.5.4 Linearidade e Modelo de Calibração ... 76

5.5.5 Precisão Intermédia, Repetibilidade e Exatidão. Arrastamento entre análises consecutivas. ... 77

5.5.6 Robustez ... 78

5.6 Metodologia para a análise estatística da correlação entre os resultados da análise genética e toxicológica ... 78

6 Resultados ... 79

6.1 Validação do método de análise genética ... 80

6.1.1 Especificidade e exatidão ... 81

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6.1.3 Precisão do método: repetibilidade e reprodutibilidade ... 85

6.1.4 Qualidade média dos resultados. ... 86

6.2 Validação do método de quantificação do tramadol e metabolitos ... 89

6.2.1 Especificidade/Seletividade, Capacidade de Identificação e Avaliação de interferentes ... 89

6.2.2 Eficiência da extração ... 89

6.2.3 Limiares analíticos: Limite de Detecção e Limite de Quantificação ... 90

6.2.4 Linearidade e Modelo de Calibração ... 90

6.2.5 Precisão Intermédia e Repetibilidade ... 92

6.2.6 Exatidão ... 92

6.3 Resultados de amostras ... 94

6.4 Estudo de casos ... 104

7 Discussão ... 107

7.1 Metodologia de análise genética ... 107

7.2 Metodologia de análise toxicológica ... 113

7.3 Resultados do estudo das amostras ... 114

8 Perspetivas futuras ... 117

9 Conclusões ... 119

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Índice de Anexos

Anexo I – Certificados dos Materiais de Referência usados na Validação do Método de Análise Genética ... A3

Anexo I.1. Certificado do material de referência MR1 (CYP2D6*4) ... A3 Anexo I.2. Certificado do material de referência MR2 (CYP2D6*3) ... A4 Anexo I.3. Certificado do material de referência MR3 (CYP2D6*6) ... A5 Anexo II – Resultados de Validação do Método de Análise Genética... A6 Anexo II.1. Sequências analisadas no software Sequencing analysis ... A6 Anexo II.2. Variantes genéticas identificadas com o SeqScape nas amostras. ... A8 Anexo III – Fórmulas de Cálculo Utilizadas na Validação do Método de Quantificação de Tramadol e Metabolitos ... A9

Anexo III.1. Recuperação ... A9 Anexo III.2. Teste da Homogeneidade de Variâncias (Teste F) ... A9 Anexo III.3. Modelo de Calibração ... A10 Anexo III.4. Precisão Intermédia, Repetibilidade e Limite de Repetibilidade ... A11 Anexo III.5. Exatidão e Cálculo da Incerteza ... A12 Anexo IV – Resultados de Validação do Método de Quantificação de Tramadol e Metabolitos ... A14

Anexo IV.1. Linearidade ... A14 Anexo IV.2. Precisão intermédia e repetibilidade ... A18 Anexo IV.3. Exatidão e Incerteza do método ... A23 Anexo IV.4. Espectros de massa do Tramadol, N-desmetil-tramadol e O-desmetil-tramadol ... A27

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Índice de tabelas

Tabela 1. Classificação dos genótipos CYP2D6 em função do fenótipo esperado... 32

Tabela 2. Distribuição populacional da prevalência dos alelos mais estudados e a correspondente atividade enzimática. ... 44

Tabela 3. Prevalência dos fenótipos da enzima CYP2D6 na população caucasiana ... 44

Tabela 4. Sequências dos primers e localização dos fragmentos. ... 63

Tabela 5. Condições dos ciclos de temperatura da reação de PCR. ... 63

Tabela 6. Condições dos ciclos de temperatura da reação de sequenciação. ... 65

Tabela 7. Extração em fase sólida com colunas Waters Oasis HLB®. ... 72

Tabela 8. Descrição dos parâmetros de análise instrumental por GC/MS. ... 73

Tabela 9. Tolerância máxima para as áreas relativas dos iões diagnóstico. ... 74

Tabela 10. Códigos das amostras utilizadas nos ensaios de validação do método. ... 81

Tabela 11. Resultados da pesquisa das sequências obtidas para 3 amostras com o BLAST. ... 82

Tabela 12. Perfil genético dos Materiais de Referência. ... 84

Tabela 13. Resultados obtidos no ensaio do limite de detecção. ... 84

Tabela 14. Resultados obtidos no ensaio de reprodutibilidade para 15 amostras. ... 85

Tabela 15. Resultados obtidos no ensaio de repetibilidade. ... 85

Tabela 16. Valores médios de sinal e de sinal/ruído obtidos no ensaio de validação da qualidade média dos resultados. ... 87

Tabela 17. Valor de sample score obtidos no ensaio de validação ... 87

Tabela 18. Critérios de aceitação usados no ensaio de validação da qualidade média dos resultados ... 88

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Tabela 20. Somatório dos desvios dos calibradores em 5 curvas de calibração, bem

como o fator de correlação médio, para cada fator de ponderação ... 91

Tabela 21. Coeficientes de variação do estudo da precisão intermédia. ... 92

Tabela 22. Recuperações médias obtidas nas três gamas de concentrações. ... 92

Tabela 23. Incerteza obtida durante a avaliação do parâmetro da exatidão. ... 93

Tabela 24. Resumo dos resultados de validação do método de quantificação. ... 93

Tabela 25. Resumo dos resultados de genotipagem e de quantificação de tramadol... 96

Tabela 26. Frequências alélicas obtidas nas amostras post mortem. ... 98

Tabela 27. Frequência de genótipo e fenótipo previsto para as amostras post mortem. ... 98

Tabela 28. Estatística descritiva das concentrações de tramadol (TMD), N-desmetiltramadol (NDT) e O-N-desmetiltramadol (ODT) obtidas nas 100 amostras post mortem analisadas. ... 99

Tabela 29. Resultados de p-value por aplicação dos testes de Mann-Whitney e de Jonckheere-Terpstra (JT) para comparação entre grupos. ... 103

Tabela 30. Resumo da informação fornecida ao SQTF e dos resultados obtidos na análise toxicológica e genética dos casos de metabolizadores lentos. ... 105

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Índice de figuras

Figura 1. Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450 ... 36

Figura 2. Representação esquemática do funcionamento das CYP ... 37

Figura 3. Distribuição das enzimas CYP de acordo com o número de medicamentos que metabolizam e fatores que podem influenciar a sua variabilidade. ... 38

Figura 4. Representação da estrutura química dos enanteómeros do tramadol ... 47

Figura 5. Representação esquemática do metabolismo do tramadol. ... 49

Figura 6. Fluxograma do método de análise genética. ... 58

Figura 7. Variantes do gene CYP2D6 estudadas neste trabalho. ... 61

Figura 8. Demonstração esquemática da sequenciação com BigDye Terminator v. 3,1. ... 66

Figura 9. Pesquisa da sequência FH da amostra CYP016 no BLAST ... 82

Figura 10. Sequências obtidas para cada fragmento e comparação com as sequências dos pseudogenes, segundo a entrada M33387.1 do Genebank. ... 83

Figura 11. Eletroferogramas dos polimorfismos identificados nos materiais de referência: ... 83

Figura 12. Alinhamento das sequências obtidas durante o ensaio de repetibilidade na amostra CYP025. ... 86

Figura 13. Sobreposição das sequências obtidas com a de referência utilizando o SeqScape. ... 86

Figura 14. Fenótipo previsto com base nas variantes alélicas encontradas nas amostras. ... 94

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Figura 15. Correlação entre a razão logarítmica de concentração TMD/ODT e

TMD/NDT com o fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes; IM ao genótipo *10/*10 ou *4/*10; PM ao genótipo *3/*4 e *4/*4. ... 99 Figura 16. Correlação entre a razão logarítmica de concentração NDT/ODT com o

fenótipo previsto, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes; IM ao genótipo *10/*10 ou *4/*10; PM ao genótipo 3/*4 e *4/*4. ... 100 Figura 17. Correlação entre a razão logarítmica de concentração NDT/TMD e o

genótipo do indivíduo, sendo que: EM corresponde à ausência de variantes; EM1 a um alelo *10; EM2 a um alelo *4 ou *6; IM a *10/*10 ou *4/*10 e PM a *4/*4 ou *3/*4. ... 101 Figura 18. Correlação entre a razão de concentrações TMD/ODT, TMD/NDT e

NDT/TMD e o fenótipo previsto do indivíduo, onde INIB é o grupo dos casos com inibidores enzimáticos. ... 102

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Abreviaturas e Siglas

ºC graus Celcius

µL / µg / µM microlitro / micrograma / micromolar

A Adenina

AB Applied Biossystems

ADME Fase da Farmacocinética: Absorção, Distribuição, Metabolização e Excreção

ADN / DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês deoxyribonucleic acid) ADR Reações adversas (do inglês adverse reactions)

BLAST Ferramenta de pesquisa em bases de dados genéticas disponibilizada

online pela NCBI (do inglês Basic Local Alignment Search Tool)

C Citosina

CNV Variação do número de cópias do gene (do inglês Copy Number Variation) CV Coeficiente de variação percentual

CYP450 Citocromo P450

CYP2D6 Proteína da família CYP450, família 2, subfamília D, isoforma 6 Gene que codifica a síntese da proteína CYP2D6

Cypallele Human Cytochrome P450 Allele Nomenclature Database

(disponível em http://www.cypalleles.ki.se) dNTPs Desoxinucleótidos trifosfatados

(do inglês deoxy-nucleotide triphosphate) ddNTPs Di-desoxinucleótidos trifosfatados

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EI Ionização Electrónica (do inglês, Electronic Ionization)

EM Metabolizador extensivo/normal (do inglês Extensive Metabolizer) EMR Erro médio relativo

ER% Erro relativo percentual

eV electrão volt

Fcrit Valor tabelado da distribuição F para (N-1;N-1;\) FDA Food and Drug Admistration

G Guanina

GC-MS Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês Gas Chromatography-Mass Spectrometry)

ID Índice de Degradação

IM Metabolizador intermédio (do inglês Intermediate Metabolizer) INMLCF Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I. P.

(Instituto Público)

ISO International Organization for Standardization

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

LC-MS Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massa (do inglês Liquid Chromatography-Mass Sprectrometry) LOD Limite de detecção (do inglês Limit of Detection)

LOQ Limite de quantificação (do inglês Limit of Quantification) m/z Razão massa/carga

MeOH Metanol

min minuto

NCBI National Center for Biotechnology Information

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ODT O-desmetil-tramadol

OMS Organização Mundial de Saúde

OPRM1 Gene que codifica o receptor opióide µ. pb / kb Pares de bases / 1000 pares de bases PCR Reação de polimerase em cadeia

(do inglês Polymerase Chain Reaction)

PharmGKB PharmGKB Knowledge Base (disponível em www.pharmgkb.org)

PI Padrão interno

pka Constante de ionização

PM Metabolizador lento (do inglês Poor Metabolizer) r2 Coeficiente de correlação

rpm Rotações por minuto

Sy/x Desvio-padrão residual, erro-padrão

SIM Monitorização seletiva de iões (do inglês Selective Ion Monitoring) SNC Sistema Nervoso Central

SNP Polimorfismo de nucleótido único (do inglês Single Nucleotide Polimorphism) SGBF Serviço de Genética e Biologia Forenses

SPE Extração em Fase Sólida (do inglês Solid Phase Extraction) SQTF Serviço de Química e Toxicologia Forenses

S/R Razão sinal/ruído (do inglês signal-to-noise)

SSRIs Inibidores Seletivos da Recaptação de Serotonina (do inglês Selective serotonin reuptake inhibitor) SWGDAM Scientific Working Group for DNA Analysis Methods

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TMD Tramadol

tr Tempo de retenção

trr Tempo de retenção relativo

UM Metabolizador ultra-rápido (do inglês Ultrarapid Metabolizer)

WADA World Anti-Doping Agency

Wi Fator de ponderação (do inglês weighing)

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1 Resumo

A variabilidade genética tem impacto na resposta individual aos fármacos, com repercussões nas concentrações e nos efeitos observados. Os exames de toxicologia forense são importantes para conhecer a contribuição dos xenobióticos na causa de morte e as circunstâncias em que esta ocorreu. A aplicação das metodologias de farmacogenética a casos post mortem é ainda pouco frequente, dependendo sobretudo das características do gene a estudar e da existência de metodologias adequadas à análise de amostras da rotina pericial. Por outro lado, para que os resultados possam ser utilizados como prova em tribunal, é essencial dispor de fundamentação científica para a sua interpretação, que pode ser obtida através de estudos de correlação entre os resultados da genética e da toxicologia.

O tramadol é bioactivado por metabolização em O-desmetiltramadol, por acção da enzima CYP2D6. Algumas variantes genéticas são responsáveis por alterações na expressão enzimática e, portanto, na resposta analgésica e nas concentrações encontradas nas amostras post mortem, para o tramadol e para os seus metabolitos. Nos casos post mortem com tramadol, a identificação dos metabolizadores lentos pela pesquisa de variantes genéticas descritas como não-funcionais pode ser útil para explicar algumas circunstâncias relacionadas com a morte.

O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de uma metodologia de sequenciação parcial do gene CYP2D6 para a detecção de variantes genéticas responsáveis pela inativação da atividade enzimática, tendo em vista a identificação de metabolizadores lentos. A metodologia foi aplicada a casos post mortem positivos para tramadol.

Foram selecionadas e analisadas 100 amostras de sangue post mortem com tramadol. O ADN foi extraído pelo método de Chelex 100®_{e quantificado por Real-time PCR}

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usando Quantifiler Trio da Applied Biosystems (AB). A amplificação dos fragmentos de interesse do gene CYP2D6 foi efetuada por PCR com MasterMix da Qiagen. Os fragmentos amplificados foram sequenciados com Big Dye v.3.1 cycle sequence e detetados por eletroforese capilar num Genetic Analyser 3130 (AB). As sequências obtidas foram comparadas com a de referência usando o programa informático

SeqScape v3. O método foi validado de acordo com recomendações internacionais. Foi

também validado o método de confirmação quantitativa de tramadol e dos seus metabolitos N-desmetil-tramadol e O-desmetil-tramadol.

Os métodos foram aplicados com sucesso às amostras de sangue post mortem. As distribuições de alelos e de genótipos das amostras analisadas estão de acordo com o esperado para a população portuguesa e europeia. O metabolismo do tramadol, expresso pela razão de concentrações entre os seus metabolitos (N-desmetil-tramadol/O-desmetil-tramadol), demonstrou estar correlacionado com os fenótipos previstos na análise genética, em particular no caso dos metabolizadores lentos. Foi demonstrada também a importância da pesquisa de substâncias inibidoras da atividade enzimática, nos casos de tramadol. De acordo com o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo em que a metodologia de sequenciação do gene CYP2D6 foi validada e aplicada com sucesso a amostras post mortem, em Portugal. As metodologias desenvolvidas permitem a recolha sistemática de resultados em casos post mortem, constituindo ferramentas essenciais para fundamentar a utilidade da farmacogenética na interpretação de casos de tramadol, numa avaliação conjunta entre a patologia, a toxicologia e a genética forenses.

Palavras-chave: farmacogenética; CYP2D6; tramadol; post mortem; toxicologia forense

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Abstract

Genetic variation is related to individual drug response, with influence in the concentration and effects observed. Forensic toxicology is important to know the contribution of drugs to the cause of death and its circumstances. Forensic pharmacogenetics is a relatively new and growing area of research and to be used in the court decisions it is essential to have reliable methodologies that can be applied to routine analysis. On the other hand, the interpretation of the results depends on the knowledge based on scientific research with statistical coverage that can be obtained by correlation studies between genetic and toxicology results.

Tramadol is bioactivated by metabolization to O-demethyl-tramadol, by CYP2D6 enzyme. Some genetic polymorphisms are responsible for the variability in the expression of this enzyme, changing the individual drug response and also the post-mortem concentrations of tramadol and its metabolites. The poor-metabolizers identification by detection of allelic variants described as non-functional can be useful to explain some circumstances of death in the study of post-mortem cases with tramadol.

The aim of this work was the development of a Sanger sequencing methodology for CYP2D6 gene to identify genetic variants that cause absence of enzyme activity and its application to post-mortem cases with tramadol.

100 post-mortem blood samples were selected and analyzed. DNA was extracted by

Chelex 100® method and quantitated with Applied Biosystems (AB) Quantifiler Trio Kit ® by Real-time PCR. Genetic fragments amplification was done by PCR using Qiagen MasterMix. Sanger sequencing was performed with Big Dye v.3.1 cycle sequence and detected in a Genetic Analyser 3130 (AB). Allelic variants were found

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comparing the results with a reference sequence using SeqScape v3 software. The sequencing method was validated following international guidelines as well as the method used for tramadol and main metabolites quantification.

The methods were successfully applied to post mortem blood samples. Alleles and genotype frequencies were in accordance with the expected for European population. Tramadol metabolism, expressed as its metabolites concentration ratio (N-desmethyltramadol/O-desmethyltramadol), has been shown to be correlated with the predicted phenotypes based on genetic characterization. It was also demonstrated the importance of enzyme inhibitors identification in the toxicology analysis. According to our knowledge, this is the first time that a CYP2D6 sequencing methodology is validated and applied to post-mortem samples, in Portugal. The developed methodology allows the data collection of post-mortem cases, which is of primordial importance to enhance the use of these pharmacogenetic tools to explain some circumstances of death in the study of tramadol positive cases and demonstrate the importance of this pharmacogenetics tools to forensic toxicology and pathology.

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2 Introdução

A Medicina Legal e o mundo das Ciências Forenses vivem em progressiva fusão de conhecimentos, no sentido de conseguir as melhores soluções na aplicação da Lei para a realização da Justiça, contribuindo ainda para a melhoria da saúde pública e para o desenvolvimento científico. O crescimento conjunto desta diversidade disciplinar vai esbatendo as suas fronteiras, no ressurgir de um conhecimento abrangente e com grande potencial de crescimento.

2.1 A Medicina Legal em Portugal

O Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I. P. (INMLCF), é um instituto público dotado de autonomia administrativa e financeira e de património próprio, sob a superintendência e a tutela do membro do governo responsável pela área da justiça. Tem a natureza de laboratório do Estado com jurisdição sobre todo o território nacional e é considerado “instituição nacional de referência” na área da Medicina Legal e Ciências Forenses. (DL n.º 166/2012, de 31 de Julho)

Em 1899, com a Carta-Lei de 17 de Agosto, foram criadas as morgues de Lisboa, Coimbra e Porto destinadas a efetuar exames médico-forenses e vocacionadas para o ensino da Medicina Legal. Em Lisboa, a morgue estava localizada nas proximidades do “Campo de Sant’Ana”, onde se encontrava sediada a Faculdade de Medicina. Os exames químicos e toxicológicos foram realizados no Laboratório Químico da Escola Politécnica até 1 de Abril de 1912, data em que, sob a direção do Prof. Dr. Azevedo Neves, começou a funcionar o Laboratório de Química da morgue de Lisboa (Reys, 1985).

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Durante a 1ª República, em 1918, com a presidência de Sidónio Pais, foram construídos e criados os Institutos de Medicina Legal de Lisboa, Coimbra e Porto, cuja direção era reservada a docentes das Faculdades de Medicina. O decreto-lei 5:023 publicado a 3 de Dezembro de 1918, regulamenta a organização dos serviços periciais medico-forenses, definindo as circunscrições territoriais de cada Instituto. Este decreto-lei estabeleceu ainda que, para o seu funcionamento, os Institutos deveriam estar equipados com um laboratório químico, destinado a análises toxicológicas e outras de química forense, além de outros laboratórios (de medicina-legal, de antropologia, de psicologia experimental e de fotografia) e ainda um museu, um arquivo e uma biblioteca.

No final do século XX a evolução tecnológica foi fundamental para a renovação dos serviços técnicos, com a introdução de novas técnicas e tecnologias, quer de análise toxicológica (como a aquisição de equipamentos de GC/MS e HPLC), quer de genética e biologia molecular (com o desenvolvimento de técnicas de PCR e de eletroforese).

Em 2001 foi criado o Instituto Nacional de Medicina Legal, de âmbito nacional, sediado em Coimbra e com 3 delegações sem autonomia administrativa nem financeira, na dependência das quais funcionam os Gabinetes Médico-Legais da sua área de atuação: a delegação do Norte no Porto, a delegação do Centro em Coimbra e a delegação do Sul em Lisboa.

Em 2012, a nova Lei Orgânica estabelece que o Instituto passa a designar-se Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I. P. (INMLCF), com novas competências funcionais na área das ciências forenses. Os Serviços de Genética e Biologia Forenses e de Química e Toxicologia Forenses passam a ser unidades

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orgânicas de carácter nacional, estando sediados em Coimbra e Lisboa, respetivamente, dispondo de extensões funcionais nas outras delegações.

A atividade pericial do INMLCF está enquadrada pela Lei nº 45/2004 de 19 de Agosto, que estabelece o regime jurídico das perícias médico-legais e forenses; pela Lei Orgânica, constante do DR no Decreto-Lei n.º 166/2012 de 31 de Julho; e pelos Estatutos, constantes da Portaria n.º 19/2013 de 21 de Janeiro. Os serviços técnicos do INMLCF são o Serviço de Clínica e Patologia Forenses; o Serviço de Genética e Biologia Forenses e o Serviço de Química e Toxicologia Forenses.

O Serviço de Clínica e Patologia Forenses compreende duas unidades funcionais: a de Clínica Forense e a de Patologia Forense. À unidade funcional de Clínica Forense compete a realização de exames e perícias em pessoas: para a descrição e avaliação dos danos provocados na integridade psicofísica relevantes para os diversos domínios do Direito, bem como os exames de natureza psiquiátrica e psicológica ou outros atos neste domínio. A unidade funcional de Patologia Forense assegura a realização das autópsias médico-legais; dos exames de anatomia patológica forense; da identificação de cadáveres e de outros restos humanos; do embalsamamento e do estudo de peças anatómicas. Entre 2010 e 2014, foram realizadas em média 6200 autópsias por ano ( http://www.inml.mj.pt/).

O Serviço de Química e Toxicologia Forenses assegura a realização de perícias e exames laboratoriais químicos e toxicológicos, para a determinação, confirmação e quantificação de substâncias químicas, nomeadamente: drogas de abuso; medicamentos; pesticidas; etanol e outros voláteis; monóxido de carbono; cianeto ou alguns metais. As pesquisas são efetuadas em diversas matrizes, principalmente biológicas, nos seguintes âmbitos: perícias médico-legais efetuadas no vivo ou post

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estupefacientes; controlo de consumo de substâncias psicoativas em meio laboral; avaliação dos estados de influência como causa de perigosidade ou de inimputabilidade; caracterização do estado de toxicodependência, entre outras. Como exame complementar de autópsia, a perícia toxicológica é requerida sempre que o perito médico considere necessário avaliar a presença de substâncias que possam explicar a causa da morte ou das circunstâncias em que a mesma ocorreu. São requisitados exames toxicológicos em cerca de 84% das autópsias realizadas no INMLCF. As principais substâncias pesquisadas são o etanol, os medicamentos e as drogas de abuso tendo uma prevalência de casos positivos de 38%, 47% e 12%, respetivamente (J. M. Franco, 2015).

O Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) assegura a realização de perícias e exames de identificação genética de indivíduos vivos, cadáveres ou restos cadavéricos, perícias de investigação de parentesco biológico e perícias de criminalística biológica. As perícias são realizadas em diversos vestígios biológicos, tais como: sangue, sémen, saliva, cabelos, ossos, dentes ou outros tecidos. Como exame complementar de autópsia, uma das principais finalidades da investigação genética é a identificação de desconhecidos.

2.2 Interpretação de resultados post mortem

A autópsia médico-legal é efetuada sempre que haja suspeita de morte violenta ou de causa desconhecida, sendo também relevante em mortes aparentemente não violentas mas inexplicadas. Os principais objetivos são:

a. A identificação do indivíduo;

b. Determinar a causa e circunstâncias da morte; c. Determinar a data e a hora da morte,

(29)

d. Estabelecer a etiologia médico-legal.

O recurso a exames complementares de autópsia é frequente e é habitualmente efetuado por requisição aos laboratórios de toxicologia, de genética ou de anatomia patológica do INMLCF. O relatório de autópsia deverá reunir toda a informação do processo e a sua interpretação integrada, numa perspetiva multidisciplinar. A interpretação dos resultados do exame complementar de toxicologia deve ser sempre enquadrada pela informação prévia (v. g. a informação recolhida pela investigação policial e os dados clínicos), pelos achados autópticos e também pelos resultados de outros exames complementares (Mozayani & Raymon, 2004).

Os resultados toxicológicos podem ser qualitativos ou quantitativos. Nos resultados qualitativos faz-se a confirmação da presença ou da ausência de substâncias exógenas, em particular as passíveis de ter um efeito tóxico ou de promoverem um estado de influência. Quando a presença de uma substância é confirmada, pode ser fundamental a determinação da sua concentração, em particular nas amostras de sangue (Schulz, Iwersen-bergmann, Andresen, & Schmoldt, 2012). Para a interpretação dos resultados quantitativos, é frequentemente necessário comparar as concentrações obtidas em cada caso com os valores de referência publicados na literatura, onde se estabelecem os intervalos considerados terapêuticos, tóxicos ou letais (F Musshoff, Padosch, Steinborn, & Madea, 2004; Repetto & Repetto, 2015; Schulz et al., 2012). Contudo a comparação com os valores das tabelas deve ser feita de uma forma crítica e prudente. Por um lado, nestas tabelas de concentração, os limites tóxicos ou letais são suportados por casos clínicos ou post mortem já publicados, muitas vezes com pouca expressão estatística e influenciados por fatores circunstanciais, nomeadamente pela presença de outras substâncias. Por outro lado, as tabelas geralmente não têm valores de referência para as concentrações dos metabolitos nem a sua relação com as

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concentrações da substância primária. Estes valores são muito importantes nas avaliações de resultados post mortem, quando se desconhecem os hábitos de consumo, fenómenos de tolerância ou as características de cada indivíduo (Verrecas, Knaepen, Gilissen, Cassiman, & Decorte, 2004).

Na avaliação de resultados quantitativos é ainda preciso considerar a possibilidade de existência de variabilidade individual nas concentrações, mesmo com administração de doses equivalentes e padronizadas. Os fatores de variabilidade individual podem ser de natureza diversa (Frank Musshoff, Stamer, & Madea, 2010b), tais como:

a. Fisiológicos – a idade, o género ou o peso;

b. Patológicos – as patologias renais ou hepáticas, diabetes;

c. Ambientais/culturais – os hábitos alimentares ou de consumo; a exposição continuada a substâncias tóxicas;

d. Circunstanciais – co-medicação; o stress emocional, intelectual ou físico; e. Genéticos – as alterações genéticas que afetam a atividade enzimática ou

proteica.

As diferenças genéticas podem, portanto, ser responsáveis pela variabilidade na resposta dos organismos à exposição a substâncias exógenas, alterando a sua concentração e o tempo de permanência no organismo (farmacocinética), e também o grau e o tipo de acção (farmacodinâmica). A variabilidade das concentrações reflete-se nos efeitos observados, alterando a eficácia e a segurança da utilização dos fármacos, podendo ocorrer reações adversas com impacto na saúde ou no comportamento do indivíduo, podendo até conduzir à morte (Madadi et al., 2008; Frank Musshoff et al., 2010b; Silva, Soares, & Martins, 2012). A elevada frequência de reações adversas repercute-se também na gestão dos cuidados de saúde e nos custos associados. Segundo Johansson et al, as reações adversas (ADR) correspondem à 5ª causa de

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morte nos Estados Unidos da América e são responsáveis por mais de 7% das hospitalizações, prevalência que ultrapassa os 30% na população com mais de 70 anos de idade (Johansson & Ingelman-Sundberg, 2011; Lazarou, Pomeranz, & Corey, 1998). As reações adversas mais graves estão geralmente relacionadas com cardiotoxicidade e hepatotoxicidade (Buscemi & Tagliabracci, 2011; Chan, Jin, Loh, & Brunham, 2015; Johansson & Ingelman-Sundberg, 2011).

Considerando a existência de variantes genéticas responsáveis pela alteração da resposta farmacológica, as metodologias adequadas à sua detecção em amostras post

mortem podem constituir ferramentas de particular relevância para a interpretação das

concentrações observadas em cada caso (Pelotti & Bini, 2011). Holmgren et al, tal como descrito por Musshoff et al, (Frank Musshoff et al., 2010b) propõe critérios para a seleção dos casos em que seria adequado recorrer ao estudo de variantes genéticas, a saber:

Quando as concentrações relativas entre o composto administrado e os seus metabolitos não são as esperadas;

Quando existem reações adversas relacionadas com a alteração da biodisponibilidade da substância;

Quando a administração foi efetuada de forma controlada e as concentrações não são correspondentes;

Quando estão presentes outras substâncias que podem ter funcionado como inibidores enzimáticos.

As variantes genéticas mais estudadas em farmacogenética são as que têm influência na farmacocinética da substância, em particular as que alteram a capacidade funcional das enzimas de metabolização.

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2.3 Farmacocinética

O efeito das substâncias depende da concentração disponível no seu local de acção. A farmacocinética procura descrever a sua distribuição e transformação no organismo, com o objetivo de conhecer a concentração disponível no órgão em que vão exercer o efeito e qual a duração dessa disponibilidade. Para conhecer a farmacocinética das substâncias são estudados todos os fatores que afetam a capacidade de absorção, a distribuição, o metabolismo e a excreção, habitualmente designados por ADME (Y. O. Franco & Franco, 2003).

A absorção consiste na passagem das substâncias do local de exposição para a corrente sanguínea e depende muito da via de administração. A administração dos xenobióticos pode ser oral, rectal, dérmica, por inalação ou parentérica (v.g. intramuscular, intravenosa), entre outras. Na administração intravenosa, a substância entra diretamente na corrente sanguínea e neste caso não há uma fase de absorção. A administração oral é a mais frequente nos medicamentos e a absorção faz-se ao longo de todo o trato gastrointestinal, desde o estôm go ao reto, mas com maior incidência na parte inicial do intestino delgado (Meyer & Maurer, 2014). A absorção pode ser feita por transporte ativo ou por difusão passiva, dependendo das características de cada substância. A difusão passiva é mais frequente, particularmente para substâncias de pequena dimensão molecular e lipofílicas (Asic & Of, 2008). Em algumas situações as substâncias administradas podem não ser absorvidas, seja porque são degradadas pelo ácido gástrico, pelas enzimas intestinais ou devido às suas características físico-químicas (Jickells & Negrusz, 2008).

A distribuição descreve a transferência reversível da substância entre o sangue e os tecidos e a sua extensão pode ser traduzida por um parâmetro quantitativo: o Volume de Distribuição. A distribuição depende do fluxo sanguíneo nos tecidos e ainda de

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diversos fatores associados à substância – tais como o tamanho da molécula, o grau de ionização ao pH do sangue, a afinidade para a ligação às proteínas plasmáticas ou aos tecidos adiposos; e associados ao indivíduo - tais como o género, a idade ou a existência de patologias. Numa fase inicial, a distribuição faz-se pelos órgãos mais irrigados, como o fígado, o coração, os rins e o cérebro. Com o tempo, pode haver distribuição para os órgãos periféricos, tecidos musculares ou adiposos. O Volume de Distribuição será elevado para as substâncias com maior afinidade para o tecido adiposo ou a outras estruturas celulares, onde podem ficar armazenadas prolongando a sua permanência no organismo. A distribuição das substâncias entre o plasma e os tecidos depende também da via e frequência de administração (Jickells & Negrusz, 2008; Meyer & Maurer, 2014).

O metabolismo e a excreção são frequentemente referidos como a eliminação porque em conjunto promovem a remoção das substâncias do organismo. A eliminação compreende principalmente 2 vias: a via renal, por excreção dos compostos polares e hidrofílicos na urina; e a via hepática, quer por metabolização, quer por excreção biliar. Alguns compostos podem ser eliminados por outras vias, como é o caso do etanol que é excretado pelo ar expirado, ou em menor quantidade por outros fluidos corporais tais como o leite materno, o suor ou as lágrimas.

As substâncias mais hidrofóbicas são geralmente eliminadas por excreção biliar, em particular alguns metabolitos glucoronidos e sulfatos. Quando a bílis é excretada e libertada nos intestinos, as enzimas produzidas por algumas bactérias podem hidrolisar estes grupos conjugados, deixando a substância livre para a reabsorção. Este fenómeno é designado por recirculação enterohepática e, em algumas substâncias como a morfina, tem um impacto grande no tempo de permanência no organismo (Asic & Of, 2008). Nestes casos, a presença das substâncias no conteúdo gástrico não se deve

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necessariamente à administração por via oral mas sim a fenómenos de refluxo ou à difusão passiva a partir da mucosa gástrica, em particular nos compostos alcalinos. (Meyer & Maurer, 2014).

A absorção das substâncias exógenas por difusão passiva no epitélio intestinal é efetuada através da bicamada fosfolipídica das membranas. Por essa razão, as substâncias lipofílicas e com estrutura molecular pequena são mais facilmente absorvidas de acordo com o gradiente de concentração. Em contrapartida, a sua excreção na urina é mais difícil devido à baixa solubilidade em água e, sendo de pequena dimensão, podem ser reabsorvidas a nível renal.

A metabolização é um mecanismo de defesa do organismo que consiste na biotransformação dos compostos exógenos lipofílicos em substâncias hidrofílicas, para facilitar a excreção por via renal. Os produtos de reação são os metabolitos que podem ser substâncias activas também. Por essa razão, a metabolização altera a intensidade e a duração da resposta farmacológica. As reações de metabolização são catalisadas enzimaticamente, ocorrendo no local ou órgão com maior expressão da enzima específica para cada reação, mais frequentemente no fígado.

O processo de biotransformação pode dividir-se em duas fases: numa primeira fase o organismo procura aumentar a solubilidade em meio aquoso (metabolização de fase I) e na fase seguinte evitar a reabsorção renal (metabolização de fase II).

O metabolismo de fase I visa transformar as substâncias lipofílicas em substâncias mais polares, com a introdução ou exposição de grupos funcionais (–OH, –NH2, –SH ou –COOH) através de reações de oxidação, redução, hidrólise ou desalquilação. As reações são mediadas por enzimas, em particular pelas enzimas microssomais do Citocromo P450 (CYP), que se localizam essencialmente no retículo endoplasmático no fígado, mas podem também encontrar-se noutros órgãos como intestino delgado,

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rins, pulmões, cérebro e pele. As substâncias lipofílicas e hidrofóbicas penetram bem na bicamada lipídica do retículo endoplasmático dos hepatócitos, onde estão situadas as enzimas responsáveis pela metabolização. Deste tipo de reações resultam metabolitos polares que podem ser também ativos, e que podem diferir muito do composto administrado no tipo, no grau e na duração dos efeitos (Asic & Of, 2008). O metabolismo de fase II envolve reações de conjugação, formando compostos muito polares e de maior massa molecular. Os metabolitos são conjugados por glucuronização, sulfatação, acetilação ou metilação (Asic & Of, 2008). As enzimas envolvidas no metabolismo de conjugação são transferases, tais como, metiltransferase (MT), N-acetiltransferase (NAT) ou UDP-glucuroniltransferase (UGT) e os metabolitos resultantes são geralmente inativos.

Quando uma substância é administrada por via oral, após a absorção no epitélio intestinal, há uma primeira passagem no fígado antes da distribuição. Tanto nas células do epitélio como nos hepatócitos existem enzimas de metabolização. Dependendo da extensão desta primeira metabolização, o impacto nas concentrações sujeitas a distribuição e disponíveis para exercer o efeito no órgão alvo pode ser elevado. Este fenómeno é designado por eliminação pré-sistémica e pode alterar muito a biodisponibilidade da substância.

A caracterização da ADME faz-se com recurso a parâmetros calculados com base em valores observados da concentração plasmática ao longo do tempo. Os parâmetros principais (primários) são a biodisponibilidade, o volume de distribuição e a depuração (clearance). Os parâmetros secundários são dependentes do tempo e são o tempo de semi-vida de eliminação (t1/2), a área da curva de concentração plasmática em função do tempo (AUC) e a concentração máxima no plasma (Cmax) (Asic & Of, 2008; Meyer & Maurer, 2014).A metabolização é catalisada por enzimas e a sua expressão depende

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dos genes que as codificam. As variantes genéticas podem interferir na farmacocinética da substância, alterando a biodisponibilidade e a capacidade de eliminação. A análise dos genes responsáveis pela expressão das enzimas que catalisam a metabolização de fase I e de fase II pode facilitar a interpretação da distribuição das substâncias no organismo (Gaedigk, 2013; Frank Musshoff, Stamer, & Madea, 2010a; Sajantila, Palo, Ojanperä, Davis, & Budowle, 2010).

2.4 Farmacogenética

A farmacogenética é a disciplina que estuda a relação existente entre as características genéticas de cada indivíduo e a sua resposta às substâncias administradas. As diferenças nos efeitos das substâncias podem dever-se à existência de polimorfismos nos genes que codificam as enzimas que metabolizam essas substâncias, os transportadores e os receptores no órgão alvo, entre outros.

2.4.1 Resumo histórico

Os aspetos históricos da farmacogenética remontam ao ano 510 AC, quando Pitágoras relacionou o surgimento de anemia hemolítica com a ingestão de favas apenas em alguns indivíduos, atribuindo o fenómeno observado às características individuais. Surgiu como disciplina nos anos 50 do século XX com a descoberta do mesmo tipo de anemia hemolítica subsequente à administração de primaquina (anti-malárico) e que se verificou ser devida a um défice enzimático de glucose-6-fosfato hidrogenase (G6PD). A deficiência enzimática tinha uma prevalência significativa maior entre afro-americanos que entre caucasianos, concluindo-se que se deveria a um fator genético. Outros estudos foram desenvolvidos nos anos 50 relacionados com as diferenças genéticas e variabilidade individual da resposta aos fármacos, tais como o metabolismo de acetilação da isoniazida pela enzima N-acetil-transferase (NAT2) e da

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hidrólise da succinilcolina pela enzima butirilcolinesterase (BCHE). O termo farmacogenética foi introduzido por Vogel em 1959 para designar esta nova área de estudo.

Nos anos 70 dois grupos de investigação independentes (Eichelbaum em 1979 e Mahgoub em 1977) observaram reações adversas (ADR) inesperadas após a administração da esparteína e da debrisoquina, respetivamente. As ADR observadas seriam devidas a diferenças de metabolização por uma enzima que é responsável pela oxidação de ambas as substâncias, a que na altura se chamou debrisoquina ou esparteína hidroxilase. Usando estudos farmacocinéticos para compreender os efeitos observados, diferenciaram-se os indivíduos que teriam uma metabolização normal (EM) dos de metabolização lenta (PM). A sequenciação do gene que codifica essa enzima, que passou a designar-se por CYP2D6, foi conseguida pela primeira vez em 1988 por Gonzalez et al. Alguns estudos seguintes identificaram as primeiras variantes genéticas e comprovaram a existência dos pseudogenes CYP2D7 e CYP2D8 (ver 2.5.2), com elevada homologia com o CYP2D6 (Kimura, Umeno, Skoda, Meyer, & Gonzalez, 1989). Em 1993, Johansson et al identificaram pela primeira vez um metabolizador ultrarrápido (UM) (Johansson & Ingelman-Sundberg, 2011).

O desenvolvimento das técnicas de biologia molecular, em particular a PCR, permitiu aprofundar o estudo da influência genética na variabilidade de resposta aos fármacos e distingui-la de outros fatores (v.g. idade, género, patologias, etc.). Os primeiros estudos incidiram nos genes relacionados com a farmacocinética, em particular os que codificam enzimas de metabolização, tendo sido estabelecido em 1996 o The Human

Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Committee

(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm). O gene que codifica a enzima CYP2D6 foi o primeiro a ser caracterizado e tem servido de modelo para outros estudos

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farmacogenéticos, não só a nível das enzimas de metabolização mas também nos transportadores e receptores.

2.4.2 Aplicação da farmacogenética

O objetivo principal dos estudos farmacogenéticos é, atualmente, a individualização da terapia com base em informação genética. O estudo genético dos indivíduos permite adequar a farmacoterapia, facilitando a escolha dos fármacos e as dosagens para cada indivíduo de modo a obter o efeito terapêutico desejado, reduzindo substancialmente a probabilidade de existência de reações adversas, bem como os custos dos tratamentos e a ocorrência de mortes acidentais (Abraham & Adithan, 2001; Gupta, 2013; Saladores, Precht, Schroth, Brauch, & Schwab, 2013; Samer, Lorenzini, Rollason, Daali, & Desmeules, 2013; Sorich & Coory, 2014). Existem já recomendações internacionais para adequar a terapêutica tendo em conta o genótipo do indivíduo, principalmente a nível dos genes que alteram a expressão das enzimas de metabolização (guidelines em http://www.pharmgkb.org/ e Ehmann et al. 2015). A FDA publicou uma lista dos biomarcadores genéticos com demonstrada relevância clínica para as substâncias medicamentosas aprovadas nos EUA, onde, com maior frequência, aparecem os genes que codificam as enzimas de metabolização, em particular o CYP2D6 (http://www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ResearchAreas/ Pharmacogenetics/ucm083378.htm).

Os anestésicos e analgésicos opióides são, a par com a terapia oncológica (Woods, Veenstra, & Hawkins, 2011; Zafra-Ceres et al., 2013) e os antidepressivos (Hicks et al., 2013; Prado, 2009), das substâncias medicamentosas mais estudadas em farmacogenética, estando já publicados vários artigos de revisão (Book, Stamer, Lehmann, & Stüber, 2013; Coller, Christrup, & Somogyi, 2009; M. Jin, Gock, Jannetto, Jentzen, & Wong, 2005; Kleine-Brueggeney, Musshoff, Stuber, & Stamer,

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2010; Leppert, 2011; Palmer et al., 2005; Somogyi, Barratt, & Coller, 2007; Světlík & Hronová, 2013; Zahari & Ismail, 2013).

A Farmacogenética tem sido também utilizada na área forense, embora com pouca frequência. Quando as concentrações encontradas na pesquisa toxicológica post

mortem são diferentes do que seria de esperar, de acordo com a informação de cada

caso e com as tabelas de referência, a pesquisa de variantes genéticas que alterem a capacidade de metabolização pode ser útil para a sua interpretação. A sua utilidade é maior ainda quando as concentrações são tão elevadas que há suspeita de intoxicação, servindo para diferenciar uma morte intencional (homicídio ou suicídio) de uma morte acidental, devida ao desconhecimento das características genéticas do indivíduo, como no caso apresentado, em 2000, por Sallee et al (Sallee, DeVane, & Ferrell, 2000). 2.4.3 Genótipo e Fenótipo

O Fenótipo é a expressão qualificável ou quantificável das características genéticas. No caso dos genes que codificam as enzimas de metabolização traduz-se na capacidade de metabolização, que é usualmente avaliada através da determinação do índice metabólico fazendo a medição das concentrações das substâncias e dos seus metabolitos após a administração de substâncias de teste, de forma controlada. O tipo de metabolização observado é categorizado em quatro classes: metabolizadores extensivos/normais, intermédios, lentos ou ultra-rápidos, (EM, IM, PM e UM - do inglês extensive, intermediate, poor, ultrarapid metabolizers, respectivamente) (Ingelman-Sundberg, Sim, Gomez, & Rodriguez-Antona, 2007). Os metabolizadores extensivos/normais têm a atividade enzimática e a resposta ao medicamento de acordo com o que é esperado. Nos metabolizadores intermédios observa-se uma redução da velocidade de metabolização, podendo ter uma resposta aumentada ou, no caso de pro-fármacos, diminuída. Os metabolizadores lentos são indivíduos com atividade

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enzimática residual, o que clinicamente se manifesta por uma grande deficiência na formação de metabolitos e um aumento da biodisponibilidade da substância administrada. A deficiência enzimática pode ser devida a alterações genéticas que impeçam a codificação da enzima ou então que codifiquem enzimas não funcionais. Os ultra-metabolizadores têm uma atividade enzimática muito superior à esperada (Abraham & Adithan, 2001). Nestes dois perfis de metabolização, PM e UM, observam-se alterações nas concentrações das substâncias e dos seus metabolitos que se repercutem no tipo e duração da resposta, com uma maior probabilidade de ocorrência de falha terapêutica, de reações adversas ou de intoxicação.

O perfil genético dos indivíduos (genótipo) pode ser então correlacionado com as alterações no índice metabólico (fenótipo) e classificado de modo semelhante, tal como é apresentado na Tabela 1.

Tabela 1. Classificação dos genótipos CYP2D6 em função do fenótipo esperado

Classe Genótipo observado Atividade enzimática prevista EM N + N; N + R

Pelo menos um alelo funcional

Normal

IM N + 0; 0 + R; R + R

1 alelo nulo ou 2 de função reduzida

Reduzida

PM 0 + 0

homozigóticos para alelos nulos

Nula

UM N + nN

(múltiplas cópias do gene)

Aumentada

Onde, N corresponde a um alelo que codifica a enzima com atividade normal;

R corresponde a um alelo com atividade enzimática reduzida; 0 corresponde a um alelo relacionado com inativação enzimática; n corresponde ao número de cópias do gene e é maior que 1.

O estudo das correlações entre os fenótipos e os genótipos tem como objectivo prever a atividade enzimática com base nas variantes genéticas e já é possível para algumas enzimas de metabolização (v.g. CYP2D6 conforme publicado em http://www.cypalleles.ki.se/ cyp2d6.htm).

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Assim, o conhecimento das características genéticas individuais revela-se uma ferramenta importante para aplicação à prática clínica, estando por isso a ser utilizado no desenvolvimento e aprovação de novos medicamentos segundo as recomendações da agência europeia do medicamento (European Medicines Agency, 2012).

As principais vantagens da pesquisa das variantes genéticas para a previsão dos fenótipos relativamente a outros métodos, como o cálculo do índice metabólico, são:

Os resultados da análise genética não serem afetados pelas condições fisiológicas, nem por outra medicação administrada simultaneamente; Não ser necessário sujeitar indivíduos à administração de uma substância

de teste;

A amostra para análise genética poder ser colhida de forma não invasiva; Uma só amostra fornecer informação sobre a capacidade de metabolização

de diversas substâncias e é válida para toda a vida do indivíduo (Sajantila et al., 2010).

Contudo, indivíduos com o mesmo genótipo podem ter fenótipos diferentes, explicados por outros fatores não genéticos tais como: a idade, o género, alterações fisiológicas e de funcionamento dos órgãos (especialmente o fígado e rins), a existência de vias metabólicas alternativas ou de patologias, o tipo de dieta e nutrição, os hábitos de consumo (tabagismo, álcool, drogas de abuso) ou medicação, que deverão ser tidas sempre em conta na altura da decisão terapêutica (Frank Musshoff et al., 2010b).

2.4.4 Farmacogenética em contexto forense

Nos casos post mortem, o cálculo de um “índice metabólico” com base nas concentrações relativas da substância e dos seus metabolitos não permite uma correta aferição do fenótipo devido a diversos fatores que podem interferir nesta avaliação. A

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colheita da amostra é efetuada durante a autópsia, não se sabendo qual a fase cinética em que se encontrava a distribuição da substância no organismo, pois são geralmente desconhecidos os factos relativos à administração, tais como a dose, o modo e o tempo decorrido até ao momento da morte (Koski, 2005). A existência de concentração baixa de um determinado metabolito relativamente à substância primária, pode ser indicativa de duas situações: ou o tempo decorrido entre a administração e a morte foi tão curto que não houve ainda tempo para a metabolização; ou o indivíduo estava com a capacidade de metabolização diminuída. Estas situações podem gerar conclusões médico-legais diferentes. Nestes casos, a caracterização do genótipo pode trazer informação adicional e explicar as concentrações encontradas (Kupiec, Raj, & Vu, 2006; Sistonen, 2008; Zackrisson, 2009).

A primeira vez que se aplicaram ferramentas de genotipagem a amostras post mortem foi em 1999 por Druid et al, com o estudo do gene CYP2D6, não tendo sido identificados metabolizadores lentos (Druid, Holmgren, Carlsson, & Ahlner, 1999). Posteriormente, foram já publicados vários estudos em amostras post mortem que estabelecem a existência de correlação entre fenótipo e genótipo (em metabolizadores lentos), nomeadamente em casos de tramadol (Levo, Koski, Ojanperä, Vuori, & Sajantila, 2003), oxicodona (Jannetto et al., 2002), metadona (Wong et al., 2003), fentanil (M. Jin et al., 2005) e amitriptilina (Koski et al., 2006; Sistonen, 2008). Além destes, existem, atualmente, muitos trabalhos publicados que procuram evidenciar a relevância da farmacogenética aplicada à Medicina Legal e às Ciências Forenses (Buscemi & Tagliabracci, 2011; Koski, 2005; Kupiec et al., 2006; Langford, Bolton, Carlin, & Palmer, 2015; Madea, Saukko, Oliva, & Musshoff, 2010; Frank Musshoff et al., 2010b; Pelotti & Bini, 2011; Sajantila et al., 2010; Zackrisson, 2009).

(43)

A maior parte dos estudos post mortem foram efetuados com um número limitado de amostras e apenas algumas variantes genéticas (consideradas as mais relevantes). A falta de dados que correlacionem, de forma segura, as características genéticas (genótipo) com os efeitos observados (fenótipo) são a principal limitação para a aplicação destas ferramentas na área forense (Buscemi & Tagliabracci, 2011). Por esta razão, o desenvolvimento de mais estudos em farmacogenética é da maior relevância para a recolha de dados que permitam entender melhor a relação entre o genótipo e o fenótipo, em particular nos casos de intoxicação ou de falha terapêutica, contribuindo também para a aplicação à prática clínica e para a determinação dos limites de segurança das substâncias. Sajantila et al. recomenda que os fatores genéticos da metabolização sejam estudados de forma sistemática para aumentar a fiabilidade na previsão do fenótipo, sendo para tal necessária a disponibilidade de metodologias adequadas, seletivas, exatas e precisas (National Academy of Sciences, 2009; Sajantila et al., 2010).

2.5 CYP2D6

O Citocromo P450 é uma família de enzimas cuja designação advém do facto de que quando são reduzidas e ligadas ao monóxido de carbono, geram um composto rosado (designando-se com um P, de pigmento), a que corresponde um pico de absorção espectral a 450 nm (http://drnelson.uthsc.edu/talks/P450lect.2009.pdf).

As enzimas deste sistema identificam-se com as siglas CYP e dividem-se em 18 famílias (com mais de 40 % de semelhança entre si; designadas por um algarismo), 44 subfamílias (com mais de 55% de semelhança; designadas por uma letra) e cada enzima designada por um número final (Zanger & Schwab, 2013). A nomenclatura encontra-se esquematizada na Figura 1.

(44)

Suzana Fonseca

Figura 1. Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450

Os genes que codificam as enzimas são conhecidos 115 genes,

(CYP1A1/2, CYP1B1; CYP2A6/7/13, CYP2B6, CYP2C8/9/18/19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1; CYP3A4/5/7/43; CYP4A11/22, CYP4B1, CYP4F2/3/8/11/12/22, CYP4V2, CYP4X1, CYP4Z1; CYP5A1; CYP7A1, CYP7B1; CYP8A1

CYP11B1/2/17/19/20; CYP21A2/24; CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1; CYP2 CYP27B1, CYP27C1/39/46/51),

presentes noutras espécies animais e vegetais coelho (http://drnelson.uthsc.edu.htm

As enzimas CYP localizam

hepatócitos. São proteínas hidrofóbicas

terminação N, o que facilita o acesso dos substratos lipofílico bicamada lipídica. A atividade

Figura 2).

Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450

as enzimas têm a mesma denominação e na espécie humana 115 genes, entre os quais 57 conseguem codificar enzimas funcionais (CYP1A1/2, CYP1B1; CYP2A6/7/13, CYP2B6, CYP2C8/9/18/19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1; CYP3A4/5/7/43; CYP4A11/22, CYP4B1, CYP4F2/3/8/11/12/22, CYP4V2, CYP4X1, CYP4Z1; CYP5A1; CYP7A1, CYP7B1; CYP8A1, CYP8B1; CYP11A1, CYP11B1/2/17/19/20; CYP21A2/24; CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1; CYP2 CYP27B1, CYP27C1/39/46/51), e os restantes são pseudogenes. Os

presentes noutras espécies animais e vegetais, como por exemplo no rato, cão, boi ou p://drnelson.uthsc.edu.htm).

enzimas CYP localizam-se principalmente no retículo endoplasmático liso dos São proteínas hidrofóbicas ligadas à membrana por uma

facilita o acesso dos substratos lipofílicos, que se deslocam na atividade catalítica dá-se na superfície endoplasmática (ver

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Regras de nomenclatura das enzimas e dos genes do Citocromo P450

têm a mesma denominação e na espécie humana ificar enzimas funcionais (CYP1A1/2, CYP1B1; CYP2A6/7/13, CYP2B6, CYP2C8/9/18/19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1; CYP3A4/5/7/43; CYP4A11/22, CYP4B1, CYP4F2/3/8/11/12/22, CYP4V2, CYP4X1, , CYP8B1; CYP11A1, CYP11B1/2/17/19/20; CYP21A2/24; CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1; CYP27A1, os restantes são pseudogenes. Os CYP estão no rato, cão, boi ou

plasmático liso dos por uma sequência com s, que se deslocam na se na superfície endoplasmática (ver

(45)

Suzana Fonseca

Figura 2. Representação esquemática do funcionamento das CYP (adaptado de http://www.pnas

No seu funcionamento dependem da presença de uma segunda enzima, a P450 oxiredutase (NADPH:P450

o grupo heme da CYP consiga

molecular, gerando água, NADP reduzido e radicais livres de oxigénio que ficam disponíveis para integrar o substrato.

reação de oxidação, mas a hidroxilação é a mais relevante na metabol

efetuada pela introdução de um átomo de oxigénio nos compostos orgânicos, por isso se denominam monooxigenases.

Existem diversos fatores

indução ou inibição enzimática e modificam a expressão d 450 (ver Figura 3).

Representação esquemática do funcionamento das CYP (adaptado de http://www.pnas.org/content/101/31/11459/F8.large.jpg)

No seu funcionamento dependem da presença de uma segunda enzima, a NADPH:P450) , responsável pela transferência de eletrões o grupo heme da CYP consiga efetuar a clivagem da ligação dupla

molecular, gerando água, NADP reduzido e radicais livres de oxigénio que ficam disponíveis para integrar o substrato. Estas enzimas podem catalisar vários tipos de

de oxidação, mas a hidroxilação é a mais relevante na metabol

pela introdução de um átomo de oxigénio nos compostos orgânicos, por isso se denominam monooxigenases. (http://drnelson.uthsc.edu/talks/P450lect.2009.pdf

fatores, internos e externos ao organismo, que podem causar a ndução ou inibição enzimática e modificam a expressão das enzimas

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Representação esquemática do funcionamento das CYP .org/content/101/31/11459/F8.large.jpg).

No seu funcionamento dependem da presença de uma segunda enzima, a citocromo eletrões para que gação dupla do oxigénio molecular, gerando água, NADP reduzido e radicais livres de oxigénio que ficam Estas enzimas podem catalisar vários tipos de de oxidação, mas a hidroxilação é a mais relevante na metabolização e é pela introdução de um átomo de oxigénio nos compostos orgânicos, por isso http://drnelson.uthsc.edu/talks/P450lect.2009.pdf). , internos e externos ao organismo, que podem causar a do citocromo