O primeiro estudo que analisou a presença de RANKL no ligamento periodontal durante o movimento ortodôntico foi publicado por Shiotani et al. (2001). Através da movimentação ortodôntica obtida pela inserção de elásticos separadores entre os molares de ratos durante quatro dias, os autores detectaram, por meio de técnicas imunohistoquímicas, a presença de marcação para RANKL no ligamento periodontal submetido à pressão, principalmente no citoplasma e nas cisternas do retículo endoplasmático rugoso (RER) dos osteoblastos. RANKL também foi detectada na membrana plasmática dos osteoblastos e células do estroma. Similar localização subcelular foi detectada em osteócitos e fibroblastos. Nos osteoclastos, marcação de RANKL foi detectada na membrana da borda em escova, no citoplasma adjacente a ela, assim como na zona clara. Esta localização de RANKL sugeriria, de acordo com os autores, uma função regulatória sobre os osteoclastos, determinada pela localização de RANKL no RER de osteoblastos, fibroblastos e células do estroma; associada a uma função reabsortiva, determinada pela presença na membrana da borda em escova e na zona clara de osteoclastos. Dessa forma, RANKL expressa por osteoclastos poderia ter uma função auto-regulatória na sua atividade reabsortiva.
Em outro estudo, Kanzaki et al. (2001) comprovaram que o estímulo para a ocorrência de reabsorção óssea depende do contato célula-a-célula, entre as células do ligamento periodontal e células precursoras de osteoclastos. O cultivo de células precursoras, juntamente com células do
Revisão de literatura 15
ligamento periodontal, estimulou a atividade reabsortiva em dentina bovina quando comparadas às mesmas células precursoras cultivadas sozinhas. Essas células precursoras, quando cultivadas em contato indireto (no mesmo meio, porém, separadas por uma membrana que permitia a passagem de fatores solúveis, mas impedia o contato célula-a-célula) com as células do
ligamento periodontal, apresentaram uma atividade reabsortiva
significantemente diminuída, assim como o número de células TRAP-positivas diminuiu de maneira estatisticamente significante. Em paralelo, foi também constatada a expressão (através de RT-PCR) de RANKL e OPG pelas células do ligamento periodontal, sendo que a quantidade de OPG (medida através de ELISA) não se alterou entre os meios cultivados em contato direto e indireto. O estudo concluiu que as células do ligamento periodontal podem determinar o aumento da atividade osteoclástica através do contato direto com células sanguíneas, ou inibir a mesma através da produção contínua de fatores solúveis.
Após a constatação de que o aumento da atividade osteoclástica se dá pelo contato célula-a-célula entre células precursoras de osteoclastos provenientes do sangue e células do ligamento periodontal, Kanzaki et al. (2002), concluíram que essa atividade pode ser aumentada pelo emprego de forças de pressão, assim como pela adição de prostaglandina E2 (PGE2) sobre essas células em cultura. Nesse estudo, o aumento da expressão de RANKL (medido através de RT-PCR) e do número de osteoclastos (através de citoquímica) foi proporcional à magnitude e duração da força empregada. No entanto, após atingir um pico de 2 g/cm2 de magnitude e 24 horas de duração, não houve mais mudanças estatisticamente significantes no número de
Revisão de literatura 16
osteoclastos; assim como a partir de 2 g/cm2 de magnitude e 48 horas de duração, a expressão de RANKL não foi aumentada. Já com relação à OPG, não foi observada qualquer mudança na sua expressão (medida através de
RT-PCR) diante do emprego da força de pressão. Os níveis de PGE2
aumentaram significantemente, proporcionalmente à duração da força aplicada
até um período de 60 horas. A adição de PGE2 exógena ao meio promoveu um
aumento de RANKL (avaliado através de Western Blotting). Os autores
concluíram que o emprego de forças de pressão estimulou a
osteoclastogênese devido a uma maior expressão de RANKL, e não à diminuição de OPG.
Com o objetivo de estudar o papel de RANKL e OPG na remodelação óssea durante a movimentação dentária ortodonticamente induzida, Oshiro et al. (2002), utilizaram elásticos separadores entre os incisivos superiores de camundongos com deficiência na produção de OPG, fazendo o mesmo em camundongos normais. Através da imunohistoquímica, observou-se um aumento da marcação para RANKL em ambos os grupos (animais deficientes na produção de OPG e animais normais) após 2 e 5 dias de inserção dos elásticos. Nos camundongos com deficiência em OPG, a marcação para RANKL foi maior em relação aos camundongos normais, somente no momento inicial (“dia 0”). A localização de RANKL foi temporalmente diferente entre os grupos, sendo a marcação observada em osteoblastos e fibroblastos nos camundongos normais após 2 dias e, adicionalmente, em osteoclastos após 5 dias; já no grupo deficiente em OPG, foi observada marcação em osteoblastos e fibroblastos após 0 dia e, após 2 e 5 dias, também em osteoclastos. O número de osteoclastos na região do ligamento periodontal submetida à
Revisão de literatura 17
pressão, assim como a reabsorção óssea, foi maior nos camundongos com deficiência em OPG após 0, 2 e 5 dias de inserção dos elásticos separadores, em relação aos camundongos normais. Os autores concluíram que, durante a movimentação ortodôntica, a osteoclastogênese é regulada por RANKL positivamente e pela OPG negativamente.
O papel biológico de RANKL e OPG na ativação de osteoclastos foi estudado, in vitro, por Shiotani et al. (2002). Pré-osteoclastos de camundongos foram cultivados em presença de RANKL; ou do fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF); ou de RANKL e OPG. Já osteoclastos maduros foram cultivados com RANKL; ou RANKL e OPG. A adição de dentina nos meios permitiu observar a atividade reabsortiva que, através de microscopia eletrônica, comprovou ser notadamente aumentada nos meios que receberam apenas RANKL, tanto para pré-osteoclastos quanto para osteoclastos maduros. Os pré-osteoclastos, após cultivados com M-CSF, apresentaram algumas características de osteoclastos (células fundidas, com vários núcleos) entretanto, não foi observada intensa atividade reabsortiva, assim como nos meios em que pré-osteoclastos e osteoclastos foram cultivados com RANKL e OPG. O estudo concluiu que M-CSF não induz a formação de osteoclastos; RANKL é determinante na maturação e ativação de osteoclastos; e que a OPG inibe a atividade destas células.
Uma vez elucidado o papel biológico de RANKL e OPG na diferenciação e maturação de osteoclastos, Kanzaki et al., 2004 comprovaram a influência da OPG sobre a movimentação dentária ortodonticamente induzida em ratos. Foi confeccionado um aparelho ortodôntico para produzir movimentação palatina dos molares e, após a sua ativação, os animais receberam uma injeção
Revisão de literatura 18
subperiostal, na região adjacente ao lado de pressão do ligamento periodontal, contendo um vetor com o gene específico para indução da expressão de OPG. Em relação aos animais submetidos apenas à força ortodôntica, os animais com expressão de OPG induzida apresentaram uma menor atividade osteoclástica (avaliada através de citoquímica), estatisticamente significante. Do mesmo modo, nesses animais foi detectada maior marcação imunohistoquímica para OPG na região do ligamento periodontal. O grupo em que a expressão de OPG foi induzida também apresentou menor movimentação dentária, a partir do sétimo até o vigésimo primeiro dia de ativação, estatisticamente significante, em relação ao grupo submetido apenas à força ortodôntica. Esses resultados levaram os autores a concluir que, sendo OPG um receptor que inibe a ação de RANKL, a movimentação ortodôntica é regulada primariamente pela sinalização de RANKL nas células periodontais.
Para esclarecer as mudanças que ocorrem na expressão de RANKL, RANK e osteoprotegerina durante a reabsorção óssea, Ogasawara et al.(2004) avaliaram a quantidade de RANK-RNAm em osteoclastos durante a movimentação dentária ortodonticamente induzida em ratos, obtida pela inserção de elásticos separadores entre o primeiro e o segundo molar superior. A identificação do RNAm foi obtida pela visualização de sondas (complementares aos RNA-alvos) marcadas, de modo semelhante à marcação imunohistoquímica, em uma técnica denominada “hibridização in situ”. Em condições fisiológicas (antes da inserção dos elásticos separadores), foi evidenciada a expressão de RANKL por osteoclastos, osteoblastos e células do ligamento periodontal, sendo que os mesmos osteoclastos RANKL-positivos apresentaram marcação para RANK. A expressão de RANK também foi
Revisão de literatura 19
evidenciada em células mesenquimais indiferenciadas, mas não nos outros tipos celulares. Já a expressão de OPG foi observada em osteoblastos e células do ligamento periodontal. Durante a movimentação ortodôntica, o número de osteoclastos RANKL e RANK-positivos aumentou, sendo novamente a expressão de ambas concomitante em muitas dessas células. A expressão de RANKL também sofreu um incremento, mas somente nas células do ligamento periodontal e não nos osteoblastos. Nenhuma alteração na expressão de OPG foi aferida. Os autores concluíram que a expressão de RANK e RANKL ocorre concomitantemente nos osteoclastos, sob condições fisiológicas, e que essa expressão é aumentada após o emprego da força ortodôntica (inserção dos elásticos separadores).
Low et al. (2005) descreveram as mudanças na expressão de RANKL e OPG durante a reabsorção radicular induzida pelo emprego de forças ortodônticas pesadas em molares de ratos. Através de forças contínuas de 100g direcionadas para produzir mesialização dos primeiros molares inferiores, foram obtidos dados sobre a expressão de OPG e RANKL nas áreas de tecido ósseo e radicular submetidas à pressão, através da análise dos produtos da reação de RT-PCR em tempo real, 14 dias após a instalação do aparelho. Os resultados apontaram para um aumento discreto na expressão de RANKL, enquanto que, com relação à OPG, foi detectado um aumento estatisticamente significante. Os autores concluíram que os níveis de OPG, acima dos de RANKL, podem ter sido induzidos pela intensa atividade inflamatória desencadeada pelo emprego de forças ortodônticas pesadas.
Diante das evidências sobre a importância de RANK na diferenciação de osteoclastos, Aihara, Yamaguchi e Kasai (2006) realizaram um estudo para
Revisão de literatura 20
investigar os efeitos do laser de baixa potência sobre suas células precursoras, aferindo os níveis de expressão de RANK e quantificando o número de osteoclastos obtido após o seu emprego. As células (provenientes de ratos) em cultura foram expostas à radiação do laser de baixa potência de Arseniato de gálio e alumínio (AsGaAl) por períodos de 1, 3, 6 ou 10 minutos por dia, durante 8 dias, resultando em doses de 9,33, 27,99, 55,98 ou 93,30 J/cm2, respectivamente. A radiação foi empregada em um comprimento de onda de 810 nm e potência de 50 mW. O número de osteoclastos foi medido através de citoquímica e a expressão de RANK por imunohistoquímica. A comprovação da atividade reabsortiva dos osteoclastos foi feita pela introdução de slices de dentina no meio e a expressão de RANK pelas células em cultura aferida por RT-PCR. Os resultados apontaram para um aumento estatisticamente significante no número de osteoclastos, nas células irradiadas pelos períodos de 1,3 e 6 minutos por dia, sendo o maior número obtido no período de 3 minutos por dia. As células irradiadas por esse período foram então estudadas em relação à influência do tempo de exposição ao laser. Através de citoquímica, observou-se a presença de osteoclastos após 2 dias de irradiação, sendo que estas células não foram observadas antes de 3 dias nos controles. A imunohistoquímica revelou uma maior marcação para RANK após 2 e 3 dias de irradiação. Para esses períodos (2 e 3 dias de irradiação por 3 minutos ao dia), foi avaliada a expressão de RANK através de RT-PCR e observada uma banda, correspondente a RNAm para RANK, mais intensa nos meios irradiados com laser. Ao inserir slices de dentina, constatou-se maior número de lacunas reabsortivas, estatisticamente significante, nos meios irradiados por laser após 8 dias, por períodos de 1, 3 e 6 minutos por dia, mas não por 10 minutos por
Revisão de literatura 21
dia. Esse aumento da atividade reabsortiva foi proporcional aos períodos, exceto 10 minutos por dia. Os autores chegaram à conclusão de que a irradiação com laser de baixa potência (AsGaAl) induz a diferenciação e ativação de osteoclastos in vitro, via expressão de RANK.
Kanzaki et al. (2006ª) comprovaram a influência de RANKL sob a movimentação dentária ortodonticamente induzida em ratos, empregando técnicas de terapia genética. Foi confeccionado um aparelho ortodôntico para produzir movimentação palatina dos molares e, após a sua ativação, os animais receberam uma injeção subperiostal, na região adjacente ao lado de pressão do ligamento periodontal, contendo o vetor com o gene específico para indução da expressão de RANKL. Em relação ao grupo controle (em que não foi induzida a expressão de RANKL), foi observada, através de citoquímica, uma maior atividade osteoclástica e, através de imunohistoquímica, maior expressão de RANKL na região do ligamento periodontal, ambas estatisticamente significantes. O grupo em que a expressão de RANKL foi induzida também apresentou maior movimentação dentária, após a ativação do aparelho ortodôntico em relação ao grupo controle, também estatisticamente significante. Esses resultados levaram os autores a concluir que, sendo RANKL um indutor da atividade osteoclástica, a movimentação ortodôntica pode ser acelerada pelo emprego da terapia genética por eles empregada.
Para avaliar os níveis de RANKL e OPG durante a movimentação ortodôntica em humanos, Kawasaki et al. (2006), analisaram o fluído crevicular de pacientes adolescentes (média de 15.1 anos) e adultos (média de 31 anos). Os grupos contavam com indivíduos de ambos os sexos, masculino e feminino. A análise quantitativa foi feita, através de ELISA, nas amostras coletadas no
Revisão de literatura 22
lado em que o ligamento periodontal foi submetido a forças de pressão por períodos de 0, 1, 24 e 168 horas. Os resultados apresentaram uma maior taxa de movimentação dentária, estatisticamente significante, nos adolescentes após 168 horas de emprego da força ortodôntica. Da mesma forma, os níveis de RANKL apresentaram-se mais elevados após 24 horas, sendo esse aumento estatisticamente maior nos pacientes adolescentes em relação aos adultos. No mesmo período, OPG apresentou níveis menores em ambos os grupos em relação aos controles, sendo que os níveis nos adultos foram ainda menores. Após 0, 1 e 168 horas, não foi observada diferença estatisticamente significante em relação aos níveis-controle. Os autores concluíram que a diminuição da movimentação dentária nos pacientes mais velhos pode ser relacionada à diminuição dos níveis de RANKL/OPG durante os estágios iniciais da movimentação ortodôntica.
Para estudar o efeito de forças de tensão sobre a expressão de OPG, Kanzaki et al. (2006b) utilizaram células de ligamento periodontal humano cultivadas conjuntamente com células precursoras de osteoclastos. As células foram submetidas a forças de tensão intermitentes por 30 minutos, 90 minutos, 6 horas, 24 horas, 48 horas ou 72 horas. Através de RT-PCR, os autores verificaram uma maior expressão estatisticamente significante de OPG, RANKL e TGF-β sendo, este último, uma citocina relacionada ao controle da expressão de OPG. Os resultados apontaram para um aumento significativo da expressão de RANKL, OPG e TGF-β após 48 e 72 horas de aplicação da força de tensão. As células submetidas a forças de tensão apresentaram uma atividade reabsortiva, sobre dentina adicionada aos meios, estatisticamente significante menor. O aumento da expressão de OPG foi dependente de TGF-β, uma vez
Revisão de literatura 23
que a neutralização da citocina no meio provocou uma diminuição de OPG em uma relação dose-dependente. Os autores concluíram que o emprego de forças de tensão intermitentes induzem o aumento da expressão de RANKL, OPG e TGF-β. Não obstante, TGF-β estaria envolvida na regulação da expressão de OPG dentro deste processo.
Nishijima et al. (2006) também analisaram o fluído crevicular de pacientes adolescentes dos sexos masculino e feminino, após a aplicação de forças ortodônticas de pressão sobre o ligamento periodontal humano. A análise quantitativa foi feita, através de ELISA, nas amostras coletadas no lado em que o ligamento periodontal foi submetido a forças de pressão por períodos de 0, 1, 24 e 168 horas e apresentaram uma maior expressão de RANKL e uma diminuição de OPG, estatisticamente significante, somente no período de 24 horas. Adicionalmente, um estudo in vitro foi realizado em células do ligamento periodontal humano, cultivadas e submetidas a forças de pressão crescentes. Foi verificado que ocorreu aumento da expressão de RANKL e diminuição de OPG, estatisticamente significante, na medida em que a intensidade da força foi aumentada, até um limite de 2 g/cm2. Sob esta intensidade de força compressiva, a mudança dos níveis de RANKL e OPG apresentou o mesmo padrão proporcionalmente ao tempo de emprego da força (0, 3, 6, 9, 12, 24 e 48 horas). Diante dos resultados obtidos, os autores concluíram que, no fluído crevicular de humanos, os níveis de RANKL sofrem aumento e os de OPG diminuição durante a movimentação ortodôntica, no lado de pressão do ligamento periodontal. Nas células do ligamento periodontal humano in vitro, as mudanças dos níveis de RANKL e OPG apresentam o mesmo padrão em uma relação tempo e força-depentendes.
Revisão de literatura 24
Em outro estudo, que analisou como forças de tensão com magnitudes diferentes podem influenciar a expressão de OPG e RAKNL, Tang, Lin e Li (2006) utilizaram osteoblastos de camundongos in vitro. As células foram submetidas a alongamento de 0%, 6%, 12% ou 18% com o incremento da força de tensão, por um período de 24 horas. A força foi empregada de forma intermitente e os resultados apresentaram uma diminuição de RNAm (aferido por RT-PCR) para RANKL, assim como uma diminuição dos níveis de RANKL (resultados obtidos por ELISA) secretada por osteoblastos, em uma relação dependente da magnitude da força empregada. Concomitantemente, houve um aumento da expressão de OPG (resultados obtidos por ELISA). Todas essas variações revelaram-se estatisticamente significantes. Os autores então concluíram que diferentes magnitudes de forças de tensão influenciam o comportamento de osteoblastos, sendo que as mudanças observadas na expressão de RANKL e OPG podem repercutir na ocorrência da remodelação óssea.
Com o objetivo de relacionar a expressão de RANKL e o fenômeno de reabsorção radicular, Yamaguchi et al. (2006), submeteram as células do ligamento periodontal de pacientes que apresentaram reabsorção radicular severa nos incisivos centrais após o tratamento ortodôntico à incidência de forças pressão in vitro. Em relação às células do grupo controle (pacientes que não apresentaram reabsorção severa), as células submetidas à força de pressão (2,0 g/cm2), provenientes de primeiros pré-molares, apresentaram maiores níveis de RANKL a partir do período de 6 horas (aferido por ELISA) e uma diminuição de OPG (ELISA), sendo essas mudanças estatisticamente significantes. Esse aumento de RANKL e diminuição de OPG foram
Revisão de literatura 25
proporcionais à duração da aplicação da força até um período de 12 horas. O número de osteoclastos, analisado através de citoquímica, também se apresentou estatisticamente maior nas células de pacientes com severa reabsorção radicular, assim como os níveis de reabsorção de dentina adicionada aos meios. Os autores concluíram que as células periodontais derivadas de indivíduos que apresentaram severa reabsorção radicular produzem uma maior quantidade de RANKL e menor de OPG quando submetidas a forças de pressão, resultando em uma hiperestimulação da osteoclastogênese.
Dunn et al. (2007), examinaram o papel da OPG na regulação da remodelação óssea ortodonticamente induzida em ratos. Através de um dispositivo ortodôntico, forças contínuas de 54±2 gramas foram empregadas no sentido de mover mesialmente os primeiros molares superiores de ratos. Doses de 0,5 e 5,0 mg/kg de OPG recombinante foram injetadas duas vezes por semana no lado de pressão do ligamento periodontal dos molares movimentados. A dose de 5,0 mg/kg inibiu a movimentação ortodôntica, de forma estatisticamente significante, em taxas de 45,7%, 70,6% e 78,7% nos períodos de 7, 14 e 21 dias respectivamente (medida pela análise de modelos); assim como diminuiu significantemente o número de osteoclastos (quantificados por citoquímica) em comparação com o grupo controle, nas áreas de pressão do ligamento periodontal. A dose de 0,5 mg/kg também inibiu a movimentação de forma estatisticamente significante, mas em níveis menores, sendo 43,8% e 31,8% nos períodos de 7 e 14 dias. Os resultados sugerem, segundo os autores, que a injeção de OPG recombinante nas áreas submetidas à reabsorção óssea (mucosa palatal adjacente à raiz mesial, de
Revisão de literatura 26
acordo com a direção da força aplicada), inibe a movimentação ortodôntica e pode contribuir para solução da perda de ancoragem na mecânica ortodôntica.
Garlet et al. (2007) realizaram um estudo onde observaram a expressão de várias citocinas, além de OPG e RANKL, no ligamento periodontal de humanos, onde incidiram tanto forças de pressão quanto de tensão in vivo. Os dentes analisados (pré-molares) foram extraídos 7 dias após o início do tratamento com expansor Hyrax e, através da análise de RT-PCR em tempo real, a expressão das diversas citocinas, OPG e RANKL foram avaliadas nos lados de tensão e pressão do ligamento periodontal. As citocinas TGF-β, TNF-α e IL-10 apresentaram aumento estatisticamente significante na sua expressão no grupo experimental, sendo os níveis de expressão de IL-10 maiores no lado de tensão do ligamento periodontal; e TNF-α maiores no lado de pressão. Com relação a RANKL e OPG, os resultados apontaram uma