UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA
Biologia reprodutiva e polinização de orquídeas nativas do estado de São
Paulo: Encyclia patens Hook., Phymatidium delicatulum Lindl. e
Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay.
Paulo Roberto de Medeiros Cabral
Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: Entomologia.
Ribeirão Preto-SP 2014
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA
Biologia reprodutiva e polinização de orquídeas nativas do estado de São
Paulo: Encyclia patens Hook., Phymatidium delicatulum Lindl. e
Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay.
Paulo Roberto de Medeiros Cabral
Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências, Área: Entomologia.
Orientador: Prof. Dr. Emerson Ricardo Pansarin
Ribeirão Preto-SP 2014
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada à fonte.
Cabral, Paulo Roberto de Medeiros
Biologia reprodutiva e polinização de orquídeas nativas do estado de São Paulo: Encyclia patens Hook., Phymatidium delicatulum Lindl. e Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay.. Ribeirão Preto, 2014. 116p.
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Entomologia.
Orientador: Emerson Ricardo Pansarin
1. Fragrância floral. 2. Flores nectaríferas. 3. Autocompatibilidade. 4. Óleo comestível. 5. Protandria.
Paulo Roberto de Medeiros Cabral
Biologia reprodutiva e polinização de orquídeas nativas do estado de São
Paulo: Encyclia patens Hook., Phymatidium delicatulum Lindl. e
Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay.
Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento Universidade de São Paulo-USP.
Profª. Drª. Helena Maura Torezan Silingardi Universidade federal de Uberlândia.
Prof. Dr. Emerson Ricardo Pansarin Universidade de São Paulo-USP (Orientador)
Ribeirão Preto-SP 2014
O correr da vida embrulha tudo, a vida é assim: esquenta e esfria, aperta e daí afrouxa, sossega e depois desinquieta. O que ela quer da gente é coragem. O que Deus quer é ver a gente aprendendo a ser capaz de ficar alegre a mais, no meio da alegria, e inda mais alegre ainda no meio da tristeza! Só assim de repente, na horinha em que se quer, de propósito-por coragem. Será? Era o que eu às vezes achava. Ao clarear do dia.
Agradecimentos
Agradeço imensamente às instituições que financiaram este trabalho: CNPq, pela bolsa de mestrado e o PROAP pelo auxílio a mim concedido. E às instituições ambientais que permitiram a realização dos trabalhos de campo: Secretaria do Meio Ambiente do Estado de São Paulo, Administraçaõ da Reserva biológica Serra do Japi por me receber, oferecendo hospedagem e Parque Estadual de Vassununga.
Ao Prof. Dr. Emerson Ricardo Pansarin, que com dedicação e paciência me orientou durante o desenvolvimento deste projeto.
À Dra. Ludmila Mickeliunas Pansarin, pelo auxílio ao longo dessa pesquisa e pela contribuição na minha formação.
Ao Prof. Dr. Leonardo Gobbo, por nos receber no seu laboratório nas realizações das nossas análises de fragrância. Agradeço também a sua aluna Maria Elvira por fazer as análises de fragrância e identificação dos compostos.
Ao Prof. Dr. Eduardo Andrade Botelho de Almeida. Também ao Dr. Sidnei Matheus por nos ajudar com a identificação das abelhas.
À Renta e à Vera pelapaciência, competência, carinho e instruções que nos deixa seguros e queridos.
Aos amigos do laboratório Carol, Bruno, Bruno (Tolima), Evelyn, Luciano e João. À minha família, em especial a minha mãe, Maria, que foi e continua sendo minha maior força e segurança.
À minha noiva Ana Paula, que foi muito importante para meu equilíbrio na finalização do trabalho, sempre paciente nos momentos difíceis e me fazendo feliz.
À minha sogra, Neide, pelos bons momentos e conselhos.
Aos meus grandes amigos Eduardo e Paulo pelas boas discussões cientificas.
A todos os docentes e funcionários do Departamento de Biologia da FFCLRP, em especial àqueles que compõem o Programa de Pós-Graduação em Entomologia
Sumário
Lista de figuras...8 Lista de Tabelas...10 Resumo...12 Abstract...15 Introdução geral...17 Referêcnias bibliográficas...21CAPÍTULO 1: Biologia reprodutiva de Encyclia patens Hook. (Laeliinae: Orchidaceae)...24 Resumo...26 Abstract...27 Introdução...28 Material e Métodos...30 Resultados...35 Discussão...42 Conclusão...46 Referências bibliográficas...47
CAPÍTULO 2: Autocompatibilidade e polinização por abelhas Tapinotaspidini no gênero com oferta de óleo, Phymatidium Lindl. (Orchidaceae:
Oncidiinae)...54 Resumo...55 Abstract...56 Introdução...57 Material e Métodos...59 Resultados...62 Discussão...66 Conclusão...69 Referências bibliográficas...70
CAPÍTULO 3: Biologia reprodutiva, polinização e protandria em Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay (Orchidaceae: Spiranthinae)...77
Resumo...78 Abstract...79 Introdução...80 Material e Métodos...82 Resultados...87 Discussão...97
Conclusão...100
Referências bibliográficas...103
Considerações finais...109
8
Lista de figuras
CAPÍTULO 1: Biologia reprodutiva de Encyclia patens Hook. (Laeliinae: Orchidaceae).
FIGURA 1: Compostos voláteis detectados na fragrância floral de Encyclia patens...37
FIGURA 2. A, Corte longitudinal da região do cunículo. B, Corte transversas região do cunículo com reagente de Fehling. C, Corte transversal do cunículo com vermelho de Rutênio. D, Vespa Polybia ignobilis. E, Mosca Syrphidae...39
CAPÍTULO 2: Autocompatibilidade e polinização por abelhas Tapinotaspidini no
gênero com oferta de óleo, Phymatidium Lindl. (Orchidaceae: Oncidiinae).
FIGURA1. A, Inflorescência. B, Abelha Trigonopedia Moure 1941 coletando óleo no labelo...65
CAPÍTULO 3: Biologia reprodutiva, polinização e protandria em Mesadenella cuspidata
(Lindl.) Garay (Orchidaceae: Spiranthinae)
.
FIGURA 1: Compostos voláteis detectados na fragrância floral de Mesadenella cuspidata...90
FIGURA 2: Protandria em Mesadenella cuspidata. Flores em vista lateral, frontal e cortes longitudinais em diferentes fases sexuais. A-C, Fase masculina. B-D, Fase feminina. E, Corte lateral na fase masculina. F, Corte lateral na fase feminina...92
9 FIGURA 3: A, Glândula de néctar. B, Corte transversal das glândulas de néctar. C, Abelha Osiris Smith 1854. D, Abelha Augochlorella tredecim Vachal 1911. E, Abelha Rhathymus friese Ducke 1907. F, Abelha operária da tribo Meliponini pilhando néctar...94
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Lista de Tabelas
CAPÍTULO 1: Biologia reprodutiva de Encyclia patens Hook. (Laeliinae: Orchidaceae).
TABELA 1: Variação, Média (𝑋 ) e desvio padrão (DP) das estruturas florais de Encyclia patens na população de estudo...38
TABELA 2: Resultados sobre o sistema reprodutivo de Encyclia patens: porcentagem de frutos desenvolvidos nos tratamentos manuais de polinização; quantidade de frutos desenvolvidos em polinização aberta no ano de 2013 e 2014; porcentagem de sementes potencialmente viáveis obtidas nos tratamentos de polinização cruzada e autopolinização...41
CAPÍTULO 2: Autocompatibilidade e polinização por abelhas Tapinotaspidini no
gênero com oferta de óleo, Phymatidium Lindl. (Orchidaceae: Oncidiinae).
TABELA 1. Resultados obtidos nos testes sobre o sistema reprodutivo de Phymatidium delicatulum: porcentagem de frutos oriundos dos tratamentos manuais; quantidade de frutos desenvolvidos em condições naturais; portecentagem de sementes potencialmente viáveis obtidas nos tratamentos manuais...64
CAPÍTULO 3: Biologia reprodutiva, polinização e protandria em Mesadenella cuspidata
(Lindl.) Garay (Orchidaceae: Spiranthinae)
.
TABELA 1: Variação, Média (𝑋 ) e desvio padrão (DP) das estruturas florais de Mesadenella cuspidata na população...91
11 TABELA 2: Resultados alcançado sobre o sistema reprodutivo de Mesadenella cuspidata; porcentagem de frutos formados nos tratamentos manuais; quantidade de frutos desenvolvidos em polinização aberta no ano de 2013 e 2014; porcentagem de sementes potencialmente viáveis oriundas dos frutos desenvolvidos nos tratamentos de manuais...9
12
Resumo
A família Orchidaceae A. Juss. pertence a ordem Asparagales e é considerada uma das maiores famílias de plantas com flores. Com distribuição cosmopolita, sua maior diversidade e abundâcia são observadas nas florestas tropicais e subtropicais úmidas. No Brasil, estima-se que ocorram cerca de 2.449 espécies que podem ser encontradas em todos os seus biomas. Entretanto, a Mata Atlântica é considerada a mais rica em números de espécies. Encyclia patens Hook., é uma espécie epífita endêmica do Brasil e apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo no nordeste, sudeste e sul do país. A sua biologia reprodutiva foi estudada no município de São Simão, no noroeste do estado de São Paulo. A espécie produz inflorescências paniculiforme apicais e flores nectaríferas que exalam uma fragrância adocicada composta por 10 substâncias. Suas flores, que apresentam coloração verde e púrpura, abrem nos meses de junho a agosto e, quando intactas, permanecem abertas por até 21 dias. O néctar produzido por elas é secretado em uma cavidade nectarífera chamada de cunículo. Contudo, não foram observados os polinizadores de Encyclia patens. Apenas vespas sociais da espécie Polybia ignobilis Haliday 1836 e também moscas da família Syrphidae foram observados como visitantes florais. Encyclia patens é autocompatível. Entretanto, não autógama e dependente de um polinizador, uma vez que os frutos formados foram exclusivamente dos tramentos de autopolinização manual (100%) e polinização cruzada (93,3%). A taxa de sementes potencialmente viáveis dos frutos provenientes destes tratamentos foi de 57,93% para autopolinização manual e 82,52% para polinização cruzada. Em condições naturais, a população estudada apresentou uma taxa de frutificação de 0,28%. Phymatidium delicatulum Lindl. é uma espécies com hábito epifito endêmica do Brasil que ocorre no nordeste, sudeste e sul do país. Os estudos sobre a sua biologia reprodutiva foi desenvolvidos na Reserva Biológica Serra do Japi, no município de Jundiaí, estado de São Paulo. Phymatidium delicatulum corresponde a plantas muito
13 pequenas (ca. 5 cm), desprovidas de pseudobulbos. Suas inflorescências são racemosas e podem produzir até 17 flores que se abrem no verão, de dezembro a fevereiro e apresentam coloração predominantemente branca com calosidades verdes sobre o labelo, onde se localizam o elaióforos. O óleo produzido por elas é coletado por abelhas Tapinotaspidini (Tetrapedia amplitarsis Friese 1899 e Trigonopedia sp. Moure 1941), que atuam como seus polinizadores. Phymatidium delicatulum é uma espécie autocompatível e não autógama. Nos tratamentos manuais de autopolinização suas flores resultaram em 31,9% de frutos que apresentaram 57,93% de sementes potencialmente viáveis. Enquanto que nos tratamentos de polinização cruzada 54% das flores resultaram em frutos com uma porcentagem de 82,52% de sementes potencialmente viáveis. Em condições naturais a taxa de frutificação de Phymatidium delicatulum foi de 10,7%. Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay apresenta hábito terrícola. Essa espécie ocorre nas regiões sul e sudeste, ocorrendo também no centro-oeste do Brasil. Os estudos sobre a sua biologia reprodutiva e polinização foram realizados na Reserva Biológica Serra do Japi, no município de Jundiaí, e no Parque Estadual de Vassununga, no município de Santa Rita do Passa Quatro, ambos no estado de São Paulo. Mesadenella cuspidata apresenta uma inflorescência racemosa apical com flores espiraladamente dispostas. Suas flores que são protândricas apresestam coloração branca e exalam uma fragrância adocicada composta por 16 voláteis diferentes. Além disso, elas apresetam um nectário em forma de bojo formado pela união das sépalas laterais e o labelo que armazena 𝑋 = 1,43 ± 0,87 de néctar com uma concentração de 𝑋 = 39,50% ± 5,98. O néctar produzido pelas suas flores é coletado por abelhas Augochlorella tredecim Vachal 191, Osiris sp. Smith 1854 e Rhathymus friese Ducke 1907. A espécie é autocompatível e não é autógama. As flores que foram submetidas à autopolinização manual resultaram em 66,6% de frutos e as que foram submetidas ao tratamento de polinização cruzada resultaram em 86,6%. A taxa de sementes potencialmente viáveis em frutos provenientes destes
14 tratamentos foi de 78,7% em autopolinização manual e 70,9% nos frutos de polinização cruzada. Em condições naturais, no ano de 2013 as flores resultaram em 74,1% de frutos e em 2014 a taxa de frutificação foi de 62,4%.
Palavras-chave: fragrância floral, flores nectaríferas, autocompatibilidade, óleo comestível,
15
Abstract
The family Orchidaceae A. Juss. currently belongs to the order Asparagales and is considered one of the largest families among the flowering plants. With cosmopolitan distribution, its greater diversity and abundance are observed along tropical rainforest and subtropical forests. In Brazil, it is estimated are recorded ca. 2.449 species. Encyclia patens Hook., is an endemic to Brazil, occurring in the northeastern, southeastern and southern regions. The study on its reproductive biology was conducted in municipality of São Simão in the northwestern of state of São Paulo. Encyclia patens produce a paniculate inflorescence, which produces nectariferous flowers that emit a sweet fragrance composed of 10 different volatile compounds. Its flowes are green and purple. The flowering period occur from June to August and each flower lasts up to 21 days. The nectar produced is secreted in a nectar chamber called cuniculus. Does not were observed the pollinators of Encyclia patens. Only social wasps (Polybia ignobilis Haliday 1836) and Syrphidae flies were recorded as floral visitors. Encyclia patens is self-compatible. However, it is a pollinator-dependent species. Fruits were formed exclusively in self-polination (100%) and cross-pollination (93.3%) treatments. The tax of potentially viable seeds from fruits of these treatments was 57.93% in manual self-pollinations and 82.52% in manual cross-pollinations. Under natural conditions, the studied population the fruit set was 0.28%. Phymatidium delicatulum Lindl., occurs in the northeast, southeast and south of Brazil. Its reproductive biology was studied in the Biological Reserve of Serra do Japi, in Jundiaí, state of São Paulo. Phymatidium delicatulum produces racemose inflorescences with up to 17 flowers that open in the summer, from December to February. The flowers are white with a green callus on the lip, where by the elaiophores.The oil produced by its flowers is collected by Tapinotaspidini bees of the specie Tetrapedia amplitarsis Friese 1899 and bees of the genus Trigonopedia Moure 1941. The species is self-compatible and not autogamous. In the treatment of manual self-pollination
16 resulted in 31.9% of fruit set and presented 57.93% of potentially viable seeds. In cross-pollinations 54% of flowers set fruits, with a percentage of 82.52% of potentially viable seeds. Under natural conditions the fructification tax of Phymatidium delicatulum was 10.7%. Mesadenella cuspidata (Lindl.) Garay occur in south, southeastern and central western Brazil. The reproductive biology and pollination of this species were studied in the Biological Reserve of Serra do Japi, in the municipality of Jundiaí and Parque Estadual de Vassunga, in the municipality of Santa Rita do Passa Quatro. Mesadenella cuspidata possesses an apical raceme with flowers arranged in spiral. Its flowers are protandrous, have white coloration and emit a sweet fragrance composed of 16 different substances. Moreover, they a nectary-shaped bunt forms by the union of the lateral sepals and the lip that produces 𝑋 = 1.43 ± 0.87 nectar with a concentration of 𝑋 = 39.50% ± 5.98. The nectar produced by the flowers is collected by bees Augochlorella tredecim Vachal 1911, Osiris sp. Smith 1854 and Rhathymus friese Ducke 1907. Mesadenella cuspidate is self-compatible and not autogamous. The manual self-pollinations resulted in 66.6% of fruits and the cross-pollination resulted in 86.6% of fruit set. The tax of potentially viable seeds from the fruits of these treatments was 78.7% in manual self-pollination and 70.9% in cross-pollination. Under natural conditions, the fruit set was 74.1% of fruit in 2013 flowering period and in 2014 the tax of fruit set was 62.4%.
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Introdução geral
A família Orchidaceae A. Juss. pertence a ordem Asparagales (Stevens 2001) e é considerada uma das maiores famílias de plantas com flores, compreendendo cerca de 24.000 espécies distribuidas em 800 gêneros (Dressler1995).
As orquídeas apresentam distribuição cosmopolita. No entanto, sua maior diversidade e abundâcia são observadas nas florestas tropicais e subtropicais úmidas (Dressler 2005). No Brasil, estima-se que ocorram aproximadamente 2.449 espécies em 240 gêneros, que podem ser encontradas em todos os biomas (Barros et al. 2014). Todavia, a Mata Atlântica é considerada a mais rica em números de espécies (Pabst & Dungs 1975).
A maior parte das espécies em Orchidaceae apresenta hábito epífito (Dressler 1993). Entretanto, na família é comum encontrar espécies que vivem sobre rochas (rupícolas), no solo (terrícolas) e em locais alagados (palustres). Além disso, há também espécies que não apresentam clorofila e vivem associadas a fungos micorrízicos (mico-heterotróficas).
Além da diversidade de hábitos, as orquídeas apresentam diferentes estratégias relacionadas, basicamente, com a obtenção e reserva de água e nutrientes como caules intumescidos formando pseudobulbos, folhas carnosas, raízes dotadas de velame e o próprio crescimento em touceiras que permite o acúmulo de matéria orgânica, são algumas destas estratégias. Por outro lado, ao contrário dos órgãos vegetativos que podem apresentar grande diversidade estrutural, suas flores são relativamente uniformes quanto ao número e arranjo de suas partes. Geralmente, elas são zigomorfas e constituídas de três sépalas e três pétalas, sendo uma das pétalas diferenciada em uma estrutura denominada labelo. Os órgãos reprodutivos são fundidos em uma única estrutura, a coluna. A coluna apresenta uma ou mais raramente duas ou três anteras e uma região estigmática, formada pela fusão dos três lobos do estigma (Dressler 1981).
18 Na maioria das espécies, os grãos de pólen são reunidos em duas ou mais polínias, e estas, em conjunto com o viscídio (e estipe em alguns gêneros), que é a extremidade adesiva responsável pela fixação ao polinizador, constituem o polinário. O polinário, por sua vez, é separado do estigma por uma região denominada rostelo que tende a evitar a ocorrência de autopolinização espontânea de suas flores (Dressler 1993).
Apesar de apresentar uma disposição estrutural uniforme, as flores das orquídeas possuem uma grande variação em detalhes estruturais, na forma e no tamanho dos componentes básicos, levando ao surgimento de estruturas muito complexas em algumas espécies (van der Pijl & Dodson 1966). Tal complexidade pode ser atribuída à importante relação entre as orquídeas e seus polinizadores, o que resulta em grande especialização e diversidade de sua morfologia floral (Dressler 1981, van der Pijl & Dodson 1966, Fay & Chase 2009), podendo existir co-evolução entre determinadas espécies e seus polinizadores (Pabst & Dungs 1975). Sendo assim, havendo mudanças significativas nas estruturas florais, nas características químicas ou fenotípicas das plantas, de modo recíproco podem ser catalisados pelos seus polinizadores ou vice-versa (van der Pijl & Dodson 1966).
As orquídeas apresentam um número consideravelmente abundante de polinizadores não especializados que são raramente eficientes no sucesso da polinização de muitas espécies (Herrera 1989). A especialização floral para polinizadores específicos e a limitação na diversidade dos polinizadores é interpretada como propiciador na redução do custo de energia da planta no sucesso da transferência de pólen entre indivíduos (Tremblay 1992).
Cerca de um terço das espécies das orquídeas não oferecem nenhum recurso aos seus polinizadores e a polinização ocorre por engano (Ackerman 1986). Além disso, algumas espécies são aptas a se reproduzirem sem o auxílio de veteros bióticos e se autopolinizam espontâneamente (e.g. Catling 1980, 1990, Catling & Catling 1991, Pansarin et al. 2008,
19 Aguiar et al. 2012). Considerando-se que em Orchidaceae a maioria das espécies é autocompatível (van der Pijl & Dodson 1966, Dressler 1981).
Por outro lado, entre as espécies com recursos, o néctar é a principal recompensa oferecida aos polinizadores. No entanto, o polén, o pseudopólen, os óleos florais, as fragrâncias, as ceras (van der Pijl & Dodson 1966, Dressler 1993) e as substâncias viscosas semelhantes a resinas também são comumente encotradas (Davies et al. 2003).
Essa grande variedade de recursos presentes nas orquídeas podem ser atribuídas à diversidade de glândulas florais como os nectários (Catling 1983, 1987, Singer & Sazima 1999, Pansarin et al. 2012, Cabral & Pansarin 2014), os elaióforos (Vogel 1974, Buchmann 1987, Mickeliunas et al. 2006, Pansarin & Pansarin 2011), os osmóforos (Pansarin & Amaral 2009, Pansarin et al. 2013) entre outras estruturas produtoras de recursos que podem ser encotradas nas suas flores (van der Pjil & Dodson 1966).
O néctar, no entanto, é um composto explorado por vários grupos de animais como abelhas, vespas, moscas, borboletas, mariposas e aves como beija-flores e olho-branco (van der Pijl & Dodson 1966, Catling 1987, Dressler 1993, Singer & Cocucci 1999, Singer & Sazima 1999, 2000, Singer 2002, Micheneau et al. 2008). Entre os Hymenoptera, as abelhas principalmente, são consideradas o grupo mais importante de polinizadores das orquídeas, sendo responsável pela polinização de cerca de 60% de todas as espécies (van der Pijl & Dodson 1966).
Ainda assim, menos freqüentes, porém não menos importantes outros animais também podem atuar como polinizadores das orquídeas. Em Grobya amherstiae Lindl., por exemplo, uma espécie nativa ocorrente no interior do estado de São Paulo, besouros foram observados polinizado suas flores (Mickeliunas et al. 2006). Além disso, em uma espécie do gênero Angraecum sp. (Angraeciinae), as flores são polinizadas por grilos (Micheneau et al.
20 2010). E na espécie Cymbidium serratum Schltr., o único registro de mamíferos, tendo ratos selvagens como visitantes florais (Wang et al. 2008).
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Capitulo 1
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Resumo
Encyclia patens Hook., é uma espécie endêmica do Brasil que apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo nas regiões nordeste, sudeste e sul do país. Os estudos sobre a sua biologia reprodutiva foram realizados no município de São Simão, no noroeste do estado de São Paulo. Essa espécie é epífita e produz inflorescências paniculiforme apicais e flores nectaríferas que exalam uma fragrância adocicada composta por 10 substâncias. Suas flores de coloração verde e púrpura se abrem nos meses de junho a agosto e, quando intactas, permanecem abertas por até 21 dias. O néctar produzido por elas é secretado em uma cavidade nectarífera, chamada cunículo. Não foram observados os polinizadores de Encyclia patens. Apenas vespas sociais da espécie Polybia ignobilis Haliday 1836 e também moscas da família Syrphidae foram observados como visitantes florais. Encyclia patens é autocompativel. Entretanto, não autógama e dependente de um polinizador, uma vez que os frutos formados foram exclusivamente dos tramentos de autopolinização manual (100%) e polinização cruzada (93,3%). A taxa de sementes potencialmente viáveis dos frutos provenientes destes tratamentos foi de 57,93% para autopolinização manual e 82,52% para polinização cruzada. Em condições naturais, a população estudada apresentou uma taxa de frutificação de 0,28%.
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Abstract
Encyclia patens Hook., is endemic to Brazil, occurring in the Northeastern, Southeastern and Southern regions. The study on its reproductive biology was conducted in municipality of São Simão in the northwestern of state of São Paulo. This specie is epiphytic with paniculate apical inflorescence, which produces nectariferous flowers and that emits sweet fragrance composed of 10 different volatile compounds. The flowers are green and purple. The flowering period occur from June to August and each flower up to 21 days. The nectar produced is accumulated in a nectar chamber called cuniculus. Does not were observed the pollinators of Encyclia patens. Only social wasps (Polybia ignobilis Haliday 1836) and Syrphidae flies were recorded as floral visitors. Although the pollinators have not been observed, Encyclia patens is self-compatible. However, it is a pollinator-dependent species, since fruits were formed exclusively in self-polinition (100%) and cross-pollination (93.3%) treatments. The tax of potentially viable seeds from fruits of these treatments was 57.93% in manual self-pollination and 82.52% in manual cross-pollination. In natural conditions, the studied population the fruit set was 0.28%.
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Introdução
A família Orchidaceae apresenta alguns dos mais intrigantes e complexos mecanisnos de polinização conhecidos, sendo as suas flores polinizadas por diversos grupos de insetos como Diptera, Lepidoptera, Coleoptera e Hymenoptera (van der Pijl & Dodson 1966, Dressler 1981).
Entre as orquídeas, várias espécies atraem os insetos para as suas flores com a produção de fragrâncias florais que apresentam um papel importante na polinização. Tais compostos atuam como sinalizadores para os insetos que visitam suas flores em busca de algum recurso (van der Pijl & Dodson 1966, Singer 2002, Stökl et al. 2007, Humeneau et al. 2011).
Suas flores produzem uma série de recursos como óleos florais, ceras, substâncias viscosas semelhantes a resinas e o néctar, composto considerado a principal recompensa oferecida aos seus polinizadores (van der Pijl & Dodson 1966, Davies et al. 2003). Tal composto pode ser produzido em estruturas secretoras como nectários florais (Cabral & Pansarin,dados não publicados), nectários extraflorais (Leitão et al. 2014), glândulas nectaríferas (Pansarin 2003), ou ainda em cunículos, um tipo de nectário comum encontrado em espécies da subtribo Laeliinae (Dressler 1993, Pridgeon et al. 1999).
Laeliinae é uma subtribo restrita a região Neotropical que compreende cerca de 1.500 espécies distribuídas em 43 gêneros (Dressler 1993). O grupo constitui um dos melhores exemplos de radiação adaptativa entre as orquideas, sendo encontrados todos os principais grupos de polinizadores observados na família (van der Pijl & Dodson 1966, Dressler 1981). Apesar dos dados serem escassos, a maioria dos gêneros da subtribo é polinizado por Hymenoptera. No entanto, em Epidendrum, que é considerado o maior gênero do grupo, os polinizadores são principalmente os Lepidoptera (van der Pijl & Dodson 1966).
29 O gênero Encyclia Hook. é neotropical e apresenta aproximadamente 120 espécies distribuídas pelos Estados Unidos, México, Brasil e Argentina (van den Berg et al., 2005). Encyclia patens Hook. que é uma dessas espécies, apresenta ampla distribuição geográfica no Brasil, ocorrendo desde o Rio Grande do Sul até o Pernambuco (Pansarin & Pansarin, 2010). Contudo, não existem estudos envolvendo a sua biologia reprodutiva e polinização. Somente vespas foram observadas visitando suas flores. Além disso, foi documentada baixa desenvolvimento de frutos em condições naturais (Pansarin & Pansarin, 2010).
O presente trabalho teve como objetivos estudar a biologia reprodutiva de Encyclia patens. Para isso foram desenvolvidas análises sobre os aspectos de sua fenologia, morfologia floral, análise química das fragrâncias florais, observações sobre seus polinizadores e mecanismos de polinização, bem como quantificação do desenvolvimento de frutos em condições naturais.
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Material e Métodos
Área de estudo
Os estudos com Encyclia patens foram desenvolvidos no município de São Simão (aproximadamente 21°29‟S e 47°36‟O), no estado de São Paulo. Essa região é caracterizada por altitudes que variam entre 620 e 700 m e temperaturas médias mensais que variam entre 17,6 °C no mês mais frio (julho) e 23,5 °C no mês mais quente (fevereiro). A precipitação média anual é de aproximadamente 1478 mm. De acordo com a classificação de Köppen (1948), o clima da região enquadra-se na categoria Cwa, ou seja, temperado, macrotérmico moderadamente chuvoso e com inverno seco não rigoroso (Pires Neto et al. 2005).
Estudos sobre a Fenologia
As observações sobre a fenologia de Encyclia patens foram realizadas sobre 4 indivíduos no município de São Simão interior do estado de São Paulo. Para cada indivíduo foi observado desenvolvimento de inflorescências, botões florais e flores, o período de antese, a longevidade floral e a deiscência dos frutos. As observações foram realizadas em oito expedições na população de estudo entre o mês de maio de 2012 a setembro de 2013 e entre abril e julho de 2014. As visitas ao campo foram intensificadas no período de floração para estudo da biologia floral e observações dos polinizadores.
Análise química dos compostos voláteis
Para a realização da análise de headspace com microextração em fase sólida (HS-SPME) dos voláteis florais algumas flores foram colocadas separadamente em um frasco de
31 vidro de 20 ml e submetidos a uma temperatura constante de 35ºC por 60 minutos. Nesse período, a fibra de sílica fundida coberta com 10µm de polidimetilsiloxano (PDMS) (Supelco Inc., Bellefont, PA) foi inserida no frasco e exposta ao headspace floral.
A análise dos compostos voláteis florais foi processada usando um cromatógrafo a gás acoplado a um espectrômetro de massa QP 2010 Shimadzu. Um detector de espectrometria com fonte de ionização por elétrons (EI-MS) foi operado sob a temperatura da fonte a 250ºC, uma corrente de emissão de 60 µA e uma energia de ionização de 70 e V. O tempo global de corrida foi registrado em modo de varredura completo (40-500 m/z de variação de massa) e uma proporção de leitura de 0.30 scan s-1. Os compostos foram dissolvidos termicamente da fibra SPME no injetor por 2 minutos a 250ºC, com modo de injeção em splitless. Esses compostos foram separados em uma coluna capilar DB-5MS (J & W Agilent) de 30 m x 0,24 mm, sendo a espessura do filme de 0,25µm, com He (79,7 kPa) como gás de arraste e fluxo de 1,3 ml min-1. A temperatura do GC se iniciou a 60ºC, e aumentou linearmente 30ºC por minuto até atingir 240ºC, durante 60 minutos.
Os dados de cromatografia foram analisados com o software GC-MS Solution e os compostos voláteis foram identificados com a biblioteca NIST 62, Wiley 7 e FFNSC 1.3, por comparação dos espectros de MS. Além disso, os índices de retenção de Kováts (KI) de cada composto foram calculados de acordo com a fórmula de Kováts (Robards et al. 1994). As áreas de cada pico das cromatogramas foram integradas para determinar a abundância relativa de cada composto.
Estudos sobre morfologia floral
Para realização dos estudos sobre a morfologia floral de Encyclia patens, 30 flores frescas foram coletadas em indivíduos coletados previamente na população de estudo e
32 mantidas em cultivo no Orquidário LBMBP da FFCLRP-USP. Suas estruturas foram medidas e analisadas sob um microscópio estereoscópico binocular utilizando um paquímetro de precisão. Foram observadas a forma, a simetria, o tamanho e o formato das peças florais, como pétalas, sépalas, labelo, coluna, antera e polinário. O material testemunho de Encyclia patens foi depositado no Orquidário do Laboratório de Biologia Molecular e Biossistemática de Plantas-LBMBP, FFCLRP-USP Universidade de São Paulo (http://splink.cria. org.br/manager/detail?setlang=pt&resource=LBMBP).
Análises histoquímicas das regiões produtoras de recursos
Para a realização dos testes, cortes a mão livre foram obtidos a partir de flores frescas coletadas em indivíduos mantidos em cultivo no orquidário LBMBP. Os testes histoquímicos foram realizados para detectar substâncias pécticas com solução aquosa de vermelho de Rutênio 0,02% (Jensen 1962) e teste para açucares redutores com reagente de Fehling (Purvis et al.1964).
Visitantes florais e mecanismo de polinização
As observações focais sobre os visitantes florais foram realizados em condições naturais nos períodos de floração no ano de 2013 e 2014. Em 2013, as observações foram realizadas entre os dias 26 de junho e 9 de julho nos períodos de 08:00-17:00h. Em 2014, as observações foram realizadas entre os dias 26 de junho e 16 de julho. Todavia, devido as adivesidades climáticas como fortes ventos, dias nublados e com chuvas que pudessem impossibilitar as observações por todo o período, elas foram realizadas no período entre 08:00-13:00h. Foram realizadas um total de 132 horas de observações. Durante as
33 observações, dois indivíduos com flores intactas foram marcadas no final de cada dia e checadas na manhã seguinte para verificar a possível ocorrência de polinização noturna.
Sistema reprodutivo
Para investigar o sistema reprodutivo de Encyclia patens foram utilizados cinco indivíduos que foram coletados e mantidos em cultivo no orquidário LBMBP. Todos os indivíduos foram submetidos a três diferentes tratamentos que são: autopolinização manual (n=30 flores), emasculação (n=30 flores) e polinização cruzada (n=30 flores). Além disso, 30 flores foram utilizadas para a realização das observações sobre a presença de autopolinização espontânea.
Taxa de frutificação em condições naturais
As informações sobre a taxa de frutificação em condições naturais foram obtidas no município de São Simão em setembro de 2013 e 2014. Foram utilizados 30 indivíduos da população de estudo, contando-se o número flores produzidas e a quantidade de frutos desenvolvidos.
Análise da viabilidade das sementes
Para a análise sobre a viabilidade das sementes, todos os frutos formados a partir dos tratamentos manuais foram amostrados. Uma amostra de 200 sementes por frutos foi analisada sob um microscópio de luz. As sementes foram classificadas em viáveis e não viáveis de acordo com o desenvolvimento dos embriões, sendo consideradas não viáveis as
34 sementes sem embriões ou com embriões rudimentares (Pansarin et al. 2008). As sementes foral coletadas quando os frutos estavam deiscentes.
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Resultados
Encyclia patens é uma espécie com hábito epífito e folhas lineares com inflorescências paniculadas apicais que podem produzir até 40 flores. Suas flores que exalam uma fragrância adocicada se abrem no inverno, nos meses de junho a julho. Tal fragrância é composta por dez substâncias voláteis distintas. O volátil mais abundante é o β-α-trans-bergamoteno que nas análises químicas apresentou uma porcentagem de área relativa de 27%, depois o composto trans-ocimeno com 25.32%, seguido pelo trans-cariofileno com 18.1 %, o α-farneseno com 12.6%, o linalol com 7.26%, o germacreno D com 1.52%, o acetato fenetilico com 1.37%, o β-cis-ocimeno com 1.35%, o α-bisaboleno com 0.87% e por último, o menos abundante isolongifolene com uma porcentagem de área relativa de 0.9% (Fig. 1).
As flores de Encyclia patens são pediceladas, ressupinadas de coloração predominantemente verde e púrpura e se abrem logo pela manhã. Cada flor pode durar cerca de 21 dias. Suas sépalas dorsais medem 𝑋 = 1,62 ± 0,06 x 0,54 ± 0,04 são oblanceoladas, levemente curvadas para frente, apresenta ápice apiculado e margem lisa; as sépalas laterais medem 𝑋 = 1,61 ± 0,05 x 0,59 ± 0,04, são oblanceoladas, levemente falcadas e com ápice apiculado; as pétalas medem 𝑋 = 1,57 ± 0,07 x 0,60 ± 0,05 são falcadas e atenuadas; o labelo é 3-lobado mede 𝑋 = 1,46 ± 0,06 x 0,89 ± 0,07 e apresenta coloração amarelo-esverdeado com linhas púrpuras longitudinais (guias de néctar), margem ondulada; os lobos laterais são de coloração branco-esverdeada com linhas púrpuras na base e envolvem a coluna (𝑋 = 0,75± 0,05 x 0,89 ± 0,07) que é sigmóide e apresenta aurículas no ápice; o polinário mede ca. 0.1 cm e é formado por 4 polínias discóides de consistência cartilaginosa; a antera mede ca. 0,2 cm é oval e de coloração amarela (Tabela 1).
36 As flores de Encyclia patens produzem uma pequena quantidade de néctar que fica acumulado por um dia após a antese da flor no interior do cunículo que apresenta a epiderme recoberta por papilas (Fig. A). A partir dos testes histoquímicos com o reagente de Fehling notou-se a presença de açucares redutores no protoplasto das células (Fig. 2B). Além disso, através dos testes histoquímicos com vermelho de Rutênio verificou-se a presença de substâncias pécticas nas células epidérmicas (Fig. 2C).
Não foram observados os polinizadores de Encyclia patens. Vespas sociais da espécie Polybia ignobilis Haliday 1836 (Fig. 2D) e também moscas da família Syrphidae (Fig. 2E) foram observadas atuando apenas como visitantes florais. A vespa Polybia ignobilis visitou somente uma flor pousando sobre o labelo e abandonando a flor logo em seguida. A mosca Syrphidae visitou rapidamente a flor pousando sobre o labelo. Em todas as visitas os insetos não tocaram as estruturas reprodutivas das flores.
Encyclia patens é uma espécie autocompatível. Todavia, depende de um polinizador para a transferência de pólen. Não houve a formação de frutos em flores emasculadas e nas flores submetidas à autopolinização espontânea. O desenvolvimento de frutos foi exclusivamente de flores submetidas à polinização cruzada (93,3%) e autopolinização manual (100%). A taxa de sementes potencialmente viáveis nos frutos provenientes destes tratamentos foi de 57,93% em autopolinização manual e 82,52% nos frutos originados dos tratamentos manuais de polinização cruzada. Em condições naturais, a população estudada apresentou uma taxa de frutificação de 0,28% (Tabela 2).
37 Figura 1: Abundância relativa dos compostos voláteis detectados na fragrância floral de Encyclia patens, no município de São Simão-SP.
0 5 10 15 20 25 30 α-trans-bergamoteno β-trans-ocimeno trans-cariofileno α-farneseno linalol germacreno D acetato fenetilico β-cis-ocimeno isolongifolene α-bisaboleno Abundância relativa C om post os vol át ei s
38 Tabela 1: Variação, Média (𝑋 ) e desvio padrão (DP) das estruturas florais de Encyclia patens na população de estudo, município de São Simão-SP.
Estruturas Comprimento (cm) Variação 𝑿 DP Largura (cm) Variação 𝑿 DP Pétalas 1,5-1,7 1,57 0,07 0,5-0,7 0,60 0,05 Labelo 1,3-1,6 1,46 0,06 0,8-1,0 0,89 0,07 Sépalas 1,5-1,7 1,61 0,05 0,5-0,7 0,59 0,04 Sépala dorsal 1,5-1,7 1,62 0,06 0,5-0,6 0,54 0,04 Coluna 0,7-0,8 0,75 0,05 0,8-1,0 0,89 0,07 Antera 0,2 - - - - - Polinário 0,1 - - - - -
39 FIGURA 2: Encyclia patens Hook. (Orchidaceae: Laeliinae). A, Corte longitudinal da região do cunículo com néctar. B, Corte transversal da região do cunículo com reagente de Fehling (precipitado castanho escuro) (aumeto=100x). C, Corte transversal da região do cunículo
40 com reagente vermelho de Rutênio (aumento=100x). D, Vespa Polybia ignobilis visitante das flores de E.patens. E, Mosca Syrphidae visitante das flores.
41 Tabela 2: Resultados obtidos nos testes sobre o sistema reprodutivo de Encyclia patens. porcentagem de frutos desenvolvidos nos tratamentos manuais de polinização cruzada, autopolinização manual e em polinização aberta na população no anos anos de 2013 e 2014; porcentagem de sementes potencialmente viáveis obtidas nos tratamentos manuais de polinização cruzada e autopolinização.
Tratamentos Flores Frutos Sementes
Autopolinização manual 30 30 (100%) 4908 (81,8%) Polinização cruzada 30 28 (93,3%) 4420 (73,6%) Emasculação 30 350 - 1 (0,28%) - - Polinização aberta (2013) Polinização aberta (2014) - - *
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Discussão
Encyclia patens, é uma espécie epífita endêmica do Brasil que apresenta flores fragrantes que exalam um forte cheiro adocicado. Tal fragrância, por análise GC-MS, apresentou ser composta por10 substâncias distintas que são: β-α-trans-bergamoteno como o mais rico, depois otrans-ocimeno, otrans-cariofileno, o α-farneseno, o linalol, ogermacreno D, o acetato fenetilico, o β-cis-ocimeno, oα-bisabolenoe por último, o menos abundante isolongifolene. Esses compostos são líquidos aromáticos que podem estar presentes em flores, folhas, sementes, ervas, madeira, frutos e raízes de várias espécies de plantas, podendo ter em sua constituição misturas muito complexas como terpenóides que podem conter até 100 ou mais compostos orgânicos. Na maioria dos casos, os óleos essências podem apresetar monotepenos, sesquiterpenos e com menor freqüência os diterpenos. No qual, seus constituintes podem estar envolvidos em múltiplas funções orgânicas, como alcoóis, cetonas éteres, ésteres aldeídos. No entanto, atuando como fitoalexinas, os terpenos apresentam diversas funções nas plantas, podendo agir como repelentes de insetos, agente na defesa contra herbívoro, entre outros (Burt et al. 2004) ou atração de polinizadores (Dodson 1969).
Na maioria das espécies de plantas com flores, a reprodução sexuada é mediada pela interação entre os órgãos reprodutores das flores e o inseto ou animal polinizador que transfere o pólen ou polínia como ocorre nas flores de muitas especies de orquídeas (e.g. Pansarin 2003, Pansarin & Amaral 2008, Pansarin & Pansarin 2013). Os polinizadores são geralmente atraídos pelas combinações de cores e fragrâncias florais, associadas a algum tipo de recompensa alimentar como à própria fragrância, às resinas, os lipídios, o pólen e o néctar (e.g. Curry et al. 1991, Davies et al. 2003, Mickeliunas et al. 2006, Pansarin & Pansarin 2013).
43 As flores de Encyclia patens produzem néctar, composto que é secretado no interior de um nectário do tipo cunículo. Os testes histoquímicos com reagente de Fehling que evidenciaram a presença de açucares redutores e com o reagente vermelho de rutênio vereficando-se a presença de substâncias pécticas nas células epidérmicas do cunículo. O cunículo, em Laeliinae, está presente também em outras espécies do grupo, como por exemplo, em Pseudolaelia corcovadensis Porto & Brade (Borba & Braga 2001), em Brassavola flagellaris Barb. Rodr. (Stpiczyńska et al. 2010) e em algumas espécies do gênero Epidendrum (e.g. Pansarin 2003, Pansarin & Amaral 2008, Almeida & Figueiredo 2003, Fuhro et al. 2010, Pinheiro & Cozzolino 2013).
Suas flores apresentam antese diurna e permanecem abertas por um período relativamente longo, característica, que de acordo com Endress (1998), pode ser observada em espécies que recebem poucas visitas ou visitas imprecisas e pode estar relacionada com compensação por espécies raramente polinizadas como ocorre em outras espécies no interior do estado de São Paulo (e.g. Mickeliunas et al. 2006, Pansarin & Pansarin 2011).
Não foram registrados os polinizadores de Encyclia patens e sim vespas sociais da espécie Polybia ignobilis e uma espécie de moscas da família Syrphidae apenas visitando as suas flores. No entanto, vespas já haviam sido doumentadas visitando suas flores anterirormente por Pansarin & Pansarin (2010). Segundo Dodson (1967), as vespas são responsáveis pela polinização de 3% das espécies de orquídeas. Portanto, as vespas foram observadas visitando flores de outras espécies de orquídeas, como Caladenia, na Austrália (Stoutamire 1983) e Prostechea vespa (Sw.) W. E. (Higgins) no Brasil (Clemente et al. 2012).
Os Diptera são considerados o segundo mais importante grupo de polinizadores das orquídeas (van der Pijl& Dodson 1966, Christensen 1994). No entanto, várias espécies têm
44 sido documentas como sendo polinizadas por moscas (e.g. Borba & Semir 1998, Singer & Cocucci 1999, Borba & Semir 2001). Além disso, entre elas, há espécies que são polinizadas por esses insetos que visitam as suas flores em busca de néctar (e.g. Kunth 1909, Gilbert 1958, Bernhardt & Burns-Balogh 1986), como por exemplo observado na espécie Epidendrum tridactylum Lindl., no qual quatro famílias de díptera foram documentadas visitando as suas flores, entre as quais uma espécie de Syrphidae (Ornidia obesa Fabricius) atua como polinizador (Pansarin & Pansarin 2013). Todavia, existem espécies como observado em Govenia utriculata (Sw.) Lindl. por Pansarin (2008), que são polinizadas atraindo os Syrphidae por engano, similar ao sistema observado no gênero Thelymitra, no qual suas flores se abrem no mesmo período em que outras espécies florescem, mimetizando seus estames (e.g. Bernhardt & Burns-Balogh 1986, Dafni & Calder 1987, Burns-Balogh & Berchard 1988).
A espécie Encyclia patens é autocompativel, porém dependente de um polinizador biótico para transferência de pólen, uma vez que não houve desenvolvimento de frutos nos tratamentos de emasculação e nas flores submetidas ao teste de autopolinização espontânea. A autocompatibilidade é comum entre as orquídeas e o desenvolvimento de frutos provenientes de autogamia é geralmente evitada por barreiras mecânicas ou etológicas eficientes da própria flor (van der Pijl & Dodson 1966, Catling & Catling 1991, Borba & Semir 1999).
Considerando que as flores de Encyclia patens produzem néctar como recurso para seus polinizadores, o número de frutos originados em condições naturais são considerados extremamente baixos quando comparados com outras espécies que ocorrem na mesma área de estudo e que também produzem néctar como por exemplo Campylocentrum micranthum (Cabral & Pansarin, dados não publicados) ou quando comparadas com algumas outras
45 espécies da subtribo Laeliinae que ocorrem no interior do estado como Epidendrum tridactylumLindl. (Pansarin & Pansarin 2013).
O desenvolvimento de sementes potencimalmente viáveis nos frutos provenientes dos tratamentos manuais realizados em Encyclia patens, no entanto, foi considerávelmente alto. Valores aproximados foram observdos em Phymatidium delicatulum e Mesadenella cuspidata. Contudo, em outras espécies estudadas no estado de São Paulo, os resultados observados são diferentes. Em espécies do gênero Eulophia R.Br., Cattleya Lindl., Laelia Lindl., Pleurothallis e Pseudolaelia Porto & Brade são considerdos relativamente baixos (Lock & Profita 1975, Stort & Martins 1980, Stort & Galdino 1984, Borba et al. 2001, Borba & Braga 2003).
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Conclusão
A espécie Encyclia patens é epífita. Suas flores são ressupinadas e de coloração verde e púrpura. Cada flor dura até 21 dias. A espécie floresce no inverno nos meses de junho a agosto. Suas flores exalam uma fragrância adocicada composta por dez voláteis diferentes. Além disso, suas flores produzem uma pequena quantidade de néctar que fica exposto somente no primeiro dia após a antese. Não foram observados os polinizadores de Encyclia patens. Entretanto, vespas sociais da espécie Polybia ignobilis e moscas da família Syrphidae foram observadas sobre as suas flores, porém não atuando como seus polinizadores. A espécie é autocompativel. Todavia, dependente de um polinizador para transferência de pólen. Frutos foram formados apenas nos tratamentos de polinização cruzada e autopolinização manual. A taxa de semente potencialmente viáveis nos frutos provinientes destes tratamentos foi consideravelmente alta. Em condições naturais, a população estudada apresentou uma taxa de frutificação baixa.
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