Novos complexos de Pd(II) contendo tiossemicarbazonas derivadas de o-vanilina: citotoxicidade e inibição das enzimas topoisomerase

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DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

NOVOS COMPLEXOS DE Pd(II) CONTENDO

TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE o-VANILINA:

CITOTOXICIDADE E INIBIÇÃO DAS ENZIMAS

TOPOISOMERASE

Mariane Araujo Franco*

Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de

MESTRA EM QUÍMICA, área de

concentração: QUÍMICA INORGÂNICA.

Orientador: Prof. Dr. Fillipe Vieira Rocha *Bolsista CNPQ

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Dedico este estudo primeiramente a Deus que me concedeu o dom da vida e sempre me deu força, nos momentos nos quais eu não tinha mais. Em seguida, eu dedico aos meus pais, Carlos e Eliane, bem como ao meu namorado Tiago, que são

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“As coisas que Deus fez são boas a seu tempo.” Eclesiastes 3: 11 “Nunca, jamais desanimeis, embora venham ventos contrários.”

Santa Paulina “A mente que abre uma nova janela, jamais volta ao seu tamanho original.”

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A Deus, por ter me dado à capacidade de chegar até aqui e estar comigo em todos os momentos da minha vida. Obrigada por estar sempre me mostrando sua grandiosidade e que sem ti nada somos. Eu o louvo, amo e adoro.

Aos meus pais, Carlos e Eliane; bem como aos outros membros da minha família, em especial minha irmã Camila e meus avós Ana, Cândida, Euripedes e Samuel; por sempre me apoiarem nos meus sonhos e me incentivarem a correr atrás dos mesmos, dessa forma, abraçando-os para eles. Obrigada por sempre terem estado ao meu lado, cuidando de mim e me amparando. Vocês são minha verdadeira casa nesse mundo. Eu amo vocês.

Ao meu namorado Tiago, por ter me dado suporte para chegar até aqui. Obrigada por ser mais que meu namorado, ser um ombro amigo que pude contar nesses dois anos de mestrado. Eu te amo.

Ao meu orientador Prof. Dr. Fillipe Vieira Rocha e ao seu grupo de pesquisa Compostos de Coordenação na Química Medicinal (CCQM); em especial ao colega de trabalho Mauro; obrigada por terem abrido às portas do laboratório para mim e compartilhado seus ensinamentos de pesquisa comigo, dessa forma, me dando oportunidade de fazer o meu mestrado e defender o mesmo.

Aos professores Dr. Alzir Azevedo Batista; bem como ao seu grupo de pesquisa LERCI, em especial aos colegas de trabalho Adriana, Celisnolia, Monize, Tamires e Vanessa; a professora Drª. Caterina Gruenwaldt Cunha Marques Netto; tal como o seu grupo de pesquisa LABMEEB, em especial a colega de trabalho Letícia; ao professor Dr. Edward Ralph Dockal; assim como o seu grupo de pesquisa LSICC, em especial ao colega de trabalho Lucas; e ao professor Dr. Victor Marcelo Deflon (IQ-USP de São Carlos) por terem me ajudado de forma

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Luciani, tal como, aos técnicos químicos, Luciana Vizotto, Paulo Lambertucci e Silmara Buchviser (IQ-USP de São Carlos) pela disponibilidade em ajudar.

Aos membros das bancas do seminário e da defesa, Profª. Drª. Clélia Mara de Paula Marques, Profª. Drª. Caterina Gruenwaldt Cunha Marques Netto, Profª. Drª. Dulce Helena Ferreira de Souza e Prof. Dr. Roberto Santana da Silva, obrigada pela disponibilidade em participar das bancas e da colaboração neste trabalho.

À Universidade Federal de São Carlos e ao Programa de Pós-graduação em Química por proporcionarem a estrutura e os equipamentos necessários para a conclusão desta pesquisa.

Ao órgão de fomento CNPQ pela bolsa concedida, bem como a CAPES (“O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001”) e a FAPESP (número do projeto: 16/04201-9) por terem financiado este estudo.

Por último, deixo os meus agradecimentos a todos que sempre torceram por mim, e que de alguma maneira contribuíram para a realização desse projeto de vida profissional.

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vii

LISTA DE ABREVIATURASE SÍMBOLOS

Palavra Abreviatura e Símbolo

Acetonitrila CH3CN

Álcool Etílico CH3CH2OH

Dimetilsulfóxido DMSO

cis-diaminodicloroplatina(II) Cisplatina

Co-ligante trifenilfosfina com substituintes na posição para: H, F,

OCH3 e CH3 PR3 2-hidroxi-3-metoxibenzaldeído o-vanilina Paládio Pd Tiossemicarbazona TSC Infravermelho IV

Ionização por Electrospray em Modo Negativo

ESI

-Ionização por Electrospray em Modo Positivo

ESI+

Ultravioleta-visível UV-vis

Ressonância Magnética Nuclear RMN

Clorofórmio Deuterado CHCl3-d

Dimetilsulfóxido Deuterado DMSO-d6

Concentração inibitória de 50 % da viabilidade celular

IC50

Sal brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazólio

MTT

Células de pulmão de feto humano MRC-5

Células tumorais de pulmão não pequenas

NSCLC Linhagem celular de adenocarcinoma

metastático de mama triplo negativa

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Palavra Abreviatura e Símbolo

Linhagem celular de adenocarcinoma metastático de pulmão humano

A549

Coeficiente de Partição log P

Ácido desoxirribonucleico DNA

Constante de ligação Kb

Ácido etilinodiamino tetra-acético EDTA

Enzima topoisomerase do tipo I Topo I

Enzima topoisomerase do tipo II Topo II

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ix

LISTA DE GRÁFICOS E TABELAS

GRÁFICO 1.1 – Estimativa de fatores que provocam o câncer...3 GRÁFICO 1.2 – As dez principais causas de morte no mundo...5 GRÁFICO 4.1 – Temperatura de fusão dos ligantes TSC e dos complexos de Pd(II)...50 GRÁFICO 4.2 – Condutividade molar dos ligantes TSC em DMSO...63 GRÁFICO 4.3 – Valores de log P obtidos para os complexos de Pd(II), bem como para a cisplatina (cis) de acordo com a referência [82]...86

TABELA 3.1 – Reagentes utilizados nas sínteses e caracterizações dos compostos...33 TABELA 3.2 – Solventes empregados nas sínteses e caracterizações dos compostos...34 TABELA 4.1 – Principais frequências na região do IV para a série 1...52 TABELA 4.2 – Atribuição dos principais modos vibracionais RAMAN para os complexos de Pd(II) contendo TSCs derivadas de o-vanilina...55 TABELA 4.3 – Comprimentos e ângulos de ligações dos monocristais C2, C6, C9 e

C10...60

TABELA 4.4– Análise elementar de C, H, N e S para os ligantes TSC e seus respectivos complexos de Pd(II)...62 TABELA 4.5 – Condutividade molar dos complexos de Pd(II) em DMSO...64 TABELA 4.6 – Atribuições das bandas de absorção na região do UV-visível para os ligantes TSC e seus respectivos complexos de Pd(II)...68 TABELA 4.7 – Deslocamentos químicos de RMN de 1H para os compostos da série 1...72 TABELA 4.8 – Relação de m/z dos complexos de Pd(II)...85 TABELA 4.9 – Valores de IC50 dos ligantes TSC e dos complexos de Pd(II) frente

às linhagens celulares tumorais MDA-MB-231 e A549, bem como frente à linhagem celular normal MRC-5...88 TABELA 4.10 – Constante de ligação para interação dos complexos de Pd(II) com CT-DNA...92

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LISTA DE EQUAÇÕES E ESQUEMAS

EQUAÇÃO 3.1 – Coeficiente de partição...41

EQUAÇÃO 3.2 – Equação de Benesi-Hildebrand modificada...44

EQUAÇÃO 4.1 – Equação para cálculo da % de hipercromismo...92

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xi

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1.1 – Transformação de uma célula normal em cancerosa...2

FIGURA 1.2 – Estrutura química da cis-diaminodicloroplatina(II)...7

FIGURA 1.3 – Mecanismo de ação da cisplatina...8

FIGURA 1.4 – Complexos metálicos de Pt(II) como agentes quimioterápicos...9

FIGURA 1.5 – Estrutura química dos complexos de Pd(II) estabilizados com o ligante piridina-2-diazotatos...11

FIGURA 1.6 – Estrutura química e numeração das tiossemicarbazonas segundo a IUPAC...12

FIGURA 1.7 – Fórmula estrutural de TSCs derivadas da vanilina e da o-vanilina...13

FIGURA 1.8 – Fórmula estrutural de complexos de Pd(II) contendo TSCs...13

FIGURA 1.9 – Estrutura química de quatro novos complexos de Pd(II) contendo TSCs...14

FIGURA 1.10 – Representação da ligação entre metais e ligantes fosfínicos terciários...16

FIGURA 1.11 – Estrutura química de complexos fosfínicos de Pd(II)...17

FIGURA 1.12 – (a) Nucleotídeos do DNA e (b) Estrutura do DNA...19

FIGURA 1.13 – Diversos modos de interação complexo-DNA...20

FIGURA 1.14 – Mecanismo de rotação controlada da enzima topo I...21

FIGURA 1.15 – Estrutura química dos inibidores enzimáticos da enzima DNA-topo Iβ...22

FIGURA 1.16 – Mecanismo de rotação controlada da enzima topo II...23

FIGURA 1.17 – Estrutura química dos inibidores enzimáticos (parte A) e catalíticos (parte B)...24

FIGURA 1.18 – Estrutura proposta para o composto TSC24...25

FIGURA 1.19 – Ensaio de inibição da topo II (A) e da topo I (B)...26

FIGURA 1.20 – Ensaio de relaxamento de topoisomerase II-α de complexos de Pd(II). C- (plasmídeo superenovelado); C+ (plasmídeo superenovelado, topoisomerase II-α e ATP); (A) 1 e 2; (B) 3 e 4...27

FIGURA 1.21 – Estrutura proposta para os complexos de Pd(II) deste trabalho....28

FIGURA 4.1 – Competição dos elétrons d do íon Pd(II)...49

FIGURA 4.2 – Espectros vibracionais do IV para a série 1 na região de 4000-400 cm-1...51

(12)

FIGURA 4.3 – Espectros de espalhamento RAMAN para os complexos de Pd(II)

contendo TSCs derivadas de o-vanilina...54

FIGURA 4.4 – Diagrama ORTEP de C2...56

FIGURA 4.8 – Espectros de absorção na região do UV-visível dos ligantes TSC e dos complexos de Pd(II)...66

FIGURA 4.9 – Esquema de numeração para atribuição dos sinais de RMN de 1H dos ligantes TSC e dos complexos de Pd(II)...70

FIGURA 4.10 – Espectro de RMN de 1H do ligante L1 em DMSO-d6...73

FIGURA 4.11 – Espectro de RMN de 1H do complexo C1 em CHCl3-d...75

FIGURA 4.15 – Efeito anisotrópico ocasionado pelos elétrons da ligação C=N2...80

FIGURA 4.16 – Espectros de RMN de 31P dos co-ligantes fosfínicos em CHCl3-d...81

FIGURA 4.17 – Espectros de RMN de 31P dos complexos de Pd(II) da série 2...82

FIGURA 4.18 – Espectros de RMN de 31P dos complexos C11 e C12...83

FIGURA 4.19 – Espectros de massa de alta resolução dos complexos de Pd(II) da série 1 em modo negativo (ESI-)...84

FIGURA 4.20 – Espectros de absorção na região do UV-vis do complexo C9 em DMSO e regressão linear para determinação de Kb...91

FIGURA 4.21 – Esquema representativo das conformações do DNA plasmideal constatadas por eletroforese em gel de agarose...94

FIGURA 4.22 – Incubação de plasmídio superenovelado com os complexos C2 (linha 5 a 8), C6 (linha 10 a 13), C9 (linha 4 a 6), C10 (linha 7 a 9), C11 (linha 10 a 12), C12 (linha 13 a 15) e cisplatina (controle positivo, linha 3) após 24 h; C -(plasmídeo superenovelado em tampão Tris-EDTA, linha 1); C-D (plasmídeo superenovelado em tampão Tris-EDTA/ DMSO (3,33 %), linha 2)...95 FIGURA 4.23 – Capacidade inibitória da enzima DNA-topo IIα pelos complexos C2 (linha 4 a 7), C6 (linha 9 a 12), C9 (linha 3 a 5), C10 (linha 6 a 8), C11 (linha 9 a

(13)

xiii

11) e C12 (linha 12 a 14). C

(plasmídeo superenovelado, linha 1); C+ (plasmídeo superenovelado, enzima DNA-topo IIα e ATP; linha 2)...97 FIGURA 4.24 – Capacidade inibitória da enzima DNA-topo Iβ pelos complexos C9

(linha 5 a 8), C10 (linha 9 a 12) e C6 (linha 13 a 16). C

(plasmídeo superenovelado, linha 1); C+ (plasmídeo superenovelado e topoisomerase I-β, linha 2); C+D

(plasmídeo superenovelado, topoisomerase I-β e DMSO em 3,33 %; linha 3)...99 FIGURA 4.25 – Capacidade inibitória da enzima DNA-topo IIβ pelos complexos C9 (linha 4 a 7), C10 (linha 8 a 11) e C6 (linha 12 a 15). C

(plasmídeo superenovelado, linha 1); C+ (plasmídeo superenovelado, topoisomerase II-β e ATP; linha 2); C+D (plasmídeo superenovelado, topoisomerase II-β, ATP e DMSO

(14)

ESTRUTURAS E MASSAS MOLECULARES

Fosfinas: Trifenilfosfina

T1

Massa Molar: 262,28 g mol-1

Tris(4-fluorofenil)fosfina

T2

Tris(4-metoxifenil)fosfina

T3

Tri(p-toluil)fosfina

T4

(15)

xv o-vanilina:

Precursor de Pd(II) ([PdCl2(CH3CN)2]):

4-etil-3-tiossemicarbazida:

4-metil-3-tiossemicarbazida:

Massa Molar:105,16 g mol-1

Tiossemicarbazida:

(16)

Série 1:

L1

C1

C2

C3

(17)

xvii

C4

Série 2:

L2

C5

C6

(18)

C7

C8

Série 3:

L3

C9

(19)

xix

C10

C11

C12

(20)

RESUMO

“NOVOS COMPLEXOS DE Pd(II) CONTENDO TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE o-VANILINA: CITOTOXICIDADE E INIBIÇÃO DAS ENZIMAS TOPOISOMERASE”

Este trabalho teve como objetivo estudar novos complexos de Pd(II) com a fórmula geral [PdCl(PR3)(TSC)]; onde PR3 é o ligante trifenilfosfina com

variações na posição para: H, F, OCH3 e CH3; TSC é o ligante quelante

1-(2-hidroxi-3-metoxibenzilideno)-4(N)-tiossemicarbazona, tendo a sua modificação na posição 4(N) com os seguintes substituintes: C2H5; CH3; H. Dessa forma, as

modificações dos substituintes nos ligantes foram efetuadas visando traçar uma relação entre a estrutura dos compostos e a atividade citotóxica. Os novos complexos foram caracterizados por diversas técnicas espectroscópicas (RMN de

1

H e 31P, IV, RAMAN, UV-vis e massas), bem como, por difração de raios-X de monocristal, condutividade molar, ponto de fusão e análise elementar de C, H, N e S. Após a caracterização química dos compostos, investigou-se a atividade citotóxica frente às linhagens celulares tumorais MDA-MB-231, A549 e na linhagem celular não tumoral MRC-5, sendo que os complexos que apresentaram IC50 mais promissores são os sem substituição em 4(N) da TSC e os com

substituintes H e F nas fosfinas. Indicando que o volume molecular dos substituintes nos ligantes interfere na citotoxicidade dos complexos. Posteriormente, planejando o entendimento de um possível alvo biológico, ensaios com biomoléculas foram realizados. O DNA foi descartado como possível alvo biológico, uma vez que os resultados dos testes de titulação espectrofotométrica e eletroforese em gel com molécula de DNA, indicaram que os complexos possuem

(21)

xxi

uma fraca ou nenhuma interação com a biomolécula. Com relação aos resultados dos testes de inibição das enzimas DNA-topo IIα e Iβ, foi possível perceber uma relação entre os valores de IC50 dos complexos com a capacidade de inibição das

enzimas, indicando que essas enzimas podem ser de fato o alvo dos compostos. Por fim, os complexos apresentaram seletividade frente às isoformas das enzimas DNA-topo IIα e IIβ, uma vez que não inibiram a ação da enzima DNA-topo IIβ, indicando que os complexos de Pd(II) são uma alternativa viável no design de compostos citotóxicos com ação frente às enzimas topoisomerase.

Palavras-chave: complexos de paládio(II), o-vanilina, atividade antitumoral,

(22)

ABSTRACT

“NEW COMPLEXES OF Pd(II) CONTAINING THIOSEMICARBAZONES DERIVED FROM o-VANILLIN: CYTOTOXICITY AND INHIBITION OF TOPOISOMERASE ENZYMES”

In this work, the objective was to study new Pd(II) complexes with the general formula [PdCl(PR3)(TSC)], where PR3 is the triphenylphosphine ligand

with para substituent: H, F, OCH3, CH3, and the chelating ligand (TSC)

1-(2-hydroxy-3-methoxybenzylidene)-4(N)-thiosemicarbazone, with different groups at the 4(N) position (C2H5; CH3; H). Therefore, modifications of the substituent in the

ligands were performed in order to establish a relationship between the structure of the compounds and the cytotoxic activity. The new complexes were full characterized by spectroscopic techniques (1H, 31P, IV, RMAN, RAMAN, UV-vis and mass), and by monocrystal X-ray diffraction, molar conductivity, melting point and elemental analysis of C, H, N, and S. After the chemical characterization of the compounds, we investigated the cytotoxicity activity against the MDA-MB-231, A549 tumor cell lines and in the non-tumor cell line MRC-5. Data showed that the most promising complexes were those with TSC without substitution and with substituents H and F in the phosphines. Results indicate that molecular volume of the substituent in the ligands influence the cytotoxicity. For a better compression of a possible biological target, we performed several interaction assays with biomolecules. The DNA was discarded as a possible target, since in the spectrophotometric titration and electrophoresis assays, we observed a weak or no interaction with the DNA. Results of inhibition assays of the DNA-topoIβ and IIα enzymes demonstrated that the IC50 values of the most promising complexes have a

(23)

xxiii

relationship with the inhibition concentrations, indicating that these enzymes could be a possible target of the compounds. Finally, the complexes presented selectivity towards the isoforms of the DNA-topo IIα and IIβ enzymes, what is desirable. We conclude that Pd(II) complexes are a good strategy to design new cytotoxic compounds capable to inhibit the DNA-topoisomerase enzymes.

Keywords: palladium(II) complexes, o-vanillin, antitumor activity, inhibition of

(24)

SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO...1

1.0

- INTRODUÇÃO...2

1.1 - CÂNCER...2 1.2 - COMPLEXOS METÁLICOS COMO AGENTES QUIMIOTERÁPICOS...6 1.3 - TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE PRODUTOS NATURAIS..11 1.4 - A IMPORTÂNCIA DAS FOSFINAS...15 1.5 - INTERAÇÃO DOS COMPLEXOS METÁLICOS COM O DNA...18 1.6 - ENZIMAS TOPOISOMERASES COMO ALVO NO COMBATE AO CÂNCER...20

CAPÍTULO 2 – OBJETIVOS...30 2.0 - OBJETIVOS...31

2.1 - OBJETIVOS GERAIS...31

CAPÍTULO 3 - PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL...32 3.0 - PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL...33

3.1- REAGENTES E SOLVENTES...33 3.2 - SÍNTESES...34 3.2.1 - SÍNTESE DOS LIGANTES TIOSSEMICARBAZONAS...34 3.2.2 - SÍNTESE DO PRECURSOR DE Pd(II) [PdCl2(CH3CN)2]...35

3.2.3 - SÍNTESE DOS COMPLEXOS DE Pd(II)...36 3.3 - CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO ESTADO SÓLIDO...37 3.3.1 - PONTO DE FUSÃO...37

3.3.2 - ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL NA REGIÃO DO

INFRAVERMELHO...37 3.3.3 - ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL RAMAN...37 3.3.4 - DIFRAÇÃO DE RAIOS-X DE MONOCRISTAL...38 3.3.5 - ANÁLISE ELEMENTAR DE CHNS...38 3.4 - CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO ESTADO LÍQUIDO...38 3.4.1- CONDUTIVIDADE MOLAR...38 3.4.2 - ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO UV-VIS...39

(25)

xxv

3.4.3 - ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA

NUCLEAR...39 3.4.4 -ESPECTROSCOPIA DE MASSAS DE ALTA RESOLUÇÃO...40 3.4.5 – DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO...40 3.5 - APLICAÇÃO BIOLÓGICA...41 3.5.1 - ATIVIDADE CITOTÓXICA...41 3.5.2 - ESTUDO DE INTERAÇÃO COM O DNA...43 3.5.2.1 - TITULAÇÃO ESPECTROSCÓPICA...43 3.5.2.2 - INTERAÇÃO COM PLASMÍDEO SUPERENOVELADO...44 3.5.3 - INIBIÇÃO DAS ENZIMAS DNA-TOPOISOMERASE I e II...45

CAPÍTULO 4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO...47 4.0 - RESULTADOS E DISCUSSÃO...48

4.1 - SÍNTESE DOS COMPLEXOS DE Pd(II)...48 4.2 - CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO ESTADO SÓLIDO...49 4.2.1 - PONTO DE FUSÃO...49

4.2.2 - ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO

INFRAVERMELHO...50 4.2.3 - ESPECTROSCOPIA RAMAN...53 4.2.4 - DIFRAÇÃO DE RAIOS-X DE MONOCRISTAL...56 4.2.5 - ANÁLISE ELEMENTAR DE CHNS...61 4.3 - CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO ESTADO LÍQUIDO...63 4.3.1 - CONDUTIVIDADE MOLAR...63 4.3.2 - ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO UV-VISÍVEL...65

4.3.3 - ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA

NUCLEAR...69 4.3.3.1 - ESPECTROSCOPIA DE RMN DE 1H...69 4.3.3.2 - ESPECTROSCOPIA DE RMN DE 31P...80 4.3.4 - ESPECTROSCOPIA DE MASSA DE ALTA RESOLUÇÃO...83 4.3.5 - COEFICIENTE DE PARTIÇÃO...85 4.4 - APLICAÇÃO BIOLÓGICA...87

(26)

4.4.1 - MEDIDAS DE CITOTOXICIDADE...87 4.4.2 - INTERAÇÃO COM DNA...90 4.4.2.1 - TITULAÇÃO ESPECTROSCÓPICA...90 4.4.2.2 - INTERAÇÃO COM PLASMÍDEO SUPERENOVELADO...93 4.4.3 - INIBIÇÃO DAS ENZIMAS DNA-TOPOISOMERASE I E II...96

CAPÍTULO 5 - CONCLUSÕES...102 5.0 - CONCLUSÕES...103

CAPÍTULO 6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...105 6.0 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...106

(27)

(28)

1.0 - INTRODUÇÃO

1.1 - CÂNCER

O câncer é a denominação do conjunto de mais de cem doenças que são originadas a partir de uma alteração ocasionada na estrutura do ácido desoxirribonucleico (DNA), dessa forma, provoca a multiplicação desenfreada de células anormais, que acabam invadindo tecidos e órgãos, podendo ocasionar a metástase, ocorrendo quando as células tumorais espalham-se para outras regiões do corpo1-4. A FIGURA 1.1 representa esquematicamente a transformação de uma célula normal em cancerosa.

FIGURA 1.1 – Transformação de uma célula normal em cancerosa. Fonte: Referência [4].

A transformação de uma célula normal em cancerosa, processo conhecido como carcinogênise, acontece lentamente no organismo, levando anos para que uma célula cancerosa forme um tumor localizável. Para chegar nesta etapa

(29)

3

à célula passa por três estágios4. Primeiramente as células normais sofrem alterações genéticas provocadas por um agente carcinogênico4. Estas alterações

estão relacionadas com o meio externo (85 %) e a fatores hereditários (15 %) (GRÁFICO 1.1)3. A população idosa está mais predisposta a desenvolver o câncer1, pois ficou exposta por mais tempo aos agentes carcinogênicos. A segunda etapa consiste na conversão lenta e gradual da célula geneticamente modificada em célula maligna4. Por fim, acontece o crescimento descontrolado das células cancerígenas,

permitindo que ocorra invasão em tecidos e órgãos4.

GRÁFICO 1.1 – Estimativa de fatores que provocam o câncer. Fonte: Referência [3].

As células tumorais podem ser muito agressivas e incontroláveis à medida que vão se dividindo rapidamente, originando os tumores malignos. Os tumores malignos se diferenciam em um único fator dos benignos, sua capacidade de sofrer o processo de metástase1. À medida que as células cancerosas vão substituindo as normais, os tecidos acometidos vão perdendo suas funções. A

(30)

invasão dos pulmões, por exemplo, podem gerar alterações respiratórias; no cérebro, convulsões, alterações da consciência e dor de cabeça.

O câncer atinge a maior parte da população mundial; sendo a causa de mais de 12 % de óbito no mundo, pelo fato de ser uma doença muito agressiva e invasiva4. Segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA), estava previsto 600 mil novos casos de câncer no biênio 2016-2017, sendo mais frequentes em homens o câncer de pulmão e nas mulheres o câncer de mama1. Em países industrializados, o câncer representa a quarta causa de óbito da população, e no mundo é o quinto causador de morte, ficando abaixo somente de doenças isquêmicas do coração, acidente vascular cerebral, infecções de vias aéreas inferiores e doença pulmonar obstrutiva crônica. Ressalta-se que os cânceres de traqueia, brônquio e pulmão são os maiores geradores de óbito5, conforme representa o GRÁFICO 1.2.

(31)

5

GRÁFICO 1.2 – As dez principais causas de morte no mundo. Fonte: Adaptado [5].

Na tentativa de minimizar estas estatísticas, o câncer é combatido por três tipos principais de tratamento: a cirurgia, a radioterapia ou a quimioterapia, sendo que eles podem ser aplicados isoladamente ou em conjunto. A cirurgia é indicada quando tem a possibilidade de retirada do tumor. A radioterapia é efetuada por meio de radiações para destruir tumores localizados que não podem ser removidos pela cirurgia, ou ainda para evitar que as células aumentem ou retornem

Sendo: (-) não-transmissíveis; (-) transmissíveis, maternas, perinatais, nutricionais e (-) lesões.

(32)

ao mesmo local após a cirurgia. A quimioterapia é efetuada pela administração de fármacos por via oral, intravenosa ou intramuscular com o propósito de inibir, destruir ou controlar o crescimento de células doentes, sendo bastante requisitada quando as células tumorais encontram-se em processo de metástase, pois o fármaco consegue espalhar-se por todo o organismo3,6,7.

1.2 -

COMPLEXOS

METÁLICOS

COMO

AGENTES

QUIMIOTERÁPICOS

Na atualidade, um dos agentes quimioterápicos mais empregados é a

cis-diaminodicloroplatina(II), conhecido popularmente como cisplatina8,9. As propriedades antitumorais desse composto foram descobertas por Barnet Rosenberg em 1965 na Universidade do Estado de Michigan, nos Estados Unidos, quando pesquisava os efeitos do campo elétrico em uma cultura de bactérias do tipo Escherichia Coli. Neste estudo, Rosenberg notou que a divisão celular das bactérias era inibida, sendo ocasionada pela cisplatina2.

Atualmente, esta droga é usada no tratamento de diferentes tipos de neoplasias: mama, osteossarcoma, melanoma, esôfago, cérvix, pulmão, cabeça, estômago e linfomas, tendo grandes porcentagens de cura10-13. A FIGURA 1.2 demonstra a estrutura da cisplatina.

(33)

7

FIGURA 1.2 – Estrutura química da cis-diaminodicloroplatina(II). Fonte: Autora.

A cisplatina entra na célula por transporte ativo ou difusão passiva14, os ligantes cloretos são substituídos por moléculas de água, originando moléculas positivamente carregadas, cis-diaminoaquocloroplatina(II) e

cis-diaminodiaquoplatina(II)15. No mecanismo de ação desse fármaco, este processo de hidrólise é de suma importância, uma vez que as espécies originadas neste processo são as que efetivamente interagem com as bases nitrogenadas adenina e guanina do DNA por meio da posição N7, uma vez que são pontos de menor impedimento estérico para o ataque eletrofílico da platina e de maior densidade eletrônica, dessa forma, provoca lesões no DNA difíceis de serem reparadas, conforme demonstra a FIGURA 1.316. A interação da cisplatina com as bases nitrogenadas do DNA pode ser intrafita quando a ligação se estabelece entre duas bases da mesma fita ou interfita quando a ligação ocorre entre uma base de guanina e adenina de fitas distintas16.

(34)

FIGURA 1.3 – Mecanismo de ação da cisplatina. Fonte: Referência [16].

Contudo, diversos efeitos colaterais são apresentados decorrentes do tratamento com este fármaco, tais como: náuseas, dificuldade na audição, neurotoxicidade, nefrotoxicidade, vômitos, queda de cabelo, dentre outros. Além disso, existem outros problemas oriundos do tratamento com este quimioterápico, como a sua vulnerabilidade ao ataque de substâncias encontradas no plasma sanguíneo, em especial aquelas que possuem um grupo tiol, como cisteína e albumina. Dessa forma, devido à preferência da platina por um grupo tiol, estudos indicam que após um dia de a droga ter sido administrada de 65 a 98 % do fármaco foi desativado. Outro problema consiste na resistência de alguns tumores à droga. Esta resistência pode ocorrer durante o tratamento ou de forma intrínseca17-19.

(35)

9

Com a descoberta da cisplatina, surgiu o interesse por compostos análogos, visando não ter a mesmas desvantagens do quimioterápico de uso comercial. Dessa forma, estudos com complexos metálicos como possíveis agentes antitumorais foram realizados, ocasionando na descoberta de mais dois novos quimioterápicos de Pt(II), carboplatina e oxaliplatina, conforme apresenta a FIGURA 1.420. Mas estes quimioterápicos apesar de demonstrarem grande atividade anticancerígena, tendo também aplicabilidade como agentes quimioterápicos como a cisplatina, continuaram apresentando resistência celular em algumas linhagens celulares tumorais e uma série de efeitos colaterais20.

FIGURA 1.4 – Complexos metálicos de Pt(II) como agentes quimioterápicos. Fonte: Adaptado [20].

Uma forma de suprir estes problemas, principalmente o da resistência celular, é encontrando compostos que atuem de forma distinta da cisplatina, objetivando outros alvos biológicos.

(36)

Os compostos de paládio(II) [Pd(II)], com configuração eletrônica igual a [Kr]4d8, estão sendo cada vez mais estudados21-24, pelo fato de apresentarem uma similaridade muito grande com o íon Pt(II), com configuração eletrônica equivalente a [Xe]4f145d8, devido ambos terem oito elétrons no orbital d, originando complexos diamagnéticos com geometria quadrática plana, importante para alguns alvos biológicos. Além disso, possuem uma relação carga-raio semelhante, uma vez que o raio iônico da Pt(II) = 0,74 Å e do Pd(II) = 0,78 Å e ambos são considerados ácidos moles, originando ligações mais fortes com o átomo doador enxofre do que com o oxigênio16,25,26.

Mesmo com as semelhanças entre esses dois íons metálicos, têm-se a preferência por trabalhar com complexos de Pd(II), pois os mesmos demonstram algumas vantagens sobre os complexos de Pt(II), uma vez que apresentam um custo inferior e maior facilidade na síntese, ocasionando em processos que demandam menos gastos e menos tempo16.

Dessa forma, diversos complexos de Pd(II) estão sendo relatados por apresentarem atividade citotóxica contra distintos tipos de câncer e diferentes modos de ação. Na maioria dos casos, os complexos de paládio exibiram uma melhor atividade antitumoral do que os complexos análogos de platina27. Na FIGURA 1.5 estão representados compostos de Pd(II) que apresentaram uma atividade citotóxica promissora para a linhagem celular de carcinoma de ovário humano resistente à cisplatina (A2780R), onde o IC50 (concentração inibitória de

50 % da viabilidade celular) variou em uma faixa de 1,4 a 58,8 µM. Destacando o composto 2 que apresentou maior atividade e maior seletividade do que a cisplatina frente às linhagens A2780R (tumoral) e HEK293 (não tumoral), com valores de

(37)

11

IC50 iguais a (8,6 ± 1,2) µM, (25 ± 1) µM e (13,0 ± 0,8) µM, (7,3 ± 0,6) µM,

respectivamente27.

FIGURA 1.5 – Estrutura química dos complexos de Pd(II) estabilizados com o ligante piridina-2-diazotatos.

Fonte: Referência [27].

1.3 - TIOSSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE PRODUTOS

NATURAIS

As tiossemicarbazonas (TSCs), estrutura base representada na FIGURA 1.6, possuem várias propriedades biológicas, como antivirais, antibactericidas e anticancerígenas. As TSCs demonstram capacidade citotóxica promissora16,28. Sendo: R’ = H e 1 tendo R = H; 2 tendo R = CH3; 4 tendo R = CF3; 5 tendo R = Cl.

(38)

FIGURA 1.6 – Estrutura química e numeração das tiossemicarbazonas segundo a IUPAC.

Fonte: Autora.

Dilovic´ et al29 relatam a síntese de TSCs (FIGURA 1.7) derivadas do produto natural vanilina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído) e o-vanilina (2-hidroxi-3-metoxibenzaldeído) que podem ser extraídas da orquídea Vanilla Planifólia30, encontrada em regiões tropicais como o Brasil. Estas moléculas se mostraram ativas frente às linhagens celulares de carcinoma laríngeo (Hep-2), carcinoma cervical (HeLa), carcinoma pancreático (MiaPaCa-2), carcinoma do cólon (SW620) e carcinoma de mama (MCF-7) apresentando valores de IC50 entre 0,2 a

(39)

13

FIGURA 1.7 –

Fórmula Estrutural de TSCs derivadas da vanilina e da

o-vanilina.

Fonte: Autora.

Nos últimos anos, a química de coordenação das TSCs tem sido bastante estudada, devido à elevada atividade biológica desses compostos, bem como por serem ligantes N,S-doadores termodinamicamente estáveis e cineticamente menos lábeis16,31,32. Em geral, a coordenação ao centro metálico ocasiona em uma maior atividade biológica e menos efeitos colaterais33-35.

Eswaran Ramachandran et al36 demonstram a síntese, caracterização e a avaliação do potencial anticâncer de cinco complexos de paládio(II) ligados a TSC (FIGURA 1.8).

FIGURA 1.8 – Fórmula estrutural de complexos de Pd(II) contendo TSCs. Fonte: Autora. Sendo: R1 = -N(CH2CH3)2; -OCH3; H e R2 = H; Ph. Sendo: R1 = H; CH3 e R2 = H; CH3; Ph; C2H5.

(40)

Os resultados de citotoxicidade demonstraram que os complexos 3 (R1 = H; R2 = C2H5), 4 ( R1 = H; R2 = Ph) e 5 (R1 = CH3; R2 = CH3) são mais

citotóxicos que a cisplatina (IC50 = 25 µM) para a linhagem celular tumoral de

pulmão humana (A549), encontrando-se valores de IC50 iguais a 18, 7 e 10 µM,

respectivamente36.

No trabalho apresentado por Kalaiarasi et al37 também retrata a síntese, caracterização estrutural e atividade biológica de quatro novos complexos de Pd(II) contendo TSC (FIGURA 1.9).

FIGURA 1.9 – Estrutura química de quatro novos complexos de Pd(II) contendo TSCs.

Fonte: Autora.

O efeito da citotoxicidade dos complexos de Pd(II) foi estudado sobre as linhagens celulares tumorais MCF-7 (câncer de mama humano) e A549 (câncer de pulmão humano), sendo que os mesmos foram mais citotóxicos que a cisplatina com IC igual a (16,79 ± 0,08) μM para a MCF-7 e (15,10 ± 0,05) μM para a

(41)

15

A549, apresentando um IC50 entre 5,20 a 6,73 μM para a linhagem MCF-7 e entre

5,09 a 6,63 μM para a A54937

.

Devido às potencialidades antiproliferativas das TSCs derivadas do produto natural o-vanilina e de seus compostos de Pd(II), neste estudo pretendeu-se utilizar TSCs inspiradas na o-vanilina visando uma melhor atividade citotóxica, bem como, um possível menor efeito colateral.

1.4 - A IMPORTÂNCIA DAS FOSFINAS

Na literatura existem muitos estudos comprovando a atividade citotóxica das fosfinas. As fosfinas constituem ligantes neutros, ζ-doador e π-aceptor, capazes de estabilizar, em geral, íons metálicos ricos em elétrons, pois possuem orbitais dπ vazios com simetria adequada para uma combinação linear com os orbitais t2g do metal, capazes de receber essa densidade eletrônica,

(42)

FIGURA 1.10 – Representação da ligação entre metais e ligantes fosfínicos terciários.

Fonte: Referência [40,41].

A implementação dos ligantes fosfínicos na estrutura molecular dos complexos auxilia na permeabilidade por meio da membrana celular, aumentando a lipofilicidade. Frente a alguns tumores esses ligantes aumentam a citotoxicidade42, bem como possuem a capacidade de ocupar bolsões hidrofóbicos nos sítios de diversas enzimas40.

O trabalho apresentado por KHAN et al43 demonstra a atividade antitumoral de complexos de Pd(II) contendo ligantes fosfínicos (FIGURA 1.11), obtendo valores de IC50 numa faixa de 1,72 a 8,21µM para a

(43)

17

(MDA-MB-231) e 1,23 a 9,68 µM para a linhagem celular de adenocarcinoma escamoso (H-157). O composto 7; R = 2,4-Cl2 e R1 = m-CH3; foi o complexo mais

promissor, pois teve uma citotoxicidade menor que da cisplatina (IC50 = (3,34 ± 0,03) µM para MDA-MB-231 e IC50 = (1,37 ± 0,09) µM para

H-157) para ambas as linhagens celulares, tendo um IC50 para a MDA-MB-231

equivalente a (2,99 ± 0,21) µM e para a H-157 igual a (1,23 ± 0,14) µM, sendo mais ativo que a cisplatina.

FIGURA 1.11 – Estrutura química de complexos fosfínicos de Pd(II). Fonte: Referência [43].

Dessa forma, pretendeu-se incorporar fosfinas na estrutura dos complexos a fim de permitir uma maior interação com os possíveis alvos, bem como, atribuir uma maior lipofilicidade. Com intuito de identificar a influência destes ligantes espectadores foram selecionadas as seguintes fosfinas:

Sendo: R = 3-F; 4-F; 2,4-Cl

2; 2-CH3 e

R

(44)

trifenilfosfina (T1), tris(4-fluorofenil)fosfina (T2), tris(4-metoxifenil)fosfina (T3) e

tri(p-toluil)fosfina (T4).

1.5 - INTERAÇÃO DOS COMPLEXOS METÁLICOS COM O

DNA

Um dos principais alvos biológicos contra o câncer é o ácido desoxirribonucleico (DNA) que é uma molécula polimérica que engloba a informação genética de cada ser vivo. O DNA é constituído por nucleotídeos aderidos por ligações fosfodiéster. Os nucleotídeos são formados por uma base nitrogenada que pode ser derivada da purina ou da piridina, essas bases são hidrofóbicas e planares, orientam-se para o interior do DNA. A orientação das ligações no DNA faz com que se originem duas fendas, ditas sulco menor e maior. O formato supramolecular da dupla hélice é conservado por várias forças não-covalentes, dentre elas, ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas, atração eletrostática entre as cadeias açúcar-fosfatos (negativas), interações π-π entre os anéis aromáticos e os cátions em solução13,38. A FIGURA 1.12 representa os nucleotídeos e a estrutura do DNA.

(45)

19

FIGURA 1.12 – (a) Nucleotídeos do DNA e (b) Estrutura do DNA. Fonte: Referência [38].

O DNA pode interagir com metalofármacos das mais diversas formas devido à sua riqueza estrutural. Dessa forma, os compostos podem interagir com o DNA de forma não-covalente, que pode ser eletrostática, interações hidrofóbicas no sulco menor do DNA, ou por intercalações, e de forma covalente, quando o composto interage diretamente com as bases nitrogenadas do DNA ou com o grupo fosfato do DNA. Essas interações são controladas por diversos fatores, como fatores estéricos, densidade eletrônica, labilidade dos ligantes presentes nos complexos, possibilidade de ligação de hidrogênio entre o complexo e o DNA, e características eletrônicas e estruturais de ligantes planares rígidos, ricos em elétrons π que favorecem a intercalação13,20

. A FIGURA 1.13 demonstra os diversos tipos de interação dos compostos com o DNA.

(46)

FIGURA 1.13 – Diversos modos de interação complexo-DNA. Fonte: Referência [20].

1.6 - ENZIMAS TOPOISOMERASES COMO ALVO NO

COMBATE AO CÂNCER

As topoisomerases são enzimas que possuem como função modificar o grau de superenrolamento do DNA, indispensáveis e essenciais nos processos de recombinação, transcrição, reparo, replicação e empacotamento44. São encontradas dois tipos de topoisomerases no corpo humano (topo): I e II.

As enzimas topoisomerases são um alvo farmacológico importante de diversos agentes antineoplásicos, pois se encontram presentes em maior quantidade em células de rápida proliferação; topo I-β e topo II-α; principalmente em células tumorais de mama (topo II-α), próstata (topo II-α), pulmão (topo I-β), colo do útero (topo I-β), neoplasias hematológicas e sarcomas (topo II-α e I-β)45-47.

(47)

21

A enzima DNA-topo Iβ é formada por 765 aminoácidos (70 KDa); ao passo que a enzima DNA-topo IIα é constituída por 1200 aminoácidos (180 KDa)48-50; sendo responsável pela catálise do relaxamento do DNA, negativo e positivo, por meio do corte de uma de suas fitas (clivagem), consentindo a rotação de uma região da dupla fita relativa à outra região. A fita cortada gira sobre a fita intacta, promovendo o relaxamento do DNA. Por fim, como ilustra a FIGURA 1.14, ocorre o desligamento do DNA da enzima recorrente a sua religação48,50.

FIGURA 1.14 – Mecanismo de rotação controlada da enzima topo I. Fonte: Referência [50].

(48)

A enzima DNA-topo Iβ possui fármacos comercialmente aceitos que podem inibi-la, conforme representa a FIGURA 1.15.

FIGURA 1.15 – Estrutura química dos inibidores enzimáticos da enzima DNA-topo Iβ.

A enzima DNA-topo II possui como função produzir quebras nas duas fitas da dupla hélice do DNA e o passá-lo por meio de outra hélice intacta, posteriormente, restaura as fitas cortadas, utilizando a hidrólise do ATP (adenosina trifosfato) para gerar energia para a realização do ciclo enzimático44,46. Esta enzima é encontrada em duas isoformas, alfa e beta, que se diferenciam pela sua produção durante o ciclo celular. A topo II-α é encontrada quase exclusivamente nos tecidos de proliferação rápida, indicando que esta isoforma possui a função principal da replicação do DNA e crescimento tumoral. Ao contrário da topo II-β que é independente dos ciclos de crescimento celular45. Em geral, os fármacos que atuam frente à enzima topo II não conseguem fazer a distinção entre as isoformas, acarretando em severos efeitos colaterais ou o surgimento de novos tumores51.

(49)

23

Estes agentes são capazes de interferir em, pelo menos, uma etapa do mecanismo de rotação da enzima, conforme demonstra a FIGURA 1.16.

FIGURA 1.16 – Mecanismo de rotação controlada da enzima topo II. Fonte: Referência [45].

O mecanismo origina-se com a ligação da enzima a dois segmentos de dupla fita do DNA, chamados de segmento G (vermelho) e segmento T (verde) (etapa 1). Posteriormente, duas moléculas de ATP se ligam à enzima, isto está associado à dimerização do domínio da ATPase (etapa 2). Em seguida, o segmento G é clivado (etapa 3) e o segmento T é transportado por meio de G rompido, o que é acompanhado pela hidrólise de uma molécula de ATP (etapa 4). O segmento G é religado e a molécula de ATP restante é hidrolisada (etapa 5). Após a dissociação das duas moléculas de ADP (adenosina difosfato), o segmento de T é transportado

(-) domínios da ATPase e (-) domínio nuclear.

(50)

por meio do domínio nuclear aberto (etapa 6). Por último, o domínio nuclear é fechado e os domínios da ATPase reabrem, permitindo a dissociação do DNA (etapa 7)45,52.

Existem dois tipos de inibidores enzimáticos, a primeira classe é conhecida como veneno da topo II, estes compostos atuam inibindo o restabelecimento adequado das duas fitas clivadas (etapa 4 da FIGURA 1.16), formando intermediários com potencialidade danosa para o metabolismo celular, podendo levar a morte celular por apoptose44,53. A segunda classe é chamada de inibidores catalíticos e podem atuar em qualquer outra etapa do ciclo enzimático: i) inibindo a interação entre a enzima e o DNA; ii) competindo com o sítio ativo do ATP; iii) impedindo a liberação das moléculas de DNA, vide FIGURA 1.16, a FIGURA 1.17 representa as estruturas dos venenos e inibidores catalíticos.

FIGURA 1.17 – Estrutura química dos inibidores venenos (parte A) e catalíticos (parte B). Fonte: Adaptado das referências [44,45].

(51)

25

As tiosemicarbazonas (TSCs) se destacam como potenciais inibidores catalíticos da topo II, pois possuem características estruturais que potencializam as interações não-covalentes com o sítio ativo da enzima, como a presença de grupos N-H capazes de estabelecer ligações de higrogênio54-58. Além disso, estas moléculas apresentam uma elevada atividade antitumoral como já foi mencionado.

Em 2010, Huang et al59 sintetizaram uma extensa série de novas tiosemicarbazonas derivadas de carboxaldeídos heterocíclicos. Alguns compostos apresentaram a capacidade de inibir a topo II-α, por apresentarem uma estrutura plana rígida que provoca fortes interações hidrofóbicas entre o composto e a topo II-α40, e atividade antitumoral excepcional frente a várias linhagens humanas, com valores de IC50 na ordem de nanomolar. O composto que mais se destacou foi o

N,N-dimetil-2-(quinolina-2-ilmetileno)hidrazinacarbotioamida (TSC24) (FIGURA 1.18), pois apresentou um amplo espectro de atividade biológica frente às linhagens testadas, câncer gástrico (SGC7901), leucemia (HL-60), câncer cervical (HeLa) e carcinoma de cólon (HT-29), com valores de IC50 de 0,03 µM; 0,05 µM; 0,09 µM;

0,02 µM, respectivamente59.

FIGURA 1.18 – Estrutura proposta para o composto TSC24. Fonte: Autora.

(52)

A capacidade do composto em inibir as enzimas topo I e II (FIGURA 1.19) foi investigada pelos autores. Os resultados demonstraram que o TSC24 induziu uma inibição quase completa da topo II na concentração de 25 µM, porém ele mostrou-se incapaz de inibir a ação da topo I59.

FIGURA 1.19 – Ensaio de inibição da topo II (A) e da topo I (B). Fonte: Referência: [59].

Assim, para se determinar o mecanismo básico da ação inibitória do composto TSC24 sobre a topo II-α, seu efeito em cada etapa do processo catalítico da enzima foi monitorado. A TSC em questão se mostrou eficaz em etapas que envolvem a necessidade do ATP, o que explica em parte, o motivo da sua incapacidade de inibir a topo I, que age sem a necessidade destas moléculas. Isto é um indício de que o composto atua no domínio da ATPase. Por isso, testes comparativos entre a reatividade do TSC24 e a molécula de ATP com o domínio da ATPase foram realizados, demonstrando que a TSC possui mais afinidade com o domínio que o ATP59.

A partir desse trabalho começaram a surgir novos estudos com TSCs como inibidores catalíticos frente a topo II, inclusive de complexos metálicos tendo como ligantes as TSCs, como demonstrou o trabalho realizado por Rocha et al60 (FIGURA 1.20) com complexos de Pd(II).

(53)

27

FIGURA 1.20 – Ensaio de relaxamento de topoisomerase II-α de complexos Pd(II). C- (plasmídeo superenrolado); C + (plasmídeo superenrolado, topoisomerase II-α e ATP); (A) 1 e 2; (B) 3 e 4.

Os resultados demonstraram que os complexos 1 e 4; tendo X como Cl- e SCN-, respectivamente; induziram uma inibição quase completa da topo II-α na concentração de 25 µM, o complexo 2; tendo X como Br-; na concentração de 50 µM e o complexo 3; tendo X como I-; na concentração de 5 µM, pois os complexos de Pd(II) apresentam uma planaridade devido a geometria plana rígida que é responsável por uma melhor acomodação dos compostos na cavidade do sítio alvo40,60. Esses complexos de Pd(II) demonstraram atuar; mesmo não tendo um mecanismo de ação claro; no domínio da ATPase, uma vez que não apresentaram inibição para a Topo I-β60.

Perante o exposto, pretendeu-se reunir as vantagens apresentadas pelo íon Pd(II), com geometria quadrática plana, os ligantes TSCs e os co-ligantes

X = Cl-, Br-, I -e SCN-.

(54)

fosfínicos, para o planejamento racional de novas moléculas do tipo [PdCl(PR3)(TSC)], visando uma elevada interação com o sítio ativo da enzima alvo

e consequentemente em uma significativa ação antiproliferativa.

Os compostos de Pd(II) cujas estruturas apresentaram variações pontuais entre si são demonstrados de forma sistemática na FIGURA 1.21, sendo que os mesmos foram divididos em três séries de acordo com o ligante TSC.

FIGURA 1.21 – Estrutura proposta para os complexos de Pd(II) deste trabalho. Fonte: Autora.

As principais modificações que se efetuou no arcabouço molecular entre os complexos foram: a substituição do grupo R1 (C2H5, CH3 ou H) na TSC e a

(55)

29

substituição do grupo R2 (H, F, OCH3 e CH3) na trifenilfosfina coordenadas ao

metal. Estas alterações possuem como finalidade i) aumentar ou introduzir a cadeia carbônica dos ligantes e ii) modular a lipofilicidade dos compostos de coordenação, bem como intensificar as forças de Van der Walls existentes entre o receptor e o complexo. O grupo haleto foi mantido para oferecer labilidade ao complexo, podendo facilitar sua interação com o alvo biológico.

(56)

(57)

31

2.0

- OBJETIVOS

2.1 - OBJETIVO GERAL

O objetivo principal desse trabalho foi estudar a inibição de complexos de Pd(II) frente às enzimas DNA-topoisomerase I e II, por meio de pequenas substituições estruturais realizadas no arcabouço molecular dos complexos contendo ligantes tiossemicarbazonas derivados de o-vanilina e co-ligantes fosfínicos, e correlacionar os resultados com a citotoxicidade.

(58)

(59)

33

3.0 - PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.1 - REAGENTES E SOLVENTES

Todos os reagentes empregados neste estudo estão apresentados na TABELA 3.1.

TABELA 3.1 - Reagentes utilizados nas sínteses e caracterizações dos compostos.

Reagente Procedência Pureza

Agarose Padrão Kasvy -

Brometo de Potássio (KBr) Sigma-aldrich 99,0 % Cloreto de Paládio (PdCl2) Neon 97,5 % 2-hidroxi-3-metoxibenzaldeído (o-vanilina) Sigma-aldrich 99,0 % 4-etil-3-tiossemicarbazida Sigma-aldrich 97,0 % 4-metil-3-tiossemicarbazida Sigma-aldrich 97,0 % Tiossemicarbazida Sigma-aldrich 99,0 % Trifenilfosfina (T1) Sigma-aldrich 98,5 % Tris(4-fluorofenil)fosfina (T2) Alfa Aesar 98,0 % Tris(4-metoxifenil)fosfina (T3) Alfa Aesar 98,0 % Tri(p-toluil)fosfina (T4) Sigma-aldrich 98,0 %

Todos os solventes utilizados neste trabalho estão demonstrados na TABELA 3.2.

(60)

TABELA 3.2 - Solventes empregados nas sínteses e caracterizações dos compostos.

Solvente Procedência Pureza

Acetona (CH3(CO)CH3) Synth P.A. 99,5 %

Acetonitrila (CH3CN) J.T.Baker 99,9 %

Ácido Clorídrico (HCl) Mallinckrodt 36,9 %

Álcool Etílico (CH3CH2OH)

Synth P.A. 100 %

Álcool Metílico (CH3OH) Synth P.A. 99,8 %

Clorofórmio (CHCl3) Synth P.A. 99,8 %

Clorofórmio Deuterado (CHCl3-d) IsotecINC 99,8 % Dimetilsulfóxido ((CH3)2SO) Synth P.A. 99,9 % Dimetilsulfóxido Deuterado (DMSO-d6) Cambridge Isotope Laboratories, INC 99,9 % Éter Etílico (CH3CH2-O-CH2CH3) Chemco 100 %

Éter de Petróleo Neon 100 %

Hexano (CH3(CH2)4CH3) Neon 100 %

3.2 - SÍNTESES

3.2.1 - SÍNTESE DOS LIGANTES TIOSSEMICARBAZONAS

Em 30 mL de etanol (CH3CH2OH) foram dissolvidos 3,76 mmol de

2-hidróxi-3-metoxibenzaldeído (o-vanilina), com agitação contínua e aquecimento (60 ºC). Posteriormente, adicionaram-se, lentamente, 3,76 mmol da TSC acidificada com ácido clorídrico (HCl) em meio etanólico, deixando todo o sistema sob refluxo por 24 h/ 48 h. Após este período, a solução foi concentrada e resfriada,

(61)

35

acarretando na precipitação do produto, este sólido foi filtrado, lavado com água, etanol e éter etílico, e secado no dessecador. Os rendimentos obtidos dessas sínteses pelo mecanismo de condensação foram: para o L1 (sólido branco

aveludado) de 91,0 %, para o L2 (sólido branco) de 87,2 % e para o L3 (sólido

amarelo claro) de 87,9 %61,62. Estes ligantes são solúveis em: acetonitrila, álcool metílico, dimetilformamida e dimetilsulfóxido, sendo insolúveis em: água, clorofórmio, éter etílico e hexano.

3.2.2 - SÍNTESE DO PRECURSOR DE Pd(II) [PdCl

2

(CH

3

CN)

2

]

Em um erlenmeyer de 250 mL, adicionaram-se 80 mL de acetonitrila (CH3CN) a 80 ºC e sob agitação magnética. Logo após, pequenas porções, que

continham um total de 0,800 g (4,51 mmol) de cloreto de paládio anidro (PdCl2)

foram adicionadas. A solução foi mantida sob aquecimento a 80 ºC e agitação magnética por cerca de duas horas. Após este intervalo de tempo, a temperatura da solução foi aumentada em cerca de 30 ºC para uma diminuição do volume. Em seguida, a solução foi resfriada, dessa forma, o complexo

trans-bis(acetonitrila)dicloropaládio(II) ([PdCl2(CH3CN)2] precipitou com

coloração amarela, obtendo-se um rendimento equivalente a 91,1 %40,63. O composto obtido pelo mecanismo de adição é solúvel em acetona, sendo insolúvel em etanol, éter etílico e metanol.

(62)

3.2.3 - SÍNTESE DOS COMPLEXOS DE Pd(II)

Uma solução contendo 10 ml de CH3CN e 0,193 mmol do precursor

[PdCl2(CH3CN)2] ficou sob agitação a temperatura ambiente quando

adicionaram-se 0,193 mmol de TSC; reagindo por 24 h. Após este período, adicionaram-adicionaram-se 0,193 mmol da fosfina de interesse, reagindo por mais 24 h, isso para os complexos C1, C5, C6, C10 e C11. Mas para os compostos C2, C4, C8 e C12 adicionou-se

primeiramente os co-ligantes fosfínicos deixando os mesmos reagirem por 24 h/ 48 h e para os complexos C3, C7 e C9 adicionaram-se todos os reagentes ao mesmo

tempo deixando-os reagir por 96 h. Logo após este intervalo de tempo, o volume da solução foi diminuído e a mesma foi resfriada, ocasionando na formação de um sólido amarelo que foi filtrado, lavado com água, hexano e éter de petróleo, somente o composto C6 foi lavado com água, metanol quente, hexano e éter de

petróleo. Em seguida, os sólidos foram deixados no dessecador por aproximadamente 24 h62.

Os rendimentos obtidos dessas sínteses foram: para o complexo C1

([PdClT1L1], sólido alaranjado) de 72,2 %; para o C2 ([PdClT2L1], sólido amarelo

intenso) foi de 55,5 %; para o C3 ([PdClT3L1], sólido amarelo claro) foi de

50,2 %; para o C4 ([PdClT4L1], sólido amarelo intenso) foi de 64,7 %; para o C5

([PdClT1L2], sólido alaranjado) foi de 63,6 %; para o C6 ([PdClT2L2], sólido

amarelo) foi de 73,4 %; para o C7 ([PdClT3L2], sólido amarelo) foi de 79,2 %; para

o C8 ([PdClT4L2], sólido amarelo intenso) foi de 72,1 %; para o C9 ([PdClT1L3],

sólido amarelo intenso) foi de 59,2 %; para o C10 ([PdClT2L3], sólido amarelo) foi

de 51,3 %; para o C11 ([PdClT3L3], sólido amarelo claro) foi de 58,2 % e para o C12

(63)

37

em: acetona, acetonitrila, clorofórmio, dimetilformamida e dimetilsulfóxido, sendo insolúveis em: água, éter de petróleo e hexano.

3.3 - CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO ESTADO SÓLIDO

3.3.1 - PONTO DE FUSÃO

As medidas de ponto de fusão foram realizadas em um equipamento MARCONI NA 301, que alcança a temperatura máxima de 400 ºC.

3.3.2 - ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL NA REGIÃO DO

INFRAVERMELHO

Por meio de um espectrofotômetro SHIMADZU

IRTracer-100, os espectros vibracionais na região do infravermelho, foram obtidos em pastilha de KBr (Sigma-aldrich), na região compreendida entre 4000 – 400 cm-1, localizado no Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos.

3.3.3 - ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL RAMAN

Os espectros RAMAN foram realizados através de um espectrômetro do tipo Bruker, modelo RFS100 com laser de Nd:YAG de comprimento de onda 1064 nm com resolução espectral de 4 cm-1 e potência 100 mW, localizado no

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Instituto de Química de Araraquara da Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho. O equipamento operou na região de 80 cm-1 a 1200 cm-1.

3.3.4 - DIFRAÇÃO DE RAIOS-X DE MONOCRISTAL

As medidas de difração de raios-X de monocristal foram realizadas em um difratômetro Bruker, modelo APEX DUO, localizado no Instituto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo sob responsabilidade do Prof. Dr. Victor Marcelo Deflon. Este difratômetro emprega radiação da linha Kα do molibdênio (0,71073 Å), à temperatura de 296 K.

3.3.5 - ANÁLISE ELEMENTAR DE CHNS

Esta medida foi realizada via calibração externa. As análises elementares de carbono, hidrogênio, nitrogênio e enxofre foram realizadas por meio de um analisador C, H, N e S modelo EA-1108 da FISONS, localizado no Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos.

3.4 - CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO ESTADO LÍQUIDO

3.4.1 - CONDUTIVIDADE MOLAR

As medidas de condutividade molar foram obtidas através de um condutivímetro MARCONI modelo MA 521, para soluções 1,0 mmol L-1 de cada um dos ligantes TSC e dos complexos de Pd(II) em DMSO. As medidas foram

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39

realizadas no instante em que se prepararam as soluções (0 h), bem como nos intervalos de tempo de 24 h e 48 h depois.

3.4.2 - ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO

UV-VIS

Os espectros na região do ultravioleta e visível (UV-vis) foram obtidos em um espectrofotômetro de arranjo de diodo da Hewlett Packard, modelo 8452A. As medidas foram realizadas em uma cubeta de quartzo com 1 cm de espessura (faixa de leitura: 190 a 800 nm). O volume total das soluções na cubeta foram de 2 mL. As soluções dos compostos foram preparadas em CH3CN, por meio de uma

solução mais concentrada de partida de 1 mmol L-1. A Lei de Lambert-Beer foi utilizada no cálculo da absortividade molar dos compostos.

3.4.3 - ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA

NUCLEAR

Os espectros de ressonância magnética nuclear de 1H e 31P foram registrados em um espectrômetro Bruker, modelo ARX 9,4T do Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos. Os espectros de 1H foram realizados em uma frequência de 400,13 MHz e os espectros de 31P foram efetuados em uma frequência de 161,98 MHz. Para dissolução das amostras utilizou-se DMSO-d6 e CHCl3-d.

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3.4.4 - ESPECTROSCOPIA DE MASSAS DE ALTA RESOLUÇÃO

Os espectros de massa de alta resolução foram obtidos com ionização por electrospray em modo positivo (ESI+) e modo negativo (ESI-) em um espectrômetro de massas de modelo LTQ Orbitrap Velos, da marca Thermo Scientific, localizado no Instituto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo, Nº do Proc. 2009/54040-8 - FAPESP/EMU. Para dissolução das amostras utilizou-se CH3CN e CH3OH.

3.4.5 - DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO

O coeficiente de partição em sistema 1-octanol/água foi determinado para os complexos C2, C6, C9, C10, C11 e C12 de acordo com o método shake-flash

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. Cada complexo foi testado em uma mistura de volumes iguais (750 μL) de água e (750 μL) 1-octanol da Sigma-aldrich com 99,0 % de pureza, agitando a mistura em um vortex, em seguida, a mesma ficou em um banho sob circulação a 37 ºC durante 24 horas. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas durante 10 min a 6000 rpm e as fases orgânicas e aquosas foram separadas. A concentração do complexo foi determinada na fase orgânica (1-octanol) por espectrofotometria de UV-vis usando uma curva de calibração preparada para o composto em 1-octanol. Os valores de log P foram calculados utilizando a EQUAÇÃO 3.1.

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EQUAÇÃO 3.1 – Coeficiente de partição. Fonte: Autora.

A concentração na fase aquosa foi determinada por meio da subtração da concentração inicial pela concentração na fase orgânica. A Lei de Lambert-Beer foi empregada no cálculo da absortividade molar do composto e, posteriormente, na sua quantificação. Os experimentos foram realizados em triplicata para ter-se uma média dos coeficientes de partição.

3.5 - APLICAÇÃO BIOLÓGICA

3.5.1 - ATIVIDADE CITOTÓXICA

Os ligantes e os complexos sintetizados foram estudados quanto à capacidade de inibir o crescimento de células de adenocarcinoma metastático de mama humana triplo negativa (MDA-MB-231), adenocarcinoma metastático de pulmão humano (A549) e células de pulmão de feto humano (MRC-5). Este teste foi realizado em colaboração com o laboratório do Prof. Dr. Alzir Azevedo Batista (DQ-UFSCar), tendo sua aluna de doutorado Adriana Pereira Mundim Guedes Macêdo efetuado todas as atividades citotóxicas.

Em soro fetal bovino (FBS) 10 % as células foram suplementadas, sendo cultivadas em cultura de monocamada aderente em meio DMEM ou RPMI, utilizando-se penicilina e estreptomicina (100 μg mL-1) como antibióticos. Em

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atmosfera umidificada contendo 5 % de CO2, as culturas foram mantidas a 37 ºC,

realizando-se repiques três vezes por semana. Em câmara hemocitométrica tipo Neubauer (Boeco), o número de células foram contadas, usando o corante azul de Tripano, a 0,04 % de tampão fosfato salino (sigla em inglês, PBS); ajustando a concentração em 1,5x10-4 células mL-113.

Para a realização dos ensaios de citotoxicidade, aplicou-se 150 μL das células (1,5x10-4 células mL-1) em placas de cultura de 96 poços (estéril). Para a adesão celular, as placas foram armazenadas em estufa (37 °C/ 5% de CO2) por

24 h. Após este período, 0,75 μL dos ligantes e dos complexos em diferentes concentrações foram adicionados à placa e a mesma foi novamente colocada na estufa por 48 h. Em seguida, retirou-se todo o meio de cultura das placas e lavou-se duas vezes com PBS (estéril) e, logo após, adicionou-se 50 μL de MTT (sal brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difeniltetrazólio) (0,5 mg mL-1). As mesmas foram deixadas em estufa por um período de 3-4 horas e adicionaram-se 100 μL de isopropanol para solubilizar os cristais formados65,13.

No período de incubação o MTT é reduzido pela dehidrogenase mitocondrial e assume-se que a viabilidade celular (correspondente à atividade redutiva) é proporcional à produção de cristais de formazan {E,Z- 1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-1,3-diphenylformazan} (violeta) (ESQUEMA 3.1) que, depois de solubilizados, são medidos espectrofotometricamente. A densidade óptica (absorbância dos poços) foi medida em um leitor de microplacas, à 540 nm. Para verificar o efeito do solvente DMSO, controles adicionais receberam 0,5% deste solvente65,13.

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ESQUEMA 3.1 – Reação de redução do MTT à formazan. Fonte: Autora.

3.5.2 - ESTUDO DE INTERAÇÃO COM O DNA

3.5.2.1 - TITULAÇÃO ESPECTROSCÓPICA

O experimento de titulação espectrofotométrica de absorção foi executado pela manutenção da concentração de ácido nucleico (30 µL) como constante (50,0 µM) em 2877 µL de tampão trizma-HCl (pH = 7,39; 25 ºC), a concentração do DNA foi calculada aplicando-se a Lei de Lambert Beer, sabendo-se que a absortividade molar do DNA em 260 nm é 6600 mol-1 cm-1 L; e variando a concentração do complexo; C2, C6, C9, C10, C11 e C12; (1,0 mM) de 1 µM a 40 µM

para atingir um volume final nas titulações de 3000 µL. Em meio tamponado, os espectros foram registrados de 700 a 200 nm62.

A constante de ligação (Kb) do complexo com CT-DNA foi

determinada aplicando-se a Equação de Benesi-Hildebrand modificada, conforme apresenta a EQUAÇÃO 3.262.

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[Complexo]/(εA – εF) = [Complexo]/(εB – εF) + 1/ Kb(εB – εF)

Sendo: [Complexo] = concentração adicionada do complexo; ɛA = Aobs/[Complexo];

εF = coeficiente de absortividade molar do DNA livre e

εB = coeficiente de absortividade molar do complexo ligado ao DNA.

EQUAÇÃO 3.2 – Equação de Benesi-Hildebrand modificada. Fonte: Autora.

Por meio da inclinação e da intercepção do ajuste linear de [Complexo]/[ɛA - ɛF] vs [Complexo] obtém-se 1/[ɛA - ɛF] e 1/Kb[ɛB - ɛF]. Através da

razão entre o coeficiente angular e linear do ajuste obtido, tem-se a constante de ligação intrínseca62. Os experimentos foram realizados em duplicata para ter-se uma média da constante de ligação.

3.5.2.2 - INTERAÇÃO COM PLASMÍDEO SUPERENOVELADO

Os experimentos de interação com o DNA por eletroforese utilizaram soluções estoques de 375 μM a 3000 μM dos complexos C2, C6, C9, C10, C11 e C12

em DMSO. Em 0,5 μL de plasmídeo pBR322 na presença de 28,5 μL de tampão Tris-EDTA adicionou-se 1 μL de cada solução; tendo como porcentagem máxima em solução de DMSO 3,33 %, em seguida, estas amostras foram incubadas por aproximadamente 24 horas. Após este período, para auxiliar a inserção dos compostos no gel, foram adicionados 15 μL do corante azul de bromofenol. Para comparação e avaliação da eficácia dos compostos, os controles negativos (plasmídio sem a presença dos compostos e plasmídio sem a presença dos