HUGO COSTA NETO
O CRIPTO-1 É UM POTENCIAL BIOMARCADOR PARA O DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DOS TUMORES ÓSSEOS
BENIGNOS E MALIGNOS DOS MAXILARES
HUGO COSTA NETO
O CRIPTO-1 É UM POTENCIAL BIOMARCADOR PARA O DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DOS TUMORES ÓSSEOS BENIGNOS E MALIGNOS DOS
MAXILARES
Tese apresentada ao curso de Pós-graduação em Ciências Odontológicas, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Odontológicas, área de concentração em Patologia Oral e Estomatologia.
Orientadora: Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - -Departamento de Odontologia
Costa Neto, Hugo.
O Cripto-1 é um potencial biomarcador para o diagnóstico diferencial dos tumores ósseos benignos e malignos dos maxilares / Hugo Costa Neto. - Natal, 2020.
71 f.: il.
Orientadora: Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão.
Tese (Doutorado em Ciências Odontológicas) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Natal, 2020.
1. Displasia fibrosa monostótica - Tese. 2. Fibroma ossificante - Tese. 3. Osteossarcoma - Tese. 4. Diagnóstico diferencial - Tese. 5. Imuno-histoquimica - Tese. I. Galvão, Hébel Cavalcanti. II. Título.
RN/UF/BSO BLACK D61 Elaborado por MONICA KARINA SANTOS REIS - CRB-15/393
HUGO COSTA NETO
O CRIPTO-1 É UM POTENCIAL BIOMARCADOR PARA O DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DOS TUMORES ÓSSEOS BENIGNOS E MALIGNOS DOS
MAXILARES
Tese apresentada ao curso de Pós-graduação em Ciências Odontológicas, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Odontológicas com área de concentração em Patologia Oral e Estomatologia.
Aprovada em: 28/02/2020
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Manuel Antonio Gordón-Núñez Membro externo/1º examinador
Universidade Estadual da Paraíba
Profa. Dra. Ana Luiza Dias Leite de Andrade Membro externo/2ª examinadora
Universidade Federal de Alfenas
Profa. Dra. Roseana de Almeida Freitas Membro interno/3ª examinadora
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Profa. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira Membro interno/4ª examinadora
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão Presidente/Orientadora
À Professora Doutora Hébel Cavalcanti Galvão, com quem aprendi tantas coisas ao longo dos anos. Fonte de inspiração, dedicação e carisma. Sou imensamente grato por toda essa jornada.
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, a Deus por tornar tudo isso possível.
À toda minha família, meus pais, Lilian Amorim da Silva Costa e Wallace Costa, aos meus irmãos, Camila Luiza Amorim Costa e Samuel Wallace Amorim Costa, ao meu cunhado, Guilherme Diógenes Correia e ao meu melhor amigo e companheiro, Nelson Soares da Sousa Dantas, que sempre estão ao meu lado nos momentos bons e ruins, mas acima de tudo, me dão todo suporte, sem medir esforços para que eu alcance todos os meus objetivos.
Aos meus amigos, agradeço a compreensão dos tantos nãos que tiveram que escutar e que ainda escutam. Sou grato pela insistência, pela fidelidade e por saber que sempre posso contar com vocês.
À minha orientadora e chefe do Departamento de Odontologia, Profª Drª Hébel Cavalcanti Galvão, agradeço o momento em que decidiu me tornar bolsista de iniciação científica. Não esqueço do seu olhar ao me dizer que já estava por selecionar outros alunos, que teriam manifestado interesse antes de mim, e tive a grata surpresa da indicação. Este ano, completamos 10 anos de uma parceira repleta de aprendizados, cuidado, escuta e de muita confiança. Obrigado por me incentivar em todos os sentidos, apoiar todas as minhas decisões, estar sempre com um sorriso no rosto e com um abraço afetuoso.
À coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas da UFRN, Profª Drª Roseana de Almeida Freitas. Alguns momentos marcam nossa vida, como ter sido premiado no Congresso da Sociedade Brasileira de Estomatologia e Patologia Oral sob sua orientação, mas ouvir seu agradecimento a mim, por ter auxiliado na apresentação de um dos casos do seminário de lâminas foi muito mais engrandecedor naquele momento. Agradeço pelas parcerias, por todos os ensinamentos e disposição sempre que bati à sua porta precisando consultar algum caso.
À Profª Drª Lélia Batista de Souza, agradeço o exemplo de dedicação ao programa de pós-graduação, pesquisa científica e por tornar esse momento possível.
À Profª Drª Éricka Janine Dantas da Silveira¸ agradeço por todos os ensinamentos, pelos conselhos, pelos exemplos de doação e determinação, pela parceria científica sempre muito prazerosa e produtiva. Esteve também comigo desde a graduação, mais de perto na monitoria em Clínica Integrada e nesse fim, tão importante, me incentivando com a pesquisa deste trabalho, trazendo boas energias, elevando o meu ânimo.
À Profª Drª Márcia Cristina da Costa Miguel, levo comigo seus exemplos de pontualidade, exigência e rigorosidade, as vezes mal compreendido, mas que foram essenciais para o crescimento e evolução. Agradeço também por tornar essa pesquisa possível.
Aos demais professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN: Profº Drº Leão Pereira Pinto, Lélia Maria Guedez Queiroz, Profº Drº Antônio de Lisboa Lopes Costa, Profª Drª Ana Miryam Costa de Medeiros, Profº Drº Bruno César de Vasconcelos Gurgel, Profº Drº Carlos Augusto Galvão Barboza e Profª Drª Patrícia Teixeira de Oliveira, agradeço por todos os aprendizados, pelos exemplos de dedicação, do ensinar, dos exemplos de cargos administrativos. Levarei todos esses exemplos comigo, pelos caminhos onde for, ótimas partes de cada um de vocês comigo.
Ao Profº Drº Manuel Antonio Gordón-Núñez, agradeço a amizade e parceria científica de todos esses anos. Todas as oportunidades que você me proporcionou, ainda no
terceiro período da graduação, e em conjunto com a Profª Drª Hébel Cavalcanti Galvão, me moldaram e me fizeram ser o que sou hoje. Você é um dos grandes responsáveis pelo meu crescimento pessoal e profissional. Eu sou extremamente grato por seu envolvimento na minha vida acadêmica e de pós-graduação. E não menos importante, te agradeço pelo ótimo convívio na UEPB e por dividir a sala de aula com o profissional exemplar que és.
À Profª Drª Ana Luiza Dias Leite de Andrade, minha irmã patológica, amiga e meu espelho na pós-graduação. Obrigado pela parceria que temos até hoje e a qual espero que jamais acabe. Obrigado por fazer parte da minha história desde os primórdios da iniciação científica. Os tempos passaram, mas pouca coisa mudou. Conte comigo para tudo.
Ao Profº Drº Joabe dos Santos Pereira e todas as nossas coincidências. Fui chamado para substituí-lo em sua antiga vaga na Universidade Estadual da Paraíba e fiz esta pesquisa graças a sua escolha, em algum momento, de fazer cotação para o anticorpo cripto, através da Profª Drª Márcia Cristina da Costa Miguel. De forma direta, me ajudou escaneando alguns casos que fazem parte deste trabalho. Indireta e diretamente, agradeço por toda a sua solicitude. Aos meus queridos amigos da pós-graduação, Amanda, Angélica, Eduardo, Jefferson, Leorik, Luiz Arthur, Mara Luana, Marianna, Patrícia, Rodrigo e Thalita. Vocês foram a melhor turma que eu poderia ter. Tivemos dois anos tão intensos de mestrado que nos tornamos uma família. Agradeço o nosso convívio tão harmonioso, carinhoso e de apoio.
Às minhas amigas da pós-graduação Andréia e Maria Luiza, obrigado pela amizade, pelo suporte, pelos nossos encontros sempre acalorados. Vocês foram um dos grandes presentes que a Patologia Oral me deu.
A todos os funcionários do Departamento de Odontologia da UFRN, bibliotecários, técnicos administrativos, auxiliares de serviços gerais, em especial aos funcionários do Programa de Pós-Graduação, Amanda, Betsaida, Gracinha, Hévio, Idel, Lourdinha, Ricardo e Sandrinha, obrigado pela feliz convivência diária e por sempre serem tão solícitos a nos ajudar.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelos dois anos de auxílios financeiros que possibilitaram a minha formação com mais leveza.
Do ponto de vista da terra quem gira é o sol Do ponto de vista da mãe todo filho é bonito Do ponto de vista do ponto o círculo é infinito Do ponto de vista do cego sirene é farol
Do ponto de vista do mar quem balança é a praia Do ponto de vista da vida um dia é pouco
Guardado no bolso do louco Há sempre um pedaço de Deus Respeite meus pontos de vista Que eu respeito os teus
Às vezes o ponto de vista tem certa miopia, Pois enxerga diferente do que a gente gostaria Não é preciso por lente nem óculos de grau Tampouco que exista somente
Um ponto de vista igual
O jeito é manter o respeito e ponto final
RESUMO
O termo lesão fibro-óssea dos maxilares (LFOM) é uma designação inespecífica para um grupo de distúrbios caracterizados, morfologicamente, pela substituição do tecido ósseo por uma matriz de tecido conjuntivo fibrosa, a qual exibe neoformação de tecido ósseo com diferentes graus de mineralização. O diagnóstico preciso das LFOM não é fácil e só pode ser realizado após uma análise minuciosa dos aspectos clínicos, radiológicos e histológicos. No entanto, deve-se admitir que alguns casos desafiam a exatidão na emissão do diagnóstico. Considerando a diversidade do comportamento biológico das lesões e as pesquisas sobre a identificação de potenciais marcadores moleculares, o objetivo deste trabalho foi realizar uma análise imuno-histoquímica do cripto-1 (CR-1) e da β-catenina em uma série de casos diagnosticados microscopicamente como displasia fibrosa (DF) (n=30), fibroma ossificante central (FOC) (n=28) e osteossarcoma (OS) (n=5) armazenados nos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica Oral de uma população brasileira. As expressões imuno-histoquímicas foram analisadas através de escore imunorreativo. Os dados obtidos foram inseridos em um arquivo do software Microsoft Excel® e, posteriormente, analisados no software Statistical Package for Social Science. Para todos os testes estatísticos utilizados, o nível de significância foi estabelecido em 5% (p<0,05). O CR-1 exibiu predominância de um padrão fortemente positivo para os casos de FOC e OS, e do padrão moderado para os casos de DF (p<0,001). A β-catenina exibiu predominância do padrão negativo para os casos de FOC e DF, e do padrão fortemente positivo para os casos de OS (p=0,001). O teste de correlação de Spearman revelou correlação positiva entre os escores imunorreativos de CR-1 e β-catenina. Os resultados desta pesquisa sugerem a participação do CR-1 na patogênese do FOC e OS, assim como o uso dessa proteína como potencial biomarcador molecular para o diagnóstico diferencial de LFOM.
Palavras-chave: displasia fibrosa monostótica; fibroma ossificante; osteossarcoma; diagnóstico diferencial;
ABSTRACT
Fibro-osseous lesions of maxilar (FOLM) is a non-specific designation for a group of disorders characterized, morphologically, by replacement of bone tissue by a matrix of fibrous connective tissue, showing neoformation of bone tissue with varying degrees of mineralization. Precise diagnosis of FOLM is not easy, and requires careful analyisis of clinical, radiological and histological aspects. Even so, some cases still challenge accuracy in diagnosis. Considering the diversity of biological behaviour of the lesions and the research regarding identification of potential molecular markers, this study aims to perform immunohistochemical analysis of crypto-1 and β-catenin in a series of cases diagnosed microscopically as fibrous dysplasia (FD) (n=30), central ossifying fibroma (COF) (n=28) and osteossarcoma (OS) (n=5), stored in archives of Oral Pathological Anatomy Service of a Brazilian population. Immunohistochemical expressions were analysed by imunorreactive score. All data obtained was inserted into a file of Microsoft Excel® software (Microsoft Corporation, USA) and then transferred to a database of SPSS® for Windows software (Statistical Package for Social Sciences; IBM, USA), version 20.0. For all statistical tests used, the significance level established was p ≤ 0.05. CR-1 showed a predominant pattern of strong positive in COF and OS cases, and a moderate positive in FD cases (p<0,001). β-catenin showed a predominant negative pattern for COF and FD cases, and a predominant strong positive pattern for OS cases (p=0,001). Spearman correlation tests showed positive correlation of the imunoreative scores of CR-1 and β-catenin. Those results suggests CR-1 could be involved in the pathogenesis of COF and OS, and this protein could be used as a potential molecular biomarker for diferential diagnosis of FOLM.
Keywords: fibrous dysplasia, monostotic; fibroma, ossifying; osteosarcoma; diagnosis, differential; immunohistochemistry.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Hematoxilina e Eosina (HE) DF (A) FOC (B) e OS (C) (Escala 500μm, 500μm e 100μm, respectivamente). Imunoexpressão de cripto-1 em DF (D) FOC (E) e OS (F) (Escala 100μm, 100μm e 100μm, respectivamente). Imunoexpressão da β-catenina em DF (G) FOC (H) e
OS (I) (Escala 100μm, 100μm e 100μm,
respectivamente)... 41
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Distribuição dos casos de FOC, DF e OS de acordo com a imunoexpressão de CR-1...
34
Tabela 2 – Distribuição dos casos de FOC, DF e OS de acordo com a imunoexpressão de beta-catenina...
35
Tabela 3 – Distribuição dos casos de FOC, DF e OS, de acordo com as características clínico-radiográficas analisadas...
43
Tabela 4 - Distribuição dos casos de FOC e DF, de acordo com as características histopatologicas analisadas...
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AP - Adenoma pleomórfico
APC – Do inglês adenomatous polyposis coli traduzido como proteína adenomatosa da polipose coli
CAEXAP - Carcinoma ex adenoma pleomórfico
cAMP – Do inglês cyclic adenosine monophosphate traduzido como monofosfato de adenosina cíclico
CCEO - Carcinoma de células escamosas oral CR-1 – Cripto 1
DCO – Displasia cemento-óssea DF – Displasia fibrosa
EGF – Do inglês epidermal growth factor traduzido como fator de crescimento epidérmico EGF-CFC - Do inglês epidermal growth factor-Cripto-1/FRL-1/Cryptic traduzido como família do fator de crescimento epidérmico - Cripto-1 / FRL-1 / Críptico
FCO - Fibroma cemento-ossificante FO – Fibroma ossificante
FOPJ - Fibroma ossificante psammomatoide juvenil FOTJ – Fibroma ossificante trabecular juvenil GSK-3β - Glicogênio sintase quinase - 3β LFOM – Lesão fibro-óssea dos maxilares
LRP - Do inglês lipoprotein Receptor-Related Protein traduzido como proteína relacionada ao receptor de lipoproteína
MMP-7 - Metaloproteinases da matriz 7 OMS – Organização Mundial da Saúde
PAI-1 – Do inglês plasminogen activator inhibitor-1 traduzido como inibidor-1 do ativador do plasminogênio
RT-PCR – Do inglês reverse transcription polymerase chain reaction traduzido como Reação em cadeia da polimerase por transcriptase reversa
TCF/LEF-1 - Do inglês T-cell factor/lymphoid enhancer-binding fator-1 traduzido como fatores de células T / fator de ligação intensificador linfoide -1
TDGF – Do inglês teratocarcinoma-derived growth factor-1 traduzido como fator de crescimento 1 derivado do teratocarcinoma
TGF-β – Do inglês transforming growth factor beta traduzido como fator de crescimento tumoral – β
Wnt – Wingless + Int β ‐ catenina – Beta catenina
SUMÁRIO
1 REFERENCIAL TEÓRICO ... 12
1.1 Lesões fibro-ósseas dos maxilares (LFOM) ... 12
1.1.1 Displasia fibrosa ... 13
1.1.2 Fibroma ossificante central ... 15
1.2 Osteossarcoma ... 18 1.3 Cripto-1 (CR-1) ... 18 1.4 Beta-catenina (Β-catenina) ... 20 2. OBJETIVOS ... 23 2.1 Objetivos específicos ... 23 3 ARTIGO ... 24 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 43 REFERÊNCIAS ... 44 ANEXOS ... 52
1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1 Lesões fibro-ósseas dos maxilares (LFOM)
O termo LFOM é uma designação inespecífica para um grupo de distúrbios caracterizados, morfologicamente, pela substituição óssea por uma matriz de tecido conjuntivo fibrosa, a qual exibe neoformação de tecido duro com diferentes graus de mineralização. Fazem parte desse grupo, lesões hamartomatosas, lesões reacionais ou displásicas, e neoplasias (MAINVILLE; TURGEON; KAUZMAN, 2017; EL-NAGGAR et al., 2017).
As LFOM estão incluídas no grupo de tumores ósseos maxilofaciais e odontogênicos. Esta nova classificação, proposta pela OMS, em 2017, subdivide diversos grupos, entre os quais está o grupo das lesões fibro-ósseas e osteocondromatosas. Este inclui o fibroma ossificante central (FOC), o cementoma gigantiforme familiar, a displasia fibrosa (DF), as displasias cemento-ósseas (DCO) e o osteoncondroma (EL-NAGGAR et al., 2017).
O diagnóstico preciso dessas lesões não é fácil e só pode ser realizado após uma análise minuciosa dos aspectos clínicos, radiológicos e histológicos. Com todos estes, a maioria das LFOM pode ser atribuída com razoável segurança a um correto diagnóstico. No entanto, deve-se admitir que alguns casos ainda desafiam a exata classificação, pois na ausência de boas informações clínicas e radiológicas, o patologista apenas pode afirmar que uma determinada biópsia é consistente com uma LFOM benigna (AHMAD; GAALAAS, 2018).
A idade do paciente, sexo, grupo étnico e a localização e distribuição da lesão também são elementos importantes a serem considerados para estabelecer o diagnóstico (MACDONALD-JANKOWSKI, 2004, MACDONALD, 2015).
Vários outros processos de doenças que evolvem os maxilares podem ser confundidos com as LFOM. Estes incluem alguns tipos de osteomielite, doença de Paget, hiperparatireoidismo, cementoblastoma, osteoblastoma e osteossarcoma de baixo grau. A distinção destas lesões geralmente pode ser realizada através da análise minunciosa dos aspectos clínicos, imagenológicos e histopatológicos, embora seja difícil para alguns casos (WHITE; PHAROAH, 2015; NEVILLE et al., 2016).
Erros de diagnóstico podem surgir quando todos os dados não são cuidadosamente considerados e podem ter repercussões terapêuticas e prognósticas (MAINVILLE; TURGEON; KAUZMAN, 2017).
Os tratamentos das LFOM variam de simples proservação ou monitoramento simples do paciente, em casos de DF, para excisões cirúrgicas que podem ser conservadoras ou mais agressivas a depender do desenvolvimento do FOC, por exemplo (AHMAD; GAALAAS, 2018). Embora a radioterapia tenha sido um tratamento aceito para certos casos de LFOMs na década de 1940, hoje deve-se salientar que esse tipo de tratamento é uma causa conhecida de transformação sarcomatosa e é totalmente contra-indicada (NEVILLE et al., 2016).
1.1.1 Displasia fibrosa
A DF é uma anomalia fibro-esquelética na qual o osso normal é substituído e alterado por osso imaturo e tecido fibroso mal organizado e inadequadamente mineralizado (EL-NAGGAR et al., 2017). O tecido ósseo é formado, mas não se desenvolve em osso lamelar e não se realinha em resposta ao estresse mecânico, e, portanto, apresenta baixa resistência mecânica (WHITE; PHAROAH, 2015).
A DF é um distúrbio do metabolismo ósseo primário que possui base genética. Está associada a uma mutação missense ativadora do complexo GNAS no cromossomo 20q13 que codifica a subunidade alfa de uma proteína G estimuladora (GS alfa) (SHENKER et al., 1994; EL-MOFTY, 2014). A GS alfa estimula a atividade da adenilil ciclase causando a super expressão do 3′ - 5′ - monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), que resulta em alterações nas propriedades celulares das células osteoprogenitoras ósseas que, por sua vez, estimulam a proliferação celular, diferenciação celular inadequada e superprodução de uma matriz óssea fibrosada desorganizada, levando a formação óssea anormal (RIMINUCCI et al., 2003).
É uma condição que pode acometer um único osso, denominando-se DF monostótica, ou múltiplos ossos, sendo chamada de DF poliostótica (WALDRON, 1993). Em sua forma poliostótica, a DF acompanha uma diversidade de síndromes, como a síndrome de Jaffe-Lichtenstein, a síndrome de McCune Albright e a síndrome de Mazabraud (NEVIILE et al., 2016).
A DF representa aproximadamente 7% de todos os tumores ósseos benignos. A DF monostótica é 6 a 10 vezes mais comum que a DF poliostótica. Ainda que a DF que ocorre em múltiplos ossos do crânio, seja considerada como monostótica, o termo DF craniofacial é utilizado, bem aceito e preferido para tais casos (MAHAJAN; KAMBOJ; BAOZ, 2005).
A DF é uma doença que está relacionada, em sua maioria, ao desenvolvimento ósseo. Em geral, começa na infância e progride ao longo da puberdade / adolescência, logo a maioria dos casos é inicialmente identificada nas duas primeiras décadas de vida. Não há predileção
pelo sexo e os pacientes afetados geralmente apresentam a queixa principal de um inchaço indolor, sendo este junto a assimetria facial as primeiras manifestações clínicas (EL-MOFTY, 2014; WU et al., 2014).
Alterações nos ossos podem variar de leve expansão, sendo principalmente uma queixa de questão cosmética. Os ossos da região craniofacial, especialmente os ossos gnáticos, estão entre os locais mais afetados. O tumor tem predileção pela maxila com apresentação predominantemente unilateral (YANG et al., 2017).
A densidade da DF varia ao longo de um espectro relacionado à maturidade das lesões. Em uma linha evolutiva de maturação, a lesão se apresenta inicialmente radiolúcida, radiolúcida com áreas radiopacas, de uma forma mista e, por fim, mais radiopaca em comparação ao osso normal (EVERSOLE; SU; EL-MOFTY, 2008).
Refletindo a estrutura interna variável e irregular das trabéculas ósseas da lesão, o padrão radiográfico pode variar em um padrão granular com aspecto de vidro fosco, um padrão que se assemelha a área superficial de uma casca de laranja, um arranjo delicado que lembre flocos de algodão ou algo mais grosseiro e amorfo (YETISER; GONUL; TOSUN; TASAR; HIDIR, 2006; EVERSOLE; SU; EL-MOFTY, 2008)
O osso cortical externo pode ser expandido, com manutenção da cortical externa com afinamento significativo, porém sem ocorrer o rompimento ósseo. No caso de dentes que estejam diretamente envolvidos com a lesão, a lâmina dura associada pode ser perdida, principalmente em lesões mais desenvolvidas com maior densidade óssea, e o espaço do ligamento periodontal pode ser bastante estreitado. Em raras ocasiões, na DF, ocorrerá deslocamento dentário ou a interferência na erupção dentária e a reabsorção radicular (WHITE; PHAROAH, 2015).
Ao exame histopatológico, os cortes histológicos exibem um tecido conjuntivo fibroso denso celularizado composto por fibroblastos e fibras colágenas. No interior do tecido conjuntivo está um componente mineralizado de trabéculas finas e curvilíneas de tecido ósseo (EL-MOFTY, 2014). A DF dos ossos gnáticos pode mostrar áreas do osso lamelar. As trabéculas ósseas da lesão se fundem com o osso circundante, refletindo as margens indistinguíveis descritas nos aspectos imagenológicos supracitados (WOO, 2015).
Os pacientes com DF geralmente não necessitam de tratamento. A cirurgia é considerada por razões cosméticas e a doença tende a diminuir após a maturação esquelética estar completa. Em raras ocasiões, a DF, quando afeta estruturas vitais próximas, pode causar deformidade significativa e tornar-se mais do que uma questão cosmética. A incapacidade mais
significativa é a cegueira. Os casos de DF que causam sinais e sintomas podem exigir intervenção cirúrgica (GUPTA; GARG; MILITAL, 2017).
1.1.2 Fibroma ossificante central
Os FOCs são neoplasias fibro-ósseas benignas que afetam os ossos do esqueleto craniofacial (NELSON; PHILIPS, 2019). Em 2017, a OMS identificou três variantes clínico-patológicas, sendo estas classificadas em FOC de origem odontogênica - também chamado de fibroma cemento-ossificante (FCO) - e dois FO juvenis distintos, o FO trabecular juvenil (FOTJ) e o FO psammomatoide juvenil (FOPJ). Estas classificações adicionais são uma tentativa de refletir os diferentes dados demográficos, características histológicas e prognóstico de cada entidade.
O FOC tem como sinonímia, algumas denominações que fazem referência ao tipo de material que o constitui, como fibroma cemento-ossificante e fibroma cementificante. Anteriormente, o material calcificado amorfo acelular contido em algumas lesões foi definido como cemento ou cementoide. No entanto, hoje em dia parece provável que isso represente osso amorfo anormal. Portanto, não há nenhuma razão convincente para usar o termo cemento ou tecido tipo cemento (WHITE; PHAROAH, 2015).
Os FOCs são verdadeiras neoplasias, visto que alguns tumores exibem proliferação anormal, autônoma e descontrolada, muitas vezes mostrando potencial crescimento significativo (EL-MOFTY; NELSON; TOYOSAWA, 2017). Eles não expressam a mutação GNAS observada na DF. Alguns casos exibiram mutações, mas estas provavelmente eram a forma juvenil, uma entidade diferente (WOO, 2015). Contudo, Pimenta et al (2006) encontraram pela primeira vez a mutação no gene COC73 (também conhecida por HRPT2) em alguns casos esporádicos.
O FOC é um tumor raro com pico de incidência em pacientes na terceira à quarta décadas de vida, com forte predileção pelo sexo feminino, acometendo 5 mulheres para cada homem. Mostra exclusiva preferência pela mandíbula, favorecendo áreas de suporte dentário nas regiões de dentes pré-molares e molares. Os tumores menores geralmente são assintomáticos e, geralmente, detectados acidentalmente em radiografias de rotina. (EVERSOLE; NEIDER; NELSON, 1985; BRANNON; FOWLER, 2001; EL-MOFY, 2014; LIU et al., 2017).
Clinicamente, as lesões apresentam expansão, lenta e indolor, das regiões vestibular e lingual dos ossos afetados (WOO, 2015). À medida que as lesões aumentam, o inchaço facial
pode se tornar clinicamente aparente. Os FOTJ e FOPJ, são menos comuns que o FOC convencional, geralmente estão presentes na segunda década, mas podem ser encontrados em uma ampla faixa etária. As variantes juvenis não mostram predileção por gênero. O FOPJ pode ocorrer em região mandibular, porém afeta predominantemente os seios faciais, sendo o seio etmoidal mais prevalente. O FOTJ surge nos ossos gnáticos e é mais comum na maxila do que na mandíbula (AHMAD; GAALAAS, 2018).
Os tumores menores geralmente não causam dor, mas as variantes juvenis usualmente exibem rápido crescimento e expansão, às vezes causando assimetria e desfiguração dramática da face. Além disso, como as variantes juvenis tendem a afetar a maxila, seios paranasais e outros ossos craniofaciais, elas podem causar sinais e sintomas associados ao efeito de massa e ao envolvimento de estruturas vitais adjacentes, incluindo alterações visuais e disfunção sinusal (NELSON; PHILLIPS, 2019).
Radiograficamente, o FOC tem bordas bem definidas e é concêntrico, logo a lesão expande aproximadamente de forma igual em todas as direções. Em comparação à DCO, a lesão apresenta uma fina borda radiolúcida, mais uniforme, parcial ou completa, representando o encapsulamento de tecidos moles que pode separá-lo do osso circunjacente (EVERSOLE; MERREL; STRUB, 1985; WHITE; PHAROAH, 2015).
Em algumas ocasiões, o osso perilesional pode desenvolver uma reação à lesão e apresentar uma borda esclerótica nessa interface. A densidade e o padrão internos são variáveis, dependendo da maturidade da lesão e da quantidade e tipo de calcificação. O padrão pode ser semelhante ao observado na DF. O crescimento concêntrico pode resultar em deslocamento dos dentes adjacentes ou causar reabsorção radicular. E mesmo que a expansão cortical esteja presente no FOC, as corticais externas geralmente permanecem intactas (KAWAGUCHI et al., 2018).
As variantes juvenis, que têm um padrão de crescimento mais agressivo, podem apresentar deiscência ao longo dos córtices externos expandidos. Evidências radiográficas de impacto de estruturas próximas correlacionadas com os sintomas dos pacientes podem ser vistas (RAO; NADEESH; ARIVAZHAGAN; MOIYADI; YASHA, 2017; SULTAN et al., 2018).
De acordo com MacDonald (2015), o FOC pode ser ainda mais diferenciado do FOTJ e FOPJ. O FOC, por vezes, possui uma cápsula, de tecido conjuntivo fibroso, observável radiológica e histologicamente, enquanto o FOTJ e o FOPJ não. A aparência imagenológica dessa cápsula depende claramente da resolução espacial da tecnologia de imagem utilizada.
Os FOCs são facilmente identificados no intraoperatório, pois geralmente os tumores são bem demarcados, apesar de comumente não serem encapsulados, mas podem se infiltrar
em ossos associados. Os cirurgiões, durante a cirurgia, geralmente descrevem as lesões por terem o aspecto “shelling out” ou de fácil destacamento do tecido ósseo perilesional (BRANNON; FOWLER, 2001).
O exame histopatológico exibirá uma proliferação de células mesenquimais fusiformes tipo fibroblastos que depositam materiais duro, tipo osteóide e tecido ósseo, geralmente com pavimentação osteoblástica proeminente, semelhante à displasia cemento-óssea, em meio ao tecido conjuntivo fibroso geralmente hipercelularizado. Conforme sugerido pela aparência intraoperatória e imagenológica, partes de cápsula fibrosa podem ser observadas em tumores encapsulados (NEVILLE et al., 2016; WOO, 2015). Geralmente, as variantes juvenis não são encapsuladas (EL-MOFTY; NELSON; TOYOSAWA, 2017).
O tecido mineralizado, associado ao FOC, pode consistir em trabéculas de osso ou osteóide com um padrão curvilíneo e lamelar. A mineralização também pode se apresentar como coleções lobuladas de material basofílico com distintas “bordas em escova” que faz interface com o tecido conjuntivo fibroso circundante. A quantidade e o tipo de mineralização podem variar entre os tumores ou mesmo dentro do mesmo tumor (WOO, 2015; NEVILLE et al., 2016).
A pavimentação osteoblástica é uma característica mais frequente do FOC. Embora o tecido conjuntivo fibroso possa ser celular e hipercromático, geralmente não são observadas atipias celulares. Em contraste, o tecido conjuntivo fibroso do FOTJ é celularizado, com figuras mitóticas ocasionais. O componente mineralizado é uma trabécula osteóide celular, que é mineralizada focalmente frequentemente no centro dessas trabéculas (SULTAN et al., 2018). A ausência de pavimentação osteoblástica é uma característica da formação óssea imatura. No entanto, coleções de células gigantes do tipo osteoclasto podem ser vistas. O FOPJ é talvez o mais fácil de ser reconhecido e mostra numerosos ossículos pequenos que são chamados de corpos psammomatoides. Essas pequenas estruturas podem coalescer para formar grandes áreas de mineralização (RAO; NANDEESH; ARIVAZHAGAN; MOIYADI; YASHA, 2017).
Por serem neoplasias, o tratamento recomendado é a completa excisão cirúrgica, por enucleação ou ressecção cirúrgica. Pode ser excisado cirurgicamente de forma conservadora, sem recorrência na maioria dos casos. A taxa de recorrência tem sido menor que 5%. Os tumores não tratados podem atingir grandes tamanhos e podem exigir tratamentos cruentos. A transformação maligna sarcomatosa não foi documentada (EVERSOLE; MERRELL; STRUB, 1985; WOO, 2015; EL-MOFTY; NELSON; TOYOSAWA, 2017).
1.2 Osteossarcoma
O osteossarcoma (OS) é um tumor ósseo maligno primário, que afeta tipicamente as placas de crescimento metafisárias, fêmur, tíbia e úmero, em que as células neoplásicas produzem osteóide ou osso. Excluindo-se as neoplasias hematopoiéticas, o OS é a lesão maligna mais comum de origem óssea (NEVILLE et al., 2016). O OS raramente afeta os ossos maxilares, constituindo apenas 6% a 7% de todos os casos (LEE et al., 2015).
Aumentos de volume, relatados como inchaços, e dor são os sintomas mais comuns nos casos de OS. Parestesia e ulcerações são menos comuns (JASNAU et al., 2008).
As características imagenológicas são importantes ferramentas de diagnóstico em tumores ósseos. Os achados podem variar de puramente osteogênico (aparência dos raios solares) a osteolítico ou uma mistura de ambos. O alargamento do espaço ligamentar periodontal e a atenuação da lâmina dura ao redor de um tumor são outras características que podem se apresentar nos osteossarcomas da mandíbula (ELKORDY et al., 2018).
Os pacientes apresentam vários subtipos histológicos de OS. A depender das quantidades relativas de osteoide, cartilagem ou fibras colágenas produzidas, muitos patologistas subclassificam os osteossarcomas nos tipos osteoblástico, condroblástico e fibroblástico, entretanto, essa classificação não possui grande importância no prognóstico (NEVILLE et al., 2016).
O tratamento do OS consiste na escolha de uma terapia multimodalidade nas formas de cirurgia e quimioterapia neoadjuvante ou adjuvante. Estudos mostram melhora nas controle e sobrevivência ao usar este tipo de protocolo (ELKORDY et al., 2018).
1.3 Cripto-1 (CR-1)
Uma nova família de genes, a família EGF-CFC, que codifica proteínas extracelulares semelhantes a fatores e/ou co-receptores de crescimento, foi identificada em humanos, camundongos, sapos e peixes-zebra. Os membros desta família incluem o CR-1 (também conhecido como fator de crescimento 1 derivado do teratocarcinoma (TDGF-1) (DONO et al., 2003; SALOMON et al., 2000).
O CR-1 é uma pequena proteína de sinalização glicosilfosfatidilinositol- ancorada/secretada, que contém vários domínios que incluem um peptídeo N-terminal, um domínio semelhante ao EGF e um domínio rico em cisteína (KENNEY; ADKINS; SANICOLA, 2004). O anticorpo cripto (H-10) é uma imunoglobulina 1 (IgG1) monoclonal de
camundongo (cadeia leve kappa) fornecido em 200 µg / ml, produzido contra aminoácidos 1-188, representando o comprimento total do cripto de origem humana (CICCODICOLA et al., 1989).
O CR-1 é expresso e identificado durante a embriogênese e é responsável por exercer funções biológicas essenciais, tais como coordenar a formação da linha primitiva, especificar o mesoderma e endoderme, bem como orientar os eixos anterior e posterior. Adicionalmente, atua como co-receptor em vias embrionárias importantes, como a via TGF-β / Smad e Wnt / β-catenina, participando da orientação correta do tecido e formação de camadas germinativas (BECK et al., 2002; WARNER, GREENE, PISANO, 2005).
O CR-1 é um fator de sinalização multifuncional que estimula os efeitos celulares, incluindo proliferação, migração, sobrevivência, transição epitelial- mesenquimal e angiogênese, para regular a embriogênese, a homeostase tecidual e a tumorigênese (GERSHON et at., 2018). E segundo Strizzi et al., (2005) essas funções podem ser reguladas por CR-1, pois atua como um co-receptor para WNT ou como fator de inibição do complexo de degradação da β-catenina.
O mais importante, o CR-1 não é detectado nos tecidos adultos normais, com exceção de uma baixa expressão em células-tronco adultas (GUDBERGSSON; DUROUX, 2019). Diversas abordagens investigativas têm sido usadas para compreender os mecanismos celulares responsáveis por eventos mediados por CR-1 associados a doenças malignas e não malignas (KLAZIUNSKA et al., 2015; GUDBERGSSON; DUROUX, 2019). A re-expressão do mesmo foi observada em diversas neoplasias benignas e malignas (GUDBERGSSON; DUROUX, 2019).
O CR-1 tem sido amplamente implicado como regulador da função das células-tronco e da tumorigênese. Além disso, também atua como oncogene, sendo superexpresso em vários tumores malignos, sendo, portanto, considerado um potencial alvo terapêutico contra tumores humanos. O aumento da expressão de CR-1 tem sido significativamente associado ao início e agressividade das células neoplásicas (POSTOVIT et al., 2008; LONARDO et al., 2011).
Yoon et al (2011) avaliaram a expressão de CR-1, em tecidos e linhagens celulares de carcinoma de células escamosas oral (CCEO), através de análise imuno-histoquímica, RT-PCR e western blot. O papel in vitro do CR-1 também foi investigado por ensaios de crescimento e migração celular após tratamento de células com proteína rhCR-1. Os autores sugerem que a superexpressão de CR-1 provavelmente desempenha um papel na transformação maligna da mucosa oral e pode estar envolvida na tumorigênese e progressão da CCEO, por favorecer o crescimento e a motilidade das células tumorais. Tomados em conjunto, esses resultados
sugerem a possibilidade de que o CR-1 possa ser um novo alvo molecular para o tratamento do CCEO.
Silva et al (2018) avaliaram a expressão de CR-1, através de imuno-histoquímica e encontraram baixa expressão em glândulas salivares compatíveis com a normalidade e no adenoma pleomórfico (AP) e alta expressão em carcinoma ex adenoma pleomórfico (CAEXAP). Os autores sugerem que o CR-1 é regulado positivamente na progressão e transformação maligna do AP de glândula salivar, alterando o potencial de invasão e consequentemente levando a uma maior agressividade desses tumores. A imunoexpressão de CR-1 pode ser útil como marcador de diagnóstico para CAEXAP. Portanto, esta proteína pode ser um alvo elegível para futuros estudos moleculares como marcador diagnóstico, prognóstico ou alvo terapêutico.
1.4 Beta-catenina (Β-catenina)
A proteína β-catenina é o alvo central e um componente essencial, de um sistema de sinalização celular evolutivamente conservado, da via de sinalização Wnt/β-catenina (CLEVERS, 2006).
A via de sinalização Wnt/β-catenina é conhecida como uma das importantes cascatas moleculares que regulam o destino celular ao longo da vida útil, estando envolvida em praticamente todos os aspectos do desenvolvimento embrionário e também controlando a auto-renovação homeostática em vários tecidos adultos (GUO; XIAO; SUN; LIU, 2012), ao participar de diversos processos biológicos, como diferenciação celular, desenvolvimento de órgãos e tecidos, desde a determinação do destino, polaridade, diferenciação até a migração, proliferação e função celular, além de estar relacionada a patogenia de diversas doenças (GRIGORYAN et al. 2008, VISWESWARAN et al., 2015).
Ao final da década de 1980, a β-catenina foi identificada pela primeira vez como uma molécula essencial na mediação da adesão célula-célula. Durante essa adesão célula-célula, a β-catenina se liga à cauda citoplasmática da E-caderina e forma um complexo caderina-catenina, que atua como uma ponte molecular entre os filamentos de actina e a E-caderina. Essas proteínas foram denominadas cateninas (em latim catena significa cadeia) para refletir sua ligação da E-caderina às estruturas citoesqueléticas (OZAWA et al., 1989; ABERLE et al., 1996).
As proteínas da família Wnt são glicoproteínas modificadas secretadas por lipídios e exercem sua função em pelo menos três vias conhecidas, a canônica das quais é a via de sinalização Wnt/β - catenina (CHIEN; CONRAD; MOON, 2009).
Xing et al (2008) determinaram a estrutura cristalina da β-catenina que inclui uma região N-terminal, um domínio Arm (de um total de 13 aminoácidos repetidos), uma região C - terminal distante adjacente a esse domínio, o final da região C-terminal, a Hélice C e as sequências não estruturadas distais, cada uma com funções específicas. A região N-terminal medeia a degradação da β-catenina, a superfície interna do domínio Arm serve como um local de ligação ao ligante, o segmento C-terminal atua como um forte transativador, recrutando efetores e inibidores, e o Helix C é necessário para sinalização Wnt, potencialmente recrutando vários co-ativadores. A função da β-catenina depende intimamente da estrutura molecular, embora o domínio de ligação ou os aminoácidos possam variar nas diferentes vias de sinalização da β-catenina (GOTTARDI; PEIFER, 2008).
A via de sinalização Wnt é classificada na via de sinalização canônica que depende da função da β-catenina (via Wnt / β-catenina) e nas vias não-canônicas que acontecem independentemente da β-catenina. Na cascata canônica de Wnt, a β-catenina é o principal fator responsável pela transdução do sinal para o núcleo e desencadeia a transcrição de genes específicos da Wnt responsáveis pelo controle das decisões sobre o destino celular em muitas células e tecidos, incluindo expressão gênica relacionada à fibrose, como fibronectina, metaloproteinase da matriz 7 (MMP-7), inibidor-1 do ativador do plasminogênio (PAI-1), Twist e Snail (GUO; XIAO; SUN; LIU, 2012).
É uma via complexa e consiste em vários receptores, inibidores, ativadores, moduladores, fosfatases, quinases e outros componentes. No entanto, existe uma molécula crítica central para essa via, a β-catenina. Embora existam pelo menos três receptores, proteína relacionada ao receptor de lipoproteína (LRP) 4, 5 e 6, e mais de vinte ativadores conhecidos como wnts, e vários inibidores, todos eles têm como alvo a β-catenina. Esses reguladores/moduladores funcionam para direcionar a β-catenina ao proteassoma para degradação ou ao núcleo para regular a expressão gênica (DUAN; BONEWALD, 2016).
Várias famílias de proteínas secretadas antagonizam a sinalização Wnt / β-catenina. A função dos inibidores de Wnt depende de seus níveis de expressão e do contexto celular. Sob condições de repouso, na ausência de um sinal Wnt/Wingless, a β-catenina citoplasmática é fosforilada por um complexo de destruição composto por axina, proteína adipomatosa da polipose coli (APC) e glicogênio sintase quinase (GSK) -3β e depois ubiquitinado e destruído pelo proteassoma em última análise (MACDONALD et al. 2007, HUANG; HE, 2008; HE et
al. 2012). Uma vez ativada, a via Wnt/Wingless inibe a fosforilação da β-catenina dependente de GSK-3β. A β-catenina hipofosforilada e estabilizada transloca-se para o núcleo, onde interage com os fatores de transcrição da família TCF/LEF-1, levando ao aumento da expressão de genes, como c-myc e ciclina D1 (TETSU; MCCORMICK, 1999; SHTUTMAN et al., 1999). A β-catenina tem dupla função, como componente estrutural integral das junções aderentes à base de caderina e o como principal fator nuclear da sinalização Wnt canônica no núcleo. O desequilíbrio dessas funções geralmente resulta em doenças e crescimento desregulado (VALENTA; HAUSMANN; BASLER, 2012).
Mutações no ganho de função na β-catenina, incluindo mutações no terminal N que levam à estabilização da proteína ou perda de mutações da função nas proteínas que participam do turnover regulado da β-catenina, como o supressor de tumor APC, resultam na regulação positiva dos níveis da proteína β-catenina, aumentando sua atividade transcricional. O aumento da transativação da β-catenina-TCF/LEF-1 pela estabilidade aprimorada da β-catenina, resultante de mutações na APC, AXIN1 ou CTNNB1 (que codifica a β-catenina), é encontrado em uma ampla variedade de cânceres humanos (POLAKIS, 2000; PEIFER; POLAKIS, 2000). Associações entre o CR-1 e a via de sinalização canônica Wnt / β-catenina têm sido relatadas. Recentemente, Lo et al (2018) encontraram, substancialmente, a relação do papel do CR-1 na determinação dos fenótipos de células-tronco embrionárias em carcinomas hepatocelulares e mecanicamente na modulação da cascata de sinalização Wnt/β-catenina, uma das vias mais frequentemente desreguladas no câncer de fígado. Adicionalmente, o CR-1 de camundongo e humano foram identificados como genes alvo na via de sinalização Wnt/β-catenina durante a embriogênese do camundongo e em células de câncer de cólon humano (MORKEL et al., 2003; HAMADA et al., 2007).
O diagnóstico diferencial das LFOM pode representar um verdadeiro desafio, justificando a busca de biomarcadores moleculares que sejam úteis em casos conflitantes e apesar de estudos voltados para aspectos clínicos, radiográficos e histopatológicos, ainda existem poucos estudos sobre biomarcadores nessas lesões (GOULART-FILHO et al., 2018).
2. OBJETIVOS
O presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão imuno-histoquímica das proteínas CR-1 e β-catenina em displasia fibrosa, fibroma ossificante central e osteossarcoma, para melhor compreender a patogenia dessas lesões.
2.1 Objetivos específicos
Analisar o percentual de células e a intensidade da expressão imuno-histoquímica da proteína CR-1 nos casos de DF, FOC e OS selecionados;
Analisar o percentual de células e a intensidade da expressão imuno-histoquímica da proteína β-catenina nos casos de DF, FOC e OS selecionados;
Investigar se há associação entre a imunomarcação do CR-1 e β-catenina nos casos de DF, FOC e OS selecionados;
Investigar se há correlação entre a imunomarcação do CR-1 e β-catenina nas LFOM selecionadas.
3 ARTIGO
O artigo será submetido ao periódico Journal of Oral Pathology & Medicine (ISSN 0904-2512, Fator de impacto: 2.030, Qualis A2), cujas normas para submissão de trabalhos se encontram no Anexo 02.
Tipo de artigo: Artigo original de pesquisa
Título: O CRIPTO-1 É UM POTENCIAL BIOMARCADOR PARA O DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DOS TUMORES ÓSSEOS BENIGNOS E MALIGNOS DOS
MAXILARES
Título em execução: Imunoexpressão do cripto-1 em tumores ósseos benignos e malignos dos maxilares
Hugo Costa Neto1, Hébel Cavalcanti Galvão1
1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Declaração de conflito de interesses: Os autores afirmam que não há nenhum potencial conflito de interesse que possa influenciar os resultados obtidos neste estudo.
Contagem de palavras: 2.682 palavras.
*Autora correspondente: Hébel Cavalcanti Galvão
Departamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte Av. Senador Salgado Filho, 1787, Lagoa Nova, CEP 59056-000, Natal, RN, Brasil. Telefone/Fax: +55843215-4138. e-mail: hebel.galvao@yahoo.com.br
RESUMO
Objetivo: Realizar uma análise imuno-histoquímica do cripto-1 e da β-catenina em uma série de casos diagnosticados microscopicamente como displasia fibrosa (n=30), fibroma ossificante central (n=28) e osteossarcoma (n=5) armazenados nos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica Oral de uma população brasileira.
Materiais e métodos: As expressões imuno-histoquímicas foram analisadas através de escore imunorreativo. Os dados obtidos foram inseridos em um arquivo do software Microsoft Excel® e, posteriormente, analisados no software Statistical Package for Social Science. Para todos os testes estatísticos utilizados, o nível de significância foi estabelecido em 5% (p<0,05).
Resultados: O cripto-1 exibiu predominância de um padrão fortemente positivo para os casos de fibroma ossificante central e osteossarcoma, e do padrão moderado para os casos de displasia fibrosa (p<0,001). A β-catenina exibiu predominância do padrão negativo para os casos de fibroma ossificante central e displasia fibrosa, e do padrão fortemente positivo para os casos de osteossarcoma (p=0,001). O teste de correlação de Spearman revelou correlação positiva entre os escores imunorreativos de cripto-1 e β-catenina.
Conclusão: Os resultados desta pesquisa sugerem a participação do cripto-1 na patogênese do fibroma ossificante central e osteossarcoma, assim como o uso dessa proteína como potencial biomarcador molecular para o diagnóstico diferencial de lesões fibro-ósseas dos maxilares.
Palavras-chave: displasia fibrosa monostótica; fibroma ossificante; diagnóstico diferencial; imuno-histoquímica.
Introdução
As lesões fibro-ósseas dos maxilares (LFOM) são um grupo de lesões microscopicamente caracterizadas pela substituição do osso por um tecido conjuntivo fibroso rico em fibroblastos que produz material mineralizado em diferentes graus de ossificação1. As semelhanças, no geral, das características clínicas, radiográficas e morfológicas, geram um grande desafio ao patologista na emissão do diagnóstico histopatológico preciso, logo a investigação completa, com o máximo de detalhes, é essencial para avaliação desses casos, além de garantir o diagnóstico e tratamento adequado2.
As LFOM têm sido reclassificadas muitas vezes, e recentemente, em 2017, a Organização Mundial de Saúde (OMS) as incluiu no grupo dos tumores odontogênicos e ósseos maxilofaciais, no qual estão as LFOM e osteocondromatosas3.
As três principais formas de LFOM, a displasia fibrosa (DF), o fibroma ossificante central (FOC) e a displasia cemento-óssea (DCO) são um conjunto de distúrbios que compartilham muitas características morfológicas, mas são aparentemente diversos clinicamente, radiograficamente, no intraoperatório e na macroscopia4,5.
A DCO é a LFOM mais comum encontrada na prática clínica odontológica, mas FOC e a DF são as que requerem tratamento e podem estar associadas a distúrbios estéticos e funcionais significativos. Como estas exibem comportamento biológico distinto, com padrões diferentes de progressão da doença, é de suma importância a distinção entre as duas lesões6.
A identificação de potenciais marcadores moleculares, que possam estar envolvidos na patogênese das LFOM, pode auxiliar na compreensão dos diferentes comportamentos biológicos dessas lesões. Destarte, o cripto-1 humano (CR-1), também conhecido como fator de crescimento 1 derivado do teratocarcinoma (TDGF-1), é um membro da família do fator de crescimento epidérmico (EGF) - Cripto-1 / ligante relacionado ao fator de crescimento fibroblástico (FRL1) / Críptico (EGF-CFC)7.
O CR-1 é expresso durante a embriogênese como um co-receptor em vias embrionárias importantes, como TGF-β/Smad e Wnt/beta (β) -catenina, participando da orientação correta do tecido e formação das camadas germinativas. No adulto saudável, o CR‐1 está desativado ou, em alguns casos, reduzido a apenas uma pequena população de células-tronco adultas8. O CR-1, segundo Strizzi et al (2005)9, promove proliferação, sobrevivência, migração e invasão celular, atuando como um co-receptor para WNT ou como fator de inibição do complexo de degradação da β - catenina.
A via de sinalização WNT/β‐catenina faz cruzamentos com cascatas de sinalização para regular a fosforilação da β‐catenina e a transcrição de genes subregulados. Os níveis de sinalização excessivamente altos podem inibir a maturação dos osteoblastos10,11.
O diagnóstico diferencial das LFOM pode representar um verdadeiro desafio, o que justifica a busca de biomarcadores moleculares que sejam úteis nos casos que causem divergência na identificação dessas lesões12. Assim, devido aos distintos comportamentos biológicos entre o FOC e a DF, o presente estudo tem como objetivo avaliar possíveis diferenças na expressão imuno-histoquímica de CR-1 e β‐catenina em LFOM.
Materiais e Métodos
Amostra
Este estudo retrospectivo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da UFRN (Licença nº 3.308.287- CAAE: 12108919.0.0000.5537). A amostra foi selecionada dos arquivos de um centro de diagnóstico em patologia oral do Brasil (1970-2018) composta por vinte e oito casos de fibroma ossificante central, trinta casos de displasia fibrosa e cinco casos de osteossarcoma (Figura 1A, 1B e 1C, respectivamente). Os dados clínicos e radiográficos foram obtidos nos registros de solicitação de biópsia.
Reação imuno-histoquímica
Para o estudo imuno-histoquímico, seções de 3 µm de espessura obtidas a partir de blocos de tecido embebidos em parafina foram montadas em lâminas revestidas com organossilano (3-aminopropiltrietoxissilano; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA). Para as etapas de desparafinização, reidratação e recuperação de antígeno, as lâminas foram tratadas com Trilogy ™ (Cell Marque, CA, EUA; 1: 100). Em seguida, a peroxidase endógena e as proteínas não específicas foram bloqueadas com peróxido de hidrogênio a 3% e incubadas com bloco de proteínas (Thermo Scientific, Runcorn, UK). O anticorpo primário contra CR-1 (Clone sc-376448, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) foi diluído (1:500) e as seções foram incubadas a 4 ° C (60 min). O anticorpo primário contra a β‐catenina (Clone sc-7963, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) foi diluído (1:1000) e as seções foram incubadas a 4 °C (overnight). Posteriormente, a reação de amplificação foi realizada usando o HiDef detection ™ - HRP Polymer System (Cell Marque; Rocklin CA, EUA). A reação foi desenvolvida com
diaminobenzidina (DAB, Sigma Chemical, St. Louis, MO, EUA) em uma câmara escura e contrastada com hematoxilina de Mayer (1 minuto). Os controles negativos foram obtidos substituindo os anticorpos primários por soro normal de coelho (Dako).
Análise imuno-histoquímica
Para avaliar as reações imuno-histoquímicas, as lâminas foram escaneadas (Pannoramic MIDI, 1:15 SPI 3D HISTECH®, Budapeste, Hungary) e avaliadas por um avaliador em dois momentos distintos independentes, sem conhecimento dos dados clínicos, no programa Case Viewer (Versão 2.2 - 3D HISTECH, Budapeste, Hungary). Foram consideradas positivas de acordo com as instruções do fabricante aquelas células que exibirem coloração acastanhada no núcleo ou núcleo-citoplasmática, independente da intensidade de marcação para ambas proteínas (CR-1 e beta-catenina). Todos os campos microscópicos de cada lâmina foram avaliados. A expressão foi avaliada de acordo com metodologia descrita por Fedchenko e Reifenrath (2014)13 e adaptada por Silva et al. (2018)14, através da utilização de escores imunorreativos (IRS). A extensão da coloração positiva foi classificada como 0 (todas as células negativas), 1 (<10% das células positivas), 2 (10-50% de células positivas), 3 (51-80% de células positivas) ou 4 (> 80% células positivas). A intensidade da coloração foi pontuada como 0 (negativo), 1 (reação leve), 2 (reação moderada) ou 3 (reação intensa). O escore final do IRS foi obtido (porcentagem de células positivas x intensidade da coloração), resultando em 0 a 12 pontos.
Análise estatística
Os resultados imuno-histoquímicos obtidos foram digitados em planilha eletrônica Excel (Microsoft Office 2019®) e posteriormente exportados para o programa Statistical Package for the Social Sciences (versão 20.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA), no qual foi realizada a análise descritiva e estatística. Para verificar as diferenças entre as variáveis analisadas, foram realizados os testes de Kruskal Wallis e Spearman. Para todos os testes estatísticos utilizados no presente estudo, o nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05).
Resultados
Análise da imunoexpressão do CR-1
A análise do percentual de células imunomarcadas para o CR-1 revelou predomínio do escore 4 para os casos de FOC (n=12; 42,9%) e OS (n=5; 100,0%) e do escore 2 para os casos de DF (n=12; 40,0%). O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis demonstrou diferença estatisticamente significativa entre os escores relativos ao percentual de células imunopositivas entre as lesões estudadas (p<0,001) (Tabela 1).
Em relação à intensidade de imunomarcação para o CR-1, observou-se maior prevalência do escore 3 para os casos analisados de FOC (n=17; 60,7%) e OS (n=5; 100,0%) e do escore 1 para os casos de DF (n=17; 56,7%). O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis revelou diferença estatisticamente significativa entre as lesões estudadas (p<0,001) (Tabela 1). Quanto ao escore final de células imunomarcadas para o CR-1, foi identificada predominância de um padrão fortemente positivo para os casos de FOC (n=15; 53,6%) (Figura 1E) e OS (n=5; 100,0%) (Figura 1F) e do padrão moderado para os casos de DF (n=11; 36,7%) (Figura 1D). O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis revelou diferença estatisticamente significativa entre as lesões estudadas (p<0,001) (Tabela 1).
Tabela 1. Distribuição dos casos de FOC, DF e OS de acordo com a imunoexpressão de CR-1. Natal-RN, 2020. Variável FOC DF OS p n % n % n % Percentual de células + Escore 1 7 25,0 10 33,3 0 0,0 <0,001 Escore 2 4 14,3 12 40,0 0 0,0 Escore 3 5 17,9 7 23,3 0 0,0 Escore 4 12 42,9 1 3,3 5 100,0 Intensidade de imunomarcação Escore 1 7 25,0 17 56,7 0 0,0 <0,001 Escore 2 4 14,3 11 36,7 0 0,0 Escore 3 17 60,7 2 6,7 5 100,0 Escore imunorreativo Negativo 5 17,9 10 33,3 0 0,0 <0,001 Fraco 4 14,3 7 23,3 0 0,0 Moderado 4 14,3 11 36,7 0 0,0 Forte 15 53,6 2 6,7 5 100,0
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral / UFRN.
Análise da imunoexpressão da beta-catenina
A análise do percentual de células imunomarcadas para a beta-catenina revelou predomínio do escore 1 para os casos de FOC (n=12; 42,9%) e DF (n=14; 46,7%) e do escore 4 para os casos de OS (n=3; 60,0%). O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis demonstrou diferença estatisticamente significativa entre os escores relativos ao percentual de células imunopositivas entre as lesões estudadas (p=0,008) (Tabela 2).
Em relação à intensidade de imunomarcação para a beta-catenina, observou-se maior prevalência do escore 1 para os casos analisados de FOC (n=12; 42,9%) e DF (n=24; 80,0%) e do escore 3 para os casos de OS (n=4; 80,0%). O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis revelou diferença estatisticamente significativa entre as lesões estudadas (p<0,001) (Tabela 2). Quanto ao escore final de células imunomarcadas para a beta-catenina, foi identificada predominância de um padrão negativo para os casos de FOC (n=12; 42,9%) (Figura 1H) e DF (n=14; 46,7%) (Figura 1G) e do padrão fortemente positivo para os casos de OS (n=4; 80,0%)
(Figura 1I). O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis revelou diferença estatisticamente significativa entre as lesões estudadas (p=0,001) (Tabela 2).
Tabela 2. Distribuição dos casos de FOC, DF e OS de acordo com a imunoexpressão de beta-catenina. Natal-RN, 2020. Variável FOC DF OS p n % n % n % Percentual de células + Escore 1 12 42,9 14 46,7 0 0,0 0,008 Escore 2 2 7,1 9 30,0 0 0,0 Escore 3 3 10,7 6 20,0 2 40,0 Escore 4 11 39,3 1 3,3 3 60,0 Intensidade de imunomarcação Escore 1 12 42,9 24 80,0 0 0,0 <0,001 Escore 2 11 39,3 6 20,0 1 20,0 Escore 3 5 17,9 0 0,0 4 80,0 Escore imunorreativo Negativo 12 42,9 14 46,7 0 0,0 0,001 Fraco 0 0,0 10 33,3 0 0,0 Moderado 11 39,3 6 20,0 1 20,0 Forte 5 17,9 0 0,0 4 80,0
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral / UFRN.
Correlação entre as imunoexpressões de CRIPTO-1 e beta-catenina
Nos casos de FOC, o teste de correlação de Spearman revelou forte correlação positiva entre os escores imunorreativos de CRIPTO-1 e beta-catenina (r= 0,822; p<0,001). Quanto aos casos de DF, o teste de correlação de Spearman demonstrou moderada correlação positiva entre os escores imunorreativos de CRIPTO-1 e beta-catenina (r= 0,531; p=0,003). Devido ao número reduzido de casos de OS, não foram realizados testes de correlação para os mesmos.
Discussão
Em geral, O FOC e a DF apresentam um grande dilema no diagnóstico tanto para clínicos, quanto para patologistas devido à sua similaridade, principalmente radiográfica e histopatológica2. Diversas pesquisas científicas sobre o FOC e a DF tentam buscar alguma diferença entre as características morfológicas dessas lesões, porém não encontram nenhum aspecto distinto. Similarmente, diversos estudos imagenológicos também encontram sobreposições entre as características radiográficas, confirmando que sem a complementação dos dados clínicos e histopatológicos, torna-se impossível diagnosticar tais lesões2,5. Contudo, a maior preocupação no processo diagnóstico é ter a convicção da exatidão na emissão do parecer, pois o tratamento do FOC precisa ser realizado, enquanto o da DF pode ser planejado, postergado e quiçá não precisar de nenhuma intervenção cirúrgica1,15.
As LFOM, apesar da semelhança com as características clínicas, imagenológicas e histopatológicas, apresentam perfis de comportamento e evolução distintos entre elas, levando a numerosos esforços para identificar biomarcadores que auxiliem na compreensão dessas diferenças12,16.
Neste sentido, o CR-1, também conhecido como fator de crescimento 1 derivado do teratocarcinoma (TDGF-1), é uma glicoproteína que desempenha um papel fundamental durante a embriogênese e é superexpressa em mais da metade dos carcinomas humanos. E, no entanto, de maneira interessante, não é expresso em tecidos normais adultos8. O CR-1 parece estar envolvido em alguns processos biológicos celulares, como migração celular, invasão e transição epitelial-mesenquimal, assim como proliferação e sobrevivência celular7,9. Esses processos parecem ser ativados através de vias de sinalização celular bem reconhecidas, como a via de sinalização WNT/β‐catenina10,11.
A expressão dessa proteína foi relatada e está associada a características clínico-patológicas de carcinoma de mama17, carcinoma da nasofaringe18, adenocarcinoma pulmonar19, carcinoma colorretal20, carcinoma de bexiga21, carcinoma hepatocelular22, melanoma23, glioma24, carcinoma da próstata25, carcinoma esofágico26, carcinoma oral27 e tumores de glândula salivar14. Até o momento, não foram publicados estudos avaliando a expressão e a distribuição de CR-1 em lesões ósseas.
Como LFOM e OS apresentam diferentes comportamentos biológicos podem ser esperadas expressões imuno-histoquímicas distintas entre essas lesões27. A presente pesquisa avaliou a expressão imuno-histoquímica do CR-1 e da β-catenina em casos diagnosticados
como FOC, DF e OS. Corroborando nossas hipóteses, os resultados foram diferentes entre as lesões estudadas, confirmando a natureza, comportamento e agressividade das mesmas.
No presente estudo, foram encontradas diferenças estatisticamente significativas, onde o CR-1 mostrou forte expressão nos núcleos celulares das células mesenquimais tipo fibroblastos nos casos de FOC e OS. Ambas as lesões neoplásicas, corroboram os achados de outros autores que encontraram a proteína alterada, sendo re-expressa, em diversos tipos de tumores, principalmente em neoplasias malignas14,17-26. Em contrapartida, os níveis de expressão na DF foram menores, reforçando neste caso a natureza da lesão, o fato de ser considerada uma má formação e que o CR-1 geralmente está expresso em tecidos embrionários, logo não estaria presente em um tecido do tipo hamartoma, com exceção das vezes que foi visualizado em algumas células-tronco adultas28.
A β-catenina foi observada de maneira inversa, porém demonstrando diferenças significativas entre os percentuais de células imunomarcadas, a intensidade de marcação e o escore final entre as lesões estudadas. Nos casos dos FOCs e das DFs, a β-catenina revelou um predomínio, em geral, de um padrão negativo e uma relação inversa da encontrada na imunomarcação do CR-1, contrariando Katoh & Katoh (2017)10 que sugerem que mutações ativadoras de Gα na DF, por exemplo, potencializam a sinalização da via Wnt/β‐catenina. No entanto, os resultados dos autores Horvai & Jordan (2014)29 respaldam os nossos achados, em relação à ausência da β-catenina nuclear na DF (p = 0,0034). Com essas análises, nós acreditamos que a β-catenina, nos casos de LFOM, não sofreu a ativação citoplasmática, sendo hiperfosforilada, destruída e logo não sendo translocada ao núcleo celular.
Considerando os casos dos OSs, utilizados para o nosso controle positivo, os maiores escores de imunomarcação foram visualizados, e nos permitem inferir que em neoplasias malignas, a β-catenina não é fosforilada, sendo a via canônica superregulada, translocando-se do citoplasma para o núcleo, interagindo com fatores de transcrição, levando ao aumento da expressão de genes. A quantidade superior de β-catenina no OS e a deficiência nos casos de FOC e DF sugerem uma relação entre a ativação da via canônica e o comportamento biológico dessas lesões. Esta marcação pode indicar diferenças entre a transcrição gênica e agressividade dos tumores estudados.
Em casos de FOC, encontramos fortes correlações, estatisticamente significativas, entre a expressão do CR-1 e a β-catenina. De forma similar, encontramos altos níveis de expressão de ambas as proteínas nos casos de OS. Em contrapartida, encontramos, nos casos de DF, uma moderada correlação, estatisticamente significativa, para baixos níveis de expressão para CR-1 e β-catenina. Sugerimos que esses resultados estejam relacionados à natureza e evolução das
lesões, corroborando os autores que evidenciam que o aumento da expressão de CR-1 tem sido significativamente associado ao início e agressividade das células neoplásicas14.
É bastante discutido na literatura, que quando estamos diante de uma LFOM, o diagnóstico conclusivo, muitas vezes é difícil de ser alcançado, pois mesmo diante de descrições clínicas e radiográficas, existe uma grande semelhança histopatológica entre as lesões1,2,12. Na presente pesquisa, evidenciamos que as amostras de FOC apresentaram forte expressão do CR-1, enquanto o contrário foi exibido nos casos de DF. Esses achados podem configurar o comportamento neoplásico do FOC e, ao mesmo, o processo anômalo da DF. O mais interessante é que esses resultados podem representar uma poderosa ferramenta para a caracterização dessas LFOM e auxiliar no estabelecimento do exato diagnóstico, tratamento adequado e prognóstico convicto.
Em conclusão, reforçamos, através de estudo imuno-histoquímico, que apesar da semelhança morfológica, o FOC e a DF possuem diferentes comportamentos biológicos e exibem uma consistente diferença na imunomarcação do anticorpo CR-1. Destarte, o CR-1 pode ser utilizado como um importante biomarcador para a investigação clínica e diagnóstico diferencial entre o FOC e a DF, subsequentemente para a indicação da terapia adequada para essas lesões.
REFERÊNCIAS
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