Determinação da Eficácia de Sistemas de Barreira Estéril contra desafios microbianos durante transporte e armazenamento
Hartmut Dunkelberg, MD; Ulrich Schmelz, MD
Tradução livre:Rosana Sampaio
Objetivo. O nível de garantia de esterilidade de 10-6 é um padrão estabelecido que define a qualidade dos produtos estéreis. O objetivo do estudo foi desenvolver um método que correlacionasse os resultados dos testes de barreira microbiana de sistemas de barreira estéril flexíveis com o desafio microbiano estimado que a embalagem encontra durante o armazenamento e transporte.
Métodos. A eficácia da embalagem de barreira microbiana foi determinada pela utilização de um teste de exposição da câmara com 20 variações de temperatura atmosféricas periódicas de 37,5mmHg e 52,5 mmHg. Embalagens para esterilização flexíveis foram utilizadas como sistemas de barreira estéreis. O valor de redução logarítmica de um sistema de barreira estéril foi calculado com base em resultados experimentais e comparado com o valor de redução logarítmica requerido pelos desafios microbianos para manter a esterilidade durante o transporte e o armazenamento.
Resultados. Para embalagens feitas de papel e material de filme plástico, o valor de redução logarítmica de 5,4 foi obtido com base em 30 de 99 lâminas que se tornaram não estéreis após exposição a uma diferença em variações de pressão atmosférica periódicas de 37,5 mmHg. Para embalagens feitas de papel e material de filme plástico, um valor de redução logarítmica de 5,2 foi obtido com base em 48 de 100 lâminas que se tornaram não estéreis após exposição a uma diferença de pressão atmosférica de 52,5 mmHg. Para embalagens feitas de material tecido não tecido e material de filme plástico, o valor de redução logarítmica de 6,38 (exemplo 3 de 99 lâminas se tornaram não estéreis após exposição a uma diferença de pressão de 37,5 mmHg) e 6,07 (exemplo 3 de 99 lâminas que se tornaram não estéreis após exposição a uma diferença de pressão de 52,5 mmHg) foram obtidos. Ao calcular um desafio microbiano esperado durante o transporte e armazenamento que requer propriedades de barreiras que correspondem a um valor de redução logarítmica de 5,83 e levando em conta o nível de garantia de
esterilidade, concluímos que somente as embalagens feitas de material tecido não tecido atenderam aos padrões Europeus EN 556-1.
Conclusões. Ao utilizar os dados obtidos em um teste de exposição microbiana com uma taxa de fluxo específica de um aerossol bacteriano, concluímos que a eficácia do sistema de barreira estéril contra o desafio microbiano atual pode ser examinada e avaliada no nível de garantia de esterilidade de 10-6.
Um requisito essencial para sistemas médicos de embalagens esterilizadas é que deve-se manter a esterilidade dos objetos fechados pelo tempo de prateleira especificado durante o transporte e armazenamento. Na prática, há tipos bem diferentes de sistemas de barreira estéreis (exemplo: embalagens para esterilização flexíveis de papel ou de material tecido não tecido e filme plástico, bolsas de esterilização de papel de grau médico poroso e alumínio de reuso rígido ou caixas de esterilização de aço inoxidável). A forma específica dos produtos médicos, seu uso pretendido, os procedimentos de esterilização considerados, e as condições de transporte influenciam a escolha do material para os sistemas de embalagem. Em hospitais, pratica-se a esterilização por meio de vapor, óxido de etileno ou processos de oxidação. O sistema de barreira estéril possui um componente permeável que permite a entrada do agente esterilizante. Por exemplo, o papel para embalagens deve estar de acordo com os requisitos do Padrão Europeu EN 868-3 (exemplo, o diâmetro do poro médio deve ser menor ou igual a 35 µm, com um diâmetro do poro máximo de 50 µm).
No entanto, devido à possibilidade de micro-organismos serem menores que este limite de tamanho, há um risco que a bactéria penetre na embalagem. O desafio microbiano para embalar varia bastante de acordo com as condições ambientais. Ele é afetado por muitos fatores, tais como condições de armazenamento (limpeza e temperatura) e transporte, que podem ser associados com uma carga microbiana alta e/ou variações de temperatura e pressão meteorológica
.
Pelos meios do teste de esterilidade, alguns estudos tentaram demonstrar que as embalagens adequadamente protegem o produto contra recontaminação durante o armazenamento e que elas mantêm a esterilidade. Porém, o teste de esterilidade sofre com diferentes limitações metodológicas. É verdade que a “esterilidade” é um termo absoluto, mas a confirmação de que qualquer produto seja estéril pode apenas ser definida em termos de uma função de probabilidade. Em concordância, a esterilidade é definida por um nível mínimo aceitável de garantia de esterilidade, que limita a probabilidade de uma unidade não estéril a 10-6. Um total de 3,8 milhões de itens tiveram que ser testados para que se confirmasse que o lote de um produto estava estéril em conformidade com o nível de garantia de esterilidade
(com 95% de intervalos de segurança [IQ]). Além disso, os testes de esterilidade acarretam riscos de contaminação microbiana acidental que resultam em leituras falso-positivas. Com referência a essas limitações o US Food and Drug
Administration determinou que “os testes de esterilidade não são recomendados
como componente do programa de estabilidade para confirmação da continuidade da esterilidade durante a vida de prateleira de um produto ou período de validade”. Métodos alternativos podem ser mais confiáveis para confirmar a integridade de uma caixa e um sistema de fechamento como um componente de protocolo de estabilidade para produtos estéreis.
Em alguns artigos anteriores, descrevemos métodos quantitativos para mensuração de eficácia da barreira de toda a embalagem final através do teste de câmara de exposição. O objetivo do estudo era desenvolver um método que correlacionasse os resultados dos testes de barreira microbiana de sistemas de barreira estéril flexíveis com o desafio microbiano estimado que a embalagem encontra durante o armazenamento e transporte. Este procedimento tinha a intuito de estabelecer se as propriedades das barreiras do sistema de embalagem eram suficientes para manter a esterilidade sob condições específicas de transporte e armazenamento em um nível de garantia de esterilidade de 10-6.
MÉTODOS
Dois tipos de embalagens para esterilização foram utilizados como sistema de embalagem médica. Um tipo consistia em um filme plástico de um lado e papel do outro. O outro tipo consistia em filme plástico de um lado e material tecido não tecido feito de fibra de polietileno de alta densidade do outro lado. De acordo com o declarado pelo fabricante, os materiais embalados utilizados eram capazes de suportar esterilização a vapor a 121ºC. Lâminas termo resistentes descobertas (diâmetro de 90 mm) preenchidos com 25 mL de casein-peptone soymeal peptone
agar (Oxoid) foram embaladas com tais embalagens. Uma série de testes
compreenderam embalagens nas quais as lâminas de ágar descobertas foram posicionadas com o lado aberto sob a superfície de papel ou material tecido não tecido. Em uma outra série de testes, os lados abertos foram posicionados abaixo do lado do filme plástico. Após seladas, as embalagens foram esterilizadas a 121ºC por 20 minutos com um ciclo de secagem de 30 minutos (autoclave ELV; Systec). A execução das máquinas de esterilização foi monitorada periodicamente com indicadores de vapor biológico (Spore – O – Check; ATI). Após o ágar ter resfriado para uma temperatura abaixo de 40ºC e solidificado, as embalagens teste foram removidas da autoclave.
Uma câmara de exposição com capacidade de 0,24m3 foi equipada com um nebulizador (Pari Juniorboy; PARI) e uma bomba de aspiração (Sartorius MD2;
Sartorius). A pressão na câmara foi medida digitalmente com um medidor de
pressão (Testo 525; Testo). A pressão atmosférica foi periodicamente reduzida a 37,5mmHg ou 52,5 mmHg. Cada período de ciclo durou 6 minutos. Umidade e pressão foram continuamente registradas. Por meio do nebulizador, 5 mL de uma suspensão de Micrococcusluteus numa concentração de 108 organismos/mL foi aplicada para produzir um aerossol microbiano na câmara de exposição.
Quando a válvula foi aberta, no intuito de equalizar a diferença em pressão atmosférica (a partir daqui, “diferença de pressão”) o aerossol passou a válvula e se dispersou na câmara. Seis lâminas descobertas estabelecidas com o nutriente ágar foram expostas como controles nas bandejas dentro da câmara, para detectar superfícies de cargas microbianas durante o teste.
Para cada grupo de teste, 100 embalagens foram utilizadas. As embalagens foram submetidas a 20 variações de pressão atmosférica periódicas em 2 horas. Para 1 execução de teste, de 7 a 8 embalagens de 4 grupos de teste por diferença de pressão (no máximo 32 embalagens) poderiam ser posicionadas dentro da câmara; 13 execuções cada foram necessárias para os testes com diferença de pressão de 37,5mmHg a 52,5 mmHg.
Após a exposição, as embalagens foram incubadas a 36ºC por 48 horas. O crescimento microbiano foi reportado como unidades de formação de colônia (ufc – unidades formadoras de colônia) por área de superfície; 95% dos IQ (indicadores químicos) foram calculados para o número de embalagens não estéreis por grupo de teste e para a contagem microbiana total.
Se o crescimento da colônia foi observado, uma solução penetrante com tinta foi aplicada à borda que sela a embalagem para identificar qualquer fenda. Se houver alguma fenda na borda selada, a leitura é desconsiderada.
A eficácia das embalagens com barreira microbiana foi expressa conforme o valor de redução logarítmica (LRV). O LRV foi calculado utilizando a seguinte equação:
LRV = logN _logN ,
onde N0 é o número significativo calculado de bactérias presentes no volume total de ar que passa pelo sistema de poros da embalagem durante as 20 variações de pressão atmosféricas periódicas de 37,5mmHg ou 52,5 mmHg, respectivamente. A contagem bacteriana no ar significativa por cm3 na exposição da câmara foi calculada por meio do consumo da suspensão bacteriana e a saída do aerossol durante as variações de pressão. Em nosso estudo, não foi empregado um classificador de ar para monitorar a concentração bacteriana na câmara de exposição. No entanto, um impinger (impactador) todo de vidro foi utilizado após
tais experimentos, para provar e monitorar os micro-organismos suspensos no ar na câmara de exposição. N1 é o número de bactéria reportada como ufc nas lâminas na embalagem após a incubação. O volume de ar na embalagem foi de aproximadamente 120 cm3. O volume de ar que passa pela embalagem de material poroso como resultado da mudança de pressão de 37,5 mmHg poderia ser calculado como 5,64cm3. Um volume total de 112,8cm3 foi obtido para 20 variações de pressão periódicas. Para uma mudança de pressão atmosférica de 52,5 mmHg, o volume de ar que passa pela embalagem foi de 7,76 cm3. Utilizando 2 exemplos, calculamos as propriedades de barreiras requisitadas no que se refere a seu LRV estimando tanto o volume de ar que potencialmente penetra na embalagem durante o transporte e o armazenamento quanto na carga microbiana suspensa no ar (N estimado) deste volume. Um fator de segurança (SF) de 106 foi incluído no intuito de atingir o nível mínimo aceitável de garantia de esterilidade de 106. Baseado nestas suposições, a eficácia necessária da embalagem de barreira microbiana no que se refere a LRV necessário foi calculada da seguinte forma:
LRV
necessário= logN
estimado_log SF,
onde N estimado é o número estimado de bactérias presentes no volume total de ar que passa pela parte porosa do sistema de embalagem durante os diferentes estágios e períodos de tempo de armazenamento e transporte.
No exemplo 1, as seguintes condições foram especificadas: armazenamento de embalagens em áreas com ar condicionado de um departamento de esterilização central por 100 dias, 10 variações de pressão atmosférica de aproximadamente 11,2 mmHg e uma concentração total de micro-organismos suspensas no ar de 30 cfu/cm3. No exemplo 2, as seguintes condições foram especificadas: armazenamento de embalagens em um armazém por 100 dias com variações de temperatura significativas de aproximadamente 11,2 mmHg e uma concentração total de micro-organismos suspensos no ar de 1.000 ufc/cm3.
Exemplos de estágios de transporte e armazenamento tipicamente associados à passagem de ar pelo material poroso da embalagem são os seguintes: variação na pressão do ar durante o armazenamento, variações na altitude durante o transporte em elevadores, rotas de transporte de diferentes altitudes acima do nível do mar e a passagem de ar na embalagem causada pelas variações da temperatura do meio ambiente.
RESULTADOS
Após a exposição da embalagem para esterilização flexível (feitos de papel ou componente tecido não tecido) para variações de pressão de 37,5mmHg ou 52,5
mmHg, não se observou crescimento microbiano nas lâminas se o lado do filme plástico estivesse posicionado acima da superfície ágar. Este resultado mostra que o lado do filme plástico não era permeável aos micro-organismos. Posicionar as superfícies ágar descobertas sob o lado do papel resultou em um aumento no número de lâminas recontaminadas, para ambos os tipos de embalagens e para exposição de ambas variações de pressão de 37,5mmHg e 52,5 mmHg. Para 99 lâminas cobertas por papel e material filme plástico (1 embalagem foi excluída da análise devido a uma fenda na borda selada da embalagem), a exposição a uma diferença de pressão de 37,5mmHg resultou em 30 lâminas não estéreis (95% de Indicadores Químicos - 20,2 a 39,0 lâminas não estéreis). Para 100 embalagens feitas de papel e material de filme plástico, a exposição a uma diferença de pressão de 52,5 mmHg resultou em 48 lâminas não estéreis (95% de Indicadores Químicos – 38,2 a 57,8 lâminas não estéreis).
Para as 99 embalagens feitas de material tecido não tecido ou material de filme plástico (1 embalagem foi excluída da análise devido a uma fenda na borda selada da embalagem) a recontaminação de 3 lâminas foi observada (95% de Indicadores Químicos - 0 a 6,3 lâminas) que foram expostos a uma diferença de pressão de 37,5 mmHg. Para as 100 embalagens feitas com material tecido não tecido ou material de filme plástico que foram expostas a uma diferença de pressão de 52,5 mmHg, a recontaminação foi observada em 7 lâminas (95% de Indicadores Químicos - 2 a 12 lâminas). A carga microbiana da superfície significativa foi de 3,141 ufc por lâmina determinada (95% de Indicadores Químicos – 2,999 a 3,285 ufc por lâmina determinada) para execuções de teste expostas a uma diferença de pressão de 37,5 mmHg e 3,516 por lâminas determinadas (95% de Indicadores Químicos – 3,425 a 3,607 ufc por lâmina determinada) para execuções de teste expostas a uma diferença de pressão de 52,5 mmHg.
FIGURA: Resultados obtidos para determinar a eficiência das embalagens de papel e filme plástico e as embalagens de filme plástico e material tecido não tecido contra os desafios microbianos, por meio do teste da câmara de exposição.
Barras cinzas, números de embalagens avaliadas (axial esquerda); barras paralelas, número de embalagens nas quais o lâmina de ágar tinha crescimento microbiano (axial esquerda); setas e dados numéricos nas caixas, número total de unidades de formação de colônias (ufc) nas lâminas.
O valor de ar que passa pela embalagem exposta a uma diferença de pressão de 37,5 mmHg foi de 5,64 cm3. O volume de ar que passa pela embalagem exposta a 20 variações de pressão periódicas foi de 112,8 cm3. Com uma concentração de micróbios significativa calculada na câmara de exposição de 6,5 x 108 ufc/cm3 para testes que empregaram uma diferença de pressão de 37,5 mmHg, a carga de ar significativa (N0) em um volume de 112,8 cm3 foi de 73,320 ufc. Para testes empregando uma diferença de pressão de 52,5 mmHg, a concentração microbiana significativa calculada foi de 5,3 x 108 ufc/m3. Utilizando um número significativo de 1,02 ufc (N1) por embalagem de papel e filme plástico em um teste que empregou uma diferença de pressão de 37,5 mmHg, um LRV de de 4,9 foi obtido. Se o LVR não foi calculado pelo número de micro-organismos de entrada na
embalagem, mas pelo número de embalagens não estéreis (exemplo 30 de 99 lâminas), um LRV de 5,4 foi medido. Com uma diferença de pressão de 52,5 mmHg, LRVs de 4,6 e 5,2, respectivamente, foram resultados sob as mesmas condições de teste com o mesmo tipo de embalagem. Para embalagens feitas de material tecido não tecido e material de filme plástico, LRVs de 6,38 (exemplo 3 de 99 lâminas se tornaram não estéreis após serem expostos a 52,5 mmHg de diferença de pressão) foram obtidos.
Os dois exemplos com condições de exposição diferentes foram utilizados para avaliar os desafios microbianos originais durante transporte e armazenamento. A eficiência necessária da embalagem com barreira microbiana em termos de LRV necessário correspondente ao exemplo 1 foi calculada da seguinte forma: uma variação de pressão atmosférica de 11,2 mmHg levou a uma variação no volume de 1,751cm3. O volume total do ar que passa pela embalagem porosa foi de 17,51 cm3, e é composta de uma carga microbiana de 0,0005253 ufc ou log Nestimado = - 3,28. De acordo com exemplo 1, as propriedades de barreira da embalagem necessárias foram LRVnecessário = 2,72 (log 0,0005253 + log 106 = 2.72). Uma
comparação das propriedades de barreira em termos de LRVnecessário para condições de armazenamento encontradas no exemplo 1 (com os resultados determinados experimentalmente pelos meios do teste da câmara de exposição) mostra que as embalagens com o componente de papel assim como as embalagens com o componente tecido não tecido inequivocadamente preenchem a necessidade do Padrão Europeu EN 556-1.
No caso do exemplo 2, os seguintes resultados foram obtidos para o volume de ar que passou pela embalagem. Ao armazenar as embalagens em um armazém por 100 dias com variações de temperatura diárias significativas de 15ºC utilizando a fórmula
V = V
0(1 - t/273,15)
Onde V é o Volume após a mudança de temperatura, V0 é o volume na temperatura inicial e t é a mudança de temperatura em graus Celsius, concluímos que ΔV temperatura = 659cm3, onde ΔV
temperatura é o volume total do fluxo de ar dentro da embalagem durante 100 dias esperado para uma variação de temperatura. Houve 10 variações de pressão atmosférica de aproximadamente 11,2 mmHg que resultaram em ΔV clima p 17,51 cm3, onde ΔV clima é a mudança no volume de ar esperado em uma variação de clima (exemplo: mudança de pressão atmosférica). O volume total de ar medido fluindo dentro da embalagem foi de 676,5 cm3. A carga microbiana correspondente a 1.000 ufc/m3 foi de 0,6765 ufc(log 0,6765 = - 0,1697). Ao calcular as propriedades de barreira necessárias (LRVnecessário) de acordo com o exemplo 2, encontramos LRVnecessário = 5,83. Ao comparar tais
resultados com os dados experimentais, concluímos que a embalagem de papel e de filme plástico ( com LRVs de 5,4 e 5,2 baseado em diferença de pressão de 37,5mmHg e 52,5 mmHg, respectivamente) não possui uma eficácia de barreira suficiente para o transporte e armazenamento fornecidos, de acordo como exemplo 2. No entanto, a embalagem de material tecido não tecido e filme plástico com LRVs de 6,38 e 6,07 baseados em diferença de pressão de 37,5mmHg e 52,5 mm Hg, respectivamente, claramente preenchem as necessidades do Padrão Europeu EN 556-1.
DISCUSSÃO
A carga microbiana do ar ambiente é objeto de inúmeras influências do meio ambiente, tais como atividades ocupacionais, fatores sazonais e que dependem do clima, assim como recursos de ar condicionado dentro dos prédios. Nas salas dos hospitais, a concentração de micro-organismos varia em sua maioria entre 102 e 103 ufc/m3, com exceção das salas altamente limpas, tais como unidades de tratamento intensivo e salas de cirurgia. A fração da carga microbiana com um tamanho particular inferior a 3,0 µm variou entre 17% e 31% durante um período de investigação de 1 ano. As espécies mais frequentemente isoladas em prédios de hospitais foram cocci gram-positivo, tais como Staphylococcus epidermidis e
Staphylococcus homini. A carga microbiana suspensa no ar pode ser um importante
fator no desafio microbiano dos sistemas de barreira estéreis.
Uma observação crítica deve ser feita: a precisão dos resultados obtidos no estudo presente é limitada, porque um classificador de ar não foi utilizado para monitorar a concentração bacteriana na câmara de exposição.
Uma data de expiração (validade) é utilizada frequentemente por hospitais para garantir a esterilidade de produtos médicos esterilizados e embalados. No entanto, em certos estudos, têm sido mostrado que a desatualização dos eventos relacionados tem sido apoiada, devido aos benefícios de custo especial. A conclusão extraída dos resultados destes estudos que relaciona a vida na prateleira dos materiais industrializados esterilizados foi que a embalagem permaneceu esterilizada indefinidamente ou até que um evento tenha comprometido a integridade da embalagem. A esterilidade seria mantida se um evento especial (exemplo: gotas, falhas, umidade) que comprometesse a integridade da embalagem não pudesse ser identificado. Portanto, mudanças proeminentes relativas são conhecidas como “eventos”. Esta abordagem assume que a embalagem é normalmente uma barreira impermeável absoluta para micro-organismos e ignora o fato de que a embalagem esterilizada por meio de vapor ou óxido de etileno tem um componente vapor permeável e gás permeável com
diâmetros do poro significativos até 35 µm e uma permeabilidade requerida para ar de 11,02 mmHg de 3L/minuto, para uma área de 100 cm2 (exemplo: EN 868-3). Deve-se notar que, neste contexto, os padrões EN se aplicam à Europa, mas não aos Estados Unidos. Conforme mostramos nos trabalhos anteriores e no estudo presente, a recontaminação é, de necessidade, não apenas de processos relacionados a eventos mas também sempre de um processo que depende de tempo, considerando o material médico de grau poroso. É influenciado por propriedades de barreira da embalagem – por exemplo, o número de camadas na caixa da embalagem ou a qualidade do material da embalagem – e as condições do ambiente, tais como conteúdo microbiano interno e externo no ar, mudanças de temperatura e pressão atmosférica e pressão mecânica durante o manuseio.
Estes estudos mostram que todos os fatores ambientais são efetivamente “eventos” e que nem uma data relacionada a evento exclusivamente, nem uma data de expiração relacionada a tempo é apropriada. A desatualização deveria ser representada baseando-se na determinação do risco científico que considere as propriedades de barreira da embalagem, por um lado, e por outro lado, a eficiência apropriada da embalagem de barreira necessária pelas influências ambientais inevitáveis específicas. O padrão internacional ISO 11607-1 especifica que o fabricante dos sistemas de barreiras estéreis deva fornecer informações no que se refere a qualquer restrição conhecida (exemplo: condições ambientais), manuseio ou utilização, e no que se refere a freqüência e natureza da manutenção das medidas aplicáveis ao reuso de materiais ou a sistemas de barreira estéril pré formados.
No nosso estudo, mostramos que o conceito de LRV que caracteriza a eficácia da embalagem de barreira pode ser aplicado com sucesso ao cálculo da eficácia da embalagem de barreira necessária que resulta dos desafios microbianos e a condição de exposição relevante para transporte e armazenamento. Desta forma, pode-se estabelecer se as propriedades de barreira da embalagem são suficientes para os desafios microbianos específicos, de acordo com os padrões qualitativos do nível de garantia de esterilidade. Nós, portanto, recomendamos que os fabricantes e usuários de sistemas de barreira estéril apresentem dados sobre a eficácia da embalagem de barreira microbiana. A compatibilidade da embalagem com condições físicas específicas (exemplo: temperatura e mudança de pressão atmosférica e condições microbiológicas durante o transporte e armazenamento pode ser determinadas). Produtos médicos estéreis embalados em embalagens porosas podem ser confiavelmente manuseados de forma responsável somente se estes dados estiverem disponíveis.
