UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
QUÍMICA
Tese de Doutorado
ANGÉLICA FERRAZ GOMES
Nova metodologia analítica para análise qualitativa e
quantitativa de metabólitos bioativos de Lippia alba
e do seu produto fitoterápico desenvolvido.
SALVADOR- BA
2017
ANGÉLICA FERRAZ GOMES
Nova metodologia analítica para análise qualitativa e
quantitativa de metabólitos bioativos de Lippia alba
e do seu produto fitoterápico desenvolvido.
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química do Instituto de
Química da Universidade Federal da
Bahia, como requisito parcial para a
obtenção do título de Doutor em
Química Orgânica
Orientador: Prof. Dr. Jorge Mauricio David
Co-orientador: Prof. Dr. Mateus Freire Leite
SALVADOR-BA
2017
Agradecimentos / Acknowledgements
Firstly, I would like to sincerely thank Prof. Hermann Stuppner for giving me the opportunity to work in very nice academic environment at the Institute of Pharmacy/Pharmacognosy of the University of Innsbruck and for suggesting the interesting in my project.
I would like to thank my supervision in Brazil, prof. Dr. Jorge Mauricio David, for giving me the opportunity to work with so much autonomy and freedom in my project, which was very important for my maturation as a researcher and my co-supervision Prof. Dr. Mateus Freire Leite for believing in our project and giving all support.
Special thanks go to Dr. Stefan Schwaiger for being there for me all the time, with so much patience and helping me whenever I needed it. He disclosed me the secrets of isolation and chromatographic separation, encouraged me to try new things and made me cut my own path. His ability, patience and perseverance inspires me to this day. Thanks also for allowing and encouraging me to take the German course. It was a very important opportunity to learn another language even though I do not know how to speak English so well.
Of course I would also like to say thank for Prof. Markus Ganzera for giving me the chance to work and learn about CE. He has always been so sweet and patient with me even when I was disturbing and annoyed with CE machine. I confess, CE drove me crazy but I really enjoyed learning and we did a great job.
Maria, I cannot forget you in my thanks, of course. Her insight, her joy and our moments of relaxation, with some good beers of course, marked my time in Innsbruck and I will never forget it.
Für alle Menschen, die mich in Österreich begleitet haben ich möchte all die Momente und Erfahrungen gratulieren, dass ich mit Ihnen gelebt haben. Ich bin sehr zufrieden, da alle Lern. Vielen Dank für alles. Bis bald.
Special thinks for Maiara, for having played such a crucial role in our research and done a great job with our partnership and for my special English teacher, Fabiana, who helpt me so much during my English classes and for having encouraged me to speak English.
I had so much fun with Silvia, Lara, Alex, Juliana, Aline, Vanessa who gave me a lot of support during difficult times in Innsbruck.
I cannot forget my friends Jorsanete, Daniela, Jaqueline Rosa, Jaqueline França, Galber, Thiago by the partnership during the classes.
I also want to mention all the colleagues from the laboratory 110, Clayton, Larissa, José, Glauber, Raul, Patrícia, Marla, who shared experiences and joy moments.
I thanks also my colleagues at IMS-UFBA, Patrícia Pires, Danielle Medeiros, Juliano Amaral, Bruno Moreira, Patrícia Baier, Caroline Rodrigues, for having helped me in the viability of my doctorate as well as with some suggestions and discussions about my project.
Acknowledgements for FAPESB and CAPES for giving me all the financial support during my PhD, especially CAPES for the opportunity to participate in the PDSE program, which contributed significantly to my training.
Finally to thank God and my family for giving me all the conditions to have reached many achievements in my life.
Resumo
Lippia alba (Mill.) N. E. Brown é uma planta conhecida popularmente como erva-cidreira, de
grande importância farmacológica largamente utilizada devido às propriedades calmante, antiespasmódica suave, analgésica, sedativa, ansiolítica e levemente expectorante. Esta espécie apresenta alguns quimiotipos os quais existem relatos de diferentes atividades, tais como o quimiotipo I (citral-mirceno), que apresentam ação calmante, espasmolítica suaves e analgésica, quimiotipo II (citral-limoneno), além destas ações, tem forte atividade sedativa e ansiolítica e o quimiotipo III (carvona-limoneno) o qual possui atividade principal mucolítica e no tratamento de transtornos gastro-intestinais. Apesar de inúmeros trabalhos publicados sobre esta espécie relacionando os efeitos relatados pelos estudos etnofarmacológicos com investigações farmacológicas e químicas, ainda não se tem publicações suficientes para desenvolver um produto fitoterapêutico a partir desta espécie. Desta forma, este trabalho teve como objetivo desenvolver metodologias analíticas para a quantificação de marcadores nesta planta bem como o desenvolvimento de um produto fitoterápico a partir da mesma na forma farmacêutica comprimidos. Os métodos analíticos foram desenvolvidos através das técnicas CLAE –UV e EC-UV, sendo utilizados como marcadores substâncias da classe dos iridóides (ácido geneposídico, epi-loganina e mussaenosídeo), fenilpropanóides (acteosídeo e isoacteosídeo) e flavonoides (tricina-7-O-diglucuronídeo, apigenina-7-O- glucuronídeo, luteolina 7-O-glucosídeo). No método desenvolvido por CLAE-UV utilizou-se coluna cromatográfica C18 150 x 4,6 s-3µm 8 nm com temperatura 45º C, vazão de 0,9 ml/min cuja fase móvel foi constituída por TFA 0,02% (fase A) e a mistura de ACN e MeOH na proporção de 7:3, respectivamente, (Fase B) em modo de eluição gradiente (7-100%). Para EC dentre as soluções tampão testadas a que apresentou melhor separação foi constituída pela solução de bórax 50mM, pH 9,5 contendo 75 mM de SDS e 5% de isopropanol. Ambos os métodos atenderam aos parâmetros de validação (seletividade, exatidão, linearidade, precisão, LD e LQ) exigidos pela ICH. A partir do método CLAE foi realizado o estudo de sazonalidade dos componentes não voláteis de dois quimiotipos desta espécie (linalol e carvona). Neste trabalho observou-se que acteosídeo era o composto majoritário no inverno e que a tricina-7-O-diglucuronídeo nas demais estações. Em relação aos iridoides, mussaenosídeo e epi-loganina foram apenas observados no quimiotipo carvona, enquanto o ácido geneposídico foi a única substancia presente em todas as amostras em ambos os quimiotipos, sugerindo que este iridoide pode ser considerado um bom marcador para esta espécie. Em relação ao desenvolvimento do comprimido a partir desta planta, foram testadas 17 formulações, sendo a 16º a que apresentou melhor perfil dentro dos parâmetros preliminares estabelecidos. Para tanto, foram avaliados os parâmetros exigidos pela ANVISA (peso médio, dureza, friabilidade, desintegração, dissolução e teor de princípio ativo). A formulação 16º atendeu todas as especificações destes parâmetros, exceto para o teor de princípio ativo. Esse problema resultou da dificuldade de secagem do extrato utilizado como matéria prima vegetal, pois o mesmo apresentou elevada higroscopicidade e mesmo com a liofilização este problema não foi solucionado. Desta forma, seria necessário o uso de técnicas de secagem mais eficientes, como spray dry para que esse problema fosse solucionado. Assim, foi sugerida a repetição da formulação 16º com o uso do extrato seco através do uso de spray drier, a repetição dos testes de controle de qualidade além realização do estudo de estabilidade.
Palavras-chave: Lippia alba, quimiotipos, sazonalidade, CLAE-DAD, Eletroforese capilar, validação, desenvolvimento de comprimidos
Abstract
Lippia alba (Mill.) N. E. Brown is a popular Brazilian herb known as ‘erva cidreira’ with great
pharmacological importance and widely used because of the antispasmodic, analgesic, sedative, anxiolytic and expectorant properties. The species has some chemotypes which present different therapeutic properties such as chemotype I (myrcene-citral), which present a tranquilizer, spasmolytic and, analgesic activity, II (citral-limonene), besides these actions, has a strong sedative and anxiolytic activity. Chemotype III (carvone-limonene) has mucolytic activity and it is used in the treatment of gastrointestinal disorders. Despite numerous published works on this species relating the effects reported by ethnopharmacological studies with pharmacological and chemical investigations, there are still not enough publications to develop a herbal product from this species. Thus, this work aimed to develop analytical methodologies for the quantification of markers in this plant as well as the development of a herbal product from the same in the pharmaceutical form tablets. The analytical methods were developed using the HPLC -UV and CE-UV techniques, using as markers substances of the class of iridoids (geneposidic acid, epi-loganin and mussaenoside) phenylpropanoids (acteoside and isoacteoside) and flavonoids (tricin-7-O-diglucuronide, apigenin-7-O-glucuronide, luteolin 7-O-glucoside). The quantitative analyses was performed in HPLC-DAD Agilent, 1100 Series, employing a RP column Pro C18 150 x 4.6 s-3µm 8 nm at 45°C, flow 0.9 ml/min, gradient solvent system consisting of 0.02% aqueous TFA and mixture of acetonitrile/methanol (7:3) (7-100%). The capillary electrophoretic separation was possible with a 50 mM borax buffer containing 75 mM SDS and 5% isopropanol as organic modifier. Both methods met the validation parameters (selectivity, accuracy, linearity, precision, LOD and LOQ) required by ICH. From the HPLC method, the seasonal study of the non-volatile components of two chemotypes of this species (linalool and carvone) was performed. In this work, it was observed that actesoside was the major compound in winter and that tricin-7-O-diglucuronide in the other seasons. Regarding the iridoids, mussaenoside and epi-loganin were only observed in the carvone chemotype, while geneposidic acid was the only substance present in all samples in both chemotypes, suggesting that this iridoid can be considered a suitable marker for this species. Concerning about development of the tablet from this plant were tested 17 formulations, which the 16th presented the best profile in the preliminary parameters. For that, the parameters required by ANVISA (average weight, hardness, friability, disintegration, dissolution and drug content) were evaluated. Formulation 16th met all the specifications of these parameters, except for the drug content. This problem resulted from the difficulty of drying the extract used as vegetable raw material, because it presented high hygroscopicity and even with lyophilization this problem was not solved. Thus, it would be necessary to use more efficient drying techniques such as spray dry in order to solve this problem. Accordingly, it was suggested the repetition of the 16th formulation with the use of extract dried through the dry spray technique and the repetition of quality control tests in addition to carrying out the stability study.
Keywords: Lippia alba, chemotypes, seasonality, HPLC-DAD, Capillary electrophoresis, validation, tablets development
Lista de siglas e abreviações
1D – unidimensional 2D- bidimensional
ABIFISA - associação brasileira das empresas do setor fitoterápico, suplemento alimentar e de promoção da saúde
ACN – acetonitrila
ANVISA – agência nacional de vigilância sanitária Borax - sodium tetraborate decahydrate
BZD – benzodiazepínico CC – cromatografia em coluna CD – compressão direta
CE-UV - capillary electrophoresis coupled to the ultraviolet detector CGEN - conselho de gestão do patrimônio genético
CH3CN – acetonitrile CH3OH – metanol
CLAE –UV – cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector de Ultravioleta CLAE-DAD – cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector de arranjo de fotodiodos
CNS - central nervous system CV – coeficiente de variação CVS – compressão por via seca CVU – compressão por via úmida DT – teste de Desintegração.
EC-DAD - eletroforese capilar acoplada ao detector de arranjo de fotodiodos EC-DAD eletroforese capilar acoplada ao detector de arranjo de fotodiodos EC-UV - eletroforese capilar acoplada ao detector de ultravioleta
ESI – electrospray
FSCE - classical” free solution capillary electrophoresis GABA - ácido gama-aminobutírico
GC-MS - gas chromatography–mass spectrometry HCl – ácido clorídrico
HPLC -UV - high performance liquid chromatography coupled to the ultraviolet detector HPLC-DAD - high performance liquid chromatography coupled to photodiode array detector ICH – international conference on harmonisation
kV – kilovolts
LOD – limit of detection LOQ – limit of quantification LQ – limite de quantificação
MEKC - micellar electrokinetic chromatography MeOH – metanol
MHz – megahertz mM - milimolar
MS- ministério da saúde MT - migration time
NACE - non-aqueous capillary electrophoresis NMR - nuclear magnetic resonance
PNPIC-SUS - política nacional de práticas integrativas e complementares no sistema único de saúde
PNPMF - política nacional de plantas medicinais e fitoterápicos PTZ – pentylenetetrazol
RDC – resolução da diretoria colegiada RE - resolução
RENAFITO - relação nacional de plantas medicinais e fitoterápicos RENISUS - relação nacional de plantas medicinais de interesse ao SUS RMN – ressonância magnética nuclear
RP – reverse phase
RPM – rotações por minute RSD - relative standard deviation RT – retention time
S/N – signal to noise
SDS - dodecil sulfato de sódio SNC – sistema nervoso central SUS - sistema único de saúde TD - teste de dureza –
TF - teste de friabilidade – TFA – ácido trifluroacético TLC - thin-layer chromatography TMS – tetrametilsilano
TVP - teste de variação de peso UV – ultraviolet
Sumário Introdução Geral ... 14 Objetivos ... 19 Objetivo Geral ... 19 Objetivos específicos ... 19 Referências ... 20
Capítulo I – Desenvolvimento de métodos analíticos para quantificação dos marcadores químicos e estudo sazonal dos quimiotipos linalol e citral ... 24
Introdução ... 24
Referências ... 29
CHEMICAL SEASONAL VARIATION OF TWO DIFFERENT CHEMOTYPES FROM LIPPIA ALBA EXTRACTS ... 31
Abstract ... 31
Introduction ... 32
Methods and materials ... 33
Plant Material ... 33
Chemicals, standards... 34
Isolation and identification ... 34
Instrumental conditions ... 35
GC-MS ... 35
HPLC-DAD–MS ... 35
HPLC–DAD and analysis instrumentation ... 36
Semipreparative HPLC ... 36
NMR experiments ... 36
Preparation of the extract ... 36
Sample preparations ... 36
Development of chromatographic conditions ... 37
Validation of the Method ... 38
Selectivity and Specificity ... 38
Analytical curve and linearity ... 38
Accuracy and recovery ... 38
Repeatability and intermediate precision ... 39
Limit of detection and limit of quantification ... 39
Results and discussion ... 39
Development and Validation of the HPLC Method ... 39
Seasonal variation ... 44
Iridoids ... 44
Flavonoids and phenylpropanoids ... 48
HPLC Profile of the chemotypes ... 53
Conclusion ... 55
References ... 56
DETERMINATION OF IRIDOIS, PHENYLPROPANOIDS AND FLAVONOIDS OF LIPPIA ALBA EXTRACTS BY MICELLAR ELECTROKINETIC CAPILLARY CHROMATOGRAPHY ... 60
Abstract ... 60
Introdution ... 60
Materials and methods ... 61
Materials ... 61
Preparation of the extract ... 61
Sample preparation ... 61
Analytical method ... 62
Method validation ... 62
Selectivity and specificity ... 62
Calibration and linearity ... 63
Accuracy and recovery ... 63
Repeatability and intermediate precision ... 63
Limit of detection and quantification ... 63
Comparison of the analytical methods ... 63
Results and discussion ... 64
Method development ... 64
Method validation ... 66
Comparison of the CE and HPLC methods ... 68
Analysis of samples ... 69
Conclusions ... 72
References ... 72
Capítulo II – Desenvolvimento de comprimido fitoterápico a partir do extrato hidroetanólico das folhas de L. alba ... 74
Referências ... 79
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE COMPRIMIDOS FITOTERÁPICO A PARTIR DO EXTRATO DE LIPPIA ALBA ... 81
Resumo ... 81
Introdução ... 81
Material vegetal ... 82
Padrões para cromatografia, solventes, reagentes e excipientes farmacêuticos ... 82
Desenvolvimento da formulação comprimido ... 83
Ângulo de repouso ... 83
Processo de Compressão ... 83
Controle de qualidade físico-químico e doseamento dos comprimidos ... 84
Ensaio de variação de peso médio ... 84
Ensaio de dureza ... 84 Ensaio de Friabilidade ... 84 Tempo de desintegração ... 84 Avaliação de teor ... 84 Análises cromatográficas ... 85 Curva de calibração ... 85
Preparo das amostras dos extratos para análise de teor ... 85
Preparo das amostras de comprimidos ... 85
Ensaio de recuperação ... 86
Perfil de dissolução ... 86
Resultados e discussão ... 86
Desenvolvimento dos comprimidos e testes físicos ... 86
Avaliação de princípio ativo ... 92
Perfil de dissolução ... 92
Teste de recuperação dos comprimidos ... 93
Teor de acteosídeo na matéria prima vegetal e nos comprimidos ... 94
Conclusão ... 95
Referências ... 95
Conclusões ... 97
ANEXO I: IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS ISOLADOS ... 98
Ácido geneposídico ... 98 8- epi loganina ... 103 Mussaenosídeo ... 108 Acteosídeo ... 113 Isoacteosídeo ... 118 Apigenina 7- O- glucuronídeo ... 123 Luteolina-7-O- glucosídeo ... 127 Tricina-7-O-diglucuronídeo ... 131
Introdução Geral
O desenvolvimento de um medicamento fitoterápico inclui várias etapas e envolve um processo interdisciplinar, multidisciplinar e muitas vezes interinstitucional. As áreas de conhecimento envolvidas vão desde a antropologia, botânica, ecologia, química, fitoquímica, farmacologia, toxicologia, biotecnologia, química orgânica até a tecnologia farmacêutica (TOLEDO et al., 2003). Em 2011, o mercado global de medicamentos (sintéticos e naturais) registrou U$ 800 bilhões, enquanto o mercado para os fitoterápicos atingiu U$ 26 bilhões. A Europa ainda concentra o maior mercado (cerca de 30% do mercado mundial de fitoterápicos), sendo a Alemanha detentora de cerca de 50%. A América Latina, apesar de abrigar sete países com biodiversidade de destaque mundial (Brasil, Colômbia, Costa Rica, Equador, México, Panamá e Peru) detém apenas 5% desse total. Neste mesmo ano (2011), o faturamento total do setor farmacêutico brasileiro foi de R$ 43 bilhões, e deste cerca de R$ 1,1 bilhão foram de medicamentos fitoterápicos, sendo comercializados 43 milhões de unidades desse tipo de medicamento, apresentando um crescimento de 13% em relação a 2010 (MARQUES et al., 2012 apud ALVES, 2013).
Apesar do Brasil ainda não ter o mercado de medicamentos fitoterápicos condizente com sua biodiversidade, segundo dados da Associação Brasileira das Empresas do Setor Fitoterápico, Suplemento Alimentar e de Promoção da Saúde (Abifisa), o setor de medicamentos fitoterápicos teve crescimento de 12% em 2012, com um faturamento de R$ 2,37 bilhões. O segmento representa 3% do mercado farmacêutico total no país cujo faturamento estimado para este ano é de R$ 117,55 bilhões. Hoje, o Brasil é o nono mercado de fármacos e medicamentos do mundo (IMPRESSÃO DIGITAL, 2013). No entanto, apesar do Brasil deter a maior biodiversidade do mundo e um grande potencial para pesquisa e desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos, a maioria dos medicamentos fitoterápicos comercializados são de plantas exóticas, cuja pesquisa e desenvolvimento foram realizados pelos países europeus na sua maioria.
No intuito de estabelecer diretrizes para inserção de plantas medicinais e fitoterápicos no sistema púbico de saúde, foi criada em 2006 a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no Sistema Único de Saúde (SUS), e a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos. Ambas as políticas apresentam em suas diretrizes o incentivo à pesquisa e ao desenvolvimento com relação ao uso de plantas medicinais e fitoterápicos que possam ser disponibilizados com qualidade, segurança e eficácia à população, priorizando a biodiversidade do país (BRASIL, 2006a; BRASIL, 2006b). Como objetivo geral, esta política visa garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso
racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional.
Em meados de 2008 foi publicada pelo Departamento de Assistência Farmacêutica do Ministério da Saúde a RENISUS (Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS), que descreve 71 espécies vegetais para uso no SUS e que constitui outro marco para a oficialização do emprego da fitoterapia no Brasil (BRASIL, 2008). A RENISUS foi elabora com base na seleção de espécies vegetais com potencial de avançar nas etapas da cadeia produtiva e de poder gerar produtos de interesse para o SUS. A seleção das espécies foi realizada por técnicos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e do Ministério da Saúde (MS), profissionais de serviços e pesquisadores da área de plantas medicinais e fitoterápicos. (BRASIL, 2008).
A RENISUS tem como objetivo subsidiar o desenvolvimento de toda a cadeia produtiva relacionada à regulamentação, cultivo, manejo, produção, comercialização e dispensação de plantas medicinais e fitoterápicos. Além disso, a RENISUS pretende orientar estudos e pesquisas que possam subsidiar a elaboração da RENAFITO (Relação Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos), o desenvolvimento e a inovação na área de plantas medicinais e fitoterápicos (BRASIL, 2008).
Em 2014 foi publicada a RDC 26, a qual trata sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos, outro importante marco para a legislação de fitoterápicos no Brasil. Nesta resolução são considerados medicamentos fitoterápicos os obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais cuja segurança e eficácia sejam baseadas em evidências clínicas e que sejam caracterizados pela constância de sua qualidade (BRASIL, 2014)
No entanto, a espécie Lippia alba ainda não foi incluída nesta lista apesar de poder ser considerada uma espécie medicinal nativa promissora ao desenvolvimento de um novo medicamento devido à vários fatores. Dentre estes destacam-se, a grande quantidade de estudos realizados na área pré-clínica os quais evidenciam diversas atividades relacionadas ao seu uso popular, diversos estudos etnofarmacológicos e etnofarmacobotânicos que citam esta espécie com grande frequência e apontam a relevância da mesma nas populações estudadas, diversos trabalhos na área agronômica que indicam as condições de cultivo e manejo que propiciam uma maior produção de biomassa e teor de óleo essencial dessa espécie além de trabalhos envolvendo melhoramento genético e a existência de um amplo estudo fitoquímico que caracterizam de maneira abrangente tanto os constituintes químicos voláteis quanto os fixos (FAUTH et al., 2002; HATANO et al., 2012; VALE et al., 1999; KLUEGER et al., 1996; KLUEGER et al., 1997; ZÉTOLA, et al., 2002; HENNEBELLE et al., 2007; GURGEL DO VALE et al., 2002; VENDRUSCOLO et al., 2006; RODRIGUES et al., 2006; SANTOS, INNECCO, 2004; JANNUZI et al., 2010; BARBOSA, et al., 2006a;
YAMAMOTO, 2006; BARBOSA, et al., 2006b; TAVARES, 2009; SCHOCKEN, 2007; BARBOSA et al., 2005; FARIAS et al., 2010; HENNEBELLE et al., 2006).
Mesmo com uma vasta publicação sobre esta espécie em diversas áreas estratégicas para o desenvolvimento de um produto e, portanto, ser uma espécie promissora, a exemplo de outras espécies nativas, L. alba necessita de um maior número de estudos para poder gerar um fitoterápico cientificamente validado (HEINZMANN; BARROS, 2007). Entretanto, para esta espécie, ainda se faz necessário o desenvolvimento de formas fitofarmacêuticas adequadas, de ensaios clínicos e de metodologia de controle de qualidade da matéria prima e dos produtos acabados com o objetivo de garantir eficácia, segurança e qualidade. Miguel e cols (2004) propuseram um fluxograma simplificado para demonstrar as principais etapas no desenvolvimento de um medicamento fitoterápico, conforme apresentado na figura 1:
Figura 1: Fluxograma de procedimentos para o desenvolvimento de pesquisa em fitoterápicos a partir de extratos vegetais
Fonte: Migue; Miguel, 2004, p. 42
O desenvolvimento de um produto fitoterápico envolve etapas que vão desde a escolha da forma farmacêutica até o controle de qualidade do produto acabado. Para tanto, o desenvolvimento de método analítico no controle de qualidade se torna uma etapa crucial para garantir o desenvolvimento das demais etapas. Desta forma, a validação de método analítico deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para
tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, precisão, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, adequados à análise(BRASIL, 2003). Neste contexto, as técnicas cromatográficas têm sido amplamente utilizadas por apresentar como vantagens a alta eficiência e rapidez. Para registro de novos produtos, todos os órgãos reguladores do Brasil e de outros países exigem a validação de metodologia analítica. Portanto, um passo importante para o desenvolvimento de um fitoterápico a partir de L. alba é o desenvolvimento e validação de método analítico para o controle de qualidade desta matéria prima vegetal.
A espécie L. alba (Mill.) (Verbenaceae) é um arbusto aromático que alcança de 1 a 2 metros de altura amplamente utilizada na América Central e do Sul com grande variedade de emprego medicinal. No Brasil é conhecida como erva cidreira do campo, alecrim do campo, cidreira brava, falsa melissa e é bastante utilizada na medicina popular (HENNEBELLE et al., 2008). Esta espécie é comumente confundida com a verdadeira erva cidreira (melissa), a Melissa officinalis. Isso ocorre devido à presença de substâncias como o citral e o citronelal, que conferem o odor cítrico característico da melissa e de algumas plantas da falsa melissa (JULIÃO, et al., 2001).
Devido a variação na composição química do óleo essencial de diferentes espécimes de L. alba foi sugerida a nomenclatura de quimiotipos, separados por seus elementos predominantes. Matos e cols (1996) caracterizaram os quimiotipos de L. alba por Cromatografia em fase gasosa (CG). Deste modo, o quimiotipo I foi caracterizado pelos elevados teores de mirceno e citral. Esse tipo é conhecido como cidreira brava e é a mais comum no norte e no sul do Brasil. O tipo II caracteriza pelos teores elevados de limoneno e citral, responsáveis pelo seu odor agradável. As plantas do quimiotipo III são conhecidas como cidreiras de quintal e são caracterizadas pela presença de limoneno e carvona, combinada com a ausência do citral o que lhe confere o odor cítrico diferenciado um pouco adocicado (MATOS, 1996).
Em relação à importância farmacológica desta espécie, pode-se observar que a mesma é utilizada em diversos programas de fitoterapia. L. alba, tais como o programa Farmácia Viva em Picos-Piauí (PEREIRA et al., 2015), além de ser largamente utilizada pela população brasileira devido às propriedades calmante, antiespasmódica suave, analgésica, sedativa, ansiolítica e levemente expectorante (MATTOS et al., 2007). Dentro deste contexto muitos estudos etnofarmacológicos e etnofamacobotânicos relataram o uso desta planta, tais como o trabalho publicado por Vendruscolo et al. (2006), realizado em Porto Alegre-RS, no qual o uso das folhas da L. alba foi indicado por este estudo como calmante e para os “nervos”. Outro estudo, realizado no município de Cruz das Almas - Ba, apontou a L. alba como a espécie mais citada sendo utilizada pela população estudada para pressão alta, calmante, flatulência, dores em geral e mal-estar (RODRIGUES et al., 2006)
Diversos estudos de atividade farmacológica foram realizados com esta espécie na tentativa de comprovar os efeitos relatados nos estudos etnofarmacológicos tais como teste de atividade no sistema cardiovascular (GAZOLA et al., 2004; MAYNARD, 2011), atividade antioxidante (HENNEBELLE et al., 2007), ansiolítica (ZETOLA et al., 2002; HATANO et al., 2012), analgésica e anti-inflamatória (VIANA et al., 1998), antibacteriana (AGUIAR et al.; 2008), antiviral (ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2005), anti-úlcera (PASCUAL et al.; 2001) e anticonvulsivante (SOARES, 2001). Diante dos relatos dos estudos etnofarmacológicos e etnofamacobotânicos de L. alba, pode-se verificar que esta espécie é promissora para o desenvolvimento de um produto fitoterápico uma vez que, é amplamente utilizada pela população brasileira e apresenta diversos estudos farmacológicos evidenciando seu potencial terapêutico.
Objetivos
Objetivo Geral
Desenvolver e validar metodologia analítica para análise qualitativa e quantitativa das folhas de L. alba e do produto fitoterápico desenvolvido a partir desta espécie.
Objetivos específicos
1. Isolar os marcadores químicos a partir do extrato hidroalcoólico das folhas desta espécie.
2. Desenvolver e validar metodologia analítica baseada em CLAE-DAD e EC-DAD para quantificação dos marcadores químicos de L. alba presentes na matéria prima vegetal. 3. Realizar o estudo sazonal dos quimiotipos linalol e carvona.
4. Desenvolver um produto fitoterápico na forma farmacêutica comprimido, a partir do extrato hidroetanólico de folhas de L. alba.
5. Realizar o controle de qualidade físico-químico do produto fitoterápico na forma farmacêutica comprimido, obtido a partir do extrato hidroetanólico de folhas de L. alba.
Referências
AGUIAR, J. S.; COSTA, M. C. C. D.; NASCIMENTO, S. C.; SENA, K. X. F. R. Atividade antimicrobiana de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Verbenaceae). Brazilian Journal of Pharmacognosy. v.18, n. 3, p. 436-440, 2008.
ALVES, L. F. Produção de Fitoterápicos no Brasil: Histórias, Problemas e Perspectivas. Revista Virtual de Química. v.5, n.3, p. 450-513, 2013.
ANDRIGHETTI-FRÖHNER, C. R.; SINCERO, T. C. M.; SILVA, A. C.; SAVI, L. A.; GAIDO, C. M.; BETTEGA, J. M.; MANCINI, M.; ALMEIDA, M. T. R.; BARBOSA, R. A.; FARIAS, M. R.; BARARDI, C. R. M.; SIMÕEWS, C. M. O. Antiviral evaluation of plants from Brazilian Atlantic Tropical Forest. Fitoterapia. v.76, n.3/4, p. 374–378, 2005.
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Capítulo I
– Desenvolvimento de métodos analíticos para
quantificação dos marcadores químicos e estudo sazonal
dos quimiotipos linalol e citral
Introdução
A utilização de espécies nativas no Brasil com fins medicinais geralmente se dá na forma de coleta extrativista, ou seja, a maioria das plantas medicinais ainda não é cultivada. Além disso, os estudos quanto à domesticação e cultivo da maioria das plantas medicinais são limitados, o que dificulta a padronização da matéria prima vegetal a ser utilizada na fitoterapia e na produção de medicamento fitoterápicos. (CAMÊLO, 2010).
O potencial industrial da Lippia alba está associado às grandes facilidades agronômicas que ela apresenta como a rusticidade, a rapidez de colonização pela propagação vegetativa, o vigor, a alogamia (fonte de variabilidade), e também por vegetar e florescer o ano todo, além de apresentar ampla adaptação para vários ambientes (YAMAMOTO, 2006).
No Brasil, estudos visando um maior conhecimento da erva-cidreira, relacionando a área agronômica e fitoquímica vêm crescendo na última década. Estas informações tratam de diversos aspectos do cultivo da espécie, relacionando-os com as características do óleo essencial produzido. Santos (2003) relatou que aparentemente, não existem variações anatômicas relevantes entre os quimiotipos desta espécie, ao contrário de suas características organolépticas e morfológicas, cujas variações são bastante evidentes, conforme descrito por Matos (2000).
Para toda produção de medicamento fitoterápico em escala industrial, é imprescindível a viabilidade da produção da matéria prima vegetal em larga escala. Para tanto, são essenciais estudos agronômicos e de caracterização química e anatômica, que visem obter a compreensão das adaptações ocorridas pelos fatores ambientais, de transformações em termos de estruturas secretoras que produzem princípios ativos e de diferentes características que possam subsidiar posteriormente alguma estratégia de cultivo visando à melhor relação custo-benefício, considerando-se a produtividade e a qualidade da planta. (CARVALHO, 2013).
Os fatores críticos para o emprego clínico dos medicamentos fitoterápicos envolvem, especialmente, dificuldades de controle de qualidade e da estabilidade desses produtos. Muitas plantas podem possuir centenas de constituintes, sendo muitos deles presentes em baixíssimas concentrações. Por outro lado, os avanços das técnicas analíticas de isolamento e identificação destes compostos têm permitido a identificação e caracterização inclusive destas substâncias que ocorrem em baixas concentrações. Outro fator limitante é a variação nos constituintes químicos dos extratos vegetais, pois o metabolismo secundário
de plantas pode ser sensível à diversos fatores, tais como temperatura, umidade, luminosidade, nutrientes do solo, método de coleta, secagem e parte da planta utilizada. Todos esses fatores podem interferir na qualidade da matéria prima vegetal e, portanto, no produto final. Esses aspectos justificam as dificuldades enfrentadas pelas indústrias na manutenção da qualidade, eficácia e segurança desses medicamentos. Todavia, com as técnicas analíticas disponíveis mais recentemente, esses problemas podem ser minimizados, viabilizando o controle da qualidade da matéria prima vegetal. Por outro lado, para minimizar o problema na uniformidade e estabilidade da matéria prima vegetal, muitas industrias optaram pelo desenvolvimento do cultivo de plantas medicinais em larga escala. Além de poder eliminar as variações edafo-climáticas o cultivo permite selecionar espécies com maior teor de princípios ativos, controlar pragas e ainda evitar contaminações por metais pesados, inseticidas e outros fatores que afetam a qualidade a segurança e a eficácia. (YUNES; CALIXTO, 2001)
Os principais fatores que podem influenciar na taxa de produção de metabólitos secundários são representados na figura 2. Dentre estes pode-se citar a temperatura, altitude, umidade, índice pluviométrico, radiação ultravioleta, condições do solo e nutrientes, sazonalidade e ciclo circadiano. No entanto, os estudos sobre a influência destes fatores na produção dos metabólitos secundários foram realizados predominantemente em espécies oriundas das regiões temperadas, muitas das quais são comercialmente importantes. Já em relação às espécies nativas, existem uma quantidade muito menor de trabalhos com esta finalidade e há necessidade de se ampliar o estudo sobre o comportamento das espécies brasileiras frente a estes fatores. A maioria dos trabalhos publicados referem-se à variação do conteúdo dos óleos voláteis das espécies nativas, sendo bastante restrita a quantidade de publicações em relação à variação dos componentes fixos frente a estes fatores.
Figura 2: Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de metabólitos secundários em plantas (ilustração de C. A. Carollo; extraída de GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Conforme ilustrado na figura 2, a sazonalidade constitui um fator importante na composição quali e quantitativa de metabólitos secundários de algumas plantas. A época em que uma espécie vegetal é coletada com a finalidade de se obter uma droga vegetal deve ser observada pois, às vezes, até mesmo a natureza dos constituintes ativos não é constante durante o ano. São relatadas, por ex., variações sazonais no conteúdo de praticamente da maioria das classes de metabólitos secundários, tais como óleos essenciais (BARROS et al., 2009), lactonas sesquiterpênicas, ácidos fenólicos (ZIDORN; STUPPNER, 2001), flavonoides glicosilados, taninos hidrolisáveis, proantocianidinas (SALMINEN et al., 2004), cumarinas (WILT; MILLER, 1992), saponinas (HAYASHI, et al., 1998), alcaloides (SAPORITO et al., 2006) e iridoides (HOGEDAL; MOLGAARD, 2000).
Algumas importantes espécies empregadas como fitoterápicos apresentam estas variações sazonais tais como a Digitalis obscura (ROCA-PÉREZ, 2004), o Hypericum
perforatum (SOUTHWELL, BOURKE, 2001), Panax ginseng (KIM, et al., 1981) e a Valeriana officinalis (BOS, et al., 1998).
Outra questão importante em relação à uniformidade da composição química da matéria prima vegetal refere-se ao quimiotipo. As raças químicas ou quimiotipos são definidas como populações quimicamente distintas dentro de uma mesma espécie que possuem fenótipos semelhantes e diferentes genótipos. Desta forma, apesar de idênticas na aparência externa, seus constituintes químicos podem variar. Tais variações químicas são geneticamente controladas e têm implicações importantes na qualidade da matéria prima vegetal, uma vez que, em alguns casos, quimiotipos diferentes podem ter atividade farmacológicas distintas. (EVANS, 1996).
São observados pelo menos três quimiotipos principais para L. alba, encontrados no Brasil, dentre eles o citral, o carvona e o linalol que apresentam variações morfológicas e diferentes atividades farmacológicas. Estudos morfológicos, anatômicos e fitoquímicos desses quimiotipos têm demonstrado que, mesmo sob as mesmas condições ambientais essas diferenças são observadas. (YAMAMOTO, 2006). Em estudos citogenéticos realizados por Pierre (2004) foi verificada a ocorrência de poliploidia e mixoploidia dentro da referida espécie. Nesse trabalho, foram encontrados números cromossômicos de 2N =30, 2N = 60 e 2N = 12 a 60 para os quimiotipos citral, carvona e linalol, respectivamente. A autora também sugeriu que o quimiotipo carvona (2n=60) constitui um autopoliploide de citral e que, possivelmente, linalol constitui um híbrido resultando do cruzamento entre os quimiotipos citral e carvona.
Do ponto de vista químico, diversos autores têm tentado classificar os quimiotipos desta espécie de acordo com a composição dos componentes majoritários dos seus óleos essenciais, no entanto, esta classificação não é uniforme, o que tem causado confusão quando esses quimiotipos são classificados por números, os quais não apresentam correspondências equivalentes entre os autores.
Matos (1996) por exemplo, classifica o quimiotipo I como mirceno, II citral-limoneno e III carvona citral-limoneno. Entretanto, Hennebelle e cols (2006) adotam uma classificação diferente sugerindo sete quimiotipos, no qual o quimiotipo I inclui todos os que contém citral estando presentes linalol em maiores ou menores quantidades. Dentro do quimiotipo I, os três principais subtipos são Ia, Ib e Ic. No subtipo Ia, citral parece ser o principal composto durante o ano todo. Em contraste, quando o composto majoritário é o linalol durante o ano inteiro foi atribuído o subtipo Ib. No subtipo Ic, há evidências de variação sazonal, tanto citral e linalol podem ser o composto principal, mas em diferentes épocas do ano. Estas observações são suportadas por uma estreita relação estrutural e a origem biossintética comum entre citral e linalol (DEWICK, 2002).
Já o quimiotipo II apresenta a tagetenona como composto principal. Plantas pertencentes ao quimiotipo II são muito comuns na Guatemala, mas são bastante raras em qualquer outro lugar.
Hennebelle e cols (2006) relatam que vários artigos publicados no Brasil se referem a um quimiotipo limoneno-carvona. Estes autores notaram em um grupo de plantas, dentro das espécies L. alba, que o limoneno quase sempre estava presente, e que pelo menos um dentre as cinco cetonas monoterpênicas (carvona, dihidrocarvona, piperitona, piperitenona ou lippiona) era geralmente presente como um dos compostos mais importantes do óleo essencial, conjuntamente com o limoneno. Para estes autores a justificativa é porque estes cinco compostos são estruturalmente relacionados, e todos derivam do limoneno, apresentando as vias biossintéticas envolvidas muito próximas. Assim, quando o
componente majoritário é o limoneno e uma destas cinco cetonas está presente, a planta foi classificada como quimiotipo III. Dentro deste quimiotipo Hennebelle e cols (2006) propuseram dois subtipos: no subtipo IIIa, cujos compostos majoritários do óleo essencial são limoneno e carvona, e no IIIb, eles são dihidrocarvona, piperitona ou lippiona.
Em relação aos demais quimiotipos Hennebelle e cols (2006) sugeriram os quimiotipos IV-VII de acordo com seus compostos majoritários: quimiotipo IV, mirceno; quimiotipo V, gama-terpineno, quimiotipo VI cânfora e 1,8-cineol, e no quimiotipo VII, estragolone. Isto mostra claramente que a classificação geral é complexa e ainda demonstra problemas. O quadro 1 apresenta um resumo da classificação dos quimiotipos de L. alba relatado por estes autores:
Quadro 1: Classificação dos quimiotipos de L. alba de acordo com Matos (1996) e Hennebelle e cols (2006)
Quimiotipo Autor Componentes majoritários
Subtipo
I Matos (1996) mirceno-citral -
Hennebelle et al. (2006)
citral-linalol Ia – citral majoritário Ib- linalol majoritário
Ic – variação sazonal entre citral e linalol
II Matos (1996) citral-limoneno -
Hennebelle et al. (2006)
tagetenona -
III Matos (1996) limoneno- carvona -
Hennebelle et al. (2006)
limoneno-cetona monoterpênica
IIIa – limoneno-carvona
IIIb limoneno – dihidrocarvona, piperitona ou lippiona IV Hennebelle et al. (2006) mirceno - V gama-terpineno - VI cânfora – 1,8 cineol - VII estragolone -
Desta forma, fica evidente a grande variedade de quimiotipos desta espécie e a dificuldade de padronização da sua classificação. Portanto, nesse trabalho, não será utilizada numeração para se referir à classificação dos quimiotipos desta espécie, mas os
mesmos serão identificados de acordo com a composição química dos componentes majoritários dos seus óleos essenciais.
A grande variedade de quimiotipos observados para L. alba é um fator desafiador para a seleção do mesmo com finalidade de se obter uma matéria prima vegetal padronizada, sendo a identificação do quimiotipo uma etapa crucial.
Desta forma, a identificação correta do quimiotipo desejado e o conhecimento do comportamento sazonal na produção dos metabólitos secundários dessa espécie são elementos estratégicos para a obtenção de matéria prima vegetal de qualidade adequada e padronizada para obtenção de um produto fitoterápico que atendam aos requisitos de segurança e eficácia.
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CHEMICAL SEASONAL VARIATION OF TWO DIFFERENT CHEMOTYPES FROM
LIPPIA ALBA EXTRACTS
Gomes, A.F.1 Leite, M.F.1 Almeida, M.P.1 Schwaiger, S.2 Stuppner, H.2 Halabalaki, M.2 Amaral, J.G.1 David, J.M 1.
Abstract
Lippia alba is a popular Brazilian herb known as ‘cidreira’. The local population traditionally
use as a tranquilizer and for gastro-intestinal disorders its leaf infusions. Many authors report the occurrence of several chemotypes of this plant, which are classified according to their essential oil compositions. These chemotypes present different therapeutic properties. However, the chemical variation of polar extracts of the different chemotypes has been scarily investigated. This work was performed to investigate the seasonal variation of the secondary metabolites in the polar extracts of carvone and linalool L. alba’s chemotypes. For this study, the carvone and linalool chemotypes were cultivated at the University of Bahia and they were identified by their essential oil composition by GC-MS analyses. A seasonal study was conducted with cultivated plants (3 especimens of linalool chemotype and 3 of carvone chemotype). The samples were collected monthly from December 2014 to December 2015 and the extracts were prepared with 80% ethanol. Aiming the analysis of these extracts, a methodology on HPLC-DAD was developed in order to recognize the major secondary metabolites present in the extracts and to determine the seasonal variations. The identification of the metabolites has occurred mainly by HPLC-DAD-MS and the quantitative analyses was performed in HPLC-DAD Agilent, 1100 Series, employing a RP column YMC – Pack Pro C18 RS 150 x 4.6 s-3µm 8 nm at 45°C, flow 0.9 ml/min, gradient solvent system consisting of 0.02% aqueous TFA and mixture of acetonitrile/methanol (7:3) (7-100%). For calibration curves, analytical markers (acteoside, isoacteoside, geneposidic acid, 8-epi-loganin, mussaenoside, luteolin 7-O-glucoside, apigenin -7-O-glucuronide and tricin-7-O-diglucuronide) have been isolated and identified by spectrometric data from the extracts with a purity of 95% (HPLC and NMR). Regarding iridoids, geneposidic acid was presented in all samples, in contrast to the 8-epi-loganin and, mussaenoside which were presented only in carvone chemotype. In these chemotype mussaenoside was the major iridoid present in all the samples. Acteoside was found as the major metabolite from July to November while tricin-7-O-diglucuronide was the major compound the all other months. Could be hypothesized that the cold and dry climatic conditions inducer acteoside production. On the other hand, hot and humid weather support tricin-7-O-diglucuronide synthesis. Interestingly, phenylpropanoids are predominant in winter and flavonoids in summer. This work permitted
to conclude chemical variation is also observed in polar constituents of Lippia alba chemotypes.
Introduction
Lippia alba (Verbenaceae) is a popular herb that growing in Brazil and it is popularly
known as ‘cidreira’.It is a very rustic and vigorous Brazilian shrub that is widely found all over South and Central America (HENNEBELLE et al., 2008). The species is mainly used in folk medicine against digestive and respiratory disorders, but also as a sedative, analgesic, anti-inflammatory, antipyretic and antihypertensive (PASCUAL et al., 2001; AGRA et al., 2008). The literature have presented various ethnopharmacological studies dealing with Lippia
alba. In the ethnopharmacological study conducted in French Guiana, L. alba was mentioned
mainly for flu, indigestion and insomnia/anxiety, treatments (TAREAU, et al., 2017.) In two studies carried out in the state of Bahia, Lippia alba was one of the two most frequently cited species. In the village of Sapucaia, Cruz das Almas, it is used as a sedative and also against hypertension, flatulence and pain (RODRIGUES; GUEDES, 2006). In Itacaré, it is used against stomach ache and digestive troubles with high concordance between informants (PINTO et al., 2006). Besides, to date L. alba also presents a large amount of pharmacological studies. The subjects of experimental works dealing with plant were performed in accordance with its traditional uses such as cardiovascular activity (GAZOLA et al., 2004), antioxidant (MAYNARD, 2011), neurosedative (ZÉTOLA et al., 2002; HATANO et al., 2012), analgesic and anti-inflammatory activities (VIANA et al., 1998; AGUIAR et al., 2008), anti-infectious properties (VERPOORTE et al., 2006), antiviral activity (ANDRIGHETTI-FRÖHNER et al., 2005), antiulcerogenic activity (PASCUAL et al.; 2001), anesthetic (SOUZA, 2017) and, anticonvulsivant action (SOARES, 2001).
The composition of the L. alba essential oils are very variable, suggesting the existence of a high number of chemotypes (HENNEBELLE et al., 2008). Many authors have tried to classify Lippia alba´s chemotypes according to the major compound present in their essential oil (HENNEBELLE et al., 2008; MATOS, 1996). In Brazil, there are at least three main chemotypes; citral, carvone and linalool types (YAMAMOTO, 2006). According to Matos (1996) each different chemotype has a specific activity, for example, myrcene-citral chemotype is related with the tranquilizer, analgesic and, antispasmodic activities, similarly, limonene-citral chemotype showed anxiolytic, sedative and, antispasmodic activities. On the other hand, limonene-carvone is related with mucolytic action.
The secondary metabolism of plants can be sensitive to several factors, such as temperature, humidity, luminosity, altitude, pluviometry, ultraviolet radiation, soil and nutrient conditions, seasonality, circadian cycle, method of collection, drying and part of the plant used. (YUNES; CALIXTO, 2001; GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Meanwhile, most studies
on the chemical variability of plants have been concentrated to in species from temperate regions, many of which are commercially important. (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Concerning about Brazilian species, there is a much smaller number of works with this purpose and there is a need to expand the study on the behavior of native species in relation to those factors.
Moreover, there are a few studies decribing the chemical variation of hydroalchoolic extracts of different chemotypes (TIMÓTEO et al., 2015). Further, the chemotype variation, another important factor that could be interfere the chemical composition and, consequently, their biological activities is the seasonal variation. Although there are many publications describing the seasonal variation of the Lippia alba´s essential oil (BARROS et al., 2009; MACHADO et al., 2014; CASTRO et al., 2002; CÂMELO, 2010) , the seasonal variation of the compounds present in the polar extracts has not been reported yet. Bearing in mind the possible variation in terms of secondary metabolites content, this work aims to investigate the possible alterations in the chemical content influenced by seasonal factor. In order to perform this study a HPLC method was developed to afford validated qualitative and quantitative data and this method was used to analyze the samples from the seasonal studies of non-volatile secondary metabolites L. alba of the two linalool and carvone chemotypes.
Methods and materials Plant Material
The plant material used for isolation as well as analysis was cultivated at the campus of the University of Bahia in Vitória da Conquista city and respective voucher specimens (number 1536 specimens) are deposited at the herbarium Mongoyós of the same institute. The number of authorization of access to genetic heritage (CGEN) is 010806/2015-6. All of the chemotypes were identified by their essential oil composition by GC-MS analyses. In order to facilitate the identification of the chemotypes in this work different letters will be used to identify them: carvone-limonene (A), linalool-eucalyptol (B); Mycene-citral (C), Myrcene-limonene-carvone (D), Myrcene-citral-linalool-limonene (E) and, Myrcene-citral-carvone (F), Linalool (G). The chemotypes A and B were selected to cultivate and were used to seasonal study. The others were collected in the same city and prepared the same way to compare them.
Plant seedlings of Lippia alba linalool-eucalyptol (A) and carvone-limonene (B) chemotype had been planted in 2013 and cultivated at the campus of University of Bahia in Vitória da Conquista city. Three individuals of each chemotype were selected to conduct the seasonal study and they are named LA 3, LA 4 and, LA12 for specimens which A chemotype
