RESSALVA
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autor
(a), o texto completo desta
dissertação será disponibilizado
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
DERIVADOS DE DITERPENOS CLERODÂNICOS de Casearia sylvestris SWARTZ OBTIDOS POR ENSAIOS IN VITRO: CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
FERNANDO BOMBARDA ODA
ORIENTADOR: Prof. Dr. André Gonzaga dos Santos COORIENTADOR: Dr. Eduardo José Crevelin
Araraquara 2017
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
DERIVADOS DE DITERPENOS CLERODÂNICOS de Casearia sylvestris SWARTZ OBTIDOS POR ENSAIOS IN VITRO: CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
FERNANDO BOMBARDA ODA
Defesa de Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR: Prof. Dr. André Gonzaga dos Santos COORIENTADOR: Dr. Eduardo José Crevelin
Araraquara 2017
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho a toda minha família, em especial à minha querida mãe Claudia, que como uma excelente professora entendeu a importância da educação intelectual na minha vida, um bem preciosíssimo, e nunca poupou esforços para me estimular e para que eu pudesse estudar.
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar a Deus criador de todas as coisas, e a seu filho Jesus Cristo, o qual como homem veio à Terra para se entregar pelas transgressões de todos os homens até os fins dos tempos e nos dar a vida eterna.
Ao apoio de todos os meus familiares, meus pais Roberto e Claudia e, especialmente, à minha avó Sidney. Agradeço a todo o apoio e paciência da minha amada namorada Larissa.
Ao meu orientador Prof. Dr. André Gonzaga dos Santos, considerado um exemplo pessoal e profissional desde a minha graduação. Agradeço pela oportunidade concedida a mim, a todos os ensinamentos e dedicação.
Ao meu coorientador Dr. Eduardo José Crevelin e ao Prof. Dr. Antônio Eduardo Miller Crotti por toda paciência e auxílio na produção desse trabalho.
Ao Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro e à Prof. Drª. Rosangela Gonçalves Peccinini pelas discussões e sugestões pertinentes para o desenvolvimento desse trabalho.
A todos alunos e ao técnico Caio do Laboratório de Farmacognosia, em especial ao doutorando Flávio que sempre me auxiliou na realização desse trabalho.
Às funcionárias do Laboratório de Pesquisa Multiusuários Jussara, Claudia e Mariluci pelo auxílio nos experimentos de cromatografia.
A todos os alunos do Laboratório de Imunologia e Microbiologia pelas contribuições.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro.
RESUMO
Casearia sylvestris Swartz, conhecida como guaçatonga, está distribuída em
todo Brasil e é muito utilizada na medicina popular, com registro etnofarmacológico desde 1877. Muitos desses usos, como o antiofídico, antiulcerogênico e anti-inflamatório já foram comprovados em estudos farmacológicos, os quais mostraram também a baixa toxicidade aguda por via oral de seus derivados vegetais. Estudos in
vivo revelaram que os diterpenos clerodânicos são os responsáveis pelas atividades
antiulcerogênica e anti-inflamatória de C. sylvestris, o que valoriza ainda mais o uso medicinal desta planta. Entretanto, a constatação de que os diterpenos clerodânicos podem sofrer degradação em meio ácido levantaram dúvidas sobre quais substâncias realmente chegam aos receptores e têm atividade: diterpenos ou seus produtos de degradação? Para elucidar essa questão, os diterpenos clerodânicos isolados casearina J (cas J) e O (cas O) foram submetidos isoladamente à degradação ácida em fluido gástrico simulado sem enzimas (PDA) e, posteriormente, metabolizados com enzimas hepáticas da fração S9 (PDA-ME). A metabolização direta dos diterpenos com a fração S9 também foi realizada (PME). As respectivas casearinas remanescentes foram quantificadas em todos os produtos de metabolização. Posteriormente, foram conduzidos ensaios de síntese e/ou liberação de óxido nítrico em macrófagos RAW 267.7 estimulados por LPS in vitro. Para a determinação estrutural dos derivados formados foram utilizadas técnicas cromatográficas (CLAE-DAD) e espectrométricas (CLUE-EM, RMN de 1H e 13C). Foram identificadas dez substâncias formadas após degradação ácida da cas J (PDA-J), além da casearina remanescente (5,05%) e seu epímero (PDA-J8). As estruturas propostas desses produtos resultaram da hidrólise do grupamento éster em C-18 (PDA-J1), hidrólise do grupamento éster em C-19 (PDA-J3), formação de dialdeído após quebra do anel diacetálico C (PDA-J2, majoritário), e adições nos grupos aldeídos do PDA-J2 de uma molécula de água (PDJ-7), uma (PDA-J4 e PDA-J4.1) ou duas de etanol (PDJ-5) e hidrólise do éster em C-18 do PDA-J2 (PDJ-6). Foram identificadas nove substâncias formadas após degradação ácida da cas O, além da casearina remanescente (13,1%). Suas estruturas resultaram da hidrólise dos grupos ésteres em 18 (PDA-O1) e C-19 (PDA-O3), formação do dialdeído após quebra do anel C (PDA-O2, majoritário), adições nos grupos aldeídos do PDA-O2 de uma (PDA-O4 e PDA-O 4.1) ou duas moléculas de etanol (PDA-O5) e hidrólise do éster em C-7 do PDA-O2 (PDA-O5), além da hidrólise do grupamento esterificado em C-6 do PDA-O5 (PDA-O6 ou PDA-O6.1). A metabolização da cas J pela fração S9 gerou duas substâncias correspondentes à quebra do butanoato em C-18 (PME-J1) e formação do seu epímero (PME-J2), permanecendo 36,8% íntegra. Em relação à metabolização da cas O, 36,5% permaneceu íntegra, e ocorreu a formação de uma molécula após quebra dos substituintes esterificados em C-18 e C-19 (PME-O1) e de outra após a formação do dialdeído no anel C (PME-O2). As análises indicaram que as metabolizações enzimáticas dos PDA resultaram nas mesmas substâncias. Os ensaios em macrófagos estimulados por LPS in vitro mostraram que os produtos de degradação ácida e/ou metabolização enzimática das casearinas não têm atividade anti-inflamatória in vitro na inibição da liberação e/ou produção de NO, igualmente às casearinas J e O íntegras.
Palavras-chave: Casearia sylvestris. Diterpenos clerodânicos. Casearinas. Fluido gástrico simulado. Metabolização hepatica. Anti-inflamatório.
ABSTRACT
Casearia sylvestris Swartz known as guaçatonga is distributed throughout Brazil
and has been widely used in folk medicine since 1877. Many of these uses, such as anti-fungal, antiulcerogenic and anti-inflammatory, have already been proven in pharmacological studies, also demonstrating low acute oral toxicity. In vivo studies have shown that clerodane diterpenes are responsible for the antiulcerogenic and anti-inflammatory activities of C. sylvestris, which further enhances the medicinal use of this plant or its derivatives. However, the finding that clerodane diterpenes may suffer degradation in acid medium have raised doubts about the actual substances reached the receptors and carry out activity: diterpenes or their degradation products? In order to elucidate this issue, purified clerodane diterpenes casearin J (cas J) and O (cas O) were subjected to acid degradation in simulated gastric fluid without enzymes (PDA) alone and subsequently metabolized with S9 fraction (PDAME) liver enzymes. A direct metabolization of diterpenes with a S9 fraction (PME) was also performed. Respective remaining casearins were quantified in all the metabolizing products. In the end, macrophage stimulated by LPS in vitro assays of nitric oxide synthesis were conducted using as sample the purified cas J and O, PDA, PME and PDAME. Chromatographic (HPLC-PDA) and spectrometric techniques (UPLC-PDA-MS, 1H and and 13C NMR) were used for the structural determination of the generated derivatives. Ten substances were identified after the acid degradation of cas J (PDA-J), in addition to the remaining casearin (5.05%) and its epimer. Proposed structures of these compounds result of ester group hydrolysis in C-18 (PDA-J1), and in C-19 (PDA-J7), dialdehyde formation after diacetal C ring breaking (PDA-J2, majority), and additions in the aldehyde groups of the PDA-J2 of a water molecule (PDJ-3), one (PDA-J4 and PDA-J4.1) or two ethanol molecules (PDJ-5) and ester hydrolysis in C-7 of PDA-J2 (PDJ-6). Besides the remaining cas O (13.1%), nine compounds were identified after acid degradation. Their structures result of hydrolysis of the esterified groups in C-18 and C-19 (PDA-O1), dialdehyde formation after C-ring rupture (PDA-O2, majority), additions in the PDA-O2 aldehyde groups of one (PDA-O3 and PDA -O3.1) or two ethanol molecules (PDA-O4) and ester hydrolysis at C-6 (PDA-O5). Metabolization of casearin J by the S9 fraction generated two substances corresponding to the breakdown of n-butanoate in C-18 (PME-J1) and formation of cas J epimer (PME-J2), remaining 36.8% intact. In relation to the metabolization of casearin O, 36.5% remained intact and one molecule was formed after breaking the esterified substituents in C-6 and C-7 (PME-O1) and the other after the formation of dialdehyde at C ring (PME-O2). The analyzes indicated that the enzymatic metabolism of the PDA resulted in the same substances. In vitro LPS stimulated macrophage assays have shown that PDA and PME do not have in vitro anti-inflammatory activity of NO inhibition, as well as intact J and O casearins.
Keywords: Casearia sylvestris. Clerodane diterpenes. Casearins. Simulated gastric fluid. Hepatic metabolism. Anti-inflammatory.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Casearia sylvestris Sw. (AGS 102) – Horto de Plantas Medicinais e Tóxicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, Araraquara. ... 24 Figura 2. Estrutura geral dos diterpenos clerodânicos de Casearia sylvestris (FERREIRA et al., 2010) Os substituintes R1-R5 de casearinas A-X, caseargrewiina F
e casearvestrinas A-C são apresentados na Tabela 1. ... 26 Figura 3. Fluxograma das atividades desenvolvidas durante o mestrado. ... 37 Figura 4. Obtenção e fracionamento do extrato etanólico de folhas de C. sylvestris. ... 42 Figura 5. Pré-tratamento do extrato e frações por EFS (C18). Volume de eluição: 5,0 mL (5 x Vm). ... 43
Figura 6. Pré-tratamento dos PDA por EFS (C18). Volume de eluição: 10 mL (10 x Vm). ... 49
Figura 7. Cromatoplaca (sílica gel) do extrato etanólico e das frações (F 1-3) obtidas por EFS. Casearina J (cas J, 1 mg/mL, Rf: 0,23), casearina O (cas O, 1 mg/mL,
Rf:0,32), extrato (ext, 5 mg/mL), frações (F 1-3, 5 mg/mL). Fase móvel: hexano:
acetato de etila: isopropanol 70:28:02 (v/v). Revelador: anisaldeído sulfúrico (110º C por 10 min). ... 56 Figura 8. Cromatogramas do extrato (2,25 mg/mL) e F2 (1,25 mg/mL). Substâncias identificadas: cas J e cas O. Análises em CLAE-DAD em coluna de FR Hypersil Gold®
(C-18, 250 x 4,6 mm, 5 μm), em gradiente linear com MeCN 55% para 100% (v/v) em 42 min, mantendo isocraticamente MeCN 100% por 8 min; vazão de 0,8 mL/min; detecção em λ 190-400 nm, com monitoramento em 235 nm; volume de injeção de 40 μL. ... 58 Figura 9. Cromatograma dos padrões cas J (0,25 mg/mL) e cas O (0,50 mg/mL). Análises em CLAE-DAD em coluna de FR Hypersil Gold® (C-18, 250 x 4,6 mm, 5 μm), em gradiente linear com MeCN 55% para 100% (v/v) em 42 min, mantendo isocraticamente por 8 min; vazão de 0,8 mL/min; detecção em λ 190-400 nm, com monitoramento em 235 nm; volume de injeção de 40 μL. ... 59 Figura 10. Curva analítica da casearina J obtida em CLAE-DAD em coluna de FR Hypersil Gold® (C-18, 250 x 4,6 mm, 5 μm), em gradiente linear com MeCN 55% para
100% (v/v) em 42 min, mantendo isocraticamente MeCN 100% por 8 min; vazão de 0,8 mL/min; detecção em λ 190-400 nm, com monitoramento em 235 nm; volume de
injeção de 40 μL. ... 60 Figura 11. Curva analítica da casearina O obtida em CLAE-DAD em coluna de FR Hypersil Gold® (C-18, 250 x 4,6 mm, 5 μm), em gradiente linear com MeCN 55% para
100% (v/v) em 42 min, mantendo isocraticamente MeCN 100% por 8 min; vazão de 0,8 mL/min; detecção em λ 190-400 nm, com monitoramento em 235 nm; volume de injeção de 40 μL. ... 60 Figura 12. Cromatoplaca (sílica gel) das subfrações (SF) obtidas por CC. Concentração: 5 mg/mL. Fase móvel: hexano: acetato de etila: isopropanol. SF 1-15 (75:23:02, v/v); SF 16-46: (70:28:02, v/v); SF 47-62 (50:47:03, v/v). Revelador: anisaldeído sulfúrico (110º C por 10 min). ... 64 Figura 13. Cromatograma analítico, preparativo e pós-preparativo da subfração SF 17-18. Condições de análise nos respectivos cromatogramas. ... 66 Figura 14. Estrutura química da casearina J. ... 70 Figura 15. Cromatograma (DAD) da SF 17-18 P (0,25 mg/mL). Análises em CLUE-DAD-EM em coluna de FR Ascentis® Express C18 (100 x 4,6 mm, 2,7 μm) em
gradiente linear com MeCN 30% (0,1% ác. Fórmico, v/v) para 90% em 30 min, mantendo isocraticamente MeCN 90% por 5 min; vazão de 0,5 mL/min, detecção em λ 190-400 nm, com monitoramento em λmáx volume de injeção de 5,0 μL. ... 72
Figura 16. Proposta mecanística de formação do epímero da casearina J (catálise ácida geral intramolecular). ... 75 Figura 17. Cromatograma analítico, preparativo e pós-preparativo da subfração SF 15-16. Condições de análise nos respectivos cromatogramas. ... 77 Figura 18. a) Estrutura química da casearina O. b) principais correlações verificadas no mapa de contorno HMBC (C→H). ... 80 Figura 19. Cromatogramas analíticos, preparativo e pós-preparativo da subfração SF 51-55.Condições de análise nos respectivos cromatogramas. ... 82 Figura 20. Cromatograma (DAD) obtido por CLUE-EM da SF 51-55 P (cas F e epímero). Análise em CLUE-DAD-EM em coluna Ascentis® Express C18 (100 x 4,6
mm, 2,7 μm), gradiente linear com MeCN 70% (0,1 % àc. fórmico) para 90% (0,1 % àc. fórmico) (v/v) em 25 min, mantendo isocraticamente 90:10 por 5 min; vazão de 0,5 mL/min; volume de injeção de 5 μL. ... 85 Figura 21. Estrutura química da casearina F e principais correlações verificadas no mapa de contorno HMBC (C→H). ... 86 Figura 22. Cromatograma analítico, preparativo e pós-preparativo das sub frações SF
5-6. Condições de análise nos respectivos cromatogramas. ... 88 Figura 23. Estrutura química do diisobutilftalato (DIBF). ... 89 Figura 24. Cromatoplaca (sílica gel) da subfração 37 (SF 37, 5,0 e 1,0 mg/mL, Rf
diterpeno majoritário: 0,5) e após degradação ácida em FGS na condição A (1h) e condição B (3h) (10,0 mg/mL). Fase móvel: hexano: acetato de etila: isopropanol (50:47:03, v/v). Revelador: anisaldeído sulfúrico (110º C por 10 min)... 91 Figura 25. Cromatoplaca (sílica gel) da casearina J (cas J, 1,0 mg/mL, Rf:0,6), frações
(10,0 mg/mL): H2O: MeCN (98:02, Faq), MeCN: H2O (98:02, Fact), AcOEt 100 (Fact),
partição da fração H2O: MeCN (98:02, Fpt). Fase móvel: hexano: acetato de etila:
isopropanol (50:47:03, v/v). Revelador: anisaldeído sulfúrico (110º C por 10 min). .. 93 Figura 26. Cromatoplaca (sílica gel) da casearina O (cas O, 1 mg/mL, Rf:0,68) e
frações (10 mg/mL): H2O:MeCN (98:02, Faq), MeCN:H2O (98:02, Facn), AcOEt
(Fact), partição da fração H2O:MeCN (98:02, Fpt). Fase móvel: hexano: acetato de
etila: isopropanol (50:47:03, v/v). Revelador: anisaldeído sulfúrico (110º C por 10 min). ... 94 Figura 27. Cromatograma dos produtos de degradação ácida da cas J (PDA-J). Substância identificada: cas J. Análise em CLAE-DAD em coluna de FR Hypersil Gold® (C-18, 250 x 4,6 mm, 5 μm), em gradiente linear com MeCN 55% para 100%
(v/v) em 42 min, mantendo isocraticamente por 8 min; vazão de 0,8 mL/min; detecção em λ 190-400 nm, com monitoramento em 235 nm; volume de injeção de 20 μL. ... 96 Figura 28. Cromatograma dos produtos de degradação ácida da casearina J (PDA-J). Análise em CLAE-DAD em coluna de FR Hypersil Gold® (C-18, 250 x 4,6 mm, 5
μm), em gradiente linear com MeCN 55% para 100% (v/v) em 42 min, mantendo isocraticamente por 8 min; vazão de 0,8 mL/min; detecção em λ 190-400 nm, com monitoramento em 235 nm; volume de injeção de 20 μL. ... 97 Figura 29. Estruturas químicas gerais dos íons formados em espectrometria de massas ESI+ (MS1/MS2) das casearinas e seus produtos. ... 100
Figura 30. Cromatograma (TIC) dos produtos de degradação ácida da casearina J (PDA-J) e estruturas químicas propostas (EM). Análise em CLUE-DAD-EM em coluna Ascentis® Express C18 (100 x 4,6 mm, 2,7 μm), gradiente linear com MeCN 30% (0,1
% àc. fórmico) para MeCN 90% (0,1 % àc. fórmico) (v/v) em 30 min, mantendo isocraticamente MeCN 90% por 5 min; vazão de 0,5 mL/min; volume de injeção de 5 μL. ... 102 Figura 31. Espectro de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PDA-J2 obtido por
CLUE-DAD-EM (tR= 17,63 min) e sua estrutura química. ... 103
Figura 32. Espectro de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PDA-J1 (t R= 14,63 min) obtido por CLUE-DAD-EM e sua estrutura química. ... 105
Figura 33. Espectro de massas (ESI+, MS1) full scan relativo à cas J e epímero (t R= 19,57 e 22,03 min) obtido por CLUE-DAD-EM e sua estrutura química... 106
Figura 34. Espectro de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao metabólito PDA-J3 (tR= 9,68 min) e sua estrutura química. ... 107
Figura 35. Espectro de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PDA-J6 (t R= 8,83 min) e sua estrutura química. ... 108
Figura 36. Espectro de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PDA-J7 (11,72 min) e sua estrutura química. ... 109
Figura 37. Espectro de massas (ESI+, MS1) full scan do PDA-J4 e PDA-J4.1 (t R= 18,33 e 20,81 min) e sua estrutura química. ... 110
Figura 38. Espectros de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PDA-J5 (t R= 24,33) e sua estrutura química. ... 111
Figura 39. Proposta mecanística de formação do PDA-J1. ... 112
Figura 40. Propostas mecanísticas de formação do PDA-J2. ... 113
Figura 41. Proposta mecanística de formação do PDA-J3. ... 115
Figura 42. Proposta mecanística de formação dos PDA-J4. ... 116
Figura 43. Proposta mecanística de formação do PDA-J5. ... 117
Figura 44. Proposta mecanística de formação do PDA-J6. ... 118
Figura 45. Proposta mecanística de formação do PDA-J7. ... 119
Figura 46. Cromatograma (DAD) dos produtos de degradação ácida da casearina O (PDA-O) e estruturas químicas propostas. Cas O (tR = 23,37 min). Análise em CLUE-DAD-EM em coluna Ascentis® Express C18 (100 x 4,6 mm, 2,7 μm), gradiente linear com MeCN 30% (0,1 % àc. fórmico) para MeCN 90% (0,1 % àc. fórmico) (v/v) em 30 min, mantendo isocraticamente MeCN 90% por 5 min; vazão de 0,5 mL/min; volume de injeção de 5 μL. ... 121
Figura 47. Espectros de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PDA-O2 (t R= 19,63 min) e sua estrutura química. ... 122
Figura 48. Espectros de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PDA-O1 (t R= 22,02 min) e sua estrutura química. ... 123
Figura 49. Espectros de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PDA-O3 (t R= 15,75 min) e sua estrutura química. ... 124
Figura 50. Espectros de massas (ESI+, MS1) full scan relativo à cas O (t
R= 23,37 min)
e sua estrutura química. ... 125
Figura 51. Espectros de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PDA-O4 e 4.1 (t R= 20,11 e 20,34 min) e suas estruturas químicas. ... 126
Figura 52. Espectros de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PDA-O5 e 5.1 (t R= 25,46 min) e suas estruturas químicas. ... 127
Figura 53. Espectros de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PDA-O6 e 6.1 (t R= 17,75 e 18,67 min) e suas estruturas químicas. ... 128
Figura 54. Proposta mecanística de formação do PDA-O1. ... 129
Figura 55. Propostas mecanísticas de formação do PDA-O2. ... 130
Figura 56. Proposta mecanística de formação do PDA-O3. ... 132
Figura 57. Proposta mecanística de formação do PDA-O4. ... 133
Figura 58. Proposta mecanística de formação do PDA-O5. ... 134
Figura 59. Proposta mecanística de formação do PDA-O6. ... 135
Figura 60. Cromatogramas dos produtos obtidos após metabolização enzimática da cas J (PME-J; 0,5 mg/mL) e dos PDA-J (PDAME-J; 2,50 mg/mL). Análise em CLAE-DAD em coluna de FR Hypersil Gold® (C-18, 250 x 4,6 mm, 5 μm), em gradiente linear com MeCN 55% para 100% (v/v) em 42 min, mantendo isocraticamente por 8 min; vazão de 0,8 mL/min; detecção em λ 190-400 nm, com monitoramento em 235 nm; volume de injeção de 20 μL... 137
Figura 61. Cromatograma dos produtos obtidos após metabolização enzimática da cas O (PDA-O; 0,50 mg/mL) e dos PDA da cas O (PDAME-O; 1,10 mg/mL). Substância identificada: cas O. Análise em CLAE-DAD em coluna de FR Hypersil Gold® (C-18, 250 x 4,6 mm, 5 μm), em gradiente linear com MeCN 55% para 100% (v/v) em 42 min, mantendo isocraticamente por 8 min; vazão de 0,8 mL/min; detecção em λ 190-400 nm, com monitoramento em 235 nm; volume de injeção de 20 μL. . 139
Figura 62. Cromatogramas (DAD e TIC) dos produtos de metabolização enzimática da cas J (PME-J) e estruturas químicas propostas. Análise em CLUE-DAD-EM em coluna Ascentis® Express C18 (100 x 4,6 mm, 2,7 μm), gradiente linear com MeCN 30% (0,1 % àc. fórmico) para MeCN 90% (0,1 % àc. fórmico) (v/v) em 30 min, mantendo isocraticamente MeCN 90% por 5 min; vazão de 0,5 mL/min; volume de injeção de 5 μL. ... 142
Figura 63. Espectros de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PME-J1 (tR= 14,38 min) e sua estrutura química. ... 143
Figura 64. Espectros de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao epímero da cas J
PME-J2 (tR= 19,20 min) e sua estrutura química. ... 144
Figura 65. Cromatogramas (DAD e TIC) dos produtos de metabolização enzimática a partir dos produtos de degradação ácida da cas J (PDAME-J) e estruturas químicas propostas. Análise em CLUE-DAD-EM em coluna Ascentis® Express C18 (100 x 4,6
mm, 2,7 μm), gradiente linear com MeCN 30% (0,1 % àc. fórmico) para MeCN 90% (0,1 % àc. fórmico) (v/v) em 30 min, mantendo isocraticamente MeCN 90% por 5 min; vazão de 0,5 mL/min; volume de injeção de 5 μL. ... 145 Figura 66. Cromatogramas (DAD e TIC) dos produtos de metabolização enzimática da cas O (PME-O) e estruturas químicas propostas. Análise em CLUE-DAD-EM em coluna Ascentis® Express C18 (100 x 4,6 mm, 2,7 μm), gradiente linear com MeCN
30% (0,1 % àc. fórmico) para MeCN 90% (0,1 % àc. fórmico) (v/v) em 30 min, mantendo isocraticamente MeCN 90% por 5 min; vazão de 0,5 mL/min; volume de injeção de 5 μL. ... 147 Figura 67. Espectros de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PME-O1 (t
R= 15,75
min) e sua estrutura química. ... 148 Figura 68. Espectros MS1 de massas (ESI+, MS1) full scan relativo ao PME-O2 (t
R=
16,64 min) e sua estrutura química. ... 149 Figura 69. Cromatogramas (DAD e TIC) dos produtos de metabolização enzimática a partir dos produtos de degradação ácida da cas O (PDAME-O) e estruturas químicas propostas. Análise em CLUE-DAD-EM em coluna Ascentis® Express C18 (100 x 4,6
mm, 2,7 μm), gradiente linear com MeCN 30% (0,1 % àc. fórmico) para MeCN 90% (0,1 % àc. fórmico) (v/v) em 30 min, mantendo isocraticamente MeCN 90% por 5 min; vazão de 0,5 mL/min; volume de injeção de 5 μL. ... 151 Figura 70. Efeito dos produtos de degradação ácida (PDA) e metabolização enzimática (PME) sobre a inibição de nitrito em ensaio de macrófagos estimulados por LPS (100 ng/mL) in vitro. ... 154
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Diterpenos clerodânicos típicos em espécies de Casearia. Os substituintes R1 a R5 referem-se à estrutura representada na Figura 2. (FERREIRA et al., 2011; XIA
et al., 2015). ... 26 Tabela 2. Rendimento do extrato em relação à droga vegetal... 54 Tabela 3. Dados das análises da casearina J em CLAE-DAD (condição 2) para construção da curva analítica. ... 61 Tabela 4. Dados das análises da casearina O em CLAE-DAD (condição 2) para construção da curva analítica. ... 61 Tabela 5. Resultados da quantificação de cas J e de casearinas totais equivalentes a cas J no extrato etanólico e F 2. ... 62 Tabela 6. Resultados da quantificação de cas O e de casearinas totais equivalentes a cas O no extrato etanólico e F 2. ... 63 Tabela 7. Massa e rendimento das subfrações (SF) obtidas de F 2 por CC, após agrupamento. ... 63 Tabela 8. Dados espectrométricos de RMN obtidos para a casearina J a 300 MHz para 1H e a 75 MHz para 13C, em pentadeuteropiridina. ... 69
Tabela 9. Dados espectrométricos de RMN obtidos para a casearina J (SF 17-18 P1) e seu isômero (SF 17 P1.1) a 300 MHz para 1H e a 75 MHz para 13C, em piridina-d5. ... 73 Tabela 10. Dados espectrométricos de RMN obtidos para a casearina O a 300 MHz para 1H e a 75 MHz para 13C, em pentadeuteropiridina. ... 79 Tabela 11. Dados espectrométricos de RMN obtidos para a casearina F (SF 51-55 P1) e seu isômero (SF 51-55 P1.1) a 300 MHz para 1H e a 75 MHz para 13C, em piridina-d5. ... 84 Tabela 12. Estrutura química do diisobutil ftalato e os dados espectrométricos de RMN obtidos para a SF 15 e 16 a 300 MHz para 1H e a 75 MHz para 13C, em piridina-d5. ... 90 Tabela 13. Teores da casearina J nos produtos de metabolização enzimática (PME-J) e nos produtos de degradação ácida seguida de metabolização enzimática (PDAME-J). Tempo de metabolização com fração S9: 3h. ... 138 Tabela 14. Teores da casearina O nos produtos de metabolização enzimática (PME-O) e nos produtos de degradação ácida seguida de metabolização enzimática
(PDAME-O). Tempo de metabolização com fração S9: 3h. ... 140 Tabela 15. Atividade citotóxica da casearina J e O, PDA e PME para macrófagos da linhagem RAW 264.7 após um período 20 horas de exposição determinada pelo método MTT. ...153
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AcOEt: acetato de etila
AINE: anti-inflamatório não-esteroidal
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC: American Type Culture Collection (Coleção Americana de Cultura de Células) ATR: attenuated total reflectance (modo de reflexão atenuada)
Cas J: casearina J Cas O: casearina O C-18: sílica octadecilsilano CC: cromatografia em coluna
CCD: cromatografia em camada delgada
CLAE-DAD: cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos
CLAE-UV: cromatografia líquida de alta eficiência com detector ultravioleta/visível clorofórmio-d5: clorofórmio deuterado
CLAEprep: cromatografia líquida de alta eficiência preparativa
CLUE-DAD-EM: cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas
COX: ciclo-oxigenase
COX-1: ciclo-oxigenase tipo 1 COX-2: ciclo-oxigenase tipo 2
cNOS: óxido nítrico sintase constitutiva
d: dupleto
dd: duplo dupleto
DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium (meio de Eagle modificado por Dulbecco)
DIC: dissociação induzida por colisão
DL50: dose letal de um composto, extrato ou fração para 50% dos animais de uma determinada espécie
IC50: concentração de um composto, extrato ou fração necessária para interagir com 50% de um determinado alvo molecular ou para provocar 50% de uma determinada resposta
ε: coeficiente de absorção molar EFS: extração em fase sólida EM: espectrômetro de massas ESI: ionização por eletrospray Ext: extrato de Casearia sylvestris EtOH: etanol
F 1: fração 1 da EFS F 2: fração 2 da EFS F 3: fração 3 da EFS FE: fase estacionária
FGS: fluido gástrico simulado FM: fase móvel
FN: fase normal FR: fase reversa
HepG2: células de carcinoma hepático humano
HMBC: Heteronuclear Multiple-Bond Correlation (Correlação Heteronuclear de 1H e 13C a múltiplas ligações)
HTC: hepatoma de Rattus novergicus
IC50: concentração capaz de provocar uma determinada ação em 50 % do alvo iNOS: óxido nítrico sintase induzida
IV-FT: espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier
J: constante de acoplamento
λmáx: comprimento de onda máximo
L-929: células normais de tecido conjuntivo de camundongo C3H/An LPS: lipopolissacarídeo
m: multipleto
Me: metila
MeCN: acetonitrila MeOH: metanol
NO: nitric oxide (óxido nítrico)
NuBBE – Núcleo de Bioensaios Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais OAc: acetato
OBu: butanoato OMe: metoxila
PDA: produto de degradação ácida
PDAME: produto de degradação ácida e metabolização enzimática Piridina-d5: piridina deuterada
PLA2: fosfolipase A2
PME: produto de metabolização enzimática PGE2: prostaglandina E2
PVDF: fluoreto de polivinildieno
q: quadrupleto
RAW 264.7: macrófagos peritoneais aderentes derivados de camundongos Balb/c Rf: fator de retenção
RMN: ressonância magnética nuclear
s: singleto sl: singleto largo
SF 1-63: subfrações da CC Sw: Swartz
t: tripleto
THP-1: monócitos humanos associados à leucemia tR: tempo de retenção
V-79: fibroblastos normais de pulmão de hamster chinês Vm: volume morto
UV/VIS: ultravioleta/ visível
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 22
1.1 Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) ... 23
1.1.1 Atividade anti-inflamatória de C. sylvestris ... 27
1.1.2 Estudos de toxicidade de C. sylvestris ... 29
2 OBJETIVOS ... 36
2.1 Objetivo Geral ... 36
2.2 Objetivos Específicos ... 36
3 ESTRATÉGIA GERAL ... 36
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 38
4.1 Materiais, equipamentos e acessórios ... 38
4.2 Coleta e preparo do material vegetal ... 40
4.2.1 Perda por dessecação em balança com radiação por infravermelho (INFRATEST) ... 40
4.3 Obtenção do extrato etanólico de folhas de C. sylvestris ... 40
4.4 Fracionamento do extrato etanólico de folhas de C. sylvestris ... 41
4.4.1 Extração em fase sólida (EFS) ... 41
4.4.2 Cromatografia em coluna (CC) ... 41
4.5 Análises cromatográficas do extrato e frações... 42
4.5.1 Cromatografia em camada delgada (CCD) ... 42
4.5.2 Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD) ... 43
4.6 Purificação de casearinas por CLAE-UV semipreparativa ... 45
4.7 Cromatografia líquida de ultra eficiência com detector de arranjo de diodos e de massas (CLUE-DAD-EM) ... 46
4.8 Determinação estrutural das substâncias isoladas ... 47
4.9 Degradação ácida das casearinas em fluido gástrico simulado (FGS) ... 47
4.9.1 Estudo inicial com casearinas semipurificadas (SF 37) ... 47
4.9.2 Estudo com casearinas purificadas (cas J e cas O) ... 48
4.10 Metabolização in vitro das casearinas utilizando fração S9 (enzimas microssomais liofilizadas de fígado de rato) ... 49
4.11 Ensaios com macrófagos in vitro ... 50
4.11.1 Preparo da microplaca aderida com macrófagos... 51
4.11.2 Estimulação celular com LPS ... 51
4.11.3 Ensaio de viabilidade celular por MTT ... 52
4.11.4 Ensaio de determinação de NO através da quantificação de nitrito... 52
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 53
5.1 Purificação e identificação de diterpenos clerodânicos do tipo das casearinas ... 53
5.1.1 Obtenção do extrato etanólico de folhas de C. sylvestris ... 53
5.1.2 Fracionamento do extrato etanólico de folhas de C. sylvestris por EFS .... 54
5.1.3 Análises cromatográficas do extrato e frações F 1-3 ... 55
5.1.3.1 Cromatografia em camada delgada (CCD): Avaliação dos perfis químicos do extrato e frações ... 55
5.1.3.2 Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD): Identificação e quantificação de casearinas totais no extrato e F 2 ... 57
5.1.2 Fracionamento de F 2 por CC... 63
5.1.3 Purificação de casearinas por cromatografia líquida de alta eficiência preparativa e determinação estrutural das casearinas purificadas ... 64
5.1.3.1 Purificação e identificação das substâncias obtidas na SF 17-18 (cas J) ... 65
5.1.3.1.1 Identificação dos componentes de SF 17-18 P (cas J e isômero) . 71 5.1.3.2 Purificação e determinação estrutural da substância isolada na SF 15-16 (cas O) ... 76
5.1.3.3 Purificação e identificação de substâncias obtidas na SF 51-55 (cas F) ... 81
5.1.3.3.1 Identificação dos componentes da SF 51-55 P (cas F e epímero) 83 5.1.3.4 Purificação e determinação estrutural da substância isolada nas SF 5 (DIBF) ... 86
5.2 Degradação ácida in vitro das casearinas através do fluido gástrico simulado (FGS) ... 90
5.2.1 Degradação ácida em FGS de uma fração semipurificada de casearinas (SF 37)... 90
5.2.2 Degradação ácida em FGS de casearinas isoladas (cas J e cas O) ... 91
5.2.2.1 Análises por CLAE-DAD dos produtos de degradação ácida em FGS das casearinas J e O ... 92
5.2.2.1.1 Casearina J ... 92
5.2.2.1.2 Casearina O ... 93
5.2.2.2 Análises por CLAE-DAD dos produtos de degradação ácida em FGS das casearinas J e O ... 95
5.2.2.2.1 Casearina J ... 95
5.2.2.2.1 Casearina O ... 97
5.2.2.3 Análises por RMN de 1H dos produtos de degradação ácida em FGS da cas J e O ... 98
5.2.2.4 Análises por CLUE-DAD-EM dos produtos de degradação ácida em FGS das cas J e O ... 98
5.2.2.4.1 Casearina J ... 101
5.2.2.4.1.1 Propostas mecanística de formação dos PDA-J ... 112
5.2.2.4.2 Casearina O ... 120
5.2.2.4.2.1 Propostas mecanísticas de formação dos PDA-O... 129
5.3 Metabolização in vitro das casearinas utilizando fração S9 (enzimas microssomais liofilizadas de fígado de rato) ... 136
5.3.1 Análises por CLAE-DAD dos produtos de degradação ácida em FGS e metabolização hepática das casearinas J e O ... 136
5.3.1.2 Casearina O ... 138
5.3.2 Análises por CLUE-DAD-EM dos produtos de degradação ácida em FGS e metabolização hepática das casearinas J e O ... 140
5.3.2.1 Cas J ... 141
5.3.2.2 Cas O ... 146
5.3 Ensaios com macrófagos in vitro ... 152
5.3.1 Ensaio de viabilidade celular por MTT ... 152
5.3.2 Ensaio de inibição da produção de NO (quantificação de NO2-) ... 153
6 CONCLUSÕES ... 154
REFERÊNCIAS ... 156
22 1 INTRODUÇÃO
A medicina tradicional sempre esteve atrelada às plantas, as quais são uma fonte rica e abundante de novos fármacos, já que apresentam grande variabilidade em número de espécies e composição química. Apesar do avanço científico e tecnológico ter apresentado novas técnicas que não se baseiam em fontes naturais, mas nos sítios de ligação do alvo, principalmente em química combinatória, estudos comprovam que os produtos naturais continuam sendo importantes no desenvolvimento de fármacos e medicamentos. Um levantamento recente do surgimento dos novos agentes terapêuticos no mundo (fármacos, extratos vegetais, macromoléculas biológicas e vacinas) aprovados entre 1981 e 2014 mostra que 41% dos 1.211 novos agentes terapêuticos totais estão relacionados com produtos naturais, principalmente com plantas (NEWMAN e CRAGG, 2016; STEHMANN e SOBRAL, 2017).
O extenso território e a diversidade de biomas fazem com que o Brasil tenha uma flora ampla e diversificada, e com os esforços na última década de confecção de inventários, foram catalogadas mais de 30 mil espécies de plantas, sendo cerca de 20 mil endêmicas (STEHMANN e SOBRAL, 2017). Dentre todas as espécies de plantas destaca-se Casearia sylvestris Swartz, popularmente conhecida como guaçatonga,
sendo distribuída em 22 estados brasileiros (MARQUETE, 2001). O interesse por estudá-la deve-se, principalmente, pelos diversos usos na medicina popular, pois é utilizada como cicatrizante, antisséptico, febrífugo, depurativo, anestésico tópico, antiulceroso, antirreumático, antidiarreico, anti-inflamatório, no tratamento de doenças de pele e antiofídico, sendo que este foi o primeiro relato literário com finalidade terapêutica no Brasil, em 1877 (CAMINHOÁ, 1877; FERREIRA et al., 2011).
Muitos desses usos foram comprovados por estudos científicos, indicando que extratos de folhas da C. sylvestris apresentam ação antiulcerogênica, antiofídica, anti-inflamatória e cicatrizante (FERREIRA et al., 2011; PIERRI et al., 2017). Além de possuir ampla atividade farmacológica, ensaios toxicológicos demonstram que derivados vegetais ou substâncias isoladas dessa espécie têm baixa toxicidade aguda quando administrados oralmente em animais ou em ensaios in vitro (AMENI et al., 2015; BASILE et al., 1990; BOU et al., 2015; FERREIRA et al., 2014; MAISTRO et al., 2004; SANTOS, 2008; SANTOS et al., 2010; SILVA, 1988).
23 de Interesse ao SUS (RENISUS) e já faz parte do Formulário Nacional de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira, publicado em 2011 pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Tal formulário estabelece a padronização de fitoterápicos, garantindo sua segurança, eficácia e qualidade, o que torna mais confiável o seu uso terapêutico. Vale lembrar que neste formulário está incluída uma preparação extemporânea por infusão (chá medicinal, produto tradicional fitoterápico) de folhas de C. sylvestris, indicado apenas como antidispéptico (BRASIL, 2011). Entretanto, sabe-se que a espécie possui grande potencial terapêutico, podendo ser regulamentado para outros fins e até para o desenvolvimento de um medicamento fitoterápico. Apesar disso, esta planta não foi incluída na última lista de medicamentos ou produtos tradicionais fitoterápicos de registro simplificado e atualmente não há nenhum medicamento à base de C. sylvestris ou seus derivados inscritos na ANVISA (BRASIL, 2014). Contudo, tendo em vista essas propriedades farmacológicas e sua tradição de uso relacionada à baixa toxicidade, um medicamento fitoterápico à base do extrato etanólico de folhas de C. sylvestris poderia ser desenvolvido e registrado. Uma etapa importante nesse desenvolvimento seria a investigação de possíveis produtos de degradação e/ou metabolização hepática envolvendo principalmente os seus marcadores químicos ativos, conhecidos como casearinas, o que justifica a realização desse trabalho.
154
6 CONCLUSÕES
Foram isoladas 2 casearinas (cas J e cas O) com alto grau de pureza (90,5 e 97,6%, respectivamente) para realização dos ensaios de metabolização e avaliação da atividade anti-inflamatória in vitro.
A cas J e a cas O sofreram degradação em meio FGS nas condições analisadas (1h, 37º C, pH 1,2 HCl e NaCl), sendo que apenas uma pequena parte delas continuou íntegra na mistura, 5,05% e 13,1%, respectivamente. Esse fato indica que elas sofrem extensiva degradação ao passarem pelo meio estomacal.
Foram identificadas dez substâncias nos PDA-J, sendo que o pico majoritário corresponde à molécula proposta que possui um dialdeído formado após o rompimento do anel diacetálico C da cas J (PDA-J2). As outras estruturas propostas desses produtos resultaram da hidrólise do grupamento éster em C-18 (PDA-J1), hidrólise do grupamento éster em C-19 (PDA-J3), adições nos grupos aldeídos do PDA-J2 de uma molécula de água (PDJ-7), uma (PDA-J4 e PDA-J4.1) ou duas de etanol (PDJ-5) e hidrólise do éster em C-18 do PDA-J2 (PDJ-6). Também foi identificado o epímero da cas J (PDA-J8).
155 Já em relação à cas O, foram identificadas nove substâncias nos PDA-O, sendo que o principal produto proposto também foi o que possui um dialdeído após a quebra do anel diacetálico C (PDA-O2). As outras estruturas propostas resultaram da hidrólise dos grupos ésteres em C-18 (PDA-O1) e C-19 (PDA-O3), adições nos grupos aldeídos do PDA-O2 de uma (PDA-O4 e PDA-O 4.1) ou duas moléculas de etanol (PDA-O5 e PDA-O5.1) e hidrólise do éster em C-7 do PDA-O2 (PDA-O5), além da hidrólise do grupamento esterificado em C-6 do PDA-O5 (PDA-O6 ou PDA-O6.1)
A cas J e O sofreram metabolização por enzimas da fração S9 nas condições analisadas (50 µg/mL, 3h, 37ºC, 4% de enzimas), mas uma grande parte delas continuou íntegra (36,5 e 36,8%, respectivamente). As duas substâncias identificadas oriundas de cada casearina já haviam sido verificadas nos PDA. As estruturas químicas propostas a partir da cas J resultaram da hidrólise do grupamento éster em C-18 (PME-J1) e da formação do epímero (PME-J2). As estruturas químicas propostas a partir da cas O resultaram da hidrólise dos grupos ésteres em 18 e C-19 da cas O (PME-O1) e formação do dialdeído após quebra do anel diacetálico C (PME-O2, majoritário). Esses fatos indicam que as casearinas também sofrem metabolização ao passarem pelo fígado.
A metabolização dos PDA nas mesmas condições gerou os PDAME, cuja composição química era a mesma dos produtos de degradação ácida em FGS obtidos anteriormente pelas casearinas correspondentes, com pequenas variações na intensidade dos picos.
Os ensaios de quantificação de NO2- permitiram inferir que assim como as
casearinas J e O, os seus produtos de degradação ácida (PDA) e metabolização hepática (PME) não inibiram (P<0,05) a produção e/ou liberação de NO em macrófagos estimulados por LPS in vitro (100 ng/mL).
156 REFERÊNCIAS
AMENI, A. Z.; LATORRE, O. A.; TORRES, L. M. B.; GÓRNIAK, S. L. Toxicity study about a medicinal plant Casearia sylvestris: A contribution to the Brazilian Unified Health System (SUS). Journal of Ethnopharmacology, v. 175, p. 9-13, 2015. ARAÚJO, E. J. F.; LOPES, D.Y. M.; FREITAS, R. M.; FERREIRA, P. M. P. Aspectos toxicológicos da planta medicinal Casearia sylvestris Swartz: revisão da literatura.
Revista de Ciências Farmacêutica Básica e Aplicada, v. 35, p. 355–361, 2014.
ARAÚJO, E. J. F.; OLIVEIRA, G. A. L.; SOUSA, L. Q.; BOLZANI, V. S.;
CAVALHEIRO, A. J.; TOME, A. R.; PERON, A. P.; SANTOS, A. G.; CITÓ, A. M. G. L.; PESSOA, C.; FREITAS, R. M.; FERREIRA, P. M. P. Counteracting effects on free radicals and histological alterations induced by a fraction with casearins. Anais da
Academia Brasileira de Ciências, v. 87, n. 3, p. 1791-1807, 2015.
ARAÚJO, E. J. F.; ALMEIDA, A. A. C.; SILVA, O. A.; COSTA, I. H. F.; REZENDE-JÚNIOR, L. M.; LIMA, F. C. A.; CAVALHEIRO, A. J.; PESSOA, C.; MORAES, M. O.; FERREIRA, P. M. P. Behavioral effects induced by antitumor cleronade diterpenes from Casearia sylvestris and in silico interactions with neuron receptors. Journal of
Ethnopharmacology, v. 198, p. 460-467, 2017.
BAILLIE, T. A. et al. Drug metabolites in safety testing. Toxicology and Applied
Pharmacology, v. 182, n. 3, p. 188-196, 2002.
BASILE, A. C.; SERTIÈ, J. A. A.; PANNIZZA, S.; OSHIRO, T. T.; AZZOLINI, C. A. Pharmacological assay of Casearia sylvestris. I: Preventive anti-ulcer activity and toxicity of the leaf crude extract. Journal of Ethnopharmacology, v. 30, p. 185-197, 1990.
BEUTLER J. A.; MCCALL, K. L.; HERBERT, K.; HERALD, D. L.; PETTIT, G. R.; JOHNSON, T.; SHOEMAKER, R. H.; BOYD, M. R. Novel cytotoxic diterpenes from
Casearia arborea. Journal of Natural Products; v. 63, p. 5, 657-61, 2000.
BOGDAN, C. Nitric oxide synthase in innate and adaptive immunity: an update. Trends in immunology, v. 36, p. 161-178, 2015.
BORGES et al. Effects of aqueous extract of Casearia sylvestris (Flacourtiaceae) on actions of snake and bee venoms and on activity of phospholipases A2.
Comparative Biochemistry and Physiology, v. 127B, p. 21-30, 2000.
BRASIL (2010). Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Farmacopeia Brasileira. 5. ed. v. 1. Brasília: Anvisa. Disponível
em:<http://www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/pdf/volume1.pdf>. Acesso em: 05 fev 2016.
BRASIL (2011). Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira. Brasília: Anvisa. 126p.
157 BRASIL (2014). Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução da diretoria colegiada - RDC n° 26, de 13 de maio de 2014. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos. Diário Oficial da União.
BUENO, P. C. P. Variabilidade química infraespecífica e dinâmica de
metabólitos secundários fenólicos e diterpênicos em Casearia sylvestris Sw. (Salicaceae): correlação metabolômica e proteômica utilizando cromatografia, espectrometria de massas, ressonância magnética nuclear e quimiometria.
2015. 255 f. Tese (Doutorado em Química) – Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2015.
BUENO, P. C. P.; PEREIRA, F.M.V.; TORRES, R.B.; CAVALHEIRO, A. J.
Development of a comprehensive method for analysing clerodane-type diterpenes and phenolic compounds from Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae) based on ultra-high performance liquid chromatography combined with chemometric tools.
Journal of Separation Science, v. 38, p. 1649-1656, 2015.
CALIXTO, J. B. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for herbal medicines (phytoterapeutic agents). Brazilian Journal of Medical and
Biological Research, v. 33, p.179-189, 2000.
CAMINHOÁ, J. M. Elementos de botânica geral e médica. Rio de Janeiro: Tipographia Nacional, 1877, v. 3, 2600 p.
CAREY, F.; SUNDBERG, R. J. Advanced Organic Chemistry. part A. 3ª edição, Spring Verlag, Nova Iorque, 1993, 787 p.
CARVALHO, P. R. F.; FURLAN, M.; YOUNG, M. C. M.; KINGSTON, D. G. I.; BOLZANI, V. da S. Acetylated DNA-damage clerodane diterpenes from Casearia
sylvestris. Phytochemistry, v. 49, n. 6, p. 1659-1662, 1998.
CARVALHO, E.S.; SANTOS, A.G.; CAVALHEIRO, A.J. Identificação de diterpenos clerodânicos em diferentes órgãos de Casearia sylvestris Swartz. Revista de
Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada. v. 30, p. 277-284, 2009.
CARVALHO, F. A. Desenvolvimento e caracterização de membranas de látex
natural de Hevea brasiliensis (Wild. ex A.Juss.) Müll.Arg. com extrato de
Casearia sylvestris Swartz e seus componentes. 2015. 168 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, 2015.
CASTRO, R. C. Caracterização por espectrometria de massas e investigação das atividades anti-inflamatória e gastroprotetora do extrato etanólico e diterpenos clerodânicos de folhas de Casearia sylvestris swartz. 2016. 152f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas). Faculdade de Ciências
158 CHEN, C. Y. Biosynthesis of di-(2-ethylhexyl) phthalate (DHEP) and di-n-butyl
phthalate (DBF) from red-alga – Bangia atropurpurea. Water Research, v.38, p. 1014-1018, 2004.
CLAUDINO, J. C.; SACRAMENTO, L. V. S.; KOCH, I.; SANTOS, H. A.; CAVALHEIRO, A. J.; TININIS, A. G.; SANTOS, A. G. Evaluation of morpho-anatomical and chemical differences between varieties of the medicinal plant
Casearia sylvestris Swartz. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 85, n. 4,
p. 1252-65, 2013.
CHI, D.S., QUI, M., KRISHNASWAMY, G., LI, C., STONE, W. Regulation of nitric oxide production from macrophages by lipopolysaccharide and catecholamines. Nitric Oxide: Biology and Chemistry, 8, 127–132, 2003.
CORDES, E. H.; BULL, H. G. Mechanism and catalysis for hydrolysis of acetals, ketals, and ortho esters. Chemical Reviews, v. 74, n. 5, p. 581-603, 1974.
DA SILVA, S. L.; CALGAROTTO, A. K.; CHAAR, J. S.; MARANGONI, S. Isolation and characterization of ellagic acid derivatives isolated from Casearia sylvestris SW aqueous extract with anti-PLA2 activity.Toxicon, v. 52, p. 655-66, 2008.
DUSSE, L. M. S.; VIEIRA, L. M.; CARVALHO, M. G. Revisão sobre óxido nítrico. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, v. 39, n. 4, p. 343-350, 2003.
EUROPEAN MEDICINES AGENCY. ICH guideline M3 (R2) on non-clinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorisation for pharmaceuticals. 2009. Disponível em
<www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/W C500002720.pdf.eu>. Acessado em: 21/Agosto/2016.
ESPÍNDOLA, L. S.; VASCONCELOS JUNIOR, J. R.; DE MESQUITA, M. L.;
MARQUIE, P.; DE PAULA, J. E.; MAMBU, L.; SANTANA, J. M. Trypanocidal activity of a new diterpene from Casearia sylvestris var. lingua. Planta Medica, v. 70, n. 11, p. 1093-1095, 2004.
ESTEVES, I.; SOUZA, I. R.; RODRIGUES, M.; CARDOSO, L. G. V.; SANTOS, L. S.; SERTIÈ, J. A. A.; PERAZZO, F. F.; LIMA, L. M.; SCHNEEDORF, J. M.; BASTOS, J. K.; CARVALHO, J. C. T. Gastric antiulcer and anti-inflamatory activities of the
essential oil from Casearia sylvestris Sw. Journal of Ethnopharmacology, v. 101, p. 191-196, 2005.
FELIPE, K. B.; KVIECINSKI, M. R.; SILVA, F. O.; BÜCKER, N. F.; FARIAS, M. S.; CASTRO, L. S. E. P. W.; GRINEVICIUS, V. M. A. S.; MOTTA, N. S.; CORREIA, J. F. G.; ROSSI, M. H.; PEDROSA, R. C. Inhibition of tumor proliferation associated with cell cycle arrest caused by extract and fraction from Casearia sylvestris (Salicaceae).
Journal of Ethnopharmacology, v. 155, p.1492-1499, 2014.
FERREIRA, V. B. N. Estudo da influência das ligações de hidrogênio
159 Química) – Universidade Federal de Santa Catarina, Santa Catarina, 2008.
FERREIRA, P.M.P.; SANTOS, A. G.; TININIS , A. G.; COSTA, P. M.; CAVALHEIRO, A. J.; BOLZANIE, V. S.; MORAES, M. O.; COSTA-LOTUFO, L. V.; MONTENEGRO, R.C.; PESSOA, C.. Casearin X exhibits cytotoxic effects in leukemia cells triggered by apoptosis. Chemico-Biological Interactions, v. 188, p.497–504, 2010.
FERREIRA, P. M. P.; COSTA-LOTUFO, L. V. MORAES, M. O.; BARROS, F. W. A.; MARTINS, A. M. A.; CAVALHEIRO, A. J.; BOLZANI, V. S.; SANTOS, A. G.;
PESSOA, C. Folk uses and pharmacological properties of Casearia sylvestris: a medicinal review. Anais da Academia Brasileira de Ciências. v. 83, n. 4, p. 1373- 1384, 2011.
FERREIRA, P. M. P.; MILITÃO, G. C. G.; LIMA, D. J. B.; COSTA, N. D. J.;
MACHADO, K. C.; SANTOS, A. G.; CAVALHEIRO, A. J.; BOLZANI, V. S.; SILVA, D. H. S.; PESSOA, C. Morphological and biochemical alterations activated by antitumor clerodane diterpenes. Chemico-Biological Interactions, v. 222, p. 112-125, 2014. FERREIRA, P. M. P.; BEZERRA, D. P.; SILVA, J. N.; COSTA, M. P.; FERREIRA, J. R. O.; ALENCAR, N. M. N.; FIGUEIREDO, I. S. T.; CAVALHEIRO, A. J.; MACHADO, C. M. L.; CHAMMAS, R.; ALVES, A. P. N. N.; MORAES, M. O.; PESSOA, C.
Preclinical anticancer effectiveness of a fraction from Casearia sylvestris and its component Casearin X: in vivo and ex vivo methods and microscopy examinations. Journal of Ethnopharmacology, v. 186, p. 270–279, 2016.
FOOD AND DRUG ADMINISTRATION. Guidance for industry – Safety Testing of Drug Metabolites. 2008. Disponível em:
<http://www.fda.gov/OHRMS/DOCKETS/98fr/FDA-2008-D-0065-GDL.pdf> Acessado em: 21/Agosto/2016.
GARG, B.; BISHT, T.; LING, T. C. Sulfonated graphene as highly efficient and
reusable acid carbocatalyst for the synthesis of ester plasticizers. The Royal Society of Chemistry, v. 4, p. 57297–57307, 2014.
GIBBONS, S., GRAY, A.I., WATERMAN, P.G. Clerodane diterpenes from the bark of
Casearia tremula. Phytochemistry, v. 41, n. 2, p. 565-70, 1996.
GREENHOUGH, A.; SMARTT, H. J. M.; MOORE, A. E.; ROBERTS, H. R.;
WILLIAMS, A. C.; CHRISTOS, P.; KAIDI, A. The COX-2/PGE2 pathway: key roles in
the hallmarks of cancer and adaptation to the tumour microenvironment. Carcinogenesis, v. 30, n. 3, p. 377-386, 2009.
GROSSER, T.; SMYTH, E. M.; FITZGERALD, G. A. Anti-inflammatory, antipyretic, and analgesic agents; pharmacotherapy of gout. In: BRUNTON, L.; CHABNER, B.; KNOLLMAN, B. Goodman and Gilman's: the pharmacological basis of therapeutics. 12. ed. New York: McGraw-Hill, 2011. cap. 34.
ITOKAWA, H.; TOTSUKA, N.; TAKEYA, K.; WATANABE, K.; OBATA, E. New antitumor principles, casearins A-F, from Casearia sylvestris Sw. (Flacourtiaceae).
160
ITOKAWA, H.; TOTSUKA, N.; MORITA, H.; TAKEYA, K.; IITAKA, Y.; SCHENKEL, E. P.; MOTIDOME, M. Antitumor principles from Casearia sylvestris Sw.
(Flacourtiaceae), structure elucidation of new clerodane diterpenes by 2-D NMR spectroscopy. Chemical Pharmaceutical Bulletin, v. 38, n. 12, p. 3384-3388, 1990. KHAN, M. R.; GRAY, A. I.; WATERMAN, P. G. Clerodane diterpenes from Zuelania
Guidonia stem bark. Phytochemistry, v. 29, n. 9, p. 2939-2942, 1990.
KHATIWORA, E. et al. Isolation and characterization of dibutyl phthalate from
Ipomoea carnea stem and its quantification by HPTLC. Journal of Pharmacy
Research, v. 4, n. 10, p. 3264-3265, 2011.
KHATIWORA, E. et al. Isolation and characterization of substituted dibutyl phthalate from Ipomoea carnea stem. Der Pharma Chemica, v. 5, n. 5, p. 5-10, 2013.
KLEIN, R.M.; SLEUMER, H.O. Flora ilustrada catarinense: flacourtiáceas. Itajaí: FLAC. p. 78-87, 1984.
LANE TE, WU-HSIEH BA, HOWARD DH. Gamma interferón cooperates with lipopolysaccharide to activate mouse splenic macrophages to an antihistoplasma state. Infection and Immunity, v. 61, n. 4, 1468–73, 1993.
LOHMANN, W. KARST, U. Biomimetic modeling of oxidative drug metabolism. Analytical and Bionalytical Chemistry. v. 391, n 1, p. 79-96, 2008.
MACHADO, M. M. Perfil fitoquímico e avaliação dos principais efeitos biológicos e imunológicos in vitro da Euphorbia Tirucalli. 2007. 105 f.
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2007.
MAISTRO, E. L.; CARVALHO, J. C.; MANTOVANI, M. S. Evaluation of the genotoxic potential of the Casearia sylvestris extract on HTC and V79 cells by the comet assay.
Toxicology In Vitro, v. 18, n. 3, p. 337-342, 2004.
MANABE, S.; NISHINO, C. Stereochemistry of cis-clerodanes diterpenes.
Tetrahedron, v. 42, n. 13, p. 3461-3470, 1986.
MARQUETE, R. 2001. Reserva ecológica do IBGE (Brasília-DF): Flacourtiaceae. Rodriguésia, v. 52, n. 80, p. 5-16, 2001.
MARQUETE, R.; VAZ, A.M.S.F. O gênero Casearia no estado do Rio de Janeiro.
Rodriguésia. n. 58, v. 4, p. 705-738, 2007.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, v. 65, n. 1-2, p. 55–63, 1983.
MESSIANO, G. B. et al. In vitro metabolism study of the promising anticancer agent the lignan (−)-grandisin. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v.
161 72, p. 240–244, 2013.
MORITA et al. Structures and cytotxic activity relationship of casearins, new clerodane diterpenes from Casearia sylvestris Sw. Chemical Pharmaceutical Bulletin, v. 39, n. 3, p. 693-697, 1991.
MORRINSON, R. T.; Boyd, R. N. Química Orgânica, 13ª ed. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 1996.
MORTELMANS, K.; ZEIGER, E. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutation Research, v. 455, n. 2000, p. 29-60, 2008.
MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, v. 65, n. 1-2, p. 55–63, 1983.
NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products, v. 79, n. 3, p. 629-661, 2016.
OBERLIES et al. Novel bioactive clerodane diterpenoids from the leaves and twigs of
Casearia sylvestris. Journal of Natural Products, v. 65, n. 2, p. 95-9, 2002.
OLIVEIRA, A.M.; SANTOS, A.G.; SANTOS, R.A.; CSIPAK, A.R.; OLIVATO, C.; DA SILVA, I.C.; FREITAS, M.B.; BASSI, C.L.; CAVALHEIRO, A.J.; BOLZANI, V.S.; SILVA, D.H.; SAKAMOTO-HOJO, E.T.; TAKAHASHI, C.S. SOARES, C.P. Ethanolic extract of Casearia sylvestris and its clerodane diterpen (caseargrewiin F) protect against DNA damage at low concentrations and cause DNA damage at high concentrations in mice‟s blood cells. Mutagenesis. v. 24, n. 6, p. 501-6, 2009. PAVIA, D. L.; LAMPMAN, G. M.; KRIZ, G. S.; VYVYAN, J. R. Introdução à Espectroscopia. São Paulo: Tradução da 4ª edição norte-americana. Revisão técnica Paulo Sério Santos. Tradução Pedro Barros. Cengage Learning, 2010. PEARSON, P. G.; WIENKERS, L. C. Handbook of Drug Metabolism. 2ª Ed. Information Healthcare USA, p. 616 2008.
PEREIRA, F. G.; MARQUETE, R.; CRUZ, L. O.; CALDEIRA-DE-ARAUJO, A.; MANSUR, E.; MOREIRA, D. L. DNA damages promoted by the essential oil from leaves of Casearia sylvestris Sw. (Salicaceae). Journal of Medicinal Plants Research, v. 10, n. 44, p. 818-822, 2016.
PIERRI, E. Avaliação das atividades cicatrizante e anti-inflamatória de Casearia
sylvestris Swartz em animais e identificação dos marcadores químicos. 2013.
Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) – Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade Estadual Paulista-UNESP, Araraquara.
PIERRI, E.; CASTRO, R. C.; VIZIOLI, E. O.; FERREIRA, C. M. R.; CAVALHEIRO, A. J.; TININIS, A. G.; MAN CHIN, C.; SANTOS, A. G. Anti-inflammatory action of
162 Journal of Pharmacognosy, 2017.
PRAKASH, C. V. S.; HOCH, J. M.; KINGSTON, D. G. I. Structure and
stereochemistry of new cytotoxic clerodane diterpenoids from the bark of Casearia
lucida from the Madagascar rainforest. Journal of Natural Products, v. 65, n. 2, p.
100-107, 2002.
PRIETO, A. M.; DOS SANTOS, A. G.; OLIVEIRA, A. P. S.; CAVALHEIRO, A. J.; SILVA, D. H. S.; BOLZANI, V. S.; VARANDA, E. AP.; SOARES, C. P. Assessment of the chemopreventive effect of casearin B, a clerodane diterpene extracted from
Casearia sylvestris (Salicaceae). Food and Chemical Toxicology, v. 53, p. 153-
159, 2013.
RAO, G. N.; KUMAR, P. M.; DHANDAPANI, V. S.; KRISHNA, T. R.; HAYASHI, T. Constituents of Cassia auriculata. Fitoterapia, v. 71, n. 1, p. 82-83, 2000. RASLAN, D. S.; JAMAL, C. M.; DUARTE, D. S.; BORGES, M. H.; DE LIMA, M. E. Anti-PLA2 action test of Casearia sylvestris Sw. Bolletin Chimie et Farmacie, v.
141, n. 6, p. 457-460, 2002.
ROBINSON, M. M.; ZHANG, X. The world medicines situation (Traditional medicines: global situations, issues and challenges). 3rd ed. Word Health Organization, Geneva, 2011.
RUPPELT, B. M.; PEREIRA, E. F. R.; GONÇALVES, L. C.; PEREIRA, N. A.
Pharmacological screening of plants recommended by folk medicine as anti-snake venom – I. Analgesic and anti-inflammatory activities. Memórias do Instituto Oswado Cruz, v. 86, n. 2, 203-205, 1991.
SANTOS et al. Clerodane diterpenes from leaves of Casearia sylvestris Swartz. Química Nova, v. 30, n. 5, p. 1100-1103, 2007.
SAKAE, T. M.; BALDISSEROTTON, C. M.; BIANCHINI, N. Comparação da casearia silvestris com indometacina e placebo na diminuição de edema em pata traseira de Ratos Wistar, induzido pelo uso de carragenina. Arquivos Catarinenses de
Medicina, v. 34, p. 33-36, 2005.
SANTOS, J. L. 2006. Planejamento, síntese e avaliação farmacológica de compostos híbridos potencialmente ativos para o tratamento da anemia
falciforme. 2006. 220 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Curso de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências
Farmacêuticas – Universidade Estadual Paulista-UNESP, Araraquara.
SANTOS, A. G. Identificação dos princípios ativos antiulcerogênicos do extrato das folhas de Casearia sylvestris: contribuição para o desenvolvimento de um fitoterápico. 2008. 335 f. Tese (Doutorado em Química) – Curso de Pós-graduação em Química, Instituto de Química – Universidade Estadual Paulista-UNESP,
Araraquara.
163 from leaves of Caseria sylvestris: evaluation of cytotoxicity against normal and tumor human cells. Chemistry and Biodiversity, v. 7, n. 1, p. 205-215, 2010.
SASSIOTO et al. Efeito da Casearia sylvestris no reparo ósseo com matriz óssea bovina desvitalizada em ratos. Acta Cirúrgica Brasileira, v. 19, n. 6, p. 637-641, 2004.
SCHNEIDER, N. F.; MOURA, N. F.; COLPO, T.; FLACH, A. Composição química e atividade antimicrobiana do oleo volátil de Casearia sylvestris Swart. Revista Brasileira de Farmácia, v. 87, n. 4, p. 112-114, 2006.
SILVA, F. A.; BAISCH, A. L. M.; OLIVEIRA, B.; BATTASTINI, A. M.; TORRES, F.; RACOSKI, G.; SILVA, E. S.; ALAM, M. F.; APOLINARIO, J. C. G.; LAPA, A. J. Estudos farmacológicos preliminares dos extratos de Casearia sylvestris Swartz.
Acta Amazonica, v. 18, n. 1-2, p. 219-229, 1988.
SILVA, F. B.; ALMEIDA, J. M.; SOUSA, S. M. G. Natural medicaments in
endodontics – a comparative study of the anti-inflammatory action. Brazilian Oral Research. v. 18, n. 2, p. 174-179, 2004.
SILVA, A. C.; BALZ, D.; SOUZA, J. B. D.; MORSCH, V. M.; CORRÊA, M. C.;
ZANETTI, G. D.; MANFRON, M. P.; SCHETINGER, M. R. C. Inhibition of NTPDase, 5`-nucleotidase, Na+/K+-ATPase and acetylcholinesterase activities by subchronic treatment with Casearia sylvestris. Phytomedicine, v. 13, p. 509-514, 2006.
SILVA, S.L.; CHAAR, J.S.; FIGUEIREDO, P.M.S.; YANO, T. Citotoxic evaluation of essential oil from Casearia sylvestris Sw on human cancer cells and erythrocytes.
Acta Amazonica, v. 38, n. 1, p. 107-18, 2008.
SIMÕES, C.M.O; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; PALAZZO de MELLO, J.C.; MENTZ, L.A.; ROS PETROVICK, P. Farmacognosia: do produto natural ao
medicamento. 7 ed. Porto Alegre/Florianópolis: Ed. Artmed. p. 833, 2017.
SNYDER, L. R.; KIRKLAND, J. J.; DOLAN, J. W. Introduction to modern liquid chromatography. 3ª edição, New York: John Wiley & Sons, 2010. 912 p.
SOLOMONS, T. W. Graham; Fryhle, Craig B. Química Orgânica, vol. 1 e 2. 9ª edição, LTC – Livros Técnicos e Científicos, Editora S. A., Rio de Janeiro, p. 679, 2001.
STEHMANN, R. S.; SOBRAL, M. Biodiversidade no Brasil. In. SIMÕES, C.M.O; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; PALAZZO de MELLO, J.C.; MENTZ, L.A.; ROS PETROVICK, P. Farmacognosia: do produto natural ao medicamento. 7 ed.
Porto Alegre/Florianópolis: Ed. Artmed. p. 1, 2017.
TESTA, B. KRAMER, S. D. The biochemistry of drug metabolism – na introduction: part 1. Principles and overview. Chemistry & Biodiversity. v. 3, n. 10, p. 1053-1101, 2006.
164 TORRES, R. B.; YAMAMOTO, K. Taxonomia das espécies de Casearia Jacq.
(Flacourtiaceae) do estado de São Paulo. Revista Brasileira de Botânica, n. 9, p. 239-258, 1986.
UNITED STATES PHARMACOPEIA AND NATIONAL FORMULARY. ed. 34. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, 2015.
VIJAYAKUMAR, E. K. S.; BAL-TEMBE, S.; JOSHI, K. S.; DEORE, V. B. Esculentins A & B, two new diterpenes from Casearia esculenta. Indian Journal of Chemistry, Section B: Organic Chemistry Including Medicinal Chemistry, v. 41B, n. 12, p. 2706-2708, 2002.
XIA, L.; JUNYING, Z.; WENYUAN, G.; HAIYANG, W. Study on chemical
composition, anti-inflammatory and anti-microbial activities of extracts from Chinese pear fruit (Pyrus bretschneideri Rehd.). Food and Chemical Toxicology, v. 50, p. 3673-3679, 2012.
XIA, L.; GUO, Q; TU, P.; CHAI, X. The genus Casearia: a phytochemical and pharmacological overview. Phytochemistry Reviews, v. 14, p. 99-135, 2015. WANG W, LI X-C, ALI Z AND KHAN IA. Two new C13 nor-isoprenoids from the leaves of Casearia sylvestris. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, v. 57, 636-638. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 2009a.
WANG W, ZHAO J, WANG Y-H, SMILLIE TA, LI X-C AND KHAN IA. Diterpenoids from Casearia sylvestris. Planta Medicinal, v. 75, 1476-1481, 2009b.
WANG W, ALI Z, LI X-C AND KHAN IA. Neolignans from the Leaves of Casearia
sylvestris Swartz. Helvetica Chimica Acta, v. 93, 139-146, 2010.
WYREPKOWSKI, C. C. Estudo Químico e Atividades Mutagênica e Antirradicalar de
Caesalpinia ferrea. 2014. 144 f. Tese (Doutorado em Química) – Curso de
Pós-graduação em Química, Instituto de Química – Universidade Estadual Paulista-UNESP, Araraquara.
