Atualizado em 05/2019.

Atualizado em 05/2019. Aluno: Camila Marchioni

Título: "Determinação de endocanabinóides e canabinóides em amostras biológicas de pacientes com a doença de Parkinson por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem"

Orientador: Profa. Dra. Maria Eugênia Queiroz Nassur Data da Defesa: 01/02/2019

RESUMO

Marchioni, C. Determinação de endocanabinóides e canabinóides em amostras biológicas de pacientes com a doença de Parkinson por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem. 2018. 148f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2018.

Os endocanabinóides são neurotransmissores derivados do ácido araquidônico que se ligam aos receptores canabinóides participando de diversas funções cerebrais, tais como memória, aprendizado e controle motor. Os principais endocanabinóides são a anandamida (AEA) e o 2-araquidonilglicerol (2-AG). A Doença de Parkinson (DP) é considerada a segunda patologia neurodegenerativa mais comum na população, sendo caracterizada pela redução da influência dopaminérgica. Indícios mostram um aumento de AEA e uma diminuição nos níveis de 2-AG em pacientes portadores da DP e em modelos animais induzidos ao parkinsonismo. O canabidiol (CBD) é um promissor fármaco para o tratamento da DP, pois acredita-se que apresenta um efeito neuroprotetor na degeneração de neurônios dopaminérgicos. Entretanto, o uso do Δ9–Tetraidrocanabinol (Δ9-THC) não é indicado, pois pode apresentar efeitos psicotrópicos e dependência. A cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem (HPLC-MS/MS) tem sido considerada a técnica analítica de referência para a determinação de endocanabinóides e canabinóides em amostras biológicas. A cromatografia líquida no modo column switching permite a automação das análises através da hifenação da etapa de preparo de amostras biológicas (pré-concentração dos analitos e remoção de grande parte dos componentes endógenos) com o sistema cromatográfico (separação cromatográfica e detecção). Neste contexto, dois métodos analíticos online utilizando o UHPLC-MS/MS no modo column switching foram desenvolvidos para determinação de (a) AEA e 2-AG; (b) CBD e Δ9-THC em amostras biológicas de pacientes com DP. Os endocanabinóides foram determinados em amostras de plasma e de líquido cefalorraquidiano (LCR). O método UHPLC-MS/MS no modo column switching para determinação dos endocanabinóides com uma coluna de material de acesso restrito na primeira dimensão apresentou linearidade entre 0,100 (LIQ) a 6,00 ng mL-1 para AEA e 0,04 (LIQ) a mL-10,00 ng mL-mL-1 para 2-AG nas amostras de plasma. Para as amostras de LCR a faixa linear foi de 0,45 (LIQ) a 9,00 ng mL-1 para AEA e 1,40 (LIQ) a 180 ng mL-1 para o 2-AG. Os valores de exatidão ficaram abaixo de 14,2% e de precisão abaixo de 11,1% (excluindo LIQ) para os dois analitos. Os métodos não apresentaram efeito residual e nem efeito matriz. Os analitos mostraram ser estáveis após ciclos de congelamento/descongelamento e no teste a curto e longo prazo. Estes métodos foram empregados para análise 70 amostras de plasma e 66 de LCR. Para a determinação

(UHPLC-MS/MS no modo column switching) de CBD e Δ9-THC em amostras de plasma foi sintetizada a fase molecularmente impressa (MIP) monolítica em capilar de sílica fundida (in situ). A síntese apresentou boa rentabilidade utilizando pequena massa da molécula molde (CBD reduzido). O método online, utilizando o capilar MIP na primeira dimensão, apresentou linearidade entre 10 e 300 ng mL-1 (CBD e Δ9-THC). A precisão variou entre 0,2 e 10,3% para os dois analitos e a exatidão foi inferior a 4,4% (excluindo o LIQ). O efeito residual e o efeito matriz ficaram dentro dos parâmetros estabelecidos pela ANVISA. Por fim, o método foi aplicado satisfatoriamente na determinação de CBD e Δ9-THC em amostras de plasma de pacientes em terapia com CBD.

Palavra-chave: Anandamida; 2-araquidonilglicerol; Canabidiol; Δ9– tetraidrocanabinol; Doença de Parkinson; UHPLC-MS/MS no modo column switching; In-tube SPME; Polímero Molecularmente Impresso.

Atualizado em 05/2019.

Aluno: Marília Cristina Oliveira Souza

Título: "Determinação de éteres de difenilas polibromadas (PBDEs) em alimentos comercializados no Brasil empregando microextração em sorvente empacotado (MEPS) e estimativa da ingestão diária"

Orientador: Prof. Dr. Fernando Barbosa Júnior Data da Defesa: 15/03/2019

RESUMO

Souza, M. C. O. Determinação de éteres de difenilas polibromados (PBDEs) em alimentos comercializados no Brasil empregando microextração em sorvente empacotado (MEPS) e estimativa da ingestão diária, 2019. 109 f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2019.

Éteres de difenilas polibromadas (PBDEs) são compostos classificados com retardantes de chama e são poluentes orgânicos persistentes. Estes compostos são utilizados em diversos produtos para aumentar a resistência ao fogo e a altas temperaturas. Os potenciais efeitos à saúde humana, após exposição aos PBDEs têm se tornado uma grande preocupação devido ao aumento das concentrações de PBDE no ambiente. A dieta é considerada a mais importante fonte de exposição aos PBDEs, e as amostras de alimentos devem ser monitoradas para verificar os níveis de contaminação. No entanto, a determinação rotineira desses contaminantes em amostras complexas, como os alimentos, requer um método simples, rápido e com sensibilidade compatível com as baixas concentrações encontradas. Diante do exposto, este estudo propõem um novo método combinando microextração em sorvente empacotado (MEPS) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas para determinação de 7 congêneres de PBDEs (BDE-28, BDE-47, BDE-99, BDE-100, BDE-153, BDE-154, e BDE-183) em amostras de alimentos de origem animal e com alto teor lipídico, incluindo ovo, peixe, frutos do mar, e leite. O método proposto apresenta as eguintes vantagens: (i)- Reduz a quantidade de amostra requerida nas análises (50 e 100 mg de amostra liofilizada); (ii)- Reduz o consumo de solvente; (iii)- Melhora os limites de deteção (0,42 ng/g de lipídio para ovo, 0,27 ng/g de peixe fresco, e 0,26 ng/g de leite fresco), e IV- Apresenta excelente reprodutibilidade e repetibilidade, altos valores de recuperação sem de efeito matriz. Após a etapa de validação analítica, o método foi aplicado em 123 amostras das diversas matrizes em estudo. O BDE-47 foi o congênere que apresentou maior porcentagem de detecção entre todos os PBDEs analisados. O somatório das médias das concentrações (ΣPBDEs) de todos os congêneres analisados foi de 18,1 ng/g de lipídio para as amostras de ovos, 26,4 ng/g de peixe fresco, 25,6 ng/g de frutos do mar fresco, e 39,9 ng/g de leite fresco. As concentrações encontradas neste estudo foram maiores que os encontrados em países Europeus e Estados Unidos. Baseado nisto, este estudo sugere que as altas concentrações encontradas podem ser justificadas pela ausência de legislação no Brasil quanto ao uso de PBDEs e quantidade máxima permitida em alimentos e amostras ambientais. A partir dos resultados obtidos das concentrações de PBDEs nas amostras e do consumo médio do alimento no país, estimou-se a ingestão diária (IDE) de PBDEs da população brasileira, e o IDE total foi de 31,9 ng/Kg de peso corpóreo – dia, e com base nos valores de dose de referência (BDE-47, BDE-99 e BDE-153) estimou-se o hazard index (HI),

com valor de 0,356. A IDE apresentou altos valores em relação a outros estudos descritos na literatura, e HI com valor menor que 1. Os resultados sugerem que o risco cumulativo de exposição aos PBDEs pode estar subestimado, uma vez que apenas três congêneres de PBDEs e apenas quatro tipos de alimentos foram incluídos no cálculo, necessitando de uma avaliação de risco mais detalhada para estimar o potencial risco à saúde dos brasileiros. Palavras-chave: éteres de difenilas polibromadas; microextração em sorvente empacotado; alimentos; estimativa da ingestão diária; poluentes orgânicos persistentes.

Atualizado em 05/2019. Aluno: Milena Locci de Oliveira

Título: "Esquema de amostragem esparsa para avaliar a farmacocinética da daunorrubicina e seu metabólito daunorrubicinol em pacientes adultos e pediátricos diagnosticados com leucemia mieloide aguda"

Orientador: Profa. Dra. Vera Lucia Lanchote Data da Defesa: 03/05/2019

RESUMO

De Oliveira, M.L. Esquema de amostragem esparsa para avaliar a farmacocinética da daunorrubicina e seu metabólito daunorrubicinol em pacientes adultos e pediátricos diagnosticados com leucemia mieloide aguda. 2019. 139f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2019. O objetivo principal do estudo foi estabelecer um esquema de amostragem esparsa para propiciar a avaliação da farmacocinética da daunorrubicina (DAUN) e seu metabólito daunorrubicinol (DAUNOL) em grande número de pacientes adultos e pediátricos. Foram investigados pacientes adultos (> 12 anos; n=12) diagnosticados com leucemia mieloide aguda (LMA) com indicação para uso da DAUN (60 mg/m2/dia) por infusão intravenosa de 1 h durante 3 dias consecutivos. As coletas seriadas de sangue e urina foram realizadas ao longo das 3 infusões, ocorrendo até 144 h após o início da primeira infusão. Os métodos de análise sequencial da DAUN e DAUNOL em plasma, ultrafiltrado de plasma e urina empregando LC-MS/MS foram validados nos intervalos de 0,1 a 1000 ng/mL de plasma, 0,05 a 40 ng/mL de ultrafiltrado e de 0,5 a 3000 ng/mL de urina. A farmacocinética da DAUN e DAUNOL, avaliada por modelo bicompartimental e monocompartimental, mostrou meias-vidas de eliminação de 8,7 (7,98-9,48) e 15,04 (13,92-16,26) h, respectivamente. A razão metabólica de AUC0-∞ DAUNOL/DAUN foi de 6,25, variando individualmente entre 4,16 a 8,79, um dado que exibe variação interindividual de aproximadamente 100%. O clearance total da DAUN foi de 289,54 (254,20-329,54) L/h, o clearance renal de 12,66 (10,79-14,87) L/h e o clearance hepático de 274,81 (236,30-319,60) L/h. O clearance de formação do metabólito DAUNOL foi de 22,78 (18,20-28,50) L/h. A ligação da DAUN às proteínas plasmáticas foi de 72,41 (67,02-78,24) % e do DAUNOL de 69,88 (66,72-73,20) %. Os pacientes genotipados com a variante rs25678 (C>G) da CBR1 (GG e CG; n=11) apresentaram tendência de maiores valores de AUC da DAUN quando comparados ao paciente genotipado como CC (n=1). O paciente genotipado com a variante rs1695 da GSTP1 (Ile105Val) (GG; n=1) também apresentou tendência de maior valor de AUC da DAUN quando comparado aos pacientes genotipados como AG ou AA (n=11). O modelo de farmacocinética populacional da DAUN e DAUNOL, desenvolvido com dados de pacientes pediátricos virtuais (n=12), estruturado com cinco compartimentos e validado com métodos gráficos e estatísticos, apresentou bom desempenho preditivo e mostrou-se adequado para fins de simulação de dados. A estratégia de amostragem esparsa (n=3) com tempos de coleta entre 36-85 h após

o início da primeira infusão permitiu estimar os parâmetros farmacocinéticos individuais da DAUN e DAUNOL de forma tão robusta quanto a estratégia de amostragem com coletas seriadas, oferecendo uma ferramenta viável a ser agregada em futuros estudos multicêntricos empenhados na predição da dose não empírica de DAUN em pacientes adultos e pediátricos.

Palavras-chave: Daunorrubicina; Farmacocinética; Metabolismo; Amostragem esparsa; Leucemia.

Atualizado em 05/2019.

Aluno: Tamires Amábile Valim Brigante

Título: "Esquema de amostragem esparsa para avaliar a farmacocinética da daunorrubicina e seu metabólito daunorrubicinol em pacientes adultos e pediátricos diagnosticados com leucemia mieloide aguda"

Orientador: Profa. Dra. Danielle Palma de Oliveira Data da Defesa: 31/05/2019

RESUMO

BRIGANTE, T.A.V. Avaliação de toxicidade de psicofármacos com potencial terapêutico. 2019. 91f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2019.

O canabidiol (CBD) é um composto encontrado na espécie Cannabis sativa que já teve sua eficácia reconhecida para o tratamento de epilepsia grave, além de atualmente ser estudado para o tratamento de diversas doenças do sistema nervoso. Medicamentos à base de canabidiol já são utilizados em diversos países. No Brasil, a liberação tem sido discutida e com importantes avanços desde 2014. A Ayahuasca é um chá psicoativo originário da Amazônia, amplamente utilizado por tribos indígenas e seitas religiosas. A Ayahuasca tem sido recentemente estudada por seu amplo potencial terapêutico para tratar distúrbios psiquiátricos, como ansiedade, depressão, vícios em drogas de abuso e doenças degenerativas. Dentro deste contexto, para garantir a segurança da população que poderá fazer uso dessas substâncias é essencial que estudos de toxicidade sejam realizados. Para avaliar a toxicidade intrínseca das substâncias foram realizados ensaios de neurotoxicidade e teratogenicidade. O organismo-teste utilizado para estes ensaios foi o zebrafish devido a diversas vantagens apresentadas por este organismo, sendo as principais delas, a transparência do córion e da larva que permite a observação das estruturas internas, e a semelhança do código genético com de mamíferos. Desta forma, o presente trabalho visa fornecer subsídios para a avaliação da segurança do CBD, de um derivado sintético de CBD e ayahuasca, por meio da avaliação de toxicidade utilizando abordagens diferentes empregando embriões de zebrafish. A acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima envolvida nas vias de neurotransmissão sináptica. Sua atividade tem sido amplamente utilizada como biomarcador em estudos de neurotoxicidade. A AChE é expressa cedo em zebrafish, desde o estágio embrionário. Neste trabalho, a atividade da AChE foi avaliada pelo teste de Ellman adaptado para microplaca. Um planejamento experimental foi utilizado para otimizar o preparo de amostra para essa análise. DanioScope é um software que permite avaliar alterações morfológicas e comportamentais precoces no zebrafish. O uso deste software no laboratório foi implementado e padronizado pelo desenvolvimento deste trabalho. Nenhuma malformação foi observada na análise morfológica de embriões expostos a todas as concentrações testadas de CBD e derivado sintético de CBD. No entanto, houve atraso na eclosão após exposição ao CBD (EC50 = 754 μg/L) e após a exposição ao derivado sintético do CBD (EC 50 = 776 μg/L). Além disso, a exposição a estes canabinóides resultou em aumento da atividade motora em 24 hpf com LOEC para a exposição ao CBD de 20 μg/L e ao derivado sintético do CBD, LOEC de 70 μg/L). Esta diferença encontrada na atividade motora não se mantes nos demais períodos avaliados. Os embriões expostos ao CBD não

apresentaram diferenças na atividade da acetilcolinesterase. A exposição à Ayahuasca na maior concentração testada (1000 ppm) resultou em redução da taxa de embriões com bexiga natatória inflada (<10%). Além disso, esta concentração de ayahuasca afetou o desenvolvimento dos olhos já que a medida da área dos olhos mostrou-se reduzida nos embriões expstos à esta concentração. Em menores concentrações, a exposição à ayahuasca não alterou o desenvolvimento dos embriões no período testado.