UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO CURSO DE MESTRADO EM ORTODONTIA BIOLOGIA MOLECULAR DA MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA EDUARDO ERNST MASSARELLI

UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO

CURSO DE MESTRADO EM ORTODONTIA

BIOLOGIA MOLECULAR DA MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA

EDUARDO ERNST MASSARELLI

Dissertação apresentada à Universidade

Cidade de São Paulo, como parte dos

requisitos para concorrer ao título de

Mestre em Ortodontia.

São Paulo

2011

UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO

CURSO DE MESTRADO EM ORTODONTIA

BIOLOGIA MOLECULAR DA MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA

EDUARDO ERNST MASSARELLI

Dissertação apresentada à Universidade

Cidade de São Paulo, como parte dos

requisitos para concorrer ao título de

Mestre em Ortodontia.

Orientador: Prof. Dr. Flávio Vellini Ferreira

São Paulo

2011

FOLHA DE APROVAÇÃO

Massarelli. E. E., Biologia Molecular da Movimentação Ortodôntica. [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Universidade Cidade de São Paulo; 2011.

São Paulo, ____/____/________.

Banca Examinadora

1)...

Julgamento:... Assinatura:...

1)...

Julgamento:... Assinatura:...

1)...

Julgamento:... Assinatura:...

Resultado:...

Agradecimentos

Ao meu orientador, coordenador do curso de mestrado em

Ortodontia da UNICID, Professor Doutor Flávio Vellini Ferreira, pela

sua paciência e empenho para conclusão deste trabalho.

Á minha filha Luiza, que já me ensinou tanto em tão pouco

tempo, e me dá forças para lutar por qualquer objetivo. Á minha avó

Heliette, por seu carinho e compaixão.

Ao meu co-orientador, Cláudio Antônio Barbosa de Toledo, in

memoriam.

Ao Professor Doutor Flávio Augusto Cotrim Ferreira, pela

confiança e por estar sempre disponível para ajudar.

Aos meus Professores, Doutores Ana Carla Raphaelli Nahás,

Daniela Gamba Garib, Danilo Furquim Siqueira, Hélio Scavone Jr.,

Karyna do Valle-Corotti, Paulo Eduardo Guedes Carvalho, Rívea

Inês Ferreira, pela disponibilidade em dividir seus conhecimentos.

Massarelli. E. E., Biologia Molecular da Movimentação Ortodôntica. [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Universidade Cidade de São Paulo; 2011.

RESUMO

Na última década, a biologia molecular tem sido uma ferramenta de estudo cada vez mais presente na pesquisa ortodôntica. Estar atento ao novo conhecimento que emerge desvendando as bases moleculares da movimentação ortodôntica é um pré-requisito para o ortodontista que almeja a excelência em sua prática clínica. O foco desse estudo restringe-se a três moléculas-chave, que regulam a diferenciação e ativação dos osteoclastos e, em última instância, a reabsorção óssea necessária para movimentação ortodôntica. São elas o Receptor Ativador do Fator Nuclear kappa β (RANK), o seu ligante (RANKL) e a Osteoprotegerina (OPG). O presente estudo teve por objetivo realizar um levantamento bibliográfico do papel dessas moléculas na movimentação ortodôntica, assim como das ferramentas que o ortodontista tem em mãos para influenciá-las e as terapias que surgem como possibilidades futuras de garantir ao seu paciente um tratamento ortodôntico cada vez mais eficaz e seguro. Através dos trabalhos científicos analisados, concluiu-se que, através da variação de direção, magnitude e duração da força ortodôntica, o ortodontista pode interferir no padrão de expressão de RANKL e OPG no ligamento periodontal. Não obstante, o uso do laser de baixa potência para aumentar a movimentação ortodôntica apresenta-se como uma terapia a ser utilizada em um futuro próximo, assim como a utilização de fármacos que

garantirão uma melhor contenção pós-tratamento através da inibição da movimentação dentária.

Palavras-chave: Biologia Molecular, RANK, RANKL, OPG, Movimentação Dentária, Ortodontia.

Massarelli. E. E., Molecular Biology of Orthodontics Movement. [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Universidade Cidade de São Paulo; 2011.

ABSTRACT

In the last decade, molecular biology has been a study tool increasingly present in orthodontic research. The orthodontist who aspire excellence in their clinical practice must be aware of new knowledge that emerges revealing the molecular basis of orthodontic tooth movement. The focus of this study is three key molecules that regulate the differentiation and activation of osteoclasts and, ultimately, bone resorption witch is necessary for orthodontic movement. They are the Receptor Activator of Nuclear kappa β (RANK), its ligand (RANKL) and Osteoprotegerin (OPG). The aim of this study was to conduct a literature review of the role of these molecules in orthodontic movement, as well as the tools that the orthodontist has to influence it, nowadays or in the near future, to ensure his patient an orthodontic treatment more effective and safe. Through scientific analysis, it was concluded that, by changing the direction, magnitudes and duration of orthodontic force, the orthodontist can interfere with the expression pattern of RANKL and OPG in periodontal ligament. Nevertheless, the use low level laser therapy to increase orthodontic movement presents itself as a therapy to be used in the near future, as well as the drugs that ensure better containment post-treatment by inhibition of tooth movement.

Keywords: Biologia Molecular, RANK, RANKL, OPG, Movimentação Dentária, Ortodontia.

LISTA DE TRADUÇÕES E ABREVIATURAS

Termo utilizado / Traduções Abreviatura

Ácido Desoxirribonucléico Deoxyribonucleic acid AND DNA Ácido Ribonucléico Ribonucleic acid ARN RNA Fosfatase ácida resistente ao tartarato

Tartrate-resistant acid phosphatase TRAP

Íon de hidrogênio H+

Fator Nuclear kappa β

Nuclear Factor kappa β NF-kβ

Receptor Ativador do Fator Nuclear kappa β

Receptor Activator of Nuclear Factor kappa β RANK

Ligante do Receptor Ativador do Fator Nuclear kappa β

Receptor Activator of Nuclear Factor kappa β ligand RANKL

Osteoprotegerina

Osteoprotegerin OPG

Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA

Reação da Polimerase em Cadeia

Polymerase Chain Reaction PCR

Reação da Polimerase em Cadeia – Transcrição Reversa

Reverse Transcryption Polymerase Chain Reaction RT-PCR

Fator de Necrose Tumoral α

Tumor Necrosis Factor α TNF-α

Interleucina 1

Interleukin 1 IL-1

Proteínas inibitórias da família kappa β

Termo utilizado / Traduções Abreviatura Retículo endoplasmático rugoso

Rough endoplasmic reticulum RER

Prostaglandina E2

Prostaglandin E2 PGE2

Fator estimulador de colônias de macrófagos

Macrophage colony-stimulating factor M-CSF

Arseniato de gálio e alumínio AsGaAl

Fator de transformação do crescimento β

Transforming growth factor β TGF-β

Diodo emissor de luz

Light emitting diode LED

Tridimensional 3D

Bidimensional 2D

Receptor do fator estimulador de colônias de macrófagos

Macrophage colony-stimulating factor receptor c-Fms

Fator de crescimento epidérmico

Epidermal growth factor EGF

Fator de transcrição Runt relacionado 2

Runt-related transcription factor 2 Runx2

Receptor de calcitonina

LISTA DE UNIDADES DE MEDIDA

Símbolo

Unidade

g/cm

2

grama / centímetro quadrado

Nm

Nanômetro

mW

Miliwatt

J

Joule

mg/kg

miligrama / kilograma

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO...1 2- REVISÃO DE LITERATURA...13 3- DISCUSSÃO...51 3.1- As forças de pressão...56 3.2- As forças de tensão...59 3.3- Terapia genética...61 3.4- Fármacos...61

3.5- Vibração por ressonância...63

3.6- Laserterapia...63

3.7- Descorticalização óssea...65

3.8- Condições patológicas locais e sistêmicas...66

3.9- Reabsorção radicular...67

4- CONCLUSÃO...69

2

1- INTRODUÇÃO

É amplamente aceito o conceito de que o movimento ortodôntico se dá pela reabsorção do osso alveolar decorrente da ação da raiz dentária, que sob efeito da mecanoterapia, comprime o periodonto em uma face do alvéolo, gerando reabsorção óssea, ao mesmo tempo em que induz à deposição óssea, onde há força de tensão do ligamento periodontal. Durante anos os ortodontistas têm reservado especial atenção ao diagnóstico, focado nas análises cefalométricas, faciais e de modelo, assim como à mecanoterapia, aprimorando modelos de braquetes, a composição dos fios ortodônticos e o controle de ancoragem. Sem diminuir a relevância desses temas, o estudo das reações teciduais mediadas em nível molecular deveria receber maior destaque, sobretudo diante do advento da biologia molecular nas últimas décadas. A duplicação (replicação do DNA), a transcrição (síntese do RNA) e a tradução (síntese de proteínas) podem regular, em última instância, parâmetros como reabsorção radicular e velocidade da deposição e da reabsorção óssea.

Antes do nível molecular, devem-se saber quais são as células-chave envolvidas no processo de remodelação óssea que ocorre durante a movimentação dentária ortodonticamente induzida. Duas linhagens de células estão presentes no osso, cada uma com sua função específica. As células osteogênicas, onde se incluem os osteoblastos, formam e mantém o osso nas regiões de tensão do ligamento periodontal; enquanto os osteoclastos reabsorvem o osso nas regiões de compressão. As principais células do ligamento periodontal são os fibroblastos, cujos fatores secretados podem inibir a mineralização do tecido ósseo circundante (TEN CATE, 2007).

Introdução 3

Os osteoclastos multinucleados são originados da fusão de células mononucleares de origem hematopoiética da linhagem monócito/macrófago. São células assimétricas que apresentam a região da membrana irregular (borda em escova), a qual se liga à superfície óssea, onde a atividade de reabsorção ocorre. O citoplasma adjacente à borda em escova é destituído de organelas celulares, esta “zona clara” não somente liga as células à superfície mineralizada, mas também isola o microambiente entre ela e a superfície óssea. Devido ao seu tamanho, podem ser facilmente identificadas à microscopia de luz. São identificadas citoquimicamente pelo processo da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) positivo, o que as distingue de outras células gigantes. Normalmente, são encontradas na superfície óssea, ocupando depressões criadas por eles, chamadas de lacunas de Howship (TEN CATE, 2007).

Os osteoclastos são constituídos de muitos núcleos, cada um dos quais é rodeado por múltiplos complexos de Golgi, mitocôndrias, retículo endoplasmático rugoso e numerosas estruturas vesiculares situadas entre o complexo de Golgi e a superfície de reabsorção. As enzimas como a fosfatase ácida são sintetizadas nos retículos endoplasmáticos rugosos, transportadas ao complexo de Golgi e levadas à borda em escova em vesículas de transporte onde elas liberam seu conteúdo dentro de compartimentos selados adjacentes à superfície óssea, criando essencialmente um lisossomo extracelular. Outra característica do osteoclasto é um próton emitido associado à borda em escova que emite íons de hidrogênio (H+) dentro do compartimento vedado (TEN CATE, 2007).

Introdução 4

A regulação do desenvolvimento dos osteoclastos é carreada por numerosas substâncias, tais como hormônios, citocinas, fatores de crescimento e constituintes da matriz óssea (TEN CATE, 2007).

Na fase de reabsorção ocorre a aderência dos osteoclastos na superfície óssea, através de sua borda em escova. O meio acidificado pela ação do próton H+ desmineraliza o osso e expõe a matriz orgânica; ocorre então a degradação desta matriz exposta pela ação de enzimas como a catepsina B e fostatase ácida (TEN CATE, 2007).

Os odontoclastos são células provenientes da mesma linhagem dos osteoclastos (monócito/macrófago). São citologicamente muito semelhantes, apresentando múltiplos núcleos, borda em escova, zona clara e TRAP. A principal característica que distingue odontoclastos de osteoclastos é o tecido que reabsorvem, uma vez que os odontoclastos são encontrados em lacunas reabsortivas na raiz dentária. Não obstante, os odontoclastos possuem menor número de núcleos, assim como marcação para TRAP diminuída, o que sugere uma menor diferenciação, em relação aos osteoclastos, nas suas características de reabsorção da matriz orgânica (TSUCHIYA et al., 2008).

Na movimentação ortodôntica, a reabsorção óssea mediada pelos osteoclastos é o fator-limite que determina a movimentação dentária. Essa resposta fisiológica é regulada por um sofisticado processo de reações bioquímicas que orquestram a tradução da força mecânica em movimento ortodôntico, as quais são influenciadas por fatores como magnitude, direção e duração da força (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006); assim como outros de ordem genética – “a adaptação do osso às forças ortodônticas depende dos

Introdução 5

genes de osteoblastos e osteoclastos funcionando normalmente para expressar as proteínas necessárias no tempo e locais corretos” (MASELLA e MEISTER, 2006).

Na última década, foram identificados três agentes-chaves para que ocorra a reabsorção óssea mediada pelo emprego da força ortodôntica, que atuam na regulação da ativação e formação de osteoclastos, através da ativação de um fator de transcrição denominado Fator Nuclear kappa β (NF-kβ). São eles o Receptor Ativador do Fator Nuclear kappa β (RANK), o seu ligante (RANKL) e a Osteoprotegerina (OPG) (KANZAKI et al., 2001, 2002; SHIOTANI et al. 2001, 2002; OSHIRO et al., 2002). Conhecer o papel específico desses agentes, que se mostram determinantes para ativação e função reabsortiva dos osteoclastos, torna-se essencial para decifrar a interação entre estímulo mecânico e resposta biológica no nível molecular, que tem, com resultado final, a movimentação dentária ortodonticamente induzida.

Biologia Celular e Molecular

A análise de organelas isoladas em grande quantidade, a cultura de células, o aparecimento de numerosas técnicas que permitiram manipular o genoma através da adição ou supressão de genes para o estudo dos mecanismos envolvidos no fenômeno biológico da hereditariedade, assim como os processos bioquímicos que regem a produção de proteínas (polipeptídeos) e ácidos ribonucléicos (RNA e DNA), levaram ao surgimento do que se costuma chamar de biologia celular e molecular (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005; ALBERTS et al., 2007).

Introdução 6

Dentre as técnicas empregadas na biologia celular, pode-se citar a citoquímica, ainda muito utilizada para a identificação e localização das moléculas que constituem as células. Pode ser aplicada em nível de microscopia óptica e eletrônica para localizar e/ou mensurar enzimas como as fosfatases ácidas, através do emprego de corantes bioquímicos, ou da produção de partículas elétron-densas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005).

A histoquímica compreende os métodos utilizados para identificar e localizar substâncias em cortes histológicos. A imunohistoquímica localiza proteínas específicas, por meio de interações moleculares de alta afinidade (antígeno-anticorpo). Anticorpos são proteínas que fazem parte de uma grande família, a família das imunoglobulinas. Quando o organismo é exposto a moléculas estranhas (antígenos), pode haver uma resposta na forma da produção de anticorpos (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005).

Para proceder a uma reação imunohistoquímica, o material que se supõe conter uma proteína é incubado em uma solução que contém um anticorpo que reconhece esta proteína. O anticorpo se liga especificamente á proteína (assim como sua localização) pode então ser evidenciado através do marcador que foi conjugado a ele. (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005; ALBERTS et al., 2007).

A técnica de eletroforese em gel tem diversas variantes para esclarecer diferentes problemas. Uma dessas variantes serve como ferramenta para determinar o tamanho de uma proteína ou ácido nucléico consequentemente, os identificando. A técnica consiste na dissolução das moléculas em uma solução que as carrega negativamente. Com as cargas positivas neutralizadas,

Introdução 7

colocam-se as moléculas sobre um gel e submete-se este a um campo elétrico. Com todas as moléculas migrando em direção do pólo positivo, a velocidade desta migração dependerá exclusivamente do tamanho de cada uma, formando-se uma banda na região onde cada molécula cessa a sua migração (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005; ALBERTS et al., 2007).

As moléculas fracionadas são então transferidas (blotting) para uma membrana de nitrocelulose ou náilon, aplicando-se sobre elas um forte campo elétrico. Essa membrana é então colocada em uma solução com o anticorpo marcado para revelar a proteína (Wertern blotting) de interesse ou, no caso de ácidos nucléicos (Southern ou Northern blotting), em uma solução com uma sonda de RNA ou DNA marcada. A banda de cada molécula pode agora então ser visualizada com conseguinte identificação e/ou quantificação da mesma (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005; ALBERTS et al., 2007).

Através do ensaio imunoenzitáciao (ELISA), a presença de um antígeno pode ser também detectada e quantificada. O antígeno é adsorvido em um suporte sólido (placa de ELISA). Um anticorpo é conjugado a uma enzima e após a adição do substrato apropriado, ocorre a coloração da ligação antígeno-anticorpo, que pode então ser avaliada quantitativamente (ALBERTS et al., 2007).

O PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) é uma metodologia que se baseia na amplificação exponencial seletiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma única célula. O objetivo do PCR é produzir uma grande quantidade de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima. O DNA molde sofre uma amplificação controlada por enzimas,

Introdução 8

obtendo-se milhões de cópias do fragmento de DNA de interesse. O molde pode ser qualquer forma de DNA de cadeia dupla. Um ciclo de PCR consiste em três fases: desnaturação do DNA molde, ligação (“annealing”) dos primers e polimerização do DNA. Na 1ª etapa faz-se a separação das cadeias de dupla hélice de DNA através do calor. Esta separação é essencial para que, na 2ª fase, dois primers de oligonucleótidos se liguem às sequências dos pares de bases complementares da cadeia molde. Estes primers são desenhados e sintetizados de modo a ligarem-se às extremidades opostas de cada uma das cadeias de DNA molde que se pretende amplificar. Os primers servem, portanto, de ponto de partida para a replicação de DNA e, na última etapa, faz-se a sua extensão. A enzima responsável por esta polimerização é a DNA polimerase termo-estável (Taq). Duas novas cadeias são sintetizadas a partir da cadeia molde em cada ciclo completo de PCR logo, ocorre um crescimento exponencial, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cópias do que no início (SANTOS et al., 2004).

O RT-PCR (Transcrição Reversa da Reação da Polimerase em Cadeia) pode ser utilizado para informação sobre a expressão de um gene em uma célula ou tecido. A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza DNA complementar (cDNA). O cDNA serve como molde então para realização de PCR. Uma variante de RT-PCR, denominada RT-PCR em tempo real (Real Time RT-PCR), permite quantificar a amostra obtida através do método (SANTOS et al., 2004).

A hibridação in situ é um método que permite identificar o locus cromossômico onde se localiza uma determinada sequência de DNA

Introdução 9

previamente clonada. Este método tem como princípio a complementaridade das bases que reage a organização de DNA. O DNA de um esfregaço metafásico e o DNA de uma sonda são transformados em sequências monocatenares através da desnaturação e posteriormente são postos em contato em condições de hibridação. Assim a sonda vai hibridar com a sequência cromossômica onde se localizam as bases complementares. Visto que a sonda é previamente marcada (com um fluorocromo), o local de ligação torna-se visível, o que permite identificar especificamente o local do cromossoma onde se localiza o gene ou a sequência não codificadora em causa. A realização desta técnica pode ser feita usando uma única sonda ou até mesmo várias sondas, cada uma, marcada com um fluorocromo diferente. (ALBERTS et al., 2007).

Fatores de Transcrição

Para que a RNA polimerase II (enzima que catalisa a reação) consiga encontrar o ponto de início da transcrição (formação de RNA a partir do DNA), ela necessita de proteínas conhecidas como Fatores de Transcrição. Essas proteínas se ligam a sequências específicas de DNA (promotores), que representam o local de início da transcrição e recrutam a RNA polimerase II a esses sítios (ALBERTS et al., 2007) O Fator Nuclear kappa β é um complexo protéico que desempenha funções como fator de transcrição. Ele é encontrado inativado no citoplasma de células animais, inclusive os osteoclastos, e está envolvido na resposta celular a estímulos como estresse e antígenos

Introdução 10

(MASELLA; MEISTER, 2006; KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006; MEIKLE, 2006).

Ativação do Fator Nuclear kappa β

A ligação de moléculas sinalizadoras (ligantes) aos seus receptores os ativa, fazendo com que eles se liguem ao DNA, regulando a transcrição de genes específicos. Estes receptores são estruturalmente semelhantes, fazendo parte de uma superfamília de receptores nucleares. Alguns receptores estão no citosol e entram no núcleo somente após a interação com o ligante. O receptor inativo está ligado a complexos protéicos inibitórios, sendo que a interação com o ligante altera a conformação do receptor, causando a dissociação do complexo inibitório e, por conseguinte, a ligação do receptor a proteínas co-ativadoras que induzem a transcrição gênica (ALBERTS et al., 2007).

O Fator Nuclear kappa β (NF-kβ) é um complexo protéico que desempenha funções como factor de transcrição. NF-kβ pode ser encontrado em quase todos os tipos de células animais e está envolvido na resposta celular a estímulos como o estresse, citocinas, radicais livres, radiação ultravioleta, antígenos virais e bacterianos. NF-kβ desempenha um papel fundamental na regulação da resposta imunitária à infecção (ALBERTS et al., 2007).

Duas citocinas de vertebrados, produzidas por células do sistema imune inato (como macrófagos), ligam-se aos receptores de superfície e ativam o NF-kβ. Estas citocinas são o Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e a Interleucina-1 (IL-1), elas são especialmente importantes na indução de respostas inflamatórias (ALBERTS et al., 2007).

Introdução 11

As proteínas inibitórias chamadas Ikβ ligam-se firmemente ao NF-kβ no citoplasma, mantendo-o inativo. Os sinais como TNF-α e IL-1 promovem a degradação da Ikβ, o que expõe um sinal de localização nuclear nas proteínas NF-kβ que se deslocam para o núcleo e estimulam a transcrição de genes específicos (ALBERTS et al., 2007).

Para que ocorra a ativação do NF-kβ nos osteoclastos, é essencial que se faça a ligação entre RANKL e seu receptor, RANK. Enquanto RANKL é expresso principalmente na superfície de células do ligamento periodontal, osteoblastos e seus precursores, RANK é expresso na superfície de osteoclastos e seus precursores. Entretanto, a OPG, proteína solúvel e também secretada por células do ligamento periodontal, osteoblastos e precursores, compete com RANK na ligação com RANKL, inibindo assim a ativação dos osteoclastos (MASELLA; MEISTER, 2006; KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006; MEIKLE, 2006) – figura 1.

A proposta dessa revisão de literatura é reunir os dados publicados pertinentes a expressão de RANKL, RANK e OPG pelas células envolvidas na movimentação ortodôntica; e elucidar como fatores controlados pelo ortodontista como magnitude, duração e direção da força ortodôntica, assim como aplicação de terapias com laser ou até o uso de fármacos, podem

Osteoblasto osteoclasto OPG RANKL RANK Estimula reabsorção óssea Inibe reabsorção óssea

Figura 1: A regulação da ativação dos osteoclastos. RANKL se liga a RANK determinando a ativação. Ao se ligar também com RANKL, a OPG compete pelos mesmos sítios inibindo assim a atividade osteoclástica.

Introdução 12

interferir nessa expressão, analisando estudos in vitro e in vivo, tanto em humanos como em animais. O ortodontista que estiver familiarizado com esse tema, certamente estará pronto para usufruir dos benefícios que os avanços no campo da biologia molecular propiciarão, tanto para a maior eficiência da movimentação ortodôntica, quanto para o controle de seus efeitos colaterais.

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2- REVISÃO DE LITERATURA

O primeiro estudo que analisou a presença de RANKL no ligamento periodontal durante o movimento ortodôntico foi publicado por Shiotani et al. (2001). Através da movimentação ortodôntica obtida pela inserção de elásticos separadores entre os molares de ratos durante quatro dias, os autores detectaram, por meio de técnicas imunohistoquímicas, a presença de marcação para RANKL no ligamento periodontal submetido à pressão, principalmente no citoplasma e nas cisternas do retículo endoplasmático rugoso (RER) dos osteoblastos. RANKL também foi detectada na membrana plasmática dos osteoblastos e células do estroma. Similar localização subcelular foi detectada em osteócitos e fibroblastos. Nos osteoclastos, marcação de RANKL foi detectada na membrana da borda em escova, no citoplasma adjacente a ela, assim como na zona clara. Esta localização de RANKL sugeriria, de acordo com os autores, uma função regulatória sobre os osteoclastos, determinada pela localização de RANKL no RER de osteoblastos, fibroblastos e células do estroma; associada a uma função reabsortiva, determinada pela presença na membrana da borda em escova e na zona clara de osteoclastos. Dessa forma, RANKL expressa por osteoclastos poderia ter uma função auto-regulatória na sua atividade reabsortiva.

Em outro estudo, Kanzaki et al. (2001) comprovaram que o estímulo para a ocorrência de reabsorção óssea depende do contato célula-a-célula, entre as células do ligamento periodontal e células precursoras de osteoclastos. O cultivo de células precursoras, juntamente com células do

Revisão de literatura 15

ligamento periodontal, estimulou a atividade reabsortiva em dentina bovina quando comparadas às mesmas células precursoras cultivadas sozinhas. Essas células precursoras, quando cultivadas em contato indireto (no mesmo meio, porém, separadas por uma membrana que permitia a passagem de fatores solúveis, mas impedia o contato célula-a-célula) com as células do

ligamento periodontal, apresentaram uma atividade reabsortiva

significantemente diminuída, assim como o número de células TRAP-positivas diminuiu de maneira estatisticamente significante. Em paralelo, foi também constatada a expressão (através de RT-PCR) de RANKL e OPG pelas células do ligamento periodontal, sendo que a quantidade de OPG (medida através de ELISA) não se alterou entre os meios cultivados em contato direto e indireto. O estudo concluiu que as células do ligamento periodontal podem determinar o aumento da atividade osteoclástica através do contato direto com células sanguíneas, ou inibir a mesma através da produção contínua de fatores solúveis.

Após a constatação de que o aumento da atividade osteoclástica se dá pelo contato célula-a-célula entre células precursoras de osteoclastos provenientes do sangue e células do ligamento periodontal, Kanzaki et al. (2002), concluíram que essa atividade pode ser aumentada pelo emprego de forças de pressão, assim como pela adição de prostaglandina E2 (PGE2) sobre

essas células em cultura. Nesse estudo, o aumento da expressão de RANKL (medido através de RT-PCR) e do número de osteoclastos (através de citoquímica) foi proporcional à magnitude e duração da força empregada. No entanto, após atingir um pico de 2 g/cm2 de magnitude e 24 horas de duração, não houve mais mudanças estatisticamente significantes no número de

Revisão de literatura 16

osteoclastos; assim como a partir de 2 g/cm2 de magnitude e 48 horas de duração, a expressão de RANKL não foi aumentada. Já com relação à OPG, não foi observada qualquer mudança na sua expressão (medida através de

RT-PCR) diante do emprego da força de pressão. Os níveis de PGE2

aumentaram significantemente, proporcionalmente à duração da força aplicada

até um período de 60 horas. A adição de PGE2 exógena ao meio promoveu um

aumento de RANKL (avaliado através de Western Blotting). Os autores

concluíram que o emprego de forças de pressão estimulou a

osteoclastogênese devido a uma maior expressão de RANKL, e não à diminuição de OPG.

Com o objetivo de estudar o papel de RANKL e OPG na remodelação óssea durante a movimentação dentária ortodonticamente induzida, Oshiro et al. (2002), utilizaram elásticos separadores entre os incisivos superiores de camundongos com deficiência na produção de OPG, fazendo o mesmo em camundongos normais. Através da imunohistoquímica, observou-se um aumento da marcação para RANKL em ambos os grupos (animais deficientes na produção de OPG e animais normais) após 2 e 5 dias de inserção dos elásticos. Nos camundongos com deficiência em OPG, a marcação para RANKL foi maior em relação aos camundongos normais, somente no momento inicial (“dia 0”). A localização de RANKL foi temporalmente diferente entre os grupos, sendo a marcação observada em osteoblastos e fibroblastos nos camundongos normais após 2 dias e, adicionalmente, em osteoclastos após 5 dias; já no grupo deficiente em OPG, foi observada marcação em osteoblastos e fibroblastos após 0 dia e, após 2 e 5 dias, também em osteoclastos. O número de osteoclastos na região do ligamento periodontal submetida à

Revisão de literatura 17

pressão, assim como a reabsorção óssea, foi maior nos camundongos com deficiência em OPG após 0, 2 e 5 dias de inserção dos elásticos separadores, em relação aos camundongos normais. Os autores concluíram que, durante a movimentação ortodôntica, a osteoclastogênese é regulada por RANKL positivamente e pela OPG negativamente.

O papel biológico de RANKL e OPG na ativação de osteoclastos foi estudado, in vitro, por Shiotani et al. (2002). Pré-osteoclastos de camundongos foram cultivados em presença de RANKL; ou do fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF); ou de RANKL e OPG. Já osteoclastos maduros foram cultivados com RANKL; ou RANKL e OPG. A adição de dentina nos meios permitiu observar a atividade reabsortiva que, através de microscopia eletrônica, comprovou ser notadamente aumentada nos meios que receberam apenas RANKL, tanto para pré-osteoclastos quanto para osteoclastos maduros. Os pré-osteoclastos, após cultivados com M-CSF, apresentaram algumas características de osteoclastos (células fundidas, com vários núcleos) entretanto, não foi observada intensa atividade reabsortiva, assim como nos meios em que pré-osteoclastos e osteoclastos foram cultivados com RANKL e OPG. O estudo concluiu que M-CSF não induz a formação de osteoclastos; RANKL é determinante na maturação e ativação de osteoclastos; e que a OPG inibe a atividade destas células.

Uma vez elucidado o papel biológico de RANKL e OPG na diferenciação e maturação de osteoclastos, Kanzaki et al., 2004 comprovaram a influência da OPG sobre a movimentação dentária ortodonticamente induzida em ratos. Foi confeccionado um aparelho ortodôntico para produzir movimentação palatina dos molares e, após a sua ativação, os animais receberam uma injeção

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subperiostal, na região adjacente ao lado de pressão do ligamento periodontal, contendo um vetor com o gene específico para indução da expressão de OPG. Em relação aos animais submetidos apenas à força ortodôntica, os animais com expressão de OPG induzida apresentaram uma menor atividade osteoclástica (avaliada através de citoquímica), estatisticamente significante. Do mesmo modo, nesses animais foi detectada maior marcação imunohistoquímica para OPG na região do ligamento periodontal. O grupo em que a expressão de OPG foi induzida também apresentou menor movimentação dentária, a partir do sétimo até o vigésimo primeiro dia de ativação, estatisticamente significante, em relação ao grupo submetido apenas à força ortodôntica. Esses resultados levaram os autores a concluir que, sendo OPG um receptor que inibe a ação de RANKL, a movimentação ortodôntica é regulada primariamente pela sinalização de RANKL nas células periodontais.

Para esclarecer as mudanças que ocorrem na expressão de RANKL, RANK e osteoprotegerina durante a reabsorção óssea, Ogasawara et al.(2004) avaliaram a quantidade de RANK-RNAm em osteoclastos durante a movimentação dentária ortodonticamente induzida em ratos, obtida pela inserção de elásticos separadores entre o primeiro e o segundo molar superior. A identificação do RNAm foi obtida pela visualização de sondas (complementares aos RNA-alvos) marcadas, de modo semelhante à marcação imunohistoquímica, em uma técnica denominada “hibridização in situ”. Em condições fisiológicas (antes da inserção dos elásticos separadores), foi evidenciada a expressão de RANKL por osteoclastos, osteoblastos e células do ligamento periodontal, sendo que os mesmos osteoclastos RANKL-positivos apresentaram marcação para RANK. A expressão de RANK também foi

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evidenciada em células mesenquimais indiferenciadas, mas não nos outros tipos celulares. Já a expressão de OPG foi observada em osteoblastos e células do ligamento periodontal. Durante a movimentação ortodôntica, o número de osteoclastos RANKL e RANK-positivos aumentou, sendo novamente a expressão de ambas concomitante em muitas dessas células. A expressão de RANKL também sofreu um incremento, mas somente nas células do ligamento periodontal e não nos osteoblastos. Nenhuma alteração na expressão de OPG foi aferida. Os autores concluíram que a expressão de RANK e RANKL ocorre concomitantemente nos osteoclastos, sob condições fisiológicas, e que essa expressão é aumentada após o emprego da força ortodôntica (inserção dos elásticos separadores).

Low et al. (2005) descreveram as mudanças na expressão de RANKL e OPG durante a reabsorção radicular induzida pelo emprego de forças ortodônticas pesadas em molares de ratos. Através de forças contínuas de 100g direcionadas para produzir mesialização dos primeiros molares inferiores, foram obtidos dados sobre a expressão de OPG e RANKL nas áreas de tecido ósseo e radicular submetidas à pressão, através da análise dos produtos da reação de RT-PCR em tempo real, 14 dias após a instalação do aparelho. Os resultados apontaram para um aumento discreto na expressão de RANKL, enquanto que, com relação à OPG, foi detectado um aumento estatisticamente significante. Os autores concluíram que os níveis de OPG, acima dos de RANKL, podem ter sido induzidos pela intensa atividade inflamatória desencadeada pelo emprego de forças ortodônticas pesadas.

Diante das evidências sobre a importância de RANK na diferenciação de osteoclastos, Aihara, Yamaguchi e Kasai (2006) realizaram um estudo para

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investigar os efeitos do laser de baixa potência sobre suas células precursoras, aferindo os níveis de expressão de RANK e quantificando o número de osteoclastos obtido após o seu emprego. As células (provenientes de ratos) em cultura foram expostas à radiação do laser de baixa potência de Arseniato de gálio e alumínio (AsGaAl) por períodos de 1, 3, 6 ou 10 minutos por dia, durante 8 dias, resultando em doses de 9,33, 27,99, 55,98 ou 93,30 J/cm2, respectivamente. A radiação foi empregada em um comprimento de onda de 810 nm e potência de 50 mW. O número de osteoclastos foi medido através de citoquímica e a expressão de RANK por imunohistoquímica. A comprovação da atividade reabsortiva dos osteoclastos foi feita pela introdução de slices de dentina no meio e a expressão de RANK pelas células em cultura aferida por RT-PCR. Os resultados apontaram para um aumento estatisticamente significante no número de osteoclastos, nas células irradiadas pelos períodos de 1,3 e 6 minutos por dia, sendo o maior número obtido no período de 3 minutos por dia. As células irradiadas por esse período foram então estudadas em relação à influência do tempo de exposição ao laser. Através de citoquímica, observou-se a presença de osteoclastos após 2 dias de irradiação, sendo que estas células não foram observadas antes de 3 dias nos controles. A imunohistoquímica revelou uma maior marcação para RANK após 2 e 3 dias de irradiação. Para esses períodos (2 e 3 dias de irradiação por 3 minutos ao dia), foi avaliada a expressão de RANK através de RT-PCR e observada uma banda, correspondente a RNAm para RANK, mais intensa nos meios irradiados com laser. Ao inserir slices de dentina, constatou-se maior número de lacunas reabsortivas, estatisticamente significante, nos meios irradiados por laser após 8 dias, por períodos de 1, 3 e 6 minutos por dia, mas não por 10 minutos por

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dia. Esse aumento da atividade reabsortiva foi proporcional aos períodos, exceto 10 minutos por dia. Os autores chegaram à conclusão de que a irradiação com laser de baixa potência (AsGaAl) induz a diferenciação e ativação de osteoclastos in vitro, via expressão de RANK.

Kanzaki et al. (2006ª) comprovaram a influência de RANKL sob a movimentação dentária ortodonticamente induzida em ratos, empregando técnicas de terapia genética. Foi confeccionado um aparelho ortodôntico para produzir movimentação palatina dos molares e, após a sua ativação, os animais receberam uma injeção subperiostal, na região adjacente ao lado de pressão do ligamento periodontal, contendo o vetor com o gene específico para indução da expressão de RANKL. Em relação ao grupo controle (em que não foi induzida a expressão de RANKL), foi observada, através de citoquímica, uma maior atividade osteoclástica e, através de imunohistoquímica, maior expressão de RANKL na região do ligamento periodontal, ambas estatisticamente significantes. O grupo em que a expressão de RANKL foi induzida também apresentou maior movimentação dentária, após a ativação do aparelho ortodôntico em relação ao grupo controle, também estatisticamente significante. Esses resultados levaram os autores a concluir que, sendo RANKL um indutor da atividade osteoclástica, a movimentação ortodôntica pode ser acelerada pelo emprego da terapia genética por eles empregada.

Para avaliar os níveis de RANKL e OPG durante a movimentação ortodôntica em humanos, Kawasaki et al. (2006), analisaram o fluído crevicular de pacientes adolescentes (média de 15.1 anos) e adultos (média de 31 anos). Os grupos contavam com indivíduos de ambos os sexos, masculino e feminino. A análise quantitativa foi feita, através de ELISA, nas amostras coletadas no

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lado em que o ligamento periodontal foi submetido a forças de pressão por períodos de 0, 1, 24 e 168 horas. Os resultados apresentaram uma maior taxa de movimentação dentária, estatisticamente significante, nos adolescentes após 168 horas de emprego da força ortodôntica. Da mesma forma, os níveis de RANKL apresentaram-se mais elevados após 24 horas, sendo esse aumento estatisticamente maior nos pacientes adolescentes em relação aos adultos. No mesmo período, OPG apresentou níveis menores em ambos os grupos em relação aos controles, sendo que os níveis nos adultos foram ainda menores. Após 0, 1 e 168 horas, não foi observada diferença estatisticamente significante em relação aos níveis-controle. Os autores concluíram que a diminuição da movimentação dentária nos pacientes mais velhos pode ser relacionada à diminuição dos níveis de RANKL/OPG durante os estágios iniciais da movimentação ortodôntica.

Para estudar o efeito de forças de tensão sobre a expressão de OPG, Kanzaki et al. (2006b) utilizaram células de ligamento periodontal humano cultivadas conjuntamente com células precursoras de osteoclastos. As células foram submetidas a forças de tensão intermitentes por 30 minutos, 90 minutos, 6 horas, 24 horas, 48 horas ou 72 horas. Através de RT-PCR, os autores verificaram uma maior expressão estatisticamente significante de OPG, RANKL e TGF-β sendo, este último, uma citocina relacionada ao controle da expressão de OPG. Os resultados apontaram para um aumento significativo da expressão de RANKL, OPG e TGF-β após 48 e 72 horas de aplicação da força de tensão. As células submetidas a forças de tensão apresentaram uma atividade reabsortiva, sobre dentina adicionada aos meios, estatisticamente significante menor. O aumento da expressão de OPG foi dependente de TGF-β, uma vez

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que a neutralização da citocina no meio provocou uma diminuição de OPG em uma relação dose-dependente. Os autores concluíram que o emprego de forças de tensão intermitentes induzem o aumento da expressão de RANKL, OPG e TGF-β. Não obstante, TGF-β estaria envolvida na regulação da expressão de OPG dentro deste processo.

Nishijima et al. (2006) também analisaram o fluído crevicular de pacientes adolescentes dos sexos masculino e feminino, após a aplicação de forças ortodônticas de pressão sobre o ligamento periodontal humano. A análise quantitativa foi feita, através de ELISA, nas amostras coletadas no lado em que o ligamento periodontal foi submetido a forças de pressão por períodos de 0, 1, 24 e 168 horas e apresentaram uma maior expressão de RANKL e uma diminuição de OPG, estatisticamente significante, somente no período de 24 horas. Adicionalmente, um estudo in vitro foi realizado em células do ligamento periodontal humano, cultivadas e submetidas a forças de pressão crescentes. Foi verificado que ocorreu aumento da expressão de RANKL e diminuição de OPG, estatisticamente significante, na medida em que a intensidade da força foi aumentada, até um limite de 2 g/cm2. Sob esta intensidade de força compressiva, a mudança dos níveis de RANKL e OPG apresentou o mesmo padrão proporcionalmente ao tempo de emprego da força (0, 3, 6, 9, 12, 24 e 48 horas). Diante dos resultados obtidos, os autores concluíram que, no fluído crevicular de humanos, os níveis de RANKL sofrem aumento e os de OPG diminuição durante a movimentação ortodôntica, no lado de pressão do ligamento periodontal. Nas células do ligamento periodontal humano in vitro, as mudanças dos níveis de RANKL e OPG apresentam o mesmo padrão em uma relação tempo e força-depentendes.

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Em outro estudo, que analisou como forças de tensão com magnitudes diferentes podem influenciar a expressão de OPG e RAKNL, Tang, Lin e Li (2006) utilizaram osteoblastos de camundongos in vitro. As células foram submetidas a alongamento de 0%, 6%, 12% ou 18% com o incremento da força de tensão, por um período de 24 horas. A força foi empregada de forma intermitente e os resultados apresentaram uma diminuição de RNAm (aferido por RT-PCR) para RANKL, assim como uma diminuição dos níveis de RANKL (resultados obtidos por ELISA) secretada por osteoblastos, em uma relação dependente da magnitude da força empregada. Concomitantemente, houve um aumento da expressão de OPG (resultados obtidos por ELISA). Todas essas variações revelaram-se estatisticamente significantes. Os autores então concluíram que diferentes magnitudes de forças de tensão influenciam o comportamento de osteoblastos, sendo que as mudanças observadas na expressão de RANKL e OPG podem repercutir na ocorrência da remodelação óssea.

Com o objetivo de relacionar a expressão de RANKL e o fenômeno de reabsorção radicular, Yamaguchi et al. (2006), submeteram as células do ligamento periodontal de pacientes que apresentaram reabsorção radicular severa nos incisivos centrais após o tratamento ortodôntico à incidência de forças pressão in vitro. Em relação às células do grupo controle (pacientes que não apresentaram reabsorção severa), as células submetidas à força de pressão (2,0 g/cm2), provenientes de primeiros pré-molares, apresentaram maiores níveis de RANKL a partir do período de 6 horas (aferido por ELISA) e uma diminuição de OPG (ELISA), sendo essas mudanças estatisticamente significantes. Esse aumento de RANKL e diminuição de OPG foram

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proporcionais à duração da aplicação da força até um período de 12 horas. O número de osteoclastos, analisado através de citoquímica, também se apresentou estatisticamente maior nas células de pacientes com severa reabsorção radicular, assim como os níveis de reabsorção de dentina adicionada aos meios. Os autores concluíram que as células periodontais derivadas de indivíduos que apresentaram severa reabsorção radicular produzem uma maior quantidade de RANKL e menor de OPG quando submetidas a forças de pressão, resultando em uma hiperestimulação da osteoclastogênese.

Dunn et al. (2007), examinaram o papel da OPG na regulação da remodelação óssea ortodonticamente induzida em ratos. Através de um dispositivo ortodôntico, forças contínuas de 54±2 gramas foram empregadas no sentido de mover mesialmente os primeiros molares superiores de ratos. Doses de 0,5 e 5,0 mg/kg de OPG recombinante foram injetadas duas vezes por semana no lado de pressão do ligamento periodontal dos molares movimentados. A dose de 5,0 mg/kg inibiu a movimentação ortodôntica, de forma estatisticamente significante, em taxas de 45,7%, 70,6% e 78,7% nos períodos de 7, 14 e 21 dias respectivamente (medida pela análise de modelos); assim como diminuiu significantemente o número de osteoclastos (quantificados por citoquímica) em comparação com o grupo controle, nas áreas de pressão do ligamento periodontal. A dose de 0,5 mg/kg também inibiu a movimentação de forma estatisticamente significante, mas em níveis menores, sendo 43,8% e 31,8% nos períodos de 7 e 14 dias. Os resultados sugerem, segundo os autores, que a injeção de OPG recombinante nas áreas submetidas à reabsorção óssea (mucosa palatal adjacente à raiz mesial, de

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acordo com a direção da força aplicada), inibe a movimentação ortodôntica e pode contribuir para solução da perda de ancoragem na mecânica ortodôntica.

Garlet et al. (2007) realizaram um estudo onde observaram a expressão de várias citocinas, além de OPG e RANKL, no ligamento periodontal de humanos, onde incidiram tanto forças de pressão quanto de tensão in vivo. Os dentes analisados (pré-molares) foram extraídos 7 dias após o início do tratamento com expansor Hyrax e, através da análise de RT-PCR em tempo real, a expressão das diversas citocinas, OPG e RANKL foram avaliadas nos lados de tensão e pressão do ligamento periodontal. As citocinas TGF-β, TNF-α e IL-10 apresentaram aumento estatisticamente significante na sua expressão no grupo experimental, sendo os níveis de expressão de IL-10 maiores no lado de tensão do ligamento periodontal; e TNF-α maiores no lado de pressão. Com relação a RANKL e OPG, os resultados apontaram uma maior expressão, estatisticamente significante, de ambas as citocinas tanto nos lados de pressão quanto tensão. Entretanto, esse aumento da expressão de RANKL foi estatisticamente maior no lado de pressão em relação à OPG, assim como o aumento de OPG no lado de tensão revelou-se estatisticamente maior em relação à RANKL. A expressão de um marcador bioquímico de formação óssea, a Osteocalcina, também foi analisada e demonstrou um padrão de variação semelhante à OPG. Os autores concluíram que o estudo não apresentou evidências da relação de causa-efeito entre as citocinas analisadas, OPG, RANKL e a resposta tecidual, uma vez que os dados gerados in vivo são influenciados por um ambiente complexo, onde a presença de diversos tipos celulares, citocinas e hormônios (que podem interagir e

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influenciar uns aos outros) podem mascarar os resultados e induzir a conclusões não condizentes com a realidade.

Segundo Keles et al. (2007) a perda de ancoragem e a recidiva são os maiores problemas clínicos enfrentados na ortodontia. Nesse contexto, os autores realizaram um estudo com o objetivo de investigar a eficácia de OPG e do bisfosfonato (substância capaz de inibir a reabsorção óssea) Pamidronato na inibição do movimento ortodôntico. Com a utilização de um aparelho ortodôntico instalado em camundongos, foram empregadas forças iniciais de 22,4 gramas sobre os molares superiores. Após 12 dias de ativação, a força final correspondia a 20,1 gramas. O número de osteoclastos (avaliado através de citoquímica) nas áreas de pressão do ligamento periodontal aumentou de forma estatisticamente significante após 3 dias, atingindo o pico em 4 dias e persistindo até 12 dias. O movimento obtido foi proporcional ao número de osteoclastos, sendo aumentado de maneira estatisticamente significante após 8 dias. O índice de apoptose osteoclástica foi muito baixo, o que sugere que o recrutamento, mais do que a morte celular programada, é um regulador crítico da atividade reabsortiva sob a ação de forças constantes. Tanto a OPG quanto o Pamidronato, após injetados subcutaneamente nas áreas adjacentes ao ligamento periodontal sob pressão, diminuíram o número de osteoclastos, de forma estatisticamente significante, sendo que o último mostrou-se menos efetivo (redução de 70%) em relação à OPG (95%). A movimentação ortodôntica obtida também foi inibida, sendo no nível de 77% com a OPG (estatisticamente significante), contra 34% com o Pamidronato. Os autores concluíram que as forças empregadas com essa metodologia desencadeiam o recrutamento, ativação e função dos osteoclastos; e que a OPG pode ter uma

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utilidade clínica relevante na prevenção dos movimentos ortodônticos indesejáveis.

Kim et al. (2007) investigaram as mudanças na expressão de RANKL pelas células do ligamento periodontal de ratos, submetidas à força ortodôntica contínua. Em um estudo longitudinal, 15 ratos foram utilizados, sendo que no grupo experimental os primeiros molares receberam a força ortodôntica contínua de 17,6 gramas na direção vestibular. Através de reação citoquímica, osteoclastos foram localizados na distal dos molares não submetidos à força ortodôntica, e no lado de pressão do ligamento periodontal após 1 dia de ativação, atingindo o número máximo após 3 e mantendo-se após 7 dias. A

imunohistoquímica revelou marcação de RANKL em osteoblastos,

osteoclastos, células do ligamento periodontal e cementoblastos na região distal dos molares que não foram submetidos à força ortodôntica, assim como nas regiões de pressão do ligamento periodontal nos molares vestibularizados. Em relação ao lado de tensão, o lado de pressão apresentou maior marcação imunohistoquímica para RANKL após 3 e 7 dias de emprego da força. Os autores concluíram que as células do ligamento periodontal submetidas a forças contínuas de pressão expressam RANKL. Além disso, outras citocinas estariam relacionadas no equilíbrio do processo de reabsorção óssea, posto que os níveis de RANKL não determinaram o aumento contínuo do número de osteoclastos nos períodos estudados.

Para estudar os efeitos das forças intermitentes sobre a expressão de RANKL, OPG e outra citocina, IL-1β, Nakao et al. (2007) empregaram forças de pressão sobre células periodontais humanas em cultura. As células foram submetidas a forças de 2,0 ou 5,0 g/cm2, por 2 a 4 dias, 8 horas por dia ou de

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forma contínua. Através de RT-PCR, foi quantificada a expressão de RANKL, OPG e IL-1β. As células foram analisadas com relação aos danos causados pelas forças de pressão, de acordo com o nível de desoxihidrogenase lática liberada pelas mesmas, obtido através de ELISA. Os resultados apontaram para um dano celular menor com a força de 2,0 g/cm2 em relação a 5,0 g/cm2. Na comparação entre forças contínuas e intermitentes, as forças contínuas de 2,0 g/cm2 resultaram em maior dano celular, estatisticamente significante, em relação às forças intermitentes de mesma intensidade. A expressão de OPG se mostrou maior nas células controle, nas quais não incidiu a força e menor proporcionalmente à magnitude e duração da força nas células submetidas à pressão, sendo que somente após 3 dias a expressão foi menor sob forças intermitentes em relação às contínuas. Já a expressão de RANKL não foi detectada nas células controle, porém, as forças intermitentes se mostraram mais eficientes em estimular a expressão de RANKL em relação às contínuas, sendo a expressão aumentada proporcionalmente à magnitude da força de pressão empregada. Já a expressão de IL-1β foi maior sob a incidência de forças intermitentes de 2,0 g/cm2 após 4 dias. Ao neutralizar a IL-1β do meio neste período, a expressão de RANKL foi inibida. Os autores concluíram que as forças de pressão intermitentes podem induzir a expressão de RANKL pelas células do ligamento periodontal humano in vitro, produzindo menos danos celulares; e que a IL-1β é um regulador autócrino da expressão de RANKL sob essas condições.

Em outro estudo, Zuo et al. (2007) observaram a influência da movimentação dentária ortodonticamente induzida sobre a ativação do Fator Nuclear kappa β. Através de imunohistoquímica, foi constatado um aumento da

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ativação do Fator Nuclear kappa β no osso alveolar adjacente ao ligamento periodontal de incisivos de ratos submetidos à força ortodôntica contínua de 40 gramas. A marcação revelou-se presente em osteoclastos, em baixa intensidade no grupo controle (sem movimentação); e em alta intensidade após 3 e 12 horas de ativação do aparelho ortodôntico. Osteoclastos de camundongos em cultura também foram analisados e, após a adição de RANKL ao meio, não foram observadas mudanças no nível de ativação do Fator Nuclear kappa β. Através de Western Blotting, foi constatado aumento na ativação do Fator Nuclear kappa β após os osteoclastos em cultura serem submetidos a estresse mecânico (as células foram agitadas com uma espátula plástica). Os autores concluíram que a ativação do Fator Nuclear kappa β se dá após estímulo ortodôntico.

Com o objetivo de examinar os efeitos do laser de baixa potência (AsGaAl) na expressão de RANK, RANKL e OPG durante o movimento dentário ortodonticamente induzido, Fujita et al. (2008) aplicaram força ortodôntica constante de 10 gramas nos molares de ratos durante 7 dias. O laser foi irradiado com uma potência de 100 mW em um comprimento de onde de 810 nm, sendo a dose recebida por cada um dos 25 animais correspondeu a 54 J/cm2; aplicada uma vez por dia por 3 minuntos em cada ponto da gengiva adjacente aos molares, nas regiões mesial, palatal e vestibular. Além do grupo controle (25 animais não irradiados), outros 25 ratos foram irradiados com LED, seguindo a mesma metodologia, com comprimento de onde de 850 nm, potência de 75 mW e dose idêntica ao grupo experimental. Cada grupo foi dividido em 5 subgrupos de 5 animais cada, para análise dos diferentes períodos de movimentação ortodôntica (1, 2, 3, 4 e 7 dias). A região de pressão

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do ligamento periodontal foi analisada histologicamente. Através de imunohistoquímica, foi verificada uma marcação maior para RANKL, estatisticamente significante, no grupo irradiado com laser em todos os períodos analisados. A marcação para RANKL foi detectada em osteoclastos, osteoblastos e células do ligamento periodontal. A marcação para RANK, a partir de 2 dias de irradiação, foi estatisticamente maior nos animais que receberam laser e foi visualizada em osteoclastos e células mononucleares no ligamento periodontal. Marcação imunohistoquímica para OPG foi visualizada em todos os grupos, mas nenhuma variação foi detectada durante os períodos analisados, sendo que foi restrita aos osteoblastos. O número de osteoclastos, avaliado por citoquímica, foi estatisticamente maior nos animais irradiados com laser a partir de 2 dias de movimentação. A partir de 3 dias da ativação do aparelho, os animais que receberam a irradiação laser apresentaram maior movimentação ortodôntica, estatisticamente significante, em relação aos dois grupos controle (não irradiados e irradiados com LED). Para confirmar os efeitos observados in vivo, células precursoras de osteoclastos também receberam, in vitro, irradiação laser com comprimento de onda de 810 nm, potência de 50 mW e dose correspondente a 27,99 J/cm2; aplicada uma vez por dia durante 8 dias. Através de RT-PCR, foi detectada uma maior expressão de RANK, estatisticamente significante, após 2 e 3 dias de irradiação. Com esses resultados, os autores concluíram que o laser de baixa potência estimula a velocidade da movimentação ortodôntica, via indução de RANK e RANKL.

Garlet et al. (2008) estudaram, dentre outras proteínas, a expressão de RANKL e osteocalcina (proteína utilizada como marcador para formação óssea) nas regiões de tensão e pressão do ligamento periodontal de 16

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pacientes (32 dentes) submetidos a expansão rápida maxilar, com uma força intermitente de 7 Newtons (aproximadamente 714 gramas), durante 7 dias. O ligamento periodontal dos pré-molares extraídos foi analisado logo após a remoção do disjuntor. Através de RT-PCR, foi detectada uma maior expressão de RANKL e osteocalcina, estatisticamente significante, tanto no lado de pressão quanto no lado de tensão em relação ao grupo controle. Entretanto, o aumento da expressão de RANKL foi estatisticamente maior no lado de pressão em relação ao lado de tensão, sendo o contrário observado para osteocalcina. Outras citocinas também apresentaram aumento e diminuição da expressão variando conforme o lado do ligamento periodontal analisado, enquanto outras não apresentaram variação. Os autores concluíram que há uma expressão diferencial de citocinas, RANKL e osteocalcina conforme a direção de emprego da força, gerando pressão ou tensão, sendo que esse padrão acarreta o estabelecimento de microambientes distintos que contribuem para os diferentes padrões de remodelação óssea observados em ambos.

Em outro estudo in vitro, Nakajima et al. (2008) estudaram o efeito de forças de pressão contínuas (0,5; 1,0; 2,0; 3,0 e 4,0 g/cm2), empregadas durante 1, 3, 6, 9, 12 e 24 horas, na expressão de RANKL solúvel e do Fator de crescimento de fibroblastos 2 nas células do ligamento periodontal humano. As células foram obtidas de pré-molares extraídos durante o tratamento ortodôntico de seis jovens (14 a 16 anos). Através de ELISA, foi detectado aumento nos níveis do Fator de crescimento de fibroblastos 2 e RANKL, estatisticamente significante, após 24 horas de emprego da força,

independentemente da magnitude. Entretanto, a força de magnitude 4,0 g/cm2

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magnitudes empregadas. Já a OPG apresentou aumento dos níveis após 24 horas, estatisticamente significante, com diminuição da magnitude das forças de pressão empregadas, sendo que as forças de 0,5 e 1,0 g/cm2 resultaram em níveis ainda maiores, estatisticamente significantes, em relação às forças de maior magnitude. Através de RT-PCR, foi observado também um aumento na expressão do fator de crescimento de fibroblastos 2 proporcional à magnitude da força empregada, por um período de 24 horas. A neutralização do Fator de crescimento de fibroblastos 2 no meio coincidiu com uma diminuição dos níveis de RANKL e OPG, estatisticamente significante, após 24 horas do emprego da força de 4,0 g/cm2. Os autores concluíram que o Fator de crescimento de fibroblastos 2 pode estar parcialmente envolvido na osteoclastogênese durante a movimentação dentária ortodonticamente induzida.

Nishimura et al. (2008), investigaram a influência da vibração por ressonância, aplicada sobre o esmalte dentário, na movimentação ortodonticamente induzida em ratos. Os molares receberam força contínua de 12,8 gramas na direção vestibular por 21 dias, sendo que, durante 8hs, foi aplicada vibração nesses dentes, após 0, 7 e 14 dias de ativação do aparelho. Os resultados apontaram para um aumento da movimentação dentária, estatisticamente significante, através da aplicação da vibração com 21 dias de ativação. Através de imunohistoquímica, foi detectada uma maior marcação para RANKL nos animais submetidos à vibração, sendo mais intensa no lado de pressão do ligamento periodontal. Também foi detectado um aumento no número de osteoclastos (através de citoquímica e estatisticamente significante) após 7 dias. A marcação para RANKL foi visualizada em fibroblastos e osteoclastos no ligamento periodontal submetido à pressão; e em fibroblastos e

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osteoblastos no lado de tensão. Histologicamente, não foram observadas diferenças no padrão de reabsorção radicular com a aplicação da vibração conjuntamente com a força ortodôntica. Os autores concluíram que a aplicação de vibração sobre os dentes, em conjunto com a força ortodôntica, pode acelerar o movimento dentário através da indução do aumento da expressão de RANKL no ligamento periodontal, sem promover aumento de danos teciduais indesejáveis, como a reabsorção radicular.

Toygar et al. (2008), investigaram o nível de OPG no fluído crevicular de adolescentes (13 a 17 anos) submetidos à força ordotôntica contínua de 150 gramas (distalização de caninos), no lado de pressão do ligamento periodontal. As amostras foram colhidas antes da instalação do aparelho e após, 1 hora, 24 horas, 168 horas, 1 mês e 3 meses de ativação do mesmo. A concentração de OPG foi avaliada por ELISA, sendo que os resultados apontaram uma diminuição estatisticamente significante, em relação aos níveis basais, após 1 hora, mantendo-se durante os 3 meses analisados. No entanto, o grupo controle (sem força ortodôntica) apresentou concentrações variáveis que, quando comparadas com o grupo experimental, não apresentaram diferenças estatisticamente significantes. Os autores concluíram que OPG é um importante mediador responsável pela remodelação alveolar durante o movimento dentário ortodonticamente induzido.

Com o intuito de averiguar a origem dos osteoclastos responsáveis pela reabsorção óssea durante a movimentação ortodôntica, Xie, Kuijpers e Maltha (2008), avaliaram espacial e sequencialmente a distribuição dos precursores de osteoclastos, através da detecção de três receptores: Receptor de M-CSF (c-Fms), RANK e Receptor de Calcitonina. A diferenciação entre células

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precursoras e osteoclastos maduros foi feita através de imunohistoquímica. Foi utilizado o critério de que células precursoras jovens apresentam marcação para c-Fms, enquanto células precursoras maduras para c-Fms e RANK. A marcação para o Receptor de Calcitonina é considerada exclusiva de osteoclastos ativados. Elásticos separadores foram inseridos entre os molares de ratos, e os períodos de 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 6 dias foram avaliados. Na medula óssea, foram detectadas células mononucleares com marcação para c-Fms e RANK. A marcação para RANK sofreu aumento nessas células, estatisticamente significante, após 3 dias decrescendo após 6 dias mas mantendo-se estatisticamente aumentada em relação ao nível basal. A marcação para c-Fms apresentou variação semelhante, mas não estatisticamente significante. Já as células multinucleares apresentaram-se em menor número em relação às mononucleares. Osteoclastos maduros, apresentando marcação para Receptor de Calcitonina, foram visualizados em maior número com 2 dias de ativação, decrescendo até os níveis basais, com 6 dias. Na região do ligamento submetida a pressão, as células mononucleares apresentaram marcação apenas para RANK, tendo seu número elevado (estatisticamente insignificante) até que, após 3 dias, seguiu diminuindo progressivamente. As células multinucleares desta região não apresentaram marcação tanto para c-Fms, quanto para RANK e Receptor de Calcitonina antes da introdução dos elásticos. Entretanto, após 1 dia de ativação, a marcação para ambos aumentou, apresentando um aumento no número de osteoclastos maduros, estatisticamente significante, com 3 dias de ativação, voltando a diminuir após esse período mas mantendo o aumento estatisticamente significante em relação aos níveis basais. Os autores