INDICADORES DA EFICIÊNCIA REPRODUTIVA DO GARANHÃO Fernando Andrade SOUZA1*, Igor Frederico CANISSO2, Ticiano Guimarães LEITE1,
Felipe Albano do Carmo PATRÍCIO3, Abisai D`OLIVEIRA-SOUSA4, Márcio Gianordoli Teixeira GOMES1.
RESUMO
A eficiência reprodutiva obtida no rebanho é dependente da fertilidade de ambos os progenitores. Entretanto, tende-se a atribuir maior responsabilidade pelos baixos índices de fertilidade ao final da estação de monta à fêmea, negligenciando-se a avaliação do reprodutor frente a estes resultados. Contudo, deve-se conferir maior importância às variáveis relacionadas ao macho, as quais podem contribuir diretamente para a determinação de menores taxas de fertilidade. Dentre essas variáveis destaca-se a qualidade seminal, sendo primariamente avaliada pela motilidade e morfologia espermática. No entanto, atualmente empregam-se exa-mes mais minuciosos, como: identificação de fatores de crescimento no plasma seminal, razão colesterol/fosfolipídios na membrana espermática, integridade das membranas acrossomal, mitocondrial e espermática exigindo, desta maneira, um conhecimento mais abrangente, por parte do examinador, para que se possa ter um maior poder diagnóstico e preditivo da fertilidade do reprodutor a ser utilizado. Termos para indexação: Fertilidade, IGF-I, sondas fluorescentes.
INDICATORS OF REPRODUCTIVE EFFICIENCY OF STALLION ABSTRACT
Reproductive efficiency in the herd depends on the fertility of both mates. However, we tend to blame low fertility at the end of the breeding season to the female, ne-glecting to assess the male facing these results. However, more emphasis should be given on variables related to the male which can contribute directly to the de-termination of lower fertility rate. Among these variables, sperm quality is pointed out, which is primarily evaluated by motility and morphology. However, nowadays more detailed examinations are employed, such as identification of growth factors in seminal plasma, cholesterol/phospholipids ratio in the sperm membrane, acroso-me, mitochondrial and sperm membrane integrity, requiring a more comprehensive knowledge on the part of the examiner, who may have a greater diagnostic and predictive power of the fertility of the breeder to be used.
Index terms: Fertility, IGF-I, fluorescent probes
1* Médico Veterinário, Doutorando em Ciência Animal, UFMG; Rua Fortunato Bandeira, 1011, Nova Imperatriz, Imperatriz/
MA, CEP: 65907-010. [email protected] *Autor para correspondência
1 Médico Veterinário, Doutorando em Ciência Animal, UFMG 2 Médico Veterinário, Mestre Zootecnia;
3 Médico Veterinário, Mestrando em Ciência Animal, UFMG; 4 Médico Veterinário, Doutor, Professor Adjunto III – UEMA.
INTRODUÇÃO
A espécie equina possui um dos mais baixos índices de fertilidade, quando com-parada com as demais espécies domésti-cas, independente da forma de utilização do sêmen, sendo a fresco, resfriado, congela-do ou por monta natural (GINTHER et al., 1985). Normalmente, tende-se a atribuir a responsabilidade por esses baixos resulta-dos à fêmea (SOUZA, 2007). No entanto, de acordo com Amann (2006), a avaliação da fertilidade em equinos tem sido realiza-da de forma incorreta, principalmente na maneira como os dados são coletados e analisados, comprometendo uma avalia-ção mais criteriosa, principalmente quando se exclui o macho como fonte de variação (FERNANDES e PIMENTEL, 2002), pois um único garanhão é comumente exigido para a cobertura de um grande número de fêmeas dentro do plantel, podendo, desta maneira, comprometer drasticamente a taxa de fertilidade do rebanho (PALHARES, 1997).
O macho pode ter sua função repro-dutiva comprometida por diversos fatores, desde disfunções sistêmicas a locais, podendo estas últimas localizarem-se no próprio trato reprodutivo ou em outras regiões, como nos cascos que, ocasional-mente, podem impedir a monta da fêmea ou a coleta de sêmen, caracterizando a impotência coeundi. Contudo, o macho pode apresentar disfunções que compro-metam somente as células espermáticas, impotência generandi, tornando mais difícil o diagnóstico de baixa taxa de fertilidade no rebanho, requerendo do médico veterinário maiores conhecimentos quanto aos aspec-tos andrológicos, não se limitando apenas aos clínicos (BICUDO et al., 2007).
Dentro da avaliação andrológica do ga-ranhão destacam-se os métodos clássicos de avaliação do sêmen que são baseados na concentração espermática, na motilida-de progressiva e na morfologia espermática
(AMANN, 2006). No entanto, apesar destes métodos serem eficazes no diagnóstico, ainda se mostram insuficientes para a acu-rada predição da fertilidade, devido ao fato de somente amostras com baixa qualidade serem destacadas (GADEA, 2005). Assim, objetivou-se nessa revisão de literatura descrever os principais aspectos que po-dem auxiliar no diagnóstico e predição da fertilidade do garanhão.
ASPECTOS CLÍNICOS: EFEITO DA IDADE NA FERTILIDADE DO GARANHÃO
Considerando as diferenças de manejo às quais os animais estejam submetidos, no estudo da relação entre fertilidade e qualidade seminal na espécie equina, os índices mais elevados de concepção e, por consequência, maior eficiência reproduti-va podem ser esperados na presença de maiores percentuais de espermatozoides normais no ejaculado (FERNANDES e PI-MENTEL, 2002). A qualidade espermática se sobressai, devido ao espermatozoide sofrer diferentes processos no trato genital feminino (hiperativação, capacitação e/ou reação acrossômica) que determinam sua manutenção no aparelho genital da fêmea e a fecundação do ovócito (TROEDSSON et al., 1998).
Em geral, garanhões com menos de 3 ou mais de 14 anos apresentam baixa qualidade seminal, como consequência da variação fisiológica no funcionamento dos túbulos seminíferos (CHENIER et al., 2007). Os testículos do garanhão desenvolvem-se até, aproximadamente, 6 anos de idade, fase que coincide com a estabilização da produção espermática. Assim, garanhões jovens apresentam menor produção de espermatozoides totais em relação a ga-ranhões adultos. Já gaga-ranhões velhos são mais propensos a produzirem maiores per-centuais de espermatozoides com anoma-lias morfológicas em relação a garanhões
adultos, refletindo na taxa de gestação por ciclo que é, aproximadamente, 8% menor do que a de animais com idades entre 3 e 14 anos (VanBUITEN et al., 2003).
É esperado declínio na fertilidade de garanhões com idade superior a 10 anos, sendo que aos 14 anos de idade, alguns animais poderão atingir a senilidade repro-dutiva e, por isso, devem ser submetidos ao monitoramento da qualidade seminal e da quantidade de montas ou saltos realizados. Porém, deve-se ressaltar que existem ga-ranhões, que nesta faixa etária ou superior, apresentam produção espermática normal (DOWSETT e KNOTT, 1996).
O envelhecimento paterno, seme-lhante ao que ocorre com o avançar da idade na fêmea (oócito de baixa quali-dade), pode acarretar maior número de aberrações cromossômicas e desordens genéticas nas células espermáticas (HERMANN et al., 2000). Embora não exista correlação nas aberrações numéri-cas que possam onuméri-casionar aneuploidias, a frequência de estruturas cromossômicas anormais nos espermatozoides aumenta com a idade.
Os efeitos da idade sobre a fertilidade de garanhões mais velhos ainda não foram totalmente elucidados, mas inclui redução na produção espermática associada à mo-tilidade progressiva, degeneração testicular com potencial comprometimento da libido e da capacidade de monta (McDONNELL, 2005). Pesquisas sugerem que a causa da falha reprodutiva nesses animais se inicia precocemente, em nível testicular e, então, se difunde para as duas áreas do cérebro envolvidas na regulação da reprodução, hipotálamo, na região produtora de GnRH, e na adenohipófise, região produtora de gonadotrofinas (ROSER, 2000), demons-trando o acometimento geral da função endócrina ligada ao eixo reprodutivo em animais senis (SOUZA et al., 2008).
ASPECTOS BIOQUÍMICOS: EFEITO DA IGF-I LOCAL NA QUALIDADE DO PLASMA SEMINAL
A espermatogênese é dependente da normalidade funcional do eixo hipotalâmico--hipofisário-testicular, que envolve meca-nismos endócrinos clássicos e modulação parácrina e autócrina (CHENIER et al., 2007). Segundo Roser (2001), os testículos do garanhão são modulados pelo sistema parácrino/autócrino. No entanto, mais es-tudos se fazem necessários para determi-nar o envolvimento dos fatores locais que permitam a interação célula a célula que corroborem com essa hipótese.
Estudos em outras espécies indicam que a função reprodutiva normal depende dos fatores de crescimento locais, além das gonadotrofinas, dos esteróides, da vasopressina, ocitocina, interleucina 1, dentre outros. Desta forma, leva-se em consideração que o ambiente testicular possui uma rede intratesticular de regula-dores, requintadamente cronometrada e regionalizada, que pode participar primeiro no desenvolvimento da gônada e mais tar-de na iniciação e manutenção da função testicular, podendo, em parte, responder pela qualidade seminal. Contudo, ao invés da dependência total do clássico controle hormonal intracelular, esses fatores regula-dores envolvem comunicações inter, intra e celular ambiental favorecendo uma melhor interação entre os mesmos. Dentre estes fatores reguladores destacam-se os de crescimento semelhante à insulina (IGF--I), seus receptores e as suas proteínas ligadoras (IGFBPs), que exercem papel essencial na regulação do crescimento e do desenvolvimento celular (GNESSI et al., 1997).
Os fatores de crescimento são poli-peptídios que funcionam como modula-dores das células em crescimento e em diferenciação. Especificamente, o fator de crescimento semelhante à insulina do tipo
I e II (IGF-I e -II) são hormônios ubíquos que exercem potente ação mitogênica, metabólica e de diferenciação sobre as células do corpo (JONES e CLEMMONS, 1995). Considera-se que os valores de IGF-I variam com a fertilidade em algumas espécies, inclusive a humana, sendo possí-vel utilizá-los como marcadores do declínio da fertilidade (PARK et al., 2010). Todavia, não há estudos demonstrando tal relação no garanhão e, sendo nesta espécie, mais correlacionado com o início da puberdade (HESS e ROSE, 2001).
Esta cadeia de multicomponentes moleculares tem sido identificada nos tes-tículos de machos, estando envolvida na di-ferenciação e função das células de Leydig. Sua ação é estimular a esteroidogênese por aumentar a densidade de receptores para gonadotrofinas e a expressão de enzimas chave na esteroidogênese. Sendo, conse-quentemente, implicados como importantes fatores na espermatogênese (SPITERI--GREECH e NIESCHLAG, 1993).
As funções testiculares da IGF-I pare-cem ser servidas pela sua produção local, sem uma contribuição endócrina. Isto su-gere fortemente que a IGF-I testicular tem um papel determinante no desenvolvimento e diferenciação das células de Leydig e das células germinativas, e que a falta dessa substância no testículo pode induzir infertilidade (GNESSI et al., 1997). Cor-roborando com esta idéia, Wang e Hardy (2004) determinaram que o IGF-I aumenta a proliferação de precursores mesenqui-mais e a diferenciação dessas células em células de Leydig. Outro exemplo que pode ser citado, segundo estes mesmos autores, é o de que o número de células de Leydig e de enzimas esteroidogênicas específicas a estas células são diminuídas em camundongos que são nulos para IGF-I. Segundo Roser (2001), também existe produção de IGF-I no testículo de garanhões, tanto pelas células de Leydig quanto pelas de Sertoli.
Contudo, trabalhos feitos com ratos de-monstraram os efeitos aditivos do tratamento com LH e IGF-I sobre o número de células testiculares, indicando que esses dois hor-mônios atuam sobre essas células usando caminhos de sinalização distintos. A IGF-I autorregula os receptores de LH e a secreção de testosterona, enquanto a testosterona, em retorno, autorregula os receptores de IGF-I e a produção para este hormônio pelas células de Leydig (WANG e HARDY, 2004). Desta forma, o IGF-I circulante pode inicialmente au-torregular a produção de testosterona a qual, em retorno, estimula a secreção de IGF-I e o estabelecimento da retroalimentação positiva entre IGF-I e a testosterona secretada nas células de Leydig. A forte associação da IGF-I circulante com o tamanho testicular sugere que este fator de crescimento pode ter efeito mitogênico direto sobre os testículos, poden-do regular não somente a esteroipoden-dogênese testicular, mas também a proliferação celular em determinada fase da vida do animal (BRI-TO et al., 2007).
Segundo Ritzen (1983), uma comunica-ção parácrina entre as células de Sertoli e as células germinativas nos estádios iniciais de diferenciação via IGF-I é muito provável de ocorrer. Os receptores de ligação para IGF-I são localizados sobre as células de Leydig, Sertoli, espermatócitos e espermátides. Sen-do a IGF-I testicular produziSen-do principalmente pelas células de Sertoli por estimulação do FSH (RITZEN, 1983; JONES e CLEMMONS, 1995).
A produção de IGF-I pela cultura das células de Sertoli e Leydig sugere que a IGF-I pode atuar como um fator de desenvolvimen-to e diferenciação para a espermadesenvolvimen-togônia, o espermatócito e a espermátide. A expressão dos ligantes de IGF-I e -II pelas células de Sertoli e Leydig e a identificação de seus receptores sobre estas células e sobre esper-matogônias, espermatócitos e espermátides indica que estes fatores de crescimento são reguladores da função testicular (HENRI-CKS et al., 1998).
Além disso, Henricks et al. (1998) avaliaram a presença de IGF no plasma seminal e determinaram a expressão de receptores de IGF-I nos espermatozoides ejaculados e sua ação sobre a motilidade espermática. Estes autores demonstraram que a IGF-I pode interagir diretamente com o seu receptor presente no espermatozoi-de. Esta interação de ligantes e receptores pode aumentar a motilidade e a velocidade linear da célula espermática, sugerindo que a IGF-I, possivelmente, possua papel regulatório nos eventos da pré-fecundação, como demonstrado pelo trabalho de Colom-bo e Naz (1999) que constataram diferença significativa na concentração de IGF-I total no plasma seminal humano entre grupos de homens férteis e imunoinférteis.
A presença do receptor de IGF-I sobre os espermatozoides e a presença deste hormônio no sêmen e a sua habilidade em estimular a motilidade espermática provê evidências de que o sistema IGF está envol-vido também na fecundação (HENRICKS et al., 1998). Uma vez que o receptor de IGF possui atividade tirosina quinase e seu ligante está presente no plasma seminal, o sistema IGF-I pode estar envolvido no sinal de transudação, conduzindo ao aumento da motilidade, a capacitação espermática e exocitose acrossômica (GUPTA, 2005), apontando, desta forma, para o papel cru-cial de IGF-I na avaliação andrológica do reprodutor, podendo a concentração deste hormônio no plasma seminal ser o ponto determinante do melhor ou pior estado reprodutivo de certo garanhão (YOON e ROSER, 2010).
Além da atuação da IGF-I na qualida-de seminal, especula-se que a alteração da razão entre colesterol e fosfolipídios na membrana plasmática possa impedir a fecundação do oócito, por interferir no processo de capacitação espermática e na reação acrossômica. Aparentemente, a elevação da razão colesterol/fosfolipídio, tanto na membrana espermática quanto no
plasma seminal, promove falhas da reação acrossômica em garanhões, por acarretar mudanças bioquímicas que envolvem os lipídios de membrana e, consequentemente, alteração da permeabilidade e fluidez da membrana espermática (BRINSKO et al., 2007).
Os espermatozoides de garanhões subférteis podem também diferir em suas propriedades de superfície em relação às moléculas receptoras da zona pelúcida, ou podem diferir quanto à transdução da cascata de eventos relacionada aos re-ceptores, sendo que essas anomalias po-dem ser intrínsecas a uma sub-população espermática, ou a todo o ejaculado. Sua origem pode advir da espermatogênese, da maturação epididimária ou da alteração da composição do fluido seminal (MEYERS et al., 1996).
Além disso, acredita-se que há proteí-nas, no plasma seminal, que são associa-das à fertilidade. Alguns estudos sugerem que há uma possível relação entre essas proteínas plasmáticas seminais e a fertilida-de em garanhões (KARESKOSKI e KATILA, 2008), destacando-se as proteínas com afinidade à heparina.
Essas proteínas ligam-se a superfície dos espermatozoides na ejaculação por sua interação com os fosfolipídios de membrana de colina, uma vez que esses fosfolipídios são substratos da fosfolipase-A2, enzima chave implicada na reação acrossômica (MANJUNATH et al., 1994). Estes autores, trabalhando com bovinos, encontraram que as proteínas do plasma seminal bo-vino (BSPs) são co-localizadas com as fosfolipases-A2, sendo possível que estas interajam diretamente com as enzimas das fosfolipases-A2 ligadas à membrana. Estas enzimas podem ser estimuladas ou inibidas, dependendo da concentração local das BSPs. Ao regular a atividade das enzimas, as BSPs podem modular a composição li-pídica da membrana dos espermatozoides submetidos à capacitação. Alternativamente,
uma vez que as BSPs cobrem a superfície deste tipo de célula na ejaculação, via inte-ração específica com os fosfolipídios colina, elas podem limitar a disponibilidade desses fosfolipídios para ação extracelular ou para a fosfolipase-A2 ligada à membrana.
Em equinos, Brandon et al. (1999) uti-lizando análise eletroforética bidimensional do plasma seminal, revelaram que 14 pro-teínas foram comuns em todos os animais pesquisados. Quatro dessas proteínas (SP-1, SP-2, SP-3 e SP-4) foram correlacio-nadas significativamente (P <0,05) com a pontuação atribuída a cada condição repro-dutiva, sendo que a análise de regressão das densidades ópticas destas proteínas com o escore do estado reprodutivo de cada animal indicou que a SP-l (72 kDa, pI 5,6) foi positivamente correlacionada com a fertilidade (r2 = 0,706; P <0,05), enquanto o
SP-2 (75 kDa, pI 6,0), SP-3 (18 kDa, pI 4,3), e SP-4 (16 kDa, pI 6,5) foram correlacio-nadas negativamente (P <0,05, r2= -0,762,
-0,730, -0,775, respectivamente). Estes mesmos autores, utilizando análise por Western blot da proteína SP-l, indicaram haver uma homologia antigênica entre esta proteína com a de 55kDa com afinidade à heparina encontrada no plasma seminal bovino apresentada no estudo realizado por Killian et al. (1993). Isto sugeriu que estas duas proteínas podem ter um papel fisiológico semelhante e, portanto, com propriedades biológicas comuns. Os resul-tados indicaram que a análise de proteínas do plasma seminal do garanhão pode ser usada como um indicador da capacidade fecundante, onde a identificação dessas proteínas no plasma seminal pode levar a uma melhor compreensão sobre a natureza da subfertilidade ou infertilidade no cavalo. ASPECTOS FÍSICOS DAS CÉLULAS ESPERMÁTICAS: MARCADORES DA QUALIDADE ESTRUTURAL
Normalmente, a maioria dos testes
empregados para o sêmen equino avalia somente uma pequena amostra quanto a uma ou poucas funções da célula espermá-tica em determinado momento (SANTOS, 2003a). Testes empregados de forma isolada têm se mostrado pouco eficazes, devido ao fato de os espermatozoides se apresentarem como uma célula com múl-tiplos compartimentos, e com diferentes funções (GRAHAM, 1996). Desta maneira, novos exames têm sido desenvolvidos para avaliar o estado acrossomal e mitocondrial, a capacitação espermática e a integridade do DNA (SANTOS, 2003b), discriminando minuciosamente o estado ultraestrutural da célula espermática.
Dentre as novas técnicas utilizadas, destacam-se as sondas fluorescentes. Segundo o método descrito por Harrison e Vickers (1990), realizado em coelhos, onde foram utilizados dois fluorocromos: diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) e iodeto de propídio (IP), sendo adaptada e empregada na rotina, de acordo com os padrões estabelecidos por diversas equipes de pesquisa no mundo. Essa metodologia tem permitido avaliação detalhada da inte-gridade estrutural da membrana plasmática e acrossomal podendo, assim, discernir estruturas intactas e lesadas.
O emprego de sondas fluorescentes na andrologia permite avaliar a integridade e a função dos compartimentos da célula espermática (CELEGHINI, 2005), onde os espermatozoides corados com fluores-cência podem ser avaliados quanto aos aspectos morfológicos e funcionais, sem a interferência do meio extracelular (GON-ZALEZ, 2004), tornando a fluorescência um indicador sensível e específico do estado de certas moléculas (oxidadas x reduzidas, ionizadas x não ionizadas, livres x ligadas), podendo ser aplicada como um meio para medir mudanças metabólicas em células vivas (HAUGLAND, 2001).
A determinação da integridade da membrana pode ser feita com a utilização
de corantes fluorescentes (sondas) imper-meáveis à membrana, com afinidade ao DNA, onde as células não coradas são consideradas com membrana plasmática intacta (RAPHAEL, 2007). O Hoeschst 33258 (H258), YoPro-1, iodeto de propídio (PI), homodímero de etidio (EthD-1), To-Pro-3 e TOTO são exemplos de sondas que já foram testadas em células espermáticas (TARDIF et al., 1998; RAPHAEL, 2007; SIEME, 2009).
Devido à alta toxicidade do brometo de etídio, principalmente para quem o ma-nipula, sua aplicação tem sido restringida. Porém, PI, um corante fluorescente com propriedades similares, passou a ser utiliza-do. Esta sonda possui afinidade ao DNA e cora em vermelho o núcleo de células com membrana plasmática lesada (CELEGHINI, 2005; SIEME, 2009).
É possível utilizar simultaneamente essas sondas, como por exemplo, a com-binação do SYBR-14 ou CFDA com PI ou EthD-1, para detectar células com mem-brana plasmática intacta e lesada, respec-tivamente. Esta técnica de coloração dupla classifica a população de espermatozoides em três categorias: 1) CFDA ou SYBR-14 (+) significa que as células espermáticas estão vivas e emitem fluorescência verde; 2) PI (+) e CFDA ou SYBR-14 (-), esper-matozoides mortos com núcleo emitindo fluorescência vermelha; 3) células esper-máticas lesadas, emitindo fluorescência verde e vermelha, PI (+) e CFDA ou SYBR-14 (+) (SILVA e GADELLA, 2006).
Já a integridade do acrossoma, devido ao caráter glicoprotéico dos seus compo-nentes, fornece outro meio de mensurar a integridade acrossomal, através do preen-chimento fluorescente da matriz acrosso-mal de espermatozoides com acrossoma lesado com lecitinas marcadas, podendo ser conjugadas com fluoróforos (GRAHAM et al., 1990). Essas lecitinas conjugadas ligam-se especificamente a cadeias de carboidratos de glicoproteínas presentes no
acrossoma. As mais utilizadas são a aglu-tinina do Pisum sativum (PSA), da Arachis
hypogea (PNA) e da Concanavalia ensifor-mis (ConA). A PSA liga-se aos resíduos de
α-manose e α-galactose de glicoproteínas da matriz acrossomal enquanto o PNA liga--se aos resíduos de β-galactose, associa-dos à membrana externa do acrossoma. Os espermatozoides que possuem membranas intactas, não permitem a entrada e ligação dessas lecitinas. Portanto, quando essas le-citinas são utilizadas sem permeabilização das células, elas se ligam à membrana de acrossomos lesados (JUHÁSZ et al., 2000).
Quanto à função mitocondrial, devido à importância que possui frente à motili-dade espermática, tem requerido maior atenção. As mitocôndrias provavelmente fornecem energia necessária para a ma-nutenção de importantes processos na membrana da peça intermediária e da cabeça do espermatozoide. Dentre esses, uma das atividades mais importantes é a manutenção do gradiente de Na+/K+ ao longo da membrana. A bomba de Na+/K+ também está envolvida, indiretamente, no transporte de outras substâncias e, assim, regula os gradientes químicos e elétricos da membrana plasmática, que influenciam na sobrevivência espermática. Dessa for-ma, a integridade funcional da mitocôndria pode ser importante para a sobrevivência espermática no trato genital feminino e nas técnicas de reprodução assistida (SILVA e GADELLA, 2006; RAPHAEL, 2007).
A capacidade de monitorar mudanças no potencial de membrana mitocondrial das células in situ pode ser crucial para elucidar mudanças da fisiologia celular em várias situações experimentais. Os reagentes mais comuns, sensíveis ao po-tencial de membrana mitocondrial, são as rodaminas e as carbocianinas. O sucesso do uso dessas sondas em células vivas deve-se ao fato de não serem destrutivas nem causarem toxicidade, como descrito por Celeghini (2005).
Segundo Tartaglione e Ritta (2004), quanto mais parâmetros espermáticos são avaliados em uma amostra de sêmen, maior será o valor do prognóstico de ferti-lidade in vitro, sendo que as associações de sondas fluorescentes permitem avaliar simultaneamente vários compartimentos da célula espermática (NAGY et al., 2003; RAPHAEL, 2007), podendo, desta manei-ra, serem utilizadas para determinar estes requisitos.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O bom entendimento dos mecanismos endócrinos e fisiológicos, acompanhados de uma avaliação clínica e laboratorial, é ne-cessário para a determinação de problemas relacionados à fertilidade e/ou subfertilidade, para que se possam estabelecer diagnósti-cos diferenciais e oportunos para a melhoria da eficiência reprodutiva do rebanho. Toda-via, deve-se ressaltar que nem sempre o uso isolado desses indicadores de fertilidade irá cumprir com seu papel diagnóstico, necessi-tando do médico veterinário o conhecimento prévio e amplo das bases biológicas de cada teste para se determinar quando e quais associações poderão ser realizadas para se confirmar a condição reprodutiva de um determinado reprodutor.
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