Rafael Matsumoto Pereira Técnicas de imobilização e estabilização de lipases obtidas a partir de diferentes fontes microbianas

Universidade Federal de Alfenas

Campus Avançado Poços de Caldas

Instituto de Ciência e Tecnologia

Rafael Matsumoto Pereira

Técnicas de imobilização e estabilização de lipases

obtidas a partir de diferentes fontes microbianas

Poços de Caldas-MG

2014

Rafael Matsumoto Pereira

Técnicas de imobilização e estabilização de lipases

obtidas a partir de diferentes fontes microbianas

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como parte dos requisitos para obtenção de grau em Engenharia Química pelo Instituto de Ciência e Tecnologia na Universidade Federal de Alfenas – Campus avançado de Poços de Caldas.

Área de concentração: Engenharia Biotecnológica.

Orientadora: Grazielle Santos Silva Andrade.

Poços de Caldas-MG

2014

AGRADECIMENTOS

À Profª Dra. Grazielle Santos Silva Andrade, orientadora, pela dedicação, paciência, conhecimentos transmitidos e confiança depositada na realização deste trabalho. À Profª Dra. Maria Gabriela Nogueira Campos pelos conhecimentos transmitidos e ajuda na realização deste trabalho.

À colega de trabalho Paula Mari Sato pela ajuda na realização da parte experimental deste trabalho.

RESUMO

A obtenção de produtos industriais é limitada pelos catalisadores químicos que apresentam entre outras características, pouca versatilidade, pois necessitam de altas temperaturas e não são biodegradáveis. Em 1960 iniciaram-se os estudos de tecnologias que permitisse os usos catalisadores biológicos que são mais versáteis e biodegradáveis para lidar com os problemas encontrados com os catalisadores químicos. Atualmente são três os maiores seguimentos industriais que utilizam biocatalisadores na sua linha de produção (farmacêutico, alimentos e ração animal), porém cada vez mais esse recurso esta despertando interesse em outros seguimentos. Enzimas são cadeias longas de polímeros formadas por aminoácidos sucessivamente ligados covalentemente entre si por ligações peptídicas que possuem diferentes formas de classificação e podem ser de origem vegetal, animal ou microbiana. Dentre as enzimas mais utilizadas esta a lipase que são enzimas nomeadas pela União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) como triacilglicerol acil-hidrolase, EC 3.1.1.3. Elas podem ser aplicadas em diversos setores industriais e catalisar diferentes reações, além de ser imobilizadas em diferentes tipos de suportes e métodos de imobilização. Foi realizado um levantamento de diversos trabalhos que imobilizam esta enzima em diferentes suportes e métodos e suas características. Durante o levantamento bibliográfico, constatou-se que grande parte dos trabalhos relata apenas a utilização de lipase do tipo extracelular em processos de imobilização. Nesse aspecto, com objetivo de avaliar um novo processo de imobilização de lipase intracelular, uma metodologia experimental foi desenvolvida, a fim de imobilizar células contendo lipase intracelular em um hidrogel de quitosana, matriz muito utilizada como suporte de imobilização. Os resultados preliminares demonstraram que o suporte tem boa estabilidade mecânica, mas afetou a produção de lipase intracelular. Desse modo, mais estudos se faz necessário para descobrir a melhor maneira de empregar o hidrogel de quitosana na imobilização celular, visto que trata-se de um suporte de baixo custo. Palavras-chaves: Lipase. Suportes. Imobilização.

ABSTRACT

The obtaining of industrial products is limited by chemical catalysts that have among other features, little versatility, since they require high temperatures and are not biodegradable. In 1960, began the studies of technologies that enable the use of biological catalysts that are more versatile and biodegradable to deal with the problems encountered with chemical catalysts. Currently there are three major industrial sectors that use catalysts in the production line (pharmaceutical, food and animal feed), but more and more this feature that attracted interest in other segments. Enzymes are long chain polymers formed by successively amino acids covalently linked together by peptide bonds that have different ways of classification and can be of plant, animal or microbial origin. Among the most frequently used enzymes, it is lipase which are named by the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) as triacylglycerol acyl-hydrolase, EC 3.1.1.3. They can be applied in several industrial sectors and catalyze different reactions and be immobilized on different types of supports and immobilization methods. A survey of several studies that immobilize this enzyme in different supports and methods and their characteristics was made During the bibliographic research, it was observed that most studies report only the use of the extracellular lipase in immobilization procedures. In this aspect, to evaluate a new process of immobilization of intracellular lipase, an experimental methodology was developed in order to immobilize cells containing intracellular lipase on a chitosan hydrogel array widely used as immobilization support. Preliminary results demonstrated that carrier has good mechanical stability, but affected the intracellular production of lipase. Thus, more research is needed to discover the best way to employ the chitosan hydrogel in cell immobilization, since it is a low-cost support.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CALB – Candida antarctica CRL – Candida rugosa EPI – Epicloridrina GLI – Glicidol

GLU – Glutaraldeído

LLP – Lipase de pâncreas de porco LTL – Thermomyces lanuginosus MML – Mucor miehei

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO... 8 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 9 2.1. ENZIMAS _{... 9} 2.1.1. LIPASE ... 11 2.1. IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS... 14 2.2.1. TIPOS DE SUPORTE _{... 14}

2.2.2. MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS ... 15

2.2.2.1. IMOBILIZAÇÃO POR ADSORÇÃO FÍSICA ... 16

2.2.2.2. IMOBILIZAÇÃO POR LIGAÇÃO COVALENTE _{... 18}

2.2.2.3. IMOBILIZAÇÃO POR ENCAPSULAMENTO ... 20

2.2.3. IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS ... 21

3. MATERIAIS E MÉTODOS _{... 22}

3.1. MATERIAIS ... 22

3.2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL ... 23

3.2.1. PREPARAÇÃO DO HIDROGEL DE QUITOSANA _{... 23}

3.2.2. PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS ... 23

3.3. ANÁLISES ... 24

3.3.1. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS _{... 24}

3.3.2. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE LIPOLÍTICA DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS 24 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 25

5. CONCLUSÕES _{... 27}

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1. INTRODUÇÃO

Uma das maiores limitações encontradas na obtenção de produtos e intermediários em indústrias são os catalisadores químicos que, normalmente, são usados nas reações. Esses catalisadores apresentam pouca versatilidade, necessitam de altas temperaturas para que a reação ocorra com uma velocidade aceitável, são pouco específicos, formam produtos indesejados e, normalmente precisam ser purificados, aumentando assim o custo de produção (MENDES et al., 2011).

Por outro lado, os catalisadores biológicos (enzimas) podem ser aplicadas em condições brandas de temperatura, pH e pressão, pois sua velocidade de reação é superior aos catalisadores químicos e por serem mais específicos, aumentam o rendimento final do processo, não havendo formação de reações paralelas. Os produtos formados pela reação que utilizam enzimas tendem a ser biodegradável, o que ajuda a reduzir os resíduos da produção (MESSIAS et al., 2011; MENDES et al., 2011)

Devidos às inúmeras vantagens da utilização de enzimas como biocatalisadores, a partir do inicio da década de 1960 iniciou-se os estudos de tecnologias que permitissem o seu uso para tal fim. Segundo o estudo realizado pela empresa de pesquisa Freedonia Group, a venda de enzimas pode chegar a 2,8 bilhões de dólares em 2014 (SANTOS, 2012).

Atualmente são diversos os seguimentos que utilizam os biocatalisadores, sendo que o mercado mundial concentra-se em três seguimentos: i) indústrias de alimentos (produção de xarope e compostos aromatizantes); ii) enzimas técnicas (formulação de detergentes, produção de papel e celulose) e iii) produção de ração animal.

As principais enzimas de aplicação industrial são proteases, amilases, lipases, celulases, xilanases e fitases, e as maiores empresas produtoras líderes do mercado são: a empresa Novozymes, Gist-Brocades e Genencor International Inc. (MENONCINI et al., 2009).

Apesar dos grandes benefícios da utilização de enzimas, a sua aplicação industrial ainda encontra alguns obstáculos que inviabilizam seu emprego em larga escala, como por exemplo a solubilidade da enzima em água que resulta muitas vezes na contaminação do produto desejado, exigindo assim uma etapa de separação no final do processo que além de gerar custos (separação e purificação),

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inutiliza a enzima. Uma forma encontrada para sanar esse problema é utilizar a técnica de imobilização que estabiliza a enzima e permite o seu reuso (CANILHA; CARVALHO; SILVA, 2006).

A imobilização pode ser feita utilizando diferentes suportes tanto orgânicos quanto inorgânicos e por diferentes métodos, como por exemplo, a adsorção física, encapsulação, ligação covalente ou por reticulação, sendo o primeiro o mais empregado industrialmente por ter baixo custo. Porém, nos ultimos anos, diferentes suportes estão sendo estudados para realizar a imobilização por ligação covalente (GONÇALVES, 2007).

Nesse contexto, o presente trabalho tem por objetivo realizar uma revisão bibliográfica das diversas técnicas de imobilização de enzimas proveniente de diferentes fontes microbianas, particularmente as lipases, bem como suas caracteristicas cataliticas. Além disso, tendo em vista que praticamente não existe relato na literatura sobre a imobilização de lipase intracelular em hidrogel de quitosana, uma nova metodologia experimental foi testada a fim de avaliar a potencialidade desse suporte na imobilização celular.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. ENZIMAS

Enzimas são cadeias de polímeros formadas por aminoácidos sucessivamente ligados covalentemente entre si por ligações peptídicas, sendo que sua conformação e a estabilidade da estrutura molecular são mantidas por ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, forças de van der Walls, etc (SANTOS, 2012). São biocatalisadores presentes em sistemas biológicos e em organismos vivos que aceleram ou possibilitam a ocorrência de uma reação sem serem consumidas (SOUZA, 2006; SIMÕES et al., 2010; SANTOS, 2012).

As enzimas possuem diversas formas de classificação, sendo a mais importante a estabelecida pela União Internacional de Bioquímica (IUB), que as dividiu em 6 classes principais como é apresentado na Tabela 1:

10 Tabela 1 – Classificação das enzimas estabelecida pela IUB

Classificação Reação que catalisam Enzimas

Oxido-redutases Reações de óxidoredução. Transferência de átomos de

O e H ou elétrons de um substrato para o outro.

Hidrogenase; Oxidase; Peroxidase; Hidroxilases;

Oxigenases. Transferases Reações de transferência de

grupos específicos de um composto para o outro.

Aminotransferases; Acetiltransferase; Cinases;

Fosforilases; Frutosiltransferase

Hidrolases Reações hidrolíticas Lipases; Proteases;

Amilases; Pectinases. Liases Reações reversíveis, não

hidrolíticas de remoção de grupos da molécula de

substrato.

Descarboxilases; Aldolases

Isomerases Reação de isomerização transformam isômeros entre

si (cis e trans).

Glicose-isomerase.

Ligases Reação de síntese de novos compostos, derivados da junção de duas moléculas.

Piruvato carboxilase

Fonte: SANTOS, 2012

Até o século XIX, as enzimas foram nomeadas empregando-se o sufixo “ina”, geralmente em seguida ao nome da fonte da enzima. No final do mesmo século, E. Duclaux sugeriu que fosse utilizado o sufixo “ase” posteriormente ao nome do substrato do qual a enzima foi extraída. Ambas as nomenclaturas ainda são utilizadas nos dias de hoje, porém em 1956, a União Internacional de Bioquímica propôs uma nova forma de classificação que entrou em vigência em 1961 (MENDES, 2009).

As enzimas podem ser de origem vegetal (papaína, bromelina, ficina, malte), animal (pancreatina, tripsina, quimiotripsina, pepsina, renina, catalase) e microbiana (celulases, amilases fúngicas, lipases) que podem ser obtidas através de bactérias, fungos filamentosos e leveduras (ARAUJO, 2009; SANTOS, 2012). As enzimas microbianas apresentam maior interesse industrial por serem produzidas com maior facilidade em larga escala e também pela enorme diversidade microbiana que oferecem, resultando em diversas possibilidades de trabalho (SANTOS, 2012).

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2.1.1. LIPASE

As lipases, juntamente com as esterases constituem o grupo de enzimas que metabolizam e realizam a hidrolise dos lipídeos. São muito importantes fisiologicamente, pois hidrolisam óleos e gorduras em ácidos graxos, monoglicerídeos e diglicerídeos essenciais ao metabolismo.

As lipases são enzimas nomeadas pela União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) como triacilglicerol acil-hidrolase, EC 3.1.1.3. Sua função é catalisar a hidrólise de ésteres de glicerol e ácidos graxos de cadeias longas e também para catalisar a síntese de ésteres, para reações de transesterificação e lactonização, como mostrado na Figura 1 (GONÇALVES, 2007; VOLPATO, 2009; SANTOS, 2012). Apresentam massa molecular variando entre 20 a 75kDa e, normalmente, são estáveis em soluções aquosas neutras à temperatura ambiente. Sua atividade ótima ocorre em temperaturas entre 30 e 40ºC, mas podem variar dependendo de sua origem (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004).

Figura 1 – Exemplos de reações catalisadas por lípase Fonte: (MENDES, 2009).

Essas enzimas são as mais utilizadas em síntese orgânica e mais de 20% das biotransformações também ocorrem com a sua ajuda por apresentarem especificidade por um grande numero de substratos, mas principalmente devido a

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sua elevada enantioseletividade. Outro aspecto interessante que torna a lípase muito procurada é a facilidade com que suas propriedades catalíticas podem ser moduladas pelas condições de reação e pequenas variações na estrutura (SANTOS, 2012).

A lipase, assim como a maioria das enzimas, podem ser encontradas na natureza a partir de fontes animais, vegetais e microbianas. Inicialmente, eram obtidas a partir de pâncreas de animais. Porém com os avanços tecnológicos, as enzimas de origem microbiana passaram a ser mais vantajosas por apresentarem menor custo de produção, possibilidades de produção em larga escala em fermentadores industriais e oferecer uma diversidade de características físico-químicas devido as suas propriedades enzimáticas, como especificidade, estabilidade, temperatura e pH de atuação, ou habilidade para catalisar reações de síntese na presença de solventes orgânicos, além do rápido crescimento. Normalmente são produzidas por fermentação microbiana extracelular por serem mais fáceis de extrair e purificar, além de apresentarem maior estabilidade (MENDES, 2009; VOLPATO, 2009; SANTOS, 2012).

Muitos micro-organismos podem produzir diferentes lipases conforme as condições de cultivos em que se encontram (pH, composição do meio de cultura, temperatura, tempo de cultivo). Um estudo realizado por Sharma et al. (2001) listou 109 diferentes espécies capazes de produzir lipase, sendo que 47 são bactérias, principalmente dos gêneros Bacillus, Pseudomanas e Staphylococcus, 42 são fungos e 20 são leveduras. Os fungos filamentosos são considerados os melhores produtores de lipase, sendo as espécies dos gêneros Aspergillus, Fusarium, Geothrichum, Mucor, Penicillium, Rhizomucor, Rhizopus e Thermomyces os maiores produtores, assim como a levedura Candida rugosa. (GONÇALVES, 2007; DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004).

Basicamente existem dois métodos qualitativos para seleção de micro-organimos produtores de lipases na literatura. Um deles é descrito por Cardenas et al. (2001) que consiste na utilização de ágar contendo tributirina (tipo de gordura encontrada na manteiga) como substrato e a formação de um halo translúcido ao redor da colônia pelo consumo do substrado que indica a produção de lipase. E o outro método, é descrito por Wang et al. (1995), que utiliza ágar contendo rhodamina B e a produção de lipase é determinada pela presença de um halo avermelhado visível sob luz UV (ultra-violeta).

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Fatores como fonte de carbono e nitrogênio, presença de indutores, estimuladores inibidores, agentes que afetam a interface óleo/água, temperatura de incubação, pH do meio de cultura e inóculo afetam o processo de produção de lipase por microrganismos. Esses fatores infereferem no crescimento de todos os tipos de microrganismos produtores de lipase, tornando assim necessario o estudo de como ocorre essa influência na biossintese dessa enzima para que seja possivel obter uma condição ótima de produção (GONÇALVES,2007).

São diversos os campos em que a lipase pode ser utilizadas, sendo que o seu foco principal esta voltado aos setores setor alimentício e químico conforme indicado na Tabela 2.

Tabela 2- Exemplos de aplicações de lipase na industria

Setor Área Efeito Utilizado Produto

Alimentício

laticínio hidrólise da gordura

do leite agente aromatizante para produtos lácteos bebidas melhoramento do aroma e aceleração da fermentação, por remoção de lipídeos bebidas alcoólicas (vinho e outras) processamento de derivados do ovo melhoramento da qualidade do ovo por hidrólise dos lipídeos

maionese, molhos e cremes processamento de óleos transesterificaçao de óleos naturas; hidrólise de óleos (ácidos graxos), diacilglicerol óleos e gorduras modificadas (substitutos da manteiga de cacau) Químico

química fina síntese de ésteres ésteres

detergentes remoção de manchas

de óleo e gorduras

gorduras farmacêuticos digestão de óleos e

gorduras de alimentos digestivos analítico análise de triacilglicerol no sangue Diagnostico

cosmético remoção de lipídeos cosméticos em

geral

curtume remoção de gorduras

das peles de animais

produtos de couro

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2.1. IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS

A imobilização é o processo no qual se fixa a enzima de interesse em um suporte para que sua atividade catalítica não seja afetada negativamente, ou seja é uma forma de proteção contra condições adversas do meio (CANILHA; CARVAOLHO; SILVA. 2006). Esse recurso é utilizado pois permite o usa da enzima em processos continuos, pois diminiu os riscos de contaminação em operações com altas taxas de diluição e a formação de subprodutos, aumenta a estabilidade, permite o reaproveitamento do material e reduz o custo de operação. Além disso, permite a utilização em diferentes solventes, pHs e temperaturas e podem ser expostas a agentes desanturantes.

2.2.1. TIPOS DE SUPORTE

Os suportes utilizados para imobilização se dividem em dois tipos principais, os que confinam fisicamente a enzima, ou seja, a enzima é encapsulada no suporte que pode ser glóbulos ou fibras feitas de polissacarídeos, de proteína ou de polímeros sintéticos e os que aderem a superficie (adosorção física), no qual a enzima fixa-se ao suporte por ligação quimica (iônica ou covalente) (CANILHA; CARVAOLHO; SILVA. 2006).

A escolha do tipo de suporte deve ser em função da porcentagem de rentenção de atividade que o conjunto suporte-método apresentar, ou seja, quanto maior a porcentagem desse conjunto, melhor ele é. Quão grande é essa porcentagem dependerá basicamente de dois fatores: as caracterisiticas peculiares do material biológico e das condições de uso do sistema imobilizado. Portanto, não existe um suporte universal, sendo necessário, portanto, um estudo para determinar qual é o melhor suporte com base na enzima que deseja confinar (CANILHA; CARVALHO; SILVA. 2006).

Na literatura, são citados vários materiais que podem ser utilizados como suporte, podendo ser geliformes (alginato, álcool polivinílico, quitosana, etc) ou superficies sólidas (vidro poroso, alumina, etc). Esses materiais devem ser facilmente encontrados e em abundância, ter baixo custo, ser de fácil operação, não ser tóxico para a enzima e ter alta resistência mecânica. Outras caracteristicas que deve ser observadas na seleção de um suporte é a sua área superficial, permeabilidade, insolubilidade, capacidade de regeneração, morfologia e

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composição, natureza hidrofílica, resistencia ao ataque microbiano, etc (MENDES, 2009).

Uma classe de material que se comporta como bons suportes são os polímeros. Os polímeros sintéticos (resinas acrílicas) apresentam variedades de formas físicas e estruturas quimicas e podem ser combinadas para formar um suporte melhor. Já os polímeros naturais (agarose e hidrogéis de quitosana) apresentam baixo custo e são degradáveis. São exemplos de suportes (MENDES, 2009):

 Resina acrílica de afinidade –Toyopearl: com diferentes grupos químicos em sua estrutura, são hidrofílicas, com alta porosidade e é estavel em diferentes solventes organicos e em condições extremas de pH;

 Poli-Hidroxibutirato (PHB): poliésteres simples, sintetizados por muitos micro-organismos. Apresenta alta cristalinilidade e hidrofobicidade, é biodegradável e possui carater hidrofóbico. Essas caracteristicas o torna um material apropriado para a imobilização de enzimas, especificamente lipase;

 Quitosana: produto natural, de baixo custo, renovável e biodegradável obtida pela desacetilação da quitina extraida das carapaças de crustáceos que são um resíduo rejeitado pela indústria pesqueira. Pode ser aplicada em diversos processos de imobilização de enzimas devido as suas diferentes configurações geométricas tais como pó, hidrogéis, membranas e fibras e pela presença de diferentes grupos funcionais em sua estrutura;

 Agarose: mistura de moléculas de ágar com um conteúdo menor de cargas e portanto com maior capacidade de gelificação. É um dos suportes mais utilizados na imobilização de enzimas;

 Silica: produto sintético, produzido pela reação de silicato de sódio e ácido sulfúrico, que ao serem misturados, resultam em uma estrutura sólida de sílica gel. Possue alta resistência mecânica e estabilidade térmica e quimica.

2.2.2. MÉTODOS DE IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS

Os métodos de imobilização, assim como o suporte, dependem das características peculiares do material biológico e das condições de uso do sistema

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imobilizado, ou seja, não existe um método geral que pode ser usado para qualquer processo. Na literatura muitos métodos são descritos e utilizados para contornar os possíveis problemas de instabilidade das enzimas frente a solventes orgânicos, bem como otimizar as várias aplicações.

Lipases tem sido imobilizadas em diferentes suportes de natureza orgânica e inorgânica empregando diferentes métodos de imobilização tais como adsorção ou ligação da enzima a um material insolúvel por ligação cruzada, confinamento em matrizes formadas por géis poliméricos ou encapsulamento em membrana polimérica (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004, MENDES, 2009). Um esquema dos métodos de imobilização de enzimas são mostrados na Figura 2.

Figura 2 – Diferentes métodos de imobilização de enzimas Fonte: DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004.

A seguir, estão descritos os métodos mais empregados na imobilização de lipases, bem como um compêndio de diferentes trabalhos relatados na literatura.

2.2.2.1. IMOBILIZAÇÃO POR ADSORÇÃO FÍSICA

O processo de adsorção física é o método mais utilizado por ser simples, barato, não ser necessário a ativação do suporte e possibilitar a regeneração da matriz utilizada. A enzima é imobilizada em um suporte sólido por ligações de baixa energia tais como de van der Walls ou hidrofóbicas, iônicas, etc. Esse método depende de fatores como tamanho da enzima a ser adsorvida, área superficial do adsorvente, porosidade (permitem a ligação da enzima com a superficie interna do suporte, fortalecendo a adsorção) e tamanho do poro. No entanto, possui a

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desvantagem de sofrer dessorção devido às variações de tempertura, pH e força iônica. Vários materias podem ser usados como suporte e a escolha depende de propriedades tais como estabilidade e capacidade de adsorção. Alguns exemplos desses suportes mais utilizados são o polietileno, poliprileno, resina sintética, entre outros (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004; CANILHA; CARVALHO; SILVA, 2006; MENDES et al., 2011).

Palomo et al. (2002), testou a imobilização das lipases de Candida antarctica (CALB), Mucor miehei (MML) e Candida rugosa (CRL) no suporte octadecil-sepabeads pelo método de adsorção física e em glioxil-agarose e glutaraldeído-agarose pelo método de ligação covalente e estudou a atividade e estabilidade dos métodos. Enquanto a imobilização covalente em glutaraldeído e glioxil-agarose apresentou um efeito desprezível sobre a atividade da enzima (mesmo promoveu uma ligeira diminuição) a imobilização interfacial promoveu um incremento significativo na atividade da enzima. A estabilidade térmica do método de adsorção é maior do que as imobilizadas por ligação covalente.

O trabalho de Fernandes et al. (2013) avaliou o efeito de parâmetros de imobilização (tempo de imobilização e pH) da lipase comercial CaLB pelo método de adsorção, utilizando como suporte nanopartículas do PHBV e a estabilidade térmica da enzima imobilizada. De acordo com os resultados obtidos verificou-se que nos tempos de 30 e 60 min a percentagem de adsorção foi superior a 93%, mas a atividade do imobilizado foi de 0,11 e 0,09 U/g. No tempo de 120 minutos resultouno maior valor de atividade do imobilizado (0,33 U/g), sendo que a percentagem de adsorção foi de 88,90%. A avaliação do pH de imobilização foi realizada buscando um maior fator de imobilização e os resultados mostram que a imobilização em pH 5 e pH 6 apresentaram a maior atividade do imobilizado (0,35 U/g). Após a exposição de 21 horas a 40 °C, a lipase imobilizada manteve sua atividade inicial, no mesmo período de tempo a 60 °C, a atividade hidrolítica da CalB/PHBV apresentou decréscimo, com atividade residual de 67% e em 80 °C a enzima imobilizada manteve mais de 50 % de sua atividade inicial.

Mendes (2009) imobilizou lipases CALB e Thermomyces lanuginosus (LTL) em suportes hidrofóbicos octil-agarase, hexil-toyopearl e octadecil-sepabeads na relação 1:60 (suporte: solução enzimática. A atividade hidrolitica, a estabilidade térmica e o tempo de meia-vida foram determinados para casa caso.Os resultados da atividade hidrolílica mostraram que o CALB imobilizado em hexil-toyopearl

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apresentou o menor percentual de redução (16%), enquanto o suporte octadecil-sepabeads apresentou o maior percentual de redução (63%). O LTL apresentou redução no suporte octadecil-sepabeads (41%), porém apresentou um aumento na atividade de 45x e 16x nos suportes octil-agarase, hexil-toyopearl, respectivamente. A maior estabilidade térmica e o maio tempo de meia-vida foi encontrada para o CALB imobilizado em octil-agarase (196x em relação à forma solúvel e 5,55h ) e a menor para ambos também foi para o CALB, porém imobilizado em octadecil-sepabeads (62x em relação à forma solúvel e 1,75h).

2.2.2.2. IMOBILIZAÇÃO POR LIGAÇÃO COVALENTE

O método de ligação covalente baseia-se na ativação do suporte com algum grupo reativo, como por exemplo polietilenoglicol, que interage com os grupos nucleofílicos da enzima formando ligação covalente ou ligações cruzadas numa matriz constituida pela enzima e por agentes bifuncionais (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004; MENDES et al., 2011).

Mendes, Castro e Giordano (2013), testou a imoblização por ligação covalente multipontual da (LTL)em bagaço de cana-de-açúcar, partículas de poli-hidróxibutirato (PHB) e hidrogéis híbridos de quitosana-alginato. Os hidrogéis foram modificados quimicamente para a formação do hidrogel de quitosana-alginato-laurinaldeído e do hidrogel de quitosana-alginato- ácido 2,4,6 trinitrobenzenossulfônico (TNBS). Cada suporte foi ainda ativado com diferentes agentes: glicidol (GLI), epicloridrina (EPI) e glutaraldeído (GLU) 25%. As propriedades catalíticas de cada caso foram determinadas e o conjunto que apresentou melhor atividade catalítica foi a lipase imolizada no suporte quitosana-alginato-TNBS ativada com GLI (234,6 U/g de suporte), e o maior tempo de meia-vida foi no suporte quitosana-alginato-TNBS ativada com EPI (3,99h).

Amorim et al. (2003), testou a imobilização da lípase de Candida cylindraceae em um filme de quitosana ativado com glutaraldeido. A estabilidade do sistema imobilizado foi testado reutilizando o sistema 4 vezes e verificando sua atividade. A atividade da lipase caiu drasticamente em 45% da atividade inicial depois de usado pela segunda vez e manteve-se estável até a quarta.

Simões et al. (2010) testou uma matriz híbrida SiO2-quitosana preparada pela técnica sol-gel, empregando como precursor silano tetraetilortossilicato (TEOS) para

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imobilização da lipase de Candida rugosa por ligação covalente. Após realizado o procedimento de imobilização, foram obtidos derivados com atividade hidrolítica de 668 U/g de suporte, o que corresponde a 40,7% de atividade recuperada. Para a lipase livre, os valores de atividade hidrolítica variaram entre 4956 a 12296 U/g e os valores mais elevados foram obtidos no ponto central (pH = 7,0 e 50 ºC). Já para a lipase imobilizada, a atividade hidrolítica variou entre 307 a 891 U/g também em pH 7,0 e 50 ºC. O valor obtido para Vmax foi de 12050 mmol/g min para LCR livre e 1409 mmol/g min para a LCR imobilizada, já os valores de KM determinados foram 534 mM para LCR livre e 851 mM para LCR imobilizada, indicando uma mudança da afinidade da lipase pelo substrato, na forma imobilizada. O tempo de meia-vida de ambas a lipases encontrado foi de 0,19 e 1,63 h, respectivamente, para lipase livre e imobilizada em SiO2-quitosana, que corresponde a um aumento da estabilidade térmica de aproximadamente 9 vezes da lipase imobilizada em SiO2-quitosana.

Mendes (2009) testou a imobiliação da lipase de pâncreas de porco (LPP) ativada com glutaraldeído, glioxil, glicidol e epicloridrina e de fonte microbiana, LTL, LPF CALB e Lipex ® 100L ativadas com glicidol (GLI), epicloridrina (EPI) e glutaraldeído (GLU) em suporte de agarose 6BCL ativada. A imobilização da LPP não apresentou atividade hidrolitica em nenhum caso devido possivelmente a baixa estabilidade da enzima no pH de imobilização. Já as lipases de origem microbiana em 30 minutos de imobilização, aproxidamente 80% da atividade enzimática desapareceu do meio de imobilização e após 1 hora atingiu 100%. A lipase com maior atividade hidrolítica foi a LTL ativada com GLU durante 12h (321,5 U/g de suporte) e a lipase com mair tempo de meia-vida também foi a LTL imobilizada em GLI, porém com tempo de imobilização de 48h.

Knezevic et al. (2006), testou a imobilização da lIpase obtida de Candida rugosa no suporte Eupergit® C ativada por três agentes diferentes. O primeiro foi a imobilização da lipase através de grupos oxirano, o segundo por glutaraldeído e o terceiro pelo método do periodato. Foi calculada a eficiência da imobilização, a atividade da enzima, a estabilidade térmica. A maior eficiência foi alcançada quando a lipase foi imobilizada sobre Eupergit ® C através de grupos oxirano (52,4%). Já a maior atividade da lipase foi encontrada na lipase imobilizada sobre Eupergit ® C ativado por periodato.

Ellaiah et al. (2001) tratou da imobilização de lipase produzida por uma forma mutante de A. niger utilizando diferentes técnicas de aprisionamento com matrizes

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alginato de sódio, k-carragenina ou em gel de poliacrilamida. O efeito de diferentes tempos de incubação na atividade em cada matriz foi investigado. A maior atividade foi registrada na lipase imobilizada em alginato de sódio (4225 U/l) em um período de incubação de 96h e o menor valor encontrado foi para a lipase livre (2660 U/l) incubada 120h.

2.2.2.3. IMOBILIZAÇÃO POR ENCAPSULAMENTO

A imobilização por encapsulação consiste em retenção física da enzima nas cavidades internas de uma matriz sólida porosa, criando uma cela artificial delimitada por uma membrana porosa. A velocidade com qual o substrato e os produtos formados difundem-se através da membrana é um fator limitante deste método. As enzimas apresentam maior atividade em substratos de baixa massa molar, pois estes difundem-se com maior facilidade (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004; MENDES et al., 2011).

O trabalho realizado por Alsarra, Neau e Howard (2003), realizou o encapsulamento da lípase com diferentes concentrações de tripolifosfato pentassódico (TPP) e pH em 3 formas de hidrogel a base de quitosana (fresca, liofilizada e re-hidratada) e o caracterizou quanto a eficiência do processo, liberação, atividade da enzimática e eficiência na reutilização das enzimas. A máxima liberação da lipase ocorreu na imobilização na forma fresca do suporte em pH 6,0 e concentração de TPP 0,5 % (m/v) (0,759 mg) e a menor liberação também foi na forma fresca no pH 7,0 com concentração de TPP 0,5 % (m/v) (0,219 mg). A maior atividade enzimática foi encontrada para a lipase imolibizada em pH 7,0 e concentração de TPP 0,5 % (m/v) no suporte fresco (4817 U/ml) e a menor atividade em pH 7,0 e concentração de TPP 0,8 % (m/v) (697 U/ml) no suporte imobilizado. A atividade de reuso após cinco vezes apresentada pela imobilização em suporte fresco foi mantida em 88% da sua atividade inicial, o hidrogel liofilizado e re-hidratadas forneceram atividades residuais de 87% e 83%, respectivamente.

O estudo de Chiou e Wu (2003) demonstrou a imobilização da lipase de Candida rugosa em suporte de quitosana contendo grupos hidroxila ativados com carbodiimida. Carga de proteína, atividade da lipase imobilizada de forma seca e úmida apresentaram a maior eficácia em termos de carga de proteína (71 e 109 µg/

21

g de quitosana, respectivamente) e atividade final (0,98 e 3,28 U / g de quitosana, respectivamente) no pH 6,0.

2.2.3. IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS

A morfologia do micro-organismo influência diretamente na obtenção dos produtos microbianos em processos fermentativos, pois diminui o tempo de cultivo e aumenta o rendimento do processo. Uma forma encontrada para controlar a morfologia desses seres vivos, é a imobilização celular que ajuda a preservar a atividade catalítica para aplicações industriais e permite a reutilização da célula imobilizada. Esse método foi desenvolvido com o intuito de diminuir o custo do processo, pois ao contrário da imobilização de enzima, não precisa passar pela etapa de extração, isolamento e purificação. Alguns exemplos de processos em que essa ferramenta é utilizada são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3 – Exemplos de processos que empregam imobilização celular.

Processo Micro-organismo Suporte Utilizado Produção de pigmentos M. purpureus Alginato, PUF, carvão, perlita

G. fujikuroi Alginato

Produção de proteínas S. cevevisiae PVA

Beijerinckia sp. Maltodextrina

A. pullulans Agar, alginato

Produção de enzimas

N. frowardii PUF

H. lutea PVA-MAA/PEG, alginato

Aspergillus sp. CrioPAG®

P. chrysosporium PUF, cerâmica, náilon, poliestireno Agaricus sp. PUF A. Níger Alginato P. ostreatus PUF T. turnirae Alginato Biotransformação

R. minuta Agar, lã de vidro

T. versicolor Náilon

Rhodococcus sp. Alginato Fonte: COVIZZI et al., 2007

São quatros os métodos gerais utilizados para imobilização de células (COVIZZI et

al., 2007):

 Adsorção em suporte sólido: o principio deste método é semelhante à imobilização de enzimas somada à habilidade dos micro-organismos

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produzirem e secretarem exopolissacarídeos (EPS). Um dos problemas deste tipo de imobilização está relacionado com a formação e acúmulo de biofilme ou EPS sobre a superfície, o que dificulta a absorção de nutrientes resultante das condições não homogêneas do crescimento celular. Por isso o uso dessa imobilização é limitado para alguns tipos de micro-organismos, de acordo com o comportamento reológico do meio de cultivo e o tipo de matriz utilizada.

 Engaiolamento e Encapsulamento: é baseado na inclusão artificial das células em uma malha rígida ou semi-rígida que impede a difusão delas para o meio de cultivo. O tamanho da barreira em torno da célula dependerá da velocidade de fluxo, da densidade da solução polimérica e da concentração da solução iônica em que o suporte formará. Esse método permite a troca de nutrientes, metabólitos durante o processo fermentativo sem alteração na morfologia. O encapsulamento difere-se do método de engaiolamento pelo fato de que as células ficam somente envoltas na membrana e não há presença de malhas entre as células envolvidas. Ambos os métodos são limitados pela quantidade e tamanho dos poros e pela quantidade de biomassa acumulada no interior da matriz. Ágar, agarose, alginato e quitosana são alguns exemplos de matérias que podem ser utilizados como suporte para as células por esses métodos.

 Auto-imobilização: é um método utilizado quando o micro-organismo em seu crescimento formando aglomerados de micélios que se conformam em forma de esferas ou “pellets” que caracteriza esse método. Sofre influência pela quantidade de inóculo, forças mecânicas durante a fermentação e pela presença de O2 dissolvido.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. MATERIAIS

O micro-organismo utilizado neste trabalho foi o fungo da cepa Penicillium citrinum gentilmente cedida pelo laboratório de Biocatálise da Escola de Engenharia de Lorena, da Universidade de São Paulo. Para a síntese do hidrogel foi utilizado

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quitosana com alto peso molecular (Sigma-Aldrich, grau de desacetilação maior que 75%) e sal dissódico de glicerol fosfato (Sigma-Aldrich). Outros reagentes utilizados são de grau analítico: azeite de oliva comercial (Carbonell), goma arábica em pó pura (Synth) e acetona (Synth).

3.2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.2.1. PREPARAÇÃO DO HIDROGEL DE QUITOSANA

O hidrogel foi preparado dissolvendo-se quitosana (1,0179g) em 15 mL de solução aquosa de ácido clorídrico 0,1M a temperatura ambiente e posterior adição gota a gota de 1,2 mL de uma solução aquosa do sal dissódico de glicerol fosfato (3,390g em 6,0 mL de água destilada). O hidrogel foi autoclavado a 121°C por 15 minutos e cortado em cubos de aproximadamente 5x5x5 mm.

3.2.2. PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS

As células íntegras foram preparadas utilizando a técnica de fermentação submersa em frascos agitados. A metodologia que serviu de base para a realização do cultivo foi a descrita por Andrade et al. (2012), que consiste de um meio líquido sintético composto por 70g/L de peptona, 1g/L de NaNO3, 1g/L de KH2PO4 e 0,5g/L de MgSO4.7H2O. Em Erlenmeyers contendo 100 mL do meio de cultura foram adicionados 50 cubos de hidrogel de quitosana (5x5x5 mm), os quais foram previamente autoclavados (121°C/15 min). 30g/L de azeite de oliva (comercial) foi adicionado assepticamente ao meio estéril, como agente indutor da produção de lipase.

Para preparo do inóculo, os esporos foram raspados, suspensos em água estéril e submetidos à agitação até a obtenção de uma suspensão. A concentração de esporos na suspensão foi determinada por contagem em câmara de Neubauer. Um volume contendo 1x106 esporos de cada fungo foi inoculado em cada frasco Erlenmeyer contendo 100 mL de meio de cultura e os cubos de hidrogel, os quais foram incubados por 72 h a 30°C sob agitação orbital em shaker (220 rpm). A imobilização ocorreu como forma espontânea de crescimento dos micro-organismos.

24

A biomassa imobilizada foi separada do meio de cultura por filtração a vácuo, lavada com água e acetona e seca em bomba de vácuo. A biomassa imobilizada foi avaliada por meio de medida de peso seco e a atividade lipolítica foi quantificada pelo método da hidrólise do azeite de oliva modificado (ANDRADE et al., 2012) tanto no biocatalisador, quanto no filtrado, afim de verificar se houve produção de lipase extracelular.

3.3. ANÁLISES

3.3.1. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS

O teor de umidade das células íntegras após a etapa de filtração, foi determinado a partir da Equação 1:

( 1 )

em que: é a massa de micélio obtida após filtração a vácuo (g); é a massa de micélio obtida após secagem em estufa a 100°C por 24h (g).

3.3.2. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE LIPOLÍTICA DAS CÉLULAS ÍNTEGRAS IMOBILIZADAS O método de hidrólise do azeite de oliva modificado (ANDRADE et al., 2012) consistiu na preparação do substrato pela emulsão de 10 mL de azeite de oliva e 90mL de goma arábica a 3% (m/v). Em frascos Erlenmeyer de 125 mL foram adicionados: 5 mL de substrato, 4 mL de solução tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0) e 0,5 g de células imobilizadas (massa seca) ou 1,0 g do caldo fermentado. Os frascos foram incubados a 37°C por 30 min, em banho termostatizado com agitação. Após o período de incubação, a reação foi paralisada pela adição de 10 mL de uma mistura de acetona, etanol e água destilada (1:1:1). Os ácidos graxos liberados foram titulados com solução de KOH 0,025 M, utilizando fenolftaleína como indicador. Os cálculos foram realizados pela Equação 2, sendo uma unidade de atividade definida como a quantidade de enzima que libera 1µmol de ácido graxo por minuto de reação, nas condições do ensaio. As atividades foram expressas em

25



 





KOH gasto na titulação do branco (mL); M = molaridade da solução de KOH (M); t = tempo de reação (min); m = massa (g).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A fim de avaliar o processo de imobilização celular por adsorção física, o cultivo e imobilização do fungo filamentoso P. citrinum foi realizado em partículas cúbicas de hidrogel de quitosana. Após o cultivo, a biomassa imobilizada foi filtrada e lavada com água e seca a temperatura ambiente. Através da Figura 3(a,b,c,d,e,f) é possível verificar o crescimento das células e avaliar o processo de imobilização e filtração.

É possível notar (Figura 3a) que a presença do hidrogel não afetou o crescimento das células, que possuem morfologia em forma de pellets. Na Figura 3(b,c,d,e) verifica-se que o processo de imobilização foi satisfatório, visto que as células aderiram ao redor das partículas de hidrogel que adquiriram coloração mais escura, e que mesmo após a filtração e lavagem com água as células permaneceram aderidas ao suporte. Na Figura 3(f) é mostrado a biomassa imobilizada filtrada após secagem a temperatura ambiente.

26 a c e b d f

Figura 3 – Imagem da biomassa após cultivo antes de ser filtrado (a), imagem dam massa formada ao longo da filtração (b),(c), (d) e (e), imagem da biomassa formada após

completar o processo de filtração (f) .

A biomassa imobilizada foi avaliada quanto a massa seca e a atividade enzimática intracelular pelo método da hidrólise do azeite de oliva modificado. Os valores da massa do hidrogel e do micélio, assim como a umidade, a atividade da biomassa e do filtrado são mostrados na Tabela 4.

27 Tabela 4 – Valor da massa do hidrogel e do micélio, umidade e atividade da

biomassa e do filtrado.

Parametro Valor

Massa do Hidrogel 1,47g

Massa do Micélio 4,96 g

Umidade 56,08 %

Atividade da biomassa imobilizada 5,52 U/g

Atividade do filtrado 3,87 U/g

Os dados da Tabela 4 indicam que a presença do suporte não inibiu o crescimento do fungo, que atingiu o valor de 4,96g em 100 mL de meio de cultura. No entanto, a produção de lipase intracelular foi prejudicada, visto que a atividade da biomassa imobilizada foi de apenas 5,52 U/g. A atividade do filtrado foi semelhante (3,87 U/g), indicando que houve baixa produção de lipase intracelular, assim como de lipase extracelular. Esse resultado é inferior ao obtido por Andrade et al (2012) que obteve atividade intracelular de 30,82 U/g empregando o mesmo fungo pelo método de imobilização celular, porém sem nenhum suporte de imobilização.

5. CONCLUSÕES

Com base na revisão bibliográfica realizada foi possível concluir que o campo de aplicação de enzimas imobilizadas em diferentes segmentos é muito amplo. A revisão apresenta diversos trabalhos que estudaram a imobilização da lipases de diversas fontes por diferentes métodos em diferentes suportes que podem ser ativados ou não por algum agente químico. A quitosana é um suporte presente em muitos estudos, pois pode ser trabalhada em diversas morfologias, além de poder ser combinada com outros materiais para o desenvolvimento de um suporte melhor. Apesar do resultado não ter sido satisfatório, o hidrogel de quitosana é um suporte interessante por suas propriedades físico-químicas ideais requeridas para um suporte de imobilização, além de ser de baixo custo. Aliado a isso, o processo de imobilização celular reduz o custo de produção de lipases, visto que elimina as etapas de extração e purificação. Portanto, mais estudos são necessários a fim de tornar o hidrogel de quitosana viável para ser aplicado no processo de imobilização celular.

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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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