PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO
EM BIOCIÊNCIA ANIMAL
PATRÍCIA VEIGA DE ALMEIDA
OCORRÊNCIA E RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE Escherichia
coli, Staphylococcus aureus e IMPACTOS A CADEIA PRODUTIVA
LEITEIRA NO CENTRO-SUL DO ESTADO DE MATO GROSSO,
BRASIL
Cuiabá – MT
2020
OCORRÊNCIA E RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE Escherichia
coli, Staphylococcus aureus e IMPACTOS A CADEIA PRODUTIVA
LEITEIRA NO CENTRO-SUL DO ESTADO DE MATO GROSSO,
BRASIL
Dissertação apresentada à Universidade de Cuiabá (UNIC), como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Biociência Animal.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo César Tavares Carvalho.
Cuiabá – MT 2020
Dados internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca UNIC A447o
ALMEIDA, Patrícia Veiga de
Ocorrência e resistência antimicrobiana de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e impactos a cadeia produtiva leiteira no centro-sul do Estado de Mato Grosso, Brasil. / Patrícia Veiga de Almeida – Cuiabá, MT 2020.
83 p.: il.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu de Mestrado em Biociência Animal. Como requisito para obtenção do Título de Mestre em Biociência Animal – Área de Concentração em Saúde Animal. Universidade de Cuiabá, 2020.
Orientador: Prof º. Drº Ricardo César Tavares Carvalho
1. Análise Microbiológica. 2. Controle de Qualidade de Leite. 3. Perfil de Resistência Antimicrobiana.
CDU: 619:637.136 Terezinha de Jesus de Melo Fonseca - CRB1/3261
OCORRÊNCIA E RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE Escherichia
coli, Staphylococcus aureus e IMPACTOS A CADEIA PRODUTIVA
LEITEIRA NO CENTRO-SUL DO ESTADO DE MATO GROSSO,
BRASIL
Dissertação apresentada à Universidade de Cuiabá (UNIC), no Mestrado em Biociência Animal, área e concentração em Saúde Animal como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Ricardo César Tavares Carvalho Universidade de Cuiabá - UNIC
Prof. Dra. Michele Lunardi Universidade de Cuiabá – UNIC
Prof. Dr. Eduardo Eustáquio de Souza Figueiredo Universidade de Federal de Mato Grosso - UFMT
Aos meus pais, Sebastião Ediberto de Almeida por se fazer presente em cada etapa, me educar e incentivar a todo instante e a minha mãe Maria Cândia Veiga de Almeida por todo cuidado, carinho e atenção durante toda a trajetória.
Aos demais familiares (irmão e irmãs) que por muitas vezes foram fonte de inspiração para prosseguir e aos meus amigos, que com paciência, amor e carinho me trouxeram ao equilíbrio necessário em várias fases desse trajeto.
Superior (CAPES), por me conceder auxílio, que de fato foi indispensável para realização do curso de Mestrado.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Ricardo César Tavares Carvalho, por me dar a confiança nesse desafio, colaborar e compartilhar conhecimentos. Obrigada pelo comprometimento e apoio. Meus sinceros agradecimentos.
Ao Dr. Adelino Cunha Neto, por tamanha paciência e apoio com a realização das análises, que por muitas vezes disponibilizou seu tempo para me instruir com as funções laboratoriais e ensinamentos em minha dissertação, qualificação e defesa. Sem palavras para agradecer todo o seu empenho muito obrigado por tudo!
Ao Prof. Dr. Eduardo Eustáquio de Souza Figueiredo, por me oportunizar a visualizar novas ideias e por todo incentivo. Obrigada por apostar em mim!
Ao Prof. Dr. Marcelo Diniz dos Santos, que contribuiu de várias maneiras para que eu pudesse concluir essa pesquisa. Muito obrigada!
A Profª. Ms. Simone Duarte, por me acompanhar desde a graduação e contribuir desde o início, dando ideia de um novo desafio e suporte para que eu desse sequência na realização do mestrado. Agradeço imensamente!
As amizades construídas no laboratório, por contribuir dia após dia com as funções e também por compartilhar tantos momentos, desde a euforia até a descontração, obrigada pela parceria, por somar conhecimentos e me oportunizar aprendizados, no qual levarei por toda minha vida muito obrigada.
Aos produtores que me cederam o espaço para realização da pesquisa á campo, e se prontificaram a acompanhar cada visita, sempre com disposição e boa vontade, peça fundamental para construção e conclusão desse trabalho.
Agradeço também a Deus por sua generosidade e cuidado para com a minha vida. Minha fortaleza e sustento para concluir com êxodo cada etapa da minha formação acadêmica.
Aos meus pais, Sebastião Ediberto de Almeida e Maria Cândia Veiga de Almeida, que a todo o momento se prontificaram a apoiar no que fosse necessário. Agradeço infinitamente em cada detalhe, por viver junto a mim cada dificuldade e vitória, aos conselhos, incentivo e paciência. Muito obrigada! Eu amo vocês!
Aos meus amados anjos, Murillo Barony de Oliveira (sobrinho) e Murilo Nogueira (afilhado), presentes de Deus em minha vida, onde nos momentos de turbulência encontrei a paz necessária, serenidade e calmaria. Minhas preciosidades, amo vocês!
Aos meus amigos em geral, por toda compreensão, conselhos, apoio e incentivo durante a caminhada. Vocês são essenciais em minha vida, muito obrigada a todos por se fazerem presentes em momentos tão importantes para mim, amo vocês!
papel importante no mercado brasileiro, que se mostra equilibrado e com tendências de crescimento, sendo que no Estado de Mato Grosso, as propriedades de agricultura familiar são responsáveis por 55% da produção de leite do estado e 21% do agronegócio nacional. Para permanecer na cadeia de produção de leite é necessário que o produtor mantenha qualidade do leite, por meio de controles e programas de qualidade, que vão desde o campo até a mesa do consumidor, com o objetivo de minimizar a contaminação do leite. Esta contaminação pode ser oriunda de micro-organismos causadores de mastite bovina, em decorrência das dificuldades encontradas para a realização do controle de qualidade da cadeia de produção do leite, falhas no tratamento da mastite, relacionadas especialmente ao aumento de resistência bacteriana. Este fato deve- se ao uso indiscriminado de antimicrobianos, muitas vezes associados, a falta de informação técnica, como a suscetibilidade das bactérias aos agentes antimicrobianos utilizados. Sendo assim, o presente estudo buscou identificar a ocorrência e o perfil de resistência antimicrobiana dos principais agentes etiológicos causadores de mastite bovina na região Centro-Sul do Estado de Mato Grosso. Foram selecionadas oito propriedades leiteiras, localizadas na mesorregião Centro-Sul do Estado de Mato Grosso, que apresentavam resultados elevados na contagem de células somáticas e elevada contagem de bactérias totais no leite. Um total de 11 coletas de leite bovino foram retiradas diretamente do resfriador mecânico de cada uma das oito propriedades, entre os meses de fevereiro a maio de 2019, totalizando 88 amostras. Das 88 amostras de leite analisadas, 27,27% (24/88) apresentaram crescimento de Escherichia coli e 57,95% (51/88) apresentaram crescimento de Staphylococcus aureus. Dentre os 20 antibióticos testados para avaliação do perfil de resistência dos isolados de E. coli e S. aureus, foi possível observar um elevado percentual de resistência para ampicilina e rifampicina. Conclui-se com os resultados do presente estudo que o leite cru pode ser fonte de exposição a cepas de E. coli e S. aureus, em decorrência de práticas inadequadas na criação de animais na mesorregião Centro-Sul do Estado de Mato Grosso, podendo demonstrar que o uso indiscriminado de antimicrobianos, somado a tratamentos inadequados para mastite, pode consequentemente acarreta em prejuízos econômicos e um grave risco de saúde pública.
Palavra-chave: Análise microbiológica; Controle de qualidade de leite; Perfil de
role in the Brazilian market, which is balanced and with growth trends, and in the State of Mato Grosso, family farms are responsible for 55% of the production of state milk and 21% of national agribusiness. To remain in the milk production chain, it is necessary for the producer to maintain milk quality, through quality controls and programs, ranging from the field to the consumer's table, in order to minimize contamination of the milk. This contamination may come from microorganisms that cause bovine mastitis, due to the difficulties encountered in carrying out quality control of the milk production chain, failures in the treatment of mastitis, especially related to the increase in bacterial resistance. This fact is due to the indiscriminate use of antimicrobials, often associated, the lack of technical information, such as the susceptibility of bacteria to the antimicrobial agents used. Thus, the present study sought to identify the occurrence and profile of antimicrobial resistance of the main etiologic agents that cause bovine mastitis in the Center-South region of the State of Mato Grosso. Eight dairy properties were selected, located in the Central-South mesoregion of the State of Mato Grosso, which presented high results in the count of somatic cells and high count of total bacteria in the milk. A total of 11 collections of bovine milk were taken directly from the mechanical cooler of each of the eight properties, between the months of February to May 2019, totaling 88 samples. Of the 88 milk samples analyzed, 27.27% (24/88) showed growth of Escherichia coli and 57.95% (51/88) showed growth of Staphylococcus aureus. Among the 20 antibiotics tested to evaluate the resistance profile of E. coli and S. aureus isolates, it was possible to observe a high percentage of resistance for ampicillin and rifampicin. It is concluded with the results of the present study that raw milk can be a source of exposure to strains of E. coli and S. aureus, due to inadequate practices in animal husbandry in the Central-South mesoregion of the State of Mato Grosso, and may demonstrate that the indiscriminate use of antimicrobials, combined with inadequate treatments for mastitis, can consequently result in economic losses and a serious public health risk.
Keyword: Microbiological analysis; Quality control of milk; Antimicrobial resistance
Artigo II - Mastite bovina ocasionada por Escherichia coli e
Staphylococcus aureus na Cadeia Produtiva Leiteira da
Mesorregião Centro-Sul do Estado de Mato Grosso, Brasil: Ocorrência e perfil de suscetibilidade a antimicrobianos
Figura 1 - Distribuição dos percentuais de Sensibilidade (S),
Sensibilidade intermediária (I) e Resistência (R) aos antibióticos: AMP - Ampicilina; ATM - Aztreonama; AZI - Azitromicina; CFO – Cefoxitina; CIP – Ciprofloxacina; CLO – Cloranfenicol; CPM – Cefepima; CTF – Ceftiofur; ENO – Enrofloxacina; ERI – Eritromicina; FLF – Florfenicol; GEN – Gentamicina; IPM – Imipenema; NAL – Ac. Nalidixico; NIT – Nitrofurantoina; RIT – Rifampicina; SUL – Sulfonamidas; SUT – Cotrimoxazol; TET – Tetraciclina e TRI – Trimetoprima. Das cepas de Escherichia coli isoladas de Leite cru, MT, Brasil.
64
Figura 2 - Distribuição dos percentuais de Sensibilidade (S),
Sensibilidade intermediária (I) e Resistência (R) aos antibióticos: AMP - Ampicilina; ATM - Aztreonama; AZI - Azitromicina; CFO – Cefoxitina; CIP – Ciprofloxacina; CLO – Cloranfenicol; CPM – Cefepima; CTF – Ceftiofur; ENO – Enrofloxacina; ERI – Eritromicina; FLF – Florfenicol; GEN – Gentamicina; IPM – Imipenema; NAL – Ac. Nalidixico; NIT – Nitrofurantoina; RIT – Rifampicina; SUL – Sulfonamidas; SUT – Cotrimoxazol; TET – Tetraciclina e TRI – Trimetoprima. Das cepas de Staphylococcus aureus isoladas de Leite cru, Mato Grosso, Brasil.
presença em leite cru no Brasil: uma visão geral.
Tabela 1 - Frequências de citação em artigos científicos online de
grupos, família, gênero e espécies detectados como agente causal de mastite bovina no período de 2009 a 2019.
43
Tabela 2 - Frequências de citação em artigos científicos online de
grupos, família, gênero e espécies detectados em leite cru no período de 2009 a 2019.
44
Artigo II - Mastite bovina ocasionada por Escherichia coli e
Staphylococcus aureus na Cadeia Produtiva Leiteira da Mesorregião
Centro-Sul do Estado de Mato Grosso, Brasil: ocorrência e perfil de suscetibilidade a antimicrobianos
Tabela 1 - Contagem de Escherichia coli nas propriedades produtoras de
leite na mesorregião Centro-sul do Estado de Mato Grosso.
61
Tabela 2 - Contagem de Staphylococcus aureus nas propriedades
produtoras de leite na mesorregião Centro-sul do Estado de Mato Grosso.
61
Tabela 3 - Perfil de Multirresistência das cepas de E. coli isoladas em 8
propriedades leiteiras da mesorregião centro-sul do Estado de Mato Grosso.
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Tabela 4 - Perfil de Multirresistência das cepas de S. aureus isoladas em
8 propriedades leiteiras da mesorregião centro-sul do Estado de Mato Grosso.
S. agalactiae Streptococcus agalactiae S. aureus Staphylococcus aureus S. dysgalactiae Streptococcus dysgalactiae S. epidermidis Staphylococcus epidermidis S. hyicus Streptococcus hyicus
S. schleiferi Staphylococcus schleiferi S. uberis Streptococcus uberis
CBT Contagem bacteriana total CCS Contagem de células somáticas
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CNF Fator necrosante citotóxico C.T Coliformes totais
CMT California Mastitis Test
DTA Doenças transmitidas por alimentos
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária EU União Europeia
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia Estatística
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MERCOSUL Mercado Comum do Sul
2. REVISÃO DA LITERATURA ... 17
2.1. CADEIA PRODUTIVA DO LEITE ... 17
2.2. QUALIDADE DO LEITE ... 18
2.3. ARMAZENAMENTO DO LEITE CRU ... 19
2.4. FATORES QUE CAUSAM A MASTITE BOVINA ...21
2.4.1. Staphylococcus aureus ... 23
2.4.2. Coliformes totais ... 24
2.4.3. Escherichia coli ... 25
2.4.4. Resíduos de antimicrobianos e risco à saúde pública ... 26
REFERÊNCIAS ... 28 3. OBJETIVOS ... 35 3.1. OBJETIVO GERAL ... 35 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 35 DESENVOLVIMENTO ... 36 4. ARTIGO I ... 37
Micro-organismos isolados de mastite bovina, e sua presença em leite cru no Brasil: uma visão geral ... 37 INTRODUÇÃO ... 38 METODOLOGIA ... 40 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 40 CONCLUSÃO ... 46 REFERÊNCIAS ... 47 5. ARTIGO II ... 51
Escherichia coli e Staphylococcus aureus principais agentes causadores da mastite bovina: Ocorrência e perfil de suscetibilidade a antimicrobianos, em leite in natura. ... 51
INTRODUÇÃO ... 52 MATERIAIS E MÉTODOS ... 54 RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 57 CONCLUSÃO ... 68 REFERENCIAS ... 69 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 72
ANEXO 5- Certificado de participação em Mini curso Processamento de dados em pesquisa científica ... 78 ANEXO 6- Certificado de participação em Mini curso “Rotulagem de Alimentos de a a Z ... 79 ANEXO 7- Certificado de participação em Mini curso Processamento de dados em pesquisa científica ... 80 ANEXO 8- Certificado 30º Congresso brasileiro de microbiologia ... 81 ANEXO 9- Certificado de apresentação de trabalho no 22º Encontro de
atividades científicas ... 82 ANEXO 10- Certificado de apresentação de trabalho no 22º Encontro de atividades científicas ... 83
1. INTRODUÇÃO
O leite é caracterizado pela combinação homogênea de substâncias como glicerídeos, proteínas, lipídeos, sais minerais, vitaminas e enzimas. Entre os lipídeos presentes no leite estão o ácido linoleico, ácido butílico, o caroteno e as vitaminas A e D (PINHEIRO, 2012). Já a sua proteína é caracterizada por uma molécula orgânica extremamente útil na construção de tecidos corporais (ZANELA et al., 2011) e a gordura atua como uma importante fonte de vitaminas lipossolúveis que fornece energia para o organismo humano, enquanto que o cálcio e o fósforo auxiliam na estruturação de ossos e dentes (FRANCIOSI et al., 2011).
A composição do leite de vaca é de aproximadamente 85,3% de água, 14,7% de sólidos totais, sendo 2,5% a 4,5% de proteínas totais, 2,4% a 4,2% de gordura, 3,8% de lactose e 0,8% de sais minerais de enzimas e vitaminas (FRANCIOSI et al., 2011; ZANELA et al., 2011; PINHEIRO, 2012; GUANDALIM; CHAVES, 2014). Considerado como um dos alimentos mais consumidos, atualmente no mundo, 816 milhões de toneladas de leite são produzidas por ano, o que representa uma média de consumo de 116,5 litros de leite por habitante/ano (BRASIL, 2019).
Diante desse cenário, o mercado brasileiro de leite mostra-se equilibrado e com tendências de crescimento, produzindo e inspecionando em 2018 24,46 bilhões de litros de leite, o que colocou o país em 4º lugar no ranking mundial de produção de leite. Contudo, o estado de Mato Grosso vem apresentando uma queda na produção de leite desde 2014, ocupando atualmente o 11º lugar no ranking nacional de produtores de leite, com uma produção média de 734 milhões de litros/ano. Essa diferença ocorre em razão, majoritariamente, do estado ser produtor de rebanho de corte e a produção leiteira estar concentrada na agricultura familiar, que é afetada pela sazonalidade ambiental (BRASIL, 2019).
O perfil de produção do leite se difere de acordo com o espaço geográfico, e a maior parte de sua produção tem origem na agricultura familiar (72,52%). Em Mato Grosso, as propriedades da agricultura familiar são responsáveis por 55% da produção de leite do estado, que corresponde a 21% do agronegócio brasileiro (IBGE, 2019; BRASIL, 2019).
Para permanecer na cadeia de produção de leite, com incentivos financeiros, é necessário que o produtor mantenha a qualidade do leite, por meio de controles e programas de qualidade, que vão desde o campo até a mesa do consumidor, com o objetivo de minimizar a contaminação, conservando o leite, o que inclui o processo de pasteurização, que pode ser realizado de forma lenta (62°C a 65º por 30 minutos), rápida (72ºC a 75ºC por 15 a 20 segundos) e ultrarrápida (130º a 150ºC por 3 a 5 segundos) (TEIXEIRA NETO et al., 1997).
O monitoramento dos pontos críticos de controle no sistema de produção de leite baseia-se na contagem de células somáticas (CCS) e de bactérias totais (CBT) presentes no mesmo, o que caracteriza um dos parâmetros de diagnóstico para mastite bovina (BRASIL, 2019). As células somáticas são células que atuam na defesa imunológica do animal, produzidas pelo sangue, que migram para o úbere, atuando como células de descamação da glândula mamária (BRASIL, 2015). Já as bactérias totais fazem parte da composição do leite, em especial nas concentrações de gordura, proteína, lactose e sólidos totais, o que provoca alterações nos produtos industrializados (TAFAREL et al., 2013). Com isso, quando a contagem de células somáticas ultrapassarem 10.600.000 células/mL na amostra de leite, deve-se realizar exames para detecção dessa infecção no rebanho (BRASIL, 2012; GUANDALIM; CHAVES, 2014).
A mastite bovina é definida como uma inflamação da glândula mamária, que se apresenta de forma clínica e subclínica, causada principalmente por bactérias como a Echerichia coli e Staphylococcus aureus. A mastite clínica classifica-se em subaguda, aguda, superaguda, crônica e gangrenosa. Esse diagnóstico pode ser realizado observando a presença de enrijecimento da glândula mamária, grumos e parênquima glandular, além de exsudados de cor avermelhada no leite (GUANDALIM; CHAVES, 2014). A mesma é reconhecida como um dos principais problemas do rebanho leiteiro, que reflete no déficit dos programas de controle na cadeia produtiva do leite, impactando tanto a quantidade, quanto a qualidade do mesmo (BRASIL, 2019).
O controle de qualidade é de grande importância, entretanto, é uma dificuldade comum, principalmente para pequenos produtores de leite. Percebe-se que a assistência técnica quanto as Boas Práticas Agropecuárias (BPA) é um fator primordial para se obter uma matéria-prima de qualidade e sua ausência impacta
no desempenho econômico das propriedades, em decorrência da falta de controle das enfermidades (BARRETO et al., 2012).
Além das dificuldades encontradas para a realização do controle de qualidade da cadeia de produção do leite, soma-se a estas as falhas o tratamento da mastite, relacionadas especialmente ao aumento de casos de resistência bacteriana, apesar da disponibilidade de vários antimicrobianos no mercado. Este fato deve-se ao uso indiscriminado de antimicrobianos, proveniente, muitas vezes, devido à falta de informação técnica, associada a suscetibilidade das bactérias aos agentes antimicrobianos utilizados (CAZOTO et al., 2011; GIRARDINI et al., 2016).
Diante do exposto, o presente estudo buscou identificar a ocorrência e perfil de resistência antimicrobiana dos principais agentes causadores de mastite no leite produzido na bacia leiteira na região Centro-Sul de Mato Grosso, avaliando se ocorre resistência antimicrobiana no rebanho leiteiro desta região.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. CADEIA PRODUTIVA DO LEITE
A cadeia produtiva do leite exerce um papel significativo na economia dos seus países, em decorrência do numeroso grupo de agentes envolvidos no processo de produção, industrialização e distribuição. É nesta cadeia que se origina o setor de produtos lácteos, o qual contribui para a balança comercial das nações, gerando um superávit aos países que exportam o excedente. O que não é o caso do Brasil, que ainda realiza uma pequena proporção de importações, não se inserindo como exportador no mercado internacional (JANK; GALAN, 1998; ASSIS et al., 2016).
Diante desse contexto, o atual governo tem procurado expandir o livre comércio brasileiro por meio de acordos econômicos entre países, sendo a área do agronegócio uma das principais beneficiárias de ganhos econômicos potenciais. O Brasil produz e exporta, em sua maioria, produtos como café, laranja açúcar, milho, algodão e carnes. No entanto, este não é o caso do leite, pois mesmo o país ocupando o quarto lugar como produtor mundial, importa o leite na forma de líquidos lácteos, representando um volume anual importado de 3% a 5% da produção nacional, gerando um déficit comercial de aproximadamente US$ 450 milhões (CARVALHO et al., 2019).
Nesse sentido, os acordos a serem firmados pelo governo, entre o Mercado Comum do Sul (MERCOSUL) e União Europeia (UE) são prejudiciais para a cadeia de produção do leite, uma vez que podem ocorrer possíveis aumentos nas importações de leite em pó e queijos, principais produtos lácteos importados, vindos da UE, podendo assim influenciar nos preços do mercado interno e na sustentabilidade, com destaque para os pequenos produtores, grupo este responsável pela produção diária de menos de 200 litros de leite, mas que representa mais de 90% dos estabelecimentos produtores de leite no Brasil (CARVALHO et al., 2019).
2.2. QUALIDADE DO LEITE
A Organização Internacional de Normatização define a qualidade dos alimentos como “a totalidade de atributos e características de um produto ou serviço”. O leite é avaliado como um alimento de grande valor nutricional, por sua composição nobre de vários nutrientes, como proteínas, gorduras e sais minerais, além de outras propriedades, como ácido linoleico, ácido butílico, caroteno, vitaminas A e D (MULLER, 2001), sendo assim caracterizado como uma emulsão fluída contendo água e substâncias hidrossolúveis (MONARDES, 2004).
Quanto à qualidade do leite, vários fatores devem ser considerados, independentemente do sistema de produção, expansão territorial das propriedades e condição socioeconômica dos produtores. A higiene é uma das práticas mais importante para manutenção da qualidade do leite, pois esta qualidade pode ser influenciada por uma série de fatores, como a contaminação bacteriana durante o processo de ordenha, oriunda justamente da má higienização das mãos do ordenhador, do úbere, dos equipamentos de ordenha, dos latões de armazenagem, entre outros (SANTANA et al., 2001; JAMAS et al., 2018). No entanto, tal contaminação pode ser proveniente da mastite, patologia multicausal, de ampla etiologia (LANGONI et al., 1998). Quando o leite é contaminado, principalmente por agentes bacterianos, o mesmo pode ser uma fonte de transmissão de algumas doenças, geralmente associadas ao consumo do leite cru ou produtos lácteos contaminados (SANTOS; FONSECA, 2007; CEMPÍRKOVÁ R.; MIKULOVÁ, 2009).
O Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) é quem regulamenta a qualidade do leite cru por meio de parâmetros estabelecidos pela Normativa de nº 62 de 29 de dezembro de 2011 (BRASIL, 2011). Os parâmetros são a composição físico-química, microbiológica e de higiene.
A presença de proteína, lipídio, lactose, sais minerais e vitaminas definem a qualidade da composição físico-química do leite, que por sua vez, é influenciada pela alimentação, manejo, genética e raça do animal, incluindo também a etapa de lactação, escore corporal e condições de estresse (WALDNER et al., 2007; ZANELA et al., 2011;).
Os limites padrões aceitáveis referentes ao leite cru são de, no mínimo, 3,0% de gordura; acidez titulável de 0,14 a 0,18 graus dornic; densidade relativa
de 1028 a 1034; índice crioscópio de -0,530H a-0,555H; sólidos não gordurosos de, no mínimo, 8,4%; extrato seco total de, no mínimo, 11,4%; teor de proteína mínimo de 2,9%; e estabilidade de alizarol de 72%. Estes são os critérios que estabelecem e mantém a qualidade da matéria-prima.
O padrão de contagem de Células somáticas (CCS) tem o limite aceitável de, no máximo, 500 mil CS/mL e o de Contagem bacteriana total (CBT) tem como limite máximo aceitável, 300 mil UFC/mL (BRASIL, 2011).
Com isso, percebe-se que a qualidade e a segurança alimentar são assuntos primordiais que têm ganhado grande atenção na produção leiteira, passando por discussões e debates dentro e fora da indústria de laticínios, principalmente onde se inicia o processo de elaboração do produto (IZIDORO et al., 2010). Uma importante ferramenta que contribui para essa qualidade é a capacitação de supervisores de coleta do leite nas propriedades, por meio da padronização do tempo de coleta, que não deve exceder 48 horas pós ordenha, armazenamento e processamento adequados do produto (ARCURI et al., 2006).
A presença de boas práticas na produção da matéria-prima é o principal fator para permanência dos produtos lácteos no mercado competitivo, onde a qualidade microbiológica do leite cru é essencial para um bom rendimento do mesmo durante o processamento e para a aceitação dos produtos lácteos (NERO; VIÇOSA; PEREIRA, 2009), pois o mercado consumidor tem sido cada vez mais exigente quanto à qualidade dos produtos, justificando assim a importância da aplicação das boas práticas, buscando a excelência na produção leiteira, dando- se uma atenção especial quanto à higiene e as características organolépticas, por terem estas uma relação direta com a qualidade do leite e dos alimentos que são produzidos a partir dele, melhorando por fim os sistemas de certificação e controle de qualidade (MONARDES, 2004).
2.3. ARMAZENAMENTO DO LEITE CRU
O processo de armazenamento do leite, atualmente, tem início logo após a coleta “in natura”, seguindo pela estocagem e acondicionamento em tanques de resfriamento com temperatura controlada, até o seu transporte por meio de caminhões-tanques isotérmicos, ocorrendo, geralmente, a cada 48 horas (TEIXEIRA; CAMPOS, 2019). Hoje, o mercado dispõe de tanques de alta
capacidade de armazenamento e potência de resfriamento para três a cinco ordenhas, havendo, concomitantemente, capacidade de resfriar de 20% a 60% do volume total no período de 3 horas (CBQL, 2006).
Já os tanques de expansão são produzidos para quatro ordenhas, sendo que, se a sua capacidade máxima não seja respeitada, pode haver um prejuízo à qualidade do leite devido a não manutenção da temperatura de resfriamento, podendo então gerar proliferação bacteriana. Os mesmos podem ser adquiridos de acordo com a necessidade do produtor, visando atender o tamanho da produção, a vida benéfica do equipamento, e a frequência de coleta e de estoque do leite na propriedade (SANTOS; FONSECA, 2007).
O armazenamento nos tanques é realizado por meio do processo de resfriamento, com o objetivo de evitar que os nutrientes do leite se tornem um meio de cultura microbiana, afetando assim sua qualidade (RECHE et al., 2015), bem como aumentar o tempo de armazenagem nas propriedades leiteiras, reduzindo os custos com transporte ao laticínio (TEIXEIRA; CAMPOS, 2019). É o MAPA que também exige e regulamenta o resfriamento do leite nas propriedades leiteiras, o mesmo deve ser resfriado a uma temperatura igual ou inferior a 10ºC na primeira hora, caindo para 4ºC nas duas horas após a ordenha, preservando- se assim a sua qualidade, pois a multiplicação dos micro-organismos é muito rápida quando a temperatura se torna ideal para o seu crescimento (BRASIL, 2011).
Outros fatores associados à qualidade do leite armazenado são o tempo contemporizado e as condições de higiene adversas, pois podem ocasionar um aumento de micro-organismos, gerando um leite possivelmente contaminado com patogênicos, capazes, inclusive, de se proliferarem em temperatura igual ou inferior a 7ºC (SANTOS; FONSECA, 2007; CEMPÍRKOVÁR; MIKULOVÁ, 2009).
Durante o resfriamento do leite é necessária a utilização de um tanque de expansão e resfriamento. O tanque deve ter competência para resfriar o leite a 7°C em no máximo 3 horas após o término da ordenha (BRASIL, 2011). A baixa homogeneização no tanque diminui o resfriamento do leite, podendo estimular a propagação de uma microbiota mista composta de bactérias psicrotróficas e mesófilas, as quais proporcionam atividade de acidificação e lipoproteolítica concomitantemente (IZIDORO et al.,2010). Na IN 62, o resfriamento através da
expansão direta prevê uma diminuição da temperatura do leite a 4ºC, no tempo máximo de até 3 horas após o fim da ordenha (BRASIL, 2011).
Segundo Lorenzetti (2006), testando temperaturas de estocagem em tanques de resfriamentos (2,4 e 8º C) e o tempo de estocagem (6, 18 e 25 horas) após a captação do leite, observou-se que em condições favoráveis de resfriamento a contagem de micro-organismos psicrotróficas aumenta, lembrando a necessidade de diminuição do tempo de estocagem do leite na fábrica. Já sobre a falta de cuidado e higienização dos tanques de resfriamento, o autor aponta que pode contaminar o leite com bactérias psicrotróficas.
Para a solução desse problema, os tanques de expansão de menor densidade (<400L) podem ser lavados manualmente, utilizando solução de detergente alcalino, seguido de sanitizante e água quente, após cada esvaziamento. O ciclo de lavagem da tubulação de ordenha mecânica pode ser realizada automaticamente, compreendendo no ciclo o enxágue com água quente a 80º C, seguido de detergente líquido alcalino clorado e novo enxágue, seguido de soda cáustica-clorado com concentração de 2% a 2,5%, seguido de um novo enxágue (SGARBIERI, 2005; SANTOS; FONSECA, 2007; BRASIL, 2011).
Sendo assim, o resfriamento adequado do leite cru é um dos métodos mais eficazes para impedir que a propriedade nutricional do leite seja um rico meio de cultura para micro-organismos deterioradores, que podem prejudicar por fim sua qualidade (FRANCIOSI et al., 2011).
2.4. FATORES QUE CAUSAM A MASTITE BOVINA
A mastite bovina é considerada uma doença inflamatória e infecciosa da glândula mamária que acarreta a diminuição da produção láctea (LEITE; BRITO; FIGUEIREDO 1976). Normalmente, ela é descrita como qualquer lesão no úbere ocasionada por micro-organismos que, ao entrarem no canal do teto, alojam-se no tecido mamário, provocando alterações patológicas (KULKARNI; KALIWAL, 2013). Esta doença pode originar-se de fatores fisiológicos, traumáticos, alérgicos, metabólicos e/ou infecciosos (CUNHA et al., 2015; MASSOTE et al., 2019). Sendo assim, é uma doença complexa e multicausal que envolve diferentes patógenos, o ambiente e a condição do animal, tratando-se então de uma infecção comum a todas as fêmeas no período de lactação, que ocorre geralmente em
ambientes onde há falta de higiene, acúmulo de matéria orgânica ou manejo inadequado dos equipamentos de ordenha, levando a infecção de um teto doente para outro sadio. (OLIVEIRA et al., 2016; LOPES; MANZI; LANGONI, 2018; MASSOTE et al., 2019).
A mastite bovina pode apresentar-se de duas formas, sendo elas a mastite clínica e a subclínica. Na forma clínica da doença, são evidentes os sinais de inflamação, tais como: aumento de sensibilidade ao teto e presença de grumos ou flocos no leite (ACOSTA et al., 2016). Uma forma de identificar tal alteração é por meio do teste da caneca do fundo preto, que consiste na observação, já nos primeiros jatos, da mudança na coloração do leite, presença de grumos e uma consistência mais aquosa, podendo apresentar sangue ou pus (MASSOTE et al., 2019).
Este tipo de mastite pode determinar grandes perdas, em decorrência do descarte do leite, despesas com medicamentos, veterinários, perda da função das glândulas mamárias e até a morte do animal, além de ser um risco para a saúde pública. (NETO; ZAPPA, 2011; COSER; LOPES; COSTA, 2012). O impacto econômico causado pela mastite clínica no Brasil é estimado em R$ 0,1090 a R$ 0,5985/kg de leite, para frequências médias anuais de 1 e 15% de mastite clínica, respectivamente (COSER; LOPES; COSTA, 2012).
Tratando-se da mastite subclínica, a mesma é caracterizada como uma doença de difícil detecção, devido à ausência de qualquer indicação visível no leite ou na glândula mamária (GURLER et al., 2015). Neste caso, a glândula acometida apresenta elevado número de células somáticas, entretanto, o leite está macroscopicamente normal e o úbere sem sinais visíveis de inflamação. A forma de detectar esse tipo de alteração é por meio dos testes California Mastitis Test (CMT), contagem de células somáticas (CCS) ou por exames laboratoriais como cultura bacteriana (CULLOR; TYLER; SMITH, 1994). Nas mastites subclínicas, observa-se uma queda gradativa da produção de leite, trazendo grandes transtornos para os produtores, sendo que na maioria dos casos as perdas chegam a 50% da produção diária. Se não houver um rápido diagnóstico e o correto tratamento, há possibilidade de que a mastite subclínica ocasione uma mastite clínica (ZECCONI; HAHN, 2000; RADOSTITS et al., 2002).
A mastite também pode ser classificada como contagiosa ou ambiental, a depender do tipo de micro-organismo causador de infecções nos rebanhos. A
mastite contagiosa ocorre durante a ordenha, sendo transmitida por meio de uma contaminação cruzada, em que uma vaca infectada passa a infecção para uma vaca sadia. Já na mastite ambiental, as infecções ocorrem durante o período entre as ordenhas, ocasionando a infecção dos tetos por bactérias presentes no ambiente através do contato com fezes de outros animais e ausência de boas práticas antes e após a ordenha (SEEGERS; FOURICHON; BEAUDEAU, 2003).
Os micro-organismos patogênicos podem colonizar todo o úbere ou apenas um teto, disseminando-se de diversas formas para o rebanho, como por meio do acúmulo de matéria orgânica no ambiente, nos equipamentos de ordenha, nas mãos do ordenhador ou mesmo por inadequada regulagem na pressão do equipamento de extração do leite, facilitando assim a entrada dos micro-organismos na cisterna dos tetos do animal logo após a ordenha (RADOSTITS et al., 2002).
A mastite bovina pode ser causada por mais de 200 espécies de micro- organismos, incluindo bactérias, leveduras e fungos, contudo menos de 20 espécies foram estudadas detalhadamente. As bactérias correspondem a 80% das causas da doença, sendo as mais frequentes Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, E. coli e Corinecbaterium bovis (CARMO et al., 2002). Entretanto, as bactérias que estão relacionadas com um maior prejuízo econômico são: S. aureus, E. coli e coliformes totais, pois são as que mais acometem o rebanho (SGARBIERI, 2005; SANTOS; FONSECA, 2007).
2.4.1. Staphylococcus aureus
De acordo com Santiliano et al. (2010), os S. aureus são bactérias Gram- positivas pertencentes à família Micrococcaceae, que inclui quatro gêneros: Planococcus, Micrococcus, Stomatococcus e Staphylococcus. São imóveis, não esporulantes, anaeróbicas facultativas, que crescem por respiração aeróbica ou por fermentação, produzindo principalmente ácido lático. São coagulase-positiva, sendo diferenciadas do gênero Streptococcus spp. por esta característica.
De todos os patógenos que mais atinge a cadeia leiteira, destaca-se S. aureus, que é considerado o micro-organismo mais frequente na mastite bovina, principalmente nas subclínica (CONTRERAS; PAAPE; MILLER., 1999),
geralmente a mesma é contagiosa, com grande risco de contaminação de equipamentos e utensílios, além da possibilidade de veiculação desses patógenos através de leite e derivados lácteos para seres humanos, podendo desencadear casos de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA’s) (ADAMS; MOSS, 2008).
Os S. aureus são responsáveis pela produção de potentes toxinas, que uma vez introduzidas no hospedeiro induz diversas consequências biológicas, podendo atuar como enterotoxinas (MARRACK; KAPPLER, 1990; DINGES; ORWIN; SCHLIEVERT, 2000; ACOSTA et al., 2017; FEITOSA et al., 2017). As enterotoxinas são classificadas na categoria B de riscos biológicos, sendo de fácil disseminação, podendo representar um problema de saúde pública (KAEMPFER; THOMMANN; MULHAUPT, 2002; PASTACALDI; LEWIS; HOWARTH, 2011; MA et al., 2018). Existem várias formas de transmissão, sendo a mais frequente por meio do contato direto com um indivíduo infectado (ISSA; THOMPSON, 2001). A doença é controlada através do rápido diagnóstico de animais doentes, tratamento adequado e realização de boas práticas de produção, evitando assim, novos focos da doença (JONES; WIENEKE, 1986). Segundo Freitas et al. (2005), as bactérias desse gênero possuem vários fatores de virulência, contribuindo assim, para sua persistência no tecido mamário. Embora sejam tomadas medidas preventivas, que visam o controle das mastites causadas por esse patógeno, as mesmas ainda são bastante frequentes.
2.4.2. Coliformes totais
A presença de coliformes nos alimentos indica contaminação durante o processo de fabricação ou mesmo pós-processamento. Os micro-organismos indicadores são grupos ou espécies que, quando presentes em um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação fecal, sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial de um alimento, além de poder indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento (SOUZA et al., 2009).
Os coliformes totais pertencem a um grupo de bactérias, membros da família Enterobacteriaceae, que possui a capacidade de fermentar a lactose presente no leite, além de produzir gás entre 35 e 37°C, são gram-negativos e não formadores de esporos. Pertencem a esse grupo a E. coli, Enterobacter,
Citrobacter e Klebsiella. A E. coli habita o trato gastrintestinal de animais e seres humanos, enquanto os demais membros do grupo podem ser encontrados em fezes, sendo mais frequente isolados do ambiente. O que indica que a presença de coliformes totais no alimento pode não ocorrer por contaminação fecal (FRANCO; LANDGRAF, 2008).
O isolamento de coliformes totais e/ou fecais do leite bovino é um potente indicador da qualidade do mesmo, uma vez que aponta a sanidade e as boas práticas de manejo do produto (SILVA et al., 2010). No segmento leiteiro, a quantidade de coliforme total presente no leite, está relacionada à falta de higiene dos tetos no momento da ordenha, o mesmo pode acontecer com Streptococcus do ambiente. De acordo com Ribeiro et al. (2014), a elevada presença de bactérias do grupo coliformes nas amostras de leite evidencia a carência de adoção das BPA na produção do leite do rebanho.
A mastite por coliformes caracteriza-se por alta incidência de casos clínicos, geralmente de curta duração, com manifestação sistêmica e maior frequência nos momentos pré e pós-parto imediato, coincidindo com o período de imunossupressão (BURVENICH et al., 2007).
2.4.3. Escherichia coli
O E. coli são micro-organismos geralmente associados a manifestações clínica hiperaguda ou aguda nos primeiros dias de lactação, sendo observado de maneira preocupante como causador de mastite subclínica em rebanhos com bom controle de mastite contagiosa, resultando em infecções persistentes na glândula mamária, tanto na lactação quanto no período seco (RADOSTITS et al., 2002; AIRES, 2010).
Os principais fatores de virulência para E. coli incluem toxinas, adesinas, proteínas secretadas em células hospedeiras, cápsulas de polissacarídeos e antígeno O, dentre outros (LEHTOLAINEN, 2004; MAIA, 2011). A preocupação com a resistência múltipla em cepas de E. coli isoladas do leite de bovinos tem alertado para o risco de surgimentos de linhagens multirresistentes (SIQUEIRA et al., 2014).
No Brasil, Ribeiro et al. (2002) descreveram a linhagem de E. coli produtora de fator necrosante citotóxico (CNF), alfa hemolisina e sideróforo em
vacas com mastite clínica hiper-aguda. Linhagens de E. coli verotoxigênicas, da classe enterohemorrágica sorotipo O157:H7, são reconhecidas como agentes de zoonoses relacionadas ao consumo de produtos e subprodutos de origem bovina ingeridos pelo ser humano, especialmente a carne e leite. Evidências epidemiológicas têm relacionado o consumo de leite in natura a casos severos de colite hemorrágica e síndrome urêmica hemolítica no homem, assim como a identificação do sorotipo O157:H7 no leite de bovinos, em meio a surtos de doenças nas pessoas (GUIMARÃES, LANGONI, 2009).
A habilidade de E. coli em produzir endotoxina, é considerado como um principal fator de virulência. A endotoxina ou LPS compreende a porção lipopolissacarídica da parede desta bactéria, responsável pela patogenicidade e reações inflamatórias associadas com a mastite, sendo liberada durante o crescimento e inativação desta bactéria (BURVENICH et al.,2007; MAIA, 2011).
A abordagem inicial ao tratamento desta infecção consiste em controlar os sinais de toxemia inerentes à infecção com fluidoterapia intensa, ordenha dos quartos afetados com maior frequência, e a utilização de antimicrobianos adequados, isto deve servir apenas de suporte para assegurar a eliminação da infecção, evitar a ocorrência de casos crônicos e de situações de septicemia (ERSKINE et al., 1991; AIRES, 2010). Como medida adicional de controle, pode- se relacionar o adequado fornecimento de minerais, visando o aumento da capacidade imune da vaca (vitaminas A e E, cobre, selênio e zinco) e o uso de programas de vacinação.
2.4.4. Resíduos de antimicrobianos e risco à saúde pública
A Segurança Alimentar e Nutricional consiste na realização do direito de todos ao acesso regular e permanente a alimentos de qualidade, e abrange, entre outros aspectos, a garantia da qualidade biológica, sanitária, nutricional e tecnológica dos alimentos. Sendo assim, é imprescindível que se garanta a inocuidade de produtos de origem animal, por meio do controle de resíduos, a fim de que se respeitem, dessa forma, os direitos universais ao bem-estar social e à saúde do homem (MARTINS, 2010).
Em relação ao controle de resíduos biológicos, o MAPA, por meio da Portaria Nº 42, de 20 de dezembro de 1999, altera o Plano Nacional de Controle
de Resíduos Biológicos em Produtos de Origem Animal – PNCRB e os Programas de Controle de Resíduos em Carne - PCRC, Mel - PCRM, Leite - PCRL e Pescado – PCRP, com a finalidade de sistematizar os meios de controle da contaminação desses produtos por resíduos de compostos de uso na agropecuária, bem como de poluentes ambientais (BRASIL, 1999). No Brasil, são autorizados, aproximadamente, 15 compostos antimicrobianos como aditivos na alimentação animal e outros 50 para fins terapêuticos (FOLLY; MACHADO, 2001).
Diante disso, com a finalidade de controlar os riscos para a saúde pública, é necessário que se dispense cuidados com a saúde das vacas leiteiras. De acordo com o Codex Alimentarius, o leite não deve conter nenhum contaminante em níveis que coloquem o consumidor em risco. O leite contaminado por resíduos ilícitos ou acima do limite máximo de resíduos (LMR) estabelecido legalmente para antimicrobianos é considerado adulterado e impróprio para o consumo, representando danos à saúde humana e tecnológicos para a indústria de laticínios, além de prejuízos para a empresa, com rejeição de sua imagem pelo consumidor (FOLLY; MACHADO, 2001).
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3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Determinar a ocorrência e suscetibilidade antimicrobiana de Escherichia coli e Staphylococcus aureus em leite cru na bacia leiteira na região Centro-Sul do Estado de Mato Grosso.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar o monitoramento e avaliar a ocorrência de E. coli e S. aureus em leite de tanques de refrigeração, destinado a um laticínio localizado na bacia leiteira na região Centro-Sul do Estado de Mato Grosso, Brasil;
Avaliar o perfil de resistência das cepas de E. coli e S. aureus a 20 antimicrobianos amplamente utilizados na medicina humana e veterinária.
DESENVOLVIMENTO
A partir deste momento a dissertação está dividida em dois artigos:
Artigo I - Micro-organismos isolados de mastite bovina e sua presença em leite cru no Brasil: uma visão geral.
Artigo II - Mastite bovina ocasionada por Escherichia coli e Staphylococcus aureus na Cadeia Produtiva Leiteira da Mesorregião Centro-Sul do Estado de Mato Grosso, Brasil: ocorrência e perfil de suscetibilidade a antimicrobianos
4. ARTIGO I
Micro-organismos isolados de mastite bovina, e sua presença em
leite cru no Brasil: uma visão geral
Micro-organisms isolated from bovine mastitis, and its presence in
raw milk in Brazil: an overview
RESUMO:
O presente artigo objetivou buscar, organizar e descrever informações sobre micro- organismos causadores de mastite e frequentemente encontrados no leite cru em artigos publicados de 2009 a 2019, nas bases de dados Scielo, Medline e Google acadêmico. Para tanto, utilizou-se nesta investigação nos bancos de dados as palavras-chaves: “mastite”, “bovinos”, “micro-organismos”, “leite cru” e “Brasil”. Após a busca, foram encontrados 46 artigos sobre mastite, dos quais 12 foram selecionados. Já sobre o leite cru, foram encontrados 82 artigos e 11 foram selecionados para revisão. Os artigos sobre mastite discutiam a respeito de 43 micro-organismos, segundo grupos, famílias, gêneros e espécies como agentes causadores de mastite bovina em diferentes regiões do Brasil. O gênero Staphylococcus e seus grupos (coagulase positiva e negativa), bem como a espécie S. aureus, foram descritos com maior frequência (36 vezes) como agentes causadores de mastite, seguida pelo gênero Streptococcus e as espécies S. agalactiae, S. uberis e Enterococcus, além dos bacilos Corynebacterium spp., e Escherichia coli. Nos artigos que abordavam sobre leite cru, Staphylococcus coagulase positiva, Staphylococcus spp. e S. aureus, além da espécie Escherichia coli foram detectados com frequência. Na avaliação da mastite e do leite visualiza-se o predomínio do gênero Staphylococcus spp., bem como da espécie Escherichia coli, o que reforça a necessidade de monitoramento constante da saúde das glândulas dos animais, do manejo, da ordenha e do acondicionamento do leite obtido. Assegurando assim, um produto saudável ao consumidor final do leite e seus derivados.
Palavras-chave: Bovinos, Brasil, Leite cru, Mastite, Micro-organismos.
ABSTRACT:
This article aimed to search, organize and describe information about microorganisms that cause mastitis and are frequently found in raw milk in articles published from 2009 to 2019, in the Scielo, Medline and Google academic databases. For this purpose, the keywords used in the investigation were: “mastitis”, “bovines”, “microorganisms”, “raw milk” and “Brazil”. After the search, 46 articles on mastitis were found, of which 12 were selected. Regarding raw milk, 82 articles were found and 11 were selected for review. Mastitis articles discussed 43 microorganisms, according to groups, families, genera and species as causative
