ESTUDO ELETROFISIOLÓGICO E MORFO-FUNCIONAL DAS ATIVIDADES EPILEPTIFORMES EM DIFERENTES ESTÁGIOS DE MATURAÇÃO DO
HIPOCAMPO DE RATOS Laila Cristina Moreira Damázio
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAÇÃO DO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO MULTIDISCIPLINAR EM FÍSICA, QUÍMICA E NEUROCIÊNCIA, DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI, COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS EM NEUROFÍSICA.
Aprovada por:
________________________________________________ Prof. Dr. Antônio-Carlos Guimarães de Almeida
(Presidente)
________________________________________________ Prof. Dr. Fúlvio Alexandre Scorza
________________________________________________ Prof. Dr. Ricardo Mario Arida
SÃO JOÃO DEL-REI, MG - BRASIL SETEMBRO DE 2007
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Estudo eletrofisiológico e morfo-funcional das atividades epileptiformes em diferentes estágios de maturação do hipocampo de ratos[MG] 2007
XXIII, 82 p. 29,7cm (FIQUINE/UFSJ, M. Sc., Neurofísica, 2000)
Dissertação – Universidade Federal de São João del Rei, FIQUINE
1. Medidas experimentais de Fenômenos Biológicos
À Deus, por iluminar meu caminho e me permitir concluir este trabalho com saúde e muita alegria.
Aos meus Pais, Fátima e David, pelo amor, apoio e preocupação. Que a concretização deste trabalho seja um motivo de orgulho em suas vidas.
Agradecimentos
Ao Professor Antônio-Carlos Guimarães de Almeida, por orientar com dinamismo e sabedoria.
Aos Professores, Antônio Márcio e Gilcélio Amaral da Silveira pelo apoio e colaboração na elaboração deste trabalho.
Às grandes amigas, Maisinha e Fernanda, por estarem sempre dispostas a me consolar nas horas mais complicadas.
Aos amigos, Fabrício, Victor, Keite, Lucélia e Maísa pela amizade e colaboração na elaboração deste trabalho.
Aos funcionários José da Silva, Bioterista, e Dona Dalva pelo apoio e amizade.
À Secretária Simone, pela atenção, amizade, solidariedade e carinho com o qual sempre me tratou.
Aos amigos do LANEC, Prof. Mário Duarte, Prof. Hewerson, Prof. Emerson, Lívia, Maristela, Bruno, Bibiana, Mariana, Kelison, Mozar, Celso, Gisele, Gláucio, Aline, Júlio, David, Flávia, Marco Antônio, Carlos, Luiz, Rafaela, Alexandre que sempre contribuíram para um ambiente de amizade e companheirismo no laboratório.
Aos meus irmãos Rafael e Danilo, por sempre acreditarem em mim, pelo apoio e amizade imprescindíveis e por proporcionarem um ambiente agradável em minha casa.
À amiga de infância, Luciléia pelas demonstrações de companheirismo e amizade, apresentando-se sempre como excelente amiga.
Às minhas tias, Márcia, Ida Darc e Dilene, por sempre incentivarem os meus estudos.
Resumo da Dissertação apresentada à FIQUINE/UFSJ como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências (M. Sc.)
ESTUDO ELETROFISIOLÓGICO E MORFO-FUNCIONAL DAS ATIVIDADES EPILEPTIFORMES EM DIFERENTES ESTÁGIOS DE MATURAÇÃO DO
HIPOCAMPO DE RATOS
Laila Cristina Moreira Damázio
Setembro/2007
Orientador: Antônio-Carlos Guimarães de Almeida Co-orientador: Gilcélio Amaral da Silveira
Programa: FIQUINE
A distribuição iônica no meio extracelular do hipocampo interfere intensamente no comportamento das atividades epileptiformes não-sinápticos, sendo a densidade celular um fator que pode promover mudanças de fração do volume extracelular (α) levando à alterações dos parâmetros dos registros eletrofisiológicos. Desta forma, o objetivo do trabalho é analisar a eletrofisiologia das atividades epileptiformes não-sinápticas, na camada granular do giro denteado do hipocampo de rato, durante o desenvolvimento neuronal, e comparar com a quantificação celular por marcação histoquímica. O estudo constou do registro do potencial elétrico extracelular (PE) de atividades epileptiformes não-sinápticas, induzidas com o modelo zero-cálcio, em fatias de hipocampo de 66 ratos da raça wistar (fêmeas) nas seguintes faixas etárias: P09-11, P21-23, P35-37, P49-51, P70-72, P91-93, P111-112, P125-127 e P139-140 (dias pós-natal). Feitos os registros, as fatias foram re-seccionadas e coradas pelo método de Nissl, com o cresil violeta, e posterior quantificação das células no entorno do eletrodo de registro. Os resultados demonstraram que a densidade celular e a fração volume podem estar associadas às alterações dos grafo-elementos de registros extracelulares de atividades epileptiforme não-sináptica, durante as faixas etárias que vão até por volta dos 21 dias pós-natal. A partir de então, associam-se as formações de circuitarias neuronais, a confluência de diversos mecanismos inerentes ás essas formações que devem modular de forma complexa os parâmetros eletrográficos.
Abstract of Dissertation presented to FIQUINE/UFSJ as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science (M. Sc.)
ELECTROPHYSIOLOGICAL AND MORPHO-FUNCTIONAL STUDY OF THE EPILEPTIFORM ACTIVITIES IN DIFFERENT MATURATION STAGES OF RAT
HIPPOCAMPUS
Laila Cristina Moreira Damázio
September/2007
Advisor: Antônio-Carlos Guimarães de Almeida Co-Advisor: Gilcélio Amaral da Silveira
Department: Biomedical Engineering
The ionic distribution in the extracellular space of the hippocampus interferes intensely in the behavior of the non-synaptic epileptiform activities. The cellular density is a factor that may promote changes on the extracellular volume fraction taking to alterations of the electrophysiological registration parameters. Therefore, the aim of this work was to analyze the electrophysiology of the non-synaptic epileptiform activities in the granular layer of the Dentate Gyrus of the rat hippocampus, during the neuronal development, and to compare to the cellular quantification by histochemic demarcation. The study consisted of the registration of the extracellular electrical potential (EP) of the non-synaptic epileptiform activities, induced with the zero-calcium model, in hippocampus slices of 66 wistar rats (females) in the following age groups: P09-11, P21-23, P35-37, P49-51, P70-72, P91-93, P111-112, P125-127 and P139-140 (postnatal days). After the registrations, the slices were re-sectioned and colored by the Nissl method, with violet cresil, and posterior quantification of the cells around the register electrode. The results demonstrated that the cellular density and the volume fraction could be associated to alterations of the graph-elements of extracellular registrations of non-synaptic epileptiform activities, till around 21 days of age. Then, the circuitry neuronal formation were associated, the confluence of several mechanisms that were inherent to these formations that should modulate in a complex way the electrographic parameters.
SUMÁRIO
I – INTRODUÇÃO...1
II – REVISÃO DA LITERATURA...3
II.1– EPILEPSIA...3
II.2 – A ESTRUTURA MORFO-FUNCIONAL DO HIPOCAMPO E AS ATIVIDADES EPILEPTIFORMES... 6
II.3 – CONEXÕES NÃO-SINÁPTICAS E O ESPAÇO EXTRACELULAR NA INDUÇÃO DE ATIVIDADES EPILEPTIFORMES... 11
II.3.1 - Acoplamento eletrotônico (Gap-Junctions) ...11
II.3.2 - Efeito efáptico...12
II.3.3 - Efeito de campo elétrico...13
II.3.4 - Flutuações Iônicas...14
II.3.5 - O espaço extracelular... 14
II.4 – A MATURAÇÃO NEURONAL DO HIPOCAMPO DE RATOS... 17
III – MATERIAIS E MÉTODOS ... 23
III.1 – PREPARAÇÃO EXPERIMENTAL PARA INDUÇÃO DE ATIVIDADES EPILEPTIFORMES NA CG DO HIPOCAMPO DE RATOS... 23
III.1.1 - Seleção dos animais ... 23
III.1.2 - Dissecação ... 23
III.1.3 - Solução fisiológica ... 27
III.1.4 - Procedimento para conservação das fatias ... 28
III.1.5 - Equipamentos utilizados para indução de atividades epileptiformes... 29
III.5.1.1 - Câmara de perfusão ... 29
III.5.1.2 - Câmara de interface... 30
III.2 – REGISTRO DO POTENCIAL EXTRACELULAR SOBRE A CG DO GIRO DENTEADO DO HIPOCAMPO...33
III.3 - PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA ANÁLISE HISTOQUÍMICA DAS FATIAS DO REGISTRO ELETROFISIOLÓGICO ... 35
III.3.1 - Preparação da fatia do registro eletrofisiológico... 35
III.3.2 - Coloração das fatias ... 37
III.4 - QUANTIFICAÇÃO NEURONAL...39
III.5 - ANÁLISE QUANTITATIVA DO POTENCIAL ELÉTRICO EXTRACELULAR...42
III.5.1 - Análise quantitativa da amplitude da componente DC... 43
III.5.2 - Análise quantitativa da amplitude dos Populations Spikes ... 44
III.5.3 - Análise quantitativa da duração dos eventos de AE's... 44
IV – RESULTADOS... 46
IV.1 - ANÁLISE EXPERIMENTAL DO REGISTRO ELETROFISIOLÓGICO DAS ATIVIDADES EPILEPTIFORMES NÃO-SINÁPTICAS EM DIFERENTES FAIXAS ETÁRIAS DE RATOS... 46
IV.2 - ANÁLISE QUALITATIVA DA MORFOLOGIA DA CG DO GD, PELA HISTOQUÍMICA, EM DIFERENTES FAIXAS ETÁRIAS DE RATOS... 54
IV.3 - ANÁLISE QUANTITATIVA DAS CÉLULAS NA CG DO GD EM DIFERENTES FAIXAS ETÁRIAS DE RATOS... 56
IV.4 - CORRELAÇÃO ENTRE OS PARÂMETROS DO REGISTRO ELETROFISIOLÓGICO EXTRACELULAR E A CONTAGEM CELULAR EM DIFERENTES FAIXAS ETÁRIAS DE RATOS...59
V – DISCUSSÃO ... 61
VI – CONCLUSÃO ... 69
LISTA DE SÍMBOLOS
Símbolo Descrição α Fração do volume do espaço extracelular
A Área (m2)
Agj Área da gap-junctions
Am Área da membrana
dn Distância entre o centro do corpo celular neuronal gj
j
D Constante de difusão do íon j nas gap-junctions
i P ADP
K , Constantes de dissociação de ADP e fósforo
i ATP
K Constantes de dissociação de ATP
i Na
K e KKi Constantes de dissociação intracelulares de Na+ e K+
o Na
K e KKo Constantes de dissociação extracelulares de Na+ e K+
λ Tortuosidade φ Fluxo iônico (mM/s) ∇2 Operador Laplaciano Vi Potencial intracelular Vm Vextra Vintra Potencial de membrana Volume extracelular Volume intracelular
Símbolo Descrição
VPA Potencial elétrico no compartimento ∇ρ Operador Gradiente
[X]y Concentração do íon X no meio y (y = o, extracelular; y = i, intracelular). ex: [K+]o
[íon]o Concentração do íon no meio extracelular
AE´s Atividades Epileptiformes
BrdU Análago sintético da timidina
C Concentração iônica (mM) CA Corno Ammon Ca Camada alveus CE Córtex entorrinal CG Camada granular CM Camada molecular
CME Camada molecular externa CMI Camada molecular interna
Cml Camada molecular-lacunosa
Co Camada oriens
Cp Camada piramidal
dn DCX
Distância entre o centro Marcador endógeno neuronal DFT Transformada Discreta de Fourier
Símbolo Descrição
Dj Constante de difusão iônica do íon j (cm2/s)
EEC Espaço extracelular
ELT Epilepsia do lobo temporal
ELTM Epilepsia do lobo temporal mesial
F Constante de Faraday (96,487 C/mMol)
Fi Fímbria GABA Ácido γ-aminobutírico
GD Giro denteado
H Hilus IC
IFT
Intervalo de confiança
Transformada Inversa de Fourier IP Infra-piramidal
LANEC Laboratório de Neurociência Experimental e Computacional NDN Neurotransmissão por difusão não-sináptica
OMS Organização Mundial de Saúde Or Pás Osmolaridade relativa Pára-subículo PE Potencial elétrico pHo pH extracelular PrS Pré-subículo
Símbolo Descrição
PS´s Population Spikes
SAE Sistema auxiliar de experimentos SNC Sistema Nervoso Central
SP Supra-piramidal
Sr Stratum radiatum
Sub Subículo
I – INTRODUÇÃO
A epilepsia é o transtorno neurológico grave mais freqüente e que apresenta recorrências de crises espontâneas (pelo menos uma) não causadas por insultos graves do sistema nervoso central (FISHER et al., 2005). A epilepsia é considerada a segunda maior causa de procura nos centros de atendimentos neurológicos no mundo, desta forma, os gastos da Organização Mundial de Saúde (OMS) com pacientes epilépticos continuam tendo grande impacto social. Estudos com modelos experimentais de indução de atividades epilépticas têm contribuído para elucidar os mecanismos neurofisiológicos envolvidos na epilepsia.
O hipocampo de rato tem sido estudado largamente em modelos experimentais de epilepsia, devido a seu denso empacotamento celular e a capacidade de sustentação das crises epilépticas. A distribuição iônica no meio extracelular do hipocampo interfere bruscamente no comportamento dos eventos epileptiformes, sendo a maturação neuronal do hipocampo, após o nascimento, um fator que pode promover mudanças morfológicas do tecido, levando este a atividades epileptiformes sustentadas por conexões não-sinápticas.
Após o nascimento, novos neurônios e neuroglias continuam sendo gerados até a senescência do rato, e este processo, denominado neurogênese, promove mudanças em todo o encéfalo do animal (KUHN et al, 1996). De acordo com ALTMAN (1963), na camada granular do giro denteado do hipocampo de ratos, ocorre um aumento no volume devido à proliferação de neuroblastos e este processo pode se prolongar de 3 a 11 meses após o nascimento. Outros autores afirmam que a neurogênese se estende por toda a vida do animal. (SCHLESSINGER et al, 1975; GOULD et al, 1998; KUHN et
al, 1996).
Desta forma, o objetivo deste estudo é analisar a eletrofisiologia e a morfologia celular das atividades epileptiformes não-sinápticas na camada granular do giro denteado em diferentes estágios de maturação do hipocampo de ratos. O estudo consta do registro eletrofisiológico de atividades epileptiformes não-sinápticas induzidas em nove faixas etárias de ratos.
No capítulo II é feita uma revisão da literatura onde foi realizado um breve histórico da epilepsia, os diferentes tipos, alguns dados epidemiológicos no Brasil e no mundo, além da descrição dos mecanismos envolvidos. A seguir, é descrita a estrutura
morfofuncional do hipocampo na sustentação das atividades epileptiformes (AE’s), com enfoque no giro denteado e suas lâminas supra-piramidal, ápice e infra-piramidal, descrevendo a relação do espaço extracelular com os mecanismos não-sinápticos envolvidos na sustentação das AE’s com protocolo de zero-Ca2+. Finaliza-se o capítulo com a descrição da maturação neuronal em diferentes faixas etárias de ratos relacionando a neurogênese através de estudos com imuno-histoquímica e histoquímica para caracterização morfológica do tecido neuronal.
No capítulo III, são apresentados com detalhes, os procedimentos experimentais para o registro eletrofisiológico, os procedimentos para re-secção das fatias no vibrátomo e coloração pelo método Nissl. Na seqüência, são expostos os métodos de análise do potencial elétrico, a quantificação neuronal empregada na histoquímica e os métodos de simulações computacionais.
Os resultados experimentais são apresentados no capítulo IV com a representação dos valores encontrados na análise do potencial elétrico extracelular de nove faixas etárias de ratos. Paralelamente são comparados os registros eletrofisiológicos com a quantificação neuronal e os resultados das simulações computacionais.
No capítulo V, são discutidos os resultados, a partir dos dados encontrados nas literaturas, além dos resultados referentes às simulações computacionais.
Já no capítulo VI, são apresentadas as conclusões gerais do trabalho e suas contribuições no campo dos mecanismos não-sinápticos envolvidos na geração e sustentação das atividades epileptiformes não-sinápticas.
II – REVISÃO DA LITERATURA
II.1 – EpilepsiaEm termos epidemiológicos, a incidência anual de epilepsia é alta. Os dados epidemiológicos de epilepsia demonstram resultados que variam de 1.5/10004 a 57/10005 habitantes (BORGES et al, 2004). Na cidade de São Paulo, no Brasil, 11.9/1000 dos indivíduos são acometidos com epilepsia (MARINO et al., 1986).
O impacto econômico da epilepsia se tornou um assunto importante, pois, segundo os dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), depois da depressão, a epilepsia é a segunda causa mais freqüente de procura por atendimento nos centros neuropsiquiátricos e é responsável por 1% dos dias perdidos com doenças em todo o mundo. (VALENTE et al, 2004).
A epilepsia, descrita desde os primórdios da humanidade, foi vista como indicativo de possessão demoníaca ou como acúmulo de humores do mal (CANTILINO e CARVALHO, 2001). Esta situação perdurou até que Hipócrates (460 a 377 a.C.) propôs que a epilepsia seria uma doença de origem cerebral. Os documentos desta época são os primeiros a atribuir causas físicas para as doenças neurológicas (GOMES, 1997). Hoje, a epilepsia é definida como um transtorno neurológico com crises espontâneas recorrentes (pelo menos uma), não provocadas por febre, insultos agudos do sistema nervoso central (SNC) ou desequilíbrios tóxico-metabólicos graves (FISHER et al., 2005).
A classificação das crises epilépticas se baseia na descrição clínica das crises, sendo estas parciais ou generalizadas. Alguns autores também classificam a epilepsia por sua topografia, como por exemplo, a epilepsia do lobo temporal (ELT), epilepsia do lobo frontal, etc. (MARCHETTI et al., 2005).
A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a forma mais comum de epilepsia na população adulta, sendo responsável por 40% de todos os casos (ENGEL e SHIELDS, 1997; GASTAUT et al, 1975). A ELT é subdividida em mesial e neocortical ou lateral, de acordo com a origem e semiologia das crises. (ENGEL, 2001).
A epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM) é caracterizada pela esclerose hipocampal e cerca de 50-70% dos pacientes são refratários (não responsivos) ao
tratamento medicamentoso (ENGEL e RASSMUSSEN, 1993). Esse tipo de epilepsia tem seu início na infância tardia ou adolescência (FRENCH et al.,1993). A incidência de epilepsia na população pediátrica é grande. Cerca de 75% dos indivíduos com epilepsia iniciam as crises antes dos 18 anos. As síndromes epilépticas e suas manifestações clínicas se modificam com a idade. Nos recém-nascidos, por exemplo, existe uma incapacidade do SNC em desenvolver crises severas, as denominadas tônico-clônicas. Isto se deve às mudanças dinâmicas do SNC, desde o nascimento até a idade adulta (HE e CREWS, 2007; AICARDI e CHEVRIE, 1983). Já as crises febris (convulsões que surgem depois de uma febre alta) aparecem com mais freqüência entre os seis meses e os cinco anos de idade (AICARDI e CHEVRIE, 1983), mas estas, como mencionados anteriormente, não são definidos como epilepsias.
Além dos estudos com indivíduos com epilepsia, existem modelos experimentais utilizando animais que têm contribuído para o conhecimento dos fenômenos na origem e sustentação das crises epilépticas (CAVALHEIRO,1991). O desenvolvimento de modelos experimentais tem as vantagens de permitir controlar as variáveis como: uniformidade genética, idade, circuitos que podem gerar crises epilépticas, características dos insultos que podem gerar epilepsia, e tempo entre crises epilépticas, além de alterações funcionais e estruturais (GUEDES et al, 2005).
A partir de 1982, TAYLOR e DUDEK, bem como JEFFERYS e HASS, ambos utilizando fatias de hipocampo de ratos, demonstraram a importância das conexões não-sinápticas na epilepsia, a partir da indução de atividades epileptiformes (AE´s) por meio de perfusão com solução contendo baixa concentração de Ca+2, bloqueando as conexões sinápticas. Esse tipo de atividade pode ser facilmente induzida no hipocampo em função de sua estrutura estratificada, com denso empacotamento de células neuronais nas regiões de CA1, CA2, CA3, CA4 (Corno Ammon) e GD (Giro Denteado), com destaque para essa última (figura II.1).
Figura II.1 – Esquema representativo de um corte transversal do hipocampo de rato. Os
círculos pequenos formando a curva menor com formato de C invertido representam os corpos celulares do GD. Os triângulos que formam a curva maior, também em formato de C, constituem a camada de corpos celulares de células piramidais, as quais caracterizam o Corno Ammon (CA) (retirado de ENGEL, 1989).
Dentre as diversas áreas do hipocampo, o giro denteado é a que apresenta eventos epileptiformes (oriundos de atividades neuronais síncronas) com maiores durações e amplitudes, sob condições experimentais de alta concentração extracelular de K+ e baixa concentração de Ca2+ (PAN e STRINGER, 1996; XION e STRINGER, 2000; CARVALHO, 2003). Como mostrado na figura II.2, as AE`s típicas da supressão de conexões sinápticas são caracterizadas por uma salva de espículas, formadas pelo disparo simultâneo de potenciais de ação, denominadas de “population spikes” (PS), superpostas a um deslocamento negativo da linha de base. É comum o emprego do termo inglês “bursts” para esse tipo de evento com salvas de PS’s. Assim, “bursts” não sinápticos para aqueles oriundos da supressão de Ca2+ extracelular.
Figura II.2 – Registro de eventos epileptiformes não-sinápticos (salva de espículas formadas
por potenciais de ação síncronos, denominadas Population Spikes, superpostas a um deslocamentos negativo da linha de base) característicos das regiões do hipocampo,
ap’os perfusão com solução sem Ca2+ e com alta concentração de K+. Na região CA1,
eventos epileptiformes, os bursts apresentam PS´s com grandes amplitudes, na região CA3, os PS´s ocorrem de forma mais estável e com menor intervalo de tempo entre os eventos. E no GD, há atividade neuronal intensa, com bursts prolongados e apresentando variação negativa do potencial extracelular, juntamente com a ocorrência de PS´s de grandes amplitudes (retirado de DUDEK et al., 1998).
II.2 – A estrutura morfo-funcional do hipocampo e as atividades epileptiformes
Em 1937, James Papez propôs que a formação hipocampal processa as informações do giro do cíngulo e as envia para os corpos mamilares do hipotálamo via fórnix. James observou que pacientes infectados com o vírus da raiva apresentavam o hipocampo afetado, por morte neuronal, levando as alterações emocionais e crises de terror e fúria. Desta forma, o hipocampo foi incluído como uma estrutura do sistema límbico, pois, está relacionado como o comportamento e as emoções (KANDEL, 2000).
O hipocampo está localizado medialmente no lobo temporal e relaciona-se com os estados emocionais, memória e coordenação das atividades do hipotálamo e do córtex cerebral (figura II.3).
Giro do Cíngulo Núcleo anterior do tálamo Formação Hipocampal Amígdala Hipotálamo Corpo Mamilar
Córtex Pré-frontal Córtex Associação
A) B)
Figura II.3 – A) A demonstração anatômica do sistema límbico humano e o hipocampo
conectando com o córtex cerebral; B) O circuito neuronal para as emoções proposto por James Papez (KANDEL, 2000).
Já em 1989, ENGEL, apresentou estudos que confirmavam a importância do hipocampo na geração e sustentação de crises epilépticas que abrangem todo o córtex cerebral. Desta forma, estudos experimentais de indução de epilepsia no hipocampo surgiram para melhorar a compreensão dos mecanismos neurofisiológicos envolvidos na epilepsia.
O rato é o mamífero que mais contribui para os experimentos de indução da epilepsia, pois, possui uma anatomia cerebral muito semelhante à humana. O hipocampo de rato também está localizado medialmente no lobo temporal dos dois hemisférios cerebrais, como mostrado na figura II.4.
Figura II.4 – Representação esquemática tridimensional do cérebro de rato, onde estão visíveis
os dois hipocampos, dispostos medialmente em cada hemisfério cerebral (modificado de O’MARA et al., 2001).
A formação hipocampal pode ser dividida em quatro regiões: a fascia dentata ou giro denteado (dividido em lâmina infra-piramidal, lâmina supra-piramidal e ápice), o corno de Ammon (CA) ou hipocampo (dividido em CA1, CA2, CA3 e CA4), o
subiculum (S) e o córtex entorrinal (CE) (GUEDES et al, 2006). Mas, a exemplo de
outros trabalhos, a região do giro denteado (GD), CA e S serão agrupados e denominados hipocampo (figura II.5).
Ápice
Lâmina Supra-Piramidal
Lâmina Supra-Piramidal
Figura II.5 – No desenho da fatia do hipocampo podem ser identificadas as regiões CA1, CA2,
CA3, S, GD (lâmina supra-piramidal, lâmina infra-piramidal e ápice) e CE.
O Corno Ammon (CA) apresenta sete camadas, sendo as seguintes: camada molecular, camada lacunosa, camada stratum radiatum, a camada piramidal, camada oriens, camada alveus e a camada ou zona epitelial. O Corno Ammon é subdividido em CA1, CA2, CA3 e CA4, sendo esta última região de transição entre o giro denteado e o Corno Ammon (LOPES DA SILVA, 1990). No giro denteado, existem dois tipos principais de vias aferentes: uma glutamatérgica, denominada via perfurante, que se origina na camada II do córtex entorrinal e termina nos dois terços externos da camada
molecular-lacunosa do Corno Ammon e na camada molecular do subículo; a outra via é colinérgica, proveniente do núcleo septal medial e termina de forma difusa. As principais fibras eferentes do giro denteado são os axônios das células granulares, denominadas fibras musgosas, que liberam glutamato, zinco, dinorfina e ácido gama-amino-butírico (GABA). Estas fibras musgosas realizam sinapse com neurônios piramidais de CA3 e CA4, interneurônios e células musgosas do hilus (ACSÁDY et al, 1998; CRAWFORD e CONNOR, 1973). Outra via eferente de grande importância no giro denteado são as fibras musgosas, que têm origem nas células granulares e projetam conexão até os neurônios da região de CA3 (LOPES DA SILVA et al, 1990; CLAIBORNE et al, 1986). SCHARFMAN et al (2002) demonstraram uma assimetria no giro denteado, onde o brotamento das fibras musgosas aumenta à medida que percorre a lâmina supra-piramidal, ápice e vai até a lâmina infra-piramidal. Isto sugere uma diferença na estrutura e funcionalidade das sub-regiões do giro denteado. PEREIRA (2005) demonstrou uma assimetria funcional da lâmina supra-piramidal para a lâmina infra-piramidal, principalmente com relação às interconexões neuronais.
A região de CA3 projeta fibras eferentes denominadas sistema colateral de
Schaffer para a região de CA1 (AMARAL et al, 1989; LOPES DA SILVA et al; 1990).
A região de CA1 envia fibras para todas as partes do subículo (AMARAL et al, 1991). O giro denteado ou fascia dentata cuja estrutura é laminar e curva, composta por três camadas de neurônios: a camada granular, que apresenta um denso empacotamento de corpos celulares com curtos dendritos próximos ao pericário e potencial transmembrânico de repouso mais negativo que - 65 mV (PAN e STRINGER, 1996); a camada hiliar ou hilus, composta por neurônios polimórficos como os interneurônios que liberam GABA e neuropeptídeos e as células musgosas, que liberam glutamato (SORIANO e FROTSCHER, 1994), e a camada molecular, que é composta por pericários neuronais, é principalmente por fibras e terminais dendríticos, como representado na figura II.6 (LOPES DA SILVA et al., 1990; SCHARFMAN et al., 2002).
Figura II.6 - Desenho esquemático, modificado de O’MARA et al. (2001), da formação
hipocampal indicando várias regiões (corno Ammon, complexo subicular e giro denteado) e camadas (ca, camada alveus; co, camada oriens; cp, camada piramidal; sr, stratum
radiatum; cml, camada molecular - lacunosa; H, hilus; CG, camada granular; CM, camada
molecular e camadas I, II, III, IV, V e VI presentes no complexo subicular).
SCHARFMAN et al (2002) observou que os registros dos eventos epileptiformes no lado IP exibiam Population Spikes de maiores amplitudes e de maior duração. O autor sugere que a lâmina IP apresenta maior excitabilidade que a lâmina SP. As diferenças estruturais e funcionais das lâminas SP e IP advêm da produção assíncrona de neurônios e dos diferentes estágios de maturação neuronal nas duas lâminas.
Estudos como de AMARAL e WITTER (1989) e LOPES DA SILVA et al (1990) identificaram uma distribuição lamelar das principais conexões da formação hipocampal, onde estas estão dispostas de forma transversal, com um ângulo de aproximadamente 70 graus em relação ao eixo longitudinal.
O subículo é uma área cortical localizada entre a região de CA1 e o CE, sendo dividido em três partes: subículo, pré-subículo e o para-subículo (LOPES DA SILVA et
al, 1990). O subículo é considerada a região que mais projeta fibras de saída do
hipocampo e o CE que mais projeta fibras para o hipocampo (LOPES DA SILVA et al, 1990).
O subículo apresenta três camadas principais: a camada molecular, a camada de células piramidais e a camada polimórfica. A segunda é formada por um largo e denso empacotamento de células neuronais acompanhados por interneurônios (LOPES DA SILVA et al, 1990; O’MARA et al, 2001).
O córtex entorrinal é subdividido em regiões medial e lateral e projeta fibras principalmente para o giro denteado (via perfurante) e outras projeções das camadas II e III do CE para a camada molecular do subículo (WITTER e AMARAL, 1991).
II.3 – Conexões não-sinápticas e o espaço extracelular na indução de atividades epileptiformes
A transmissão do impulso nervoso pode ocorrer por dois mecanismos básicos: as conexões sinápticas e não-sinápticas. A primeira é mediada pela liberação de neurotransmissores e a segunda pela interação elétrica (KANDEL, 2000). O hipocampo possui camadas de corpos celulares compactos que favorecem o efeito das conexões não-sinápticas, por isso é um bom modelo experimental para o estudo dessas conexões. Estudos demonstraram que as comunicações não-sinápticas também são suficientes para a geração e sustentação das atividades epileptiformes (TAYLOR e DUDEK, 1982; JEFFERYS e HAAS, 1982).
Os modelos experimentais para o estudo das conexões não-sinápticas são realizados por meio do bloqueio das conexões sinápticas, utilizando solução nutriente com baixa concentração de Ca2+. Com isso, os quatro tipos principais de interações neuronais são: via campo elétrico, gap-junctions, por flutuações iônicas e acoplamento efáptico (JEFFERYS, 1995; DUDEK et al., 1998; XIONG e STRINGER, 2000; CARVALHO, 2003).
II.3.1 – Acoplamento eletrotônico (gap-junctions)
Pela primeira vez, em 1959, FURSHPAN e POTTER descreveram as
gap-junctions como uma nova transmissão não-sináptica, capaz de transferir rapidamente a
atividade elétrica da membrana pré-sináptica para a membrana pós-sináptica. Já em 1970, BENNETT et al, demonstrou que o acoplamento eletrotônico existe em várias regiões do encéfalo.
As gap-junctions são grupos de seis conexinas que formam um anel que interage
entre uma célula e outra. As gap-junctions ligam as membranas de duas células adjacentes mantendo uma distância de 3,5nm, enquanto que na sinapse química, à distância entre as membranas é de 30 a 50 nm. Cada gap-junction forma um canal de aproximadamente 1,5nm de diâmetro (JEFFERYS, 1995), como mostrado na figura II.7.
Figura II.7 - Desenho esquemático do modelo de interação entre duas células adjacentes via
gap- junctions (retirado de ALBERTS et al.,1994).
As gap-junctions permitem a passagem de pequenas moléculas e a passagem de
correntes elétricas em ambas direções e esses fatores influenciam a sincronização neuronal, por meio de pequenos potenciais despolarizantes entre neurônios (FURSPHAN e POTTER, 1959).
II.3.2 – Efeito efáptico
Efeito efáptico é um tipo de comunicação elétrica entre dois ou poucos neurônios muito próximos, entre nervos e axônios desmielinizados justapostos (figura II.8). Isto acontece pelo intenso potencial extracelular que promove despolarização transmembrânica de neurônios adjacentes (RAMON e MOORE, 1978). A interação iônica ocorre por meio de flutuações iônicas pelo restrito volume das efapsias. Com isso, a atuação desta comunicação sobre as AE´s é provocada pelos efeitos das flutuações iônicas e interação de campo elétrico.
Figura II.8 – Diagrama esquemático da interação efáptica entre axônios gigantes de lula que
foram aproximados e submersos em óleo para reduzir o espaço extracelular (mostrado ao centro). A: O fluxo iônico durante um potencial de ação produz um potencial
extracelular (Vo), neste caso maior que o potencial intracelular (Vi). B: a geração de um
potencial de ação em um axônio induz um potencial “pós-efáptico” na célula vizinha.
(retirado de RAMON e MOORE, 1978).
II.3.3 – Efeito de campo elétrico
O efeito do campo elétrico é mediado por fluxos transmembrânicos no meio extracelular. A resistividade do espaço extracelular pode variar devido a diferentes fatores, como no hipocampo, onde a resistividade pode aumentar devido a uma redução local no espaço extracelular e aumento da tortuosidade (MCBAIN et al, 1990).
A organização laminar com densos pacotes de células neuronais fornece um ótimo ambiente para grandes campos elétricos (GARDNER-MEDWIN, 1976).
Estudos como de SNOW e DUDEK, 1986; TAYLOR e DUDEK, 1982, demonstram que o campo elétrico é mais elevado com a inibição das conexões sinápticas, utilizando solução de perfusão com zero-Ca+2 (SNOW e DUDEK, 1986; TAYLOR e DUDEK, 1982). XION e STRINGER (2000) relataram que bloqueando as gap-junctions durante a indução das atividades epileptiformes ocorre sustentação das AE’s pela interação do campo elétrico. Estudos sugerem que o efeito de campo elétrico ajuda a sustentar a sincronização neuronal das atividades epileptiformes, mas não inicia os eventos (RODRIGUES, 2003).
II.3.4 – Flutuações iönicas
No estudo de LUX et al (1986) foi demonstrado que o aumento das atividades neuronais resulta em considerável alteração das concentrações iônicas e do espaço extracelular, por isso as flutuações iônicas estão sendo investigadas na sincronização de atividades epileptiformes.
O meio extracelular possui vários íons como, K+, Ca2+ e Mg2+. O aumento do K+ extracelular promove despolarização de células vizinhas e eleva a excitabilidade do tecido (KONNERTH et al, 1984; PAN e STRINGER, 1996; XION e STRINGER, 2000; CARVALHO, 2003).
Os íons Ca2+ e Mg2+ no meio extracelular afetam a excitabilidade neuronal pela blindagem nos canais iônicos da membrana e isso tende a aumentar a atuação do campo elétrico através da membrana (JEFFERYS e HAAS, 1982). Com a redução extracelular dos íons K+ e Mg2+ também ocorre uma redução na transmissão sináptica (JEFFERYS e HAAS, 1982).
Já o íon Na2+ é capaz de atuar na indução de potenciais de ação e o seu influxo pelos canais iônicos causa a despolarização do potencial transmembrânico. O íon Na2+ potencializa o efeito de campo elétrico e o acoplamento eletrotônico (LUX et al, 1986).
II.3.5 – O espaço extracelular
O espaço extracelular (EEC) é composto por neurotransmissores, neuromoduladores, componentes metabólicos e íons que mudam dinamicamente durante atividade neuronal, afetando substancialmente a transmissão de informação no tecido nervoso. Dessa forma, o EEC é um importante canal de comunicação entre neurônios e entre os neurônios e as células gliais (NICHOLSON, 1979; NICHOLSON e RICE, 1991; SYKOVÁ, 1992; SYKOVÁ, 1991).
De acordo com NICHOLSON e SYKOVÁ (1998), o cérebro de uma pessoa adulta tem o equivalente a 15-25 % de volume do EEC em relação ao volume total do cérebro. Além disso, os parâmetros de difusão no EEC mudam durante atividades neuronais, o que afeta o movimento de substâncias neuroativas e a comunicação entre neurônios e glia.
O EEC é composto principalmente por composição iônica. Um exemplo claro é a composição do fluido cerebroespinhal que é composto por: 141 mM Na+2, 124mM Cl
-, 3mM K+, 121 mM HCO-3, 1.2 mM Ca2+ e 2.5 mM Mg2+ (SYKOVÁ, 1983, 1992, 1997).
Os valores absolutos do volume EEC diminuem com a mudança da geometria do espaço extracelular e isso foi constatado por NICHOLSON e PHILIPS (1981) utilizando o método de iontoforese. Esse método determinou que a fração do volume do EEC (α) é igual ao volume EEC dividido pelo volume total do tecido, a tortuosidade do tecido (λ) é o aumento do comprimento da passagem de partículas por difusão entre dois pontos da membrana celular.
Recentes estudos demonstram que o volume do espaço extracelular afeta as correntes da membrana em resposta a mudanças do pico de voltagem, além das células gliais serem permeáveis ao íon K+, permitindo a despolarização da membrana e conseqüente efluxo de K+ para fora da célula (BERGER et al, 1991).
Durante o desenvolvimento pós-natal do cérebro do rato, ocorrem mudanças nos parâmetros de difusão do espaço extracelular. A fração do volume do espaço extracelular é maior nos primeiros dias pós-natal e isto pode ser atribuído à incompleta migração neuronal, gliogêneses, angiogênese e à presença de muitos proteoglicans na matrix extracelular (VORISEK e SYKOVA, 1997).
No cérebro de ratos ocorrem mudanças relativas na fração de volume do EEC durante o seu desenvolvimento, e isto interfere na diluição de diversas substâncias e íons no tecido nervoso.
LEHMENKUHLER et al, (1993) utilizou ratos Wistar de 2 a 120 dias e analisou o desenvolvimento das camadas do córtex cerebral. Como mostrado nas figuras II.9 e II.10, observa-se uma diminuição dos valores de α com o aumento da idade do animal e em especial a camada de número IV que corresponde à camada granular do neocórtex do rato.
Figura II.9 – Gráfico tridimensional da distribuição da fração do volume em função dos dias
pós-natal e as camadas do neocórtex. As setas indicam a camada granular do neocórtex do rato (LEHMENKUHLER et al, 1993).
Os parâmetros de difusão do EEC variam de acordo com o avanço da idade do animal. Na figura II.10 é possível identificar variações nos parâmetros da fração do volume do espaço extracelular e na tortuosidade do tecido. LEHMENKUHLER et al, (1993) observa ainda um aumento em todos os parâmetros de difusão ao comparar ratos de P3 dias com ratos de P120 dias.
Figura II.10 – Representação dos parâmetros de difusão analisados em seis camadas do córtex
cerebral de ratos jovens e adultos. Observam-se diferentes valores para os parâmetros de difusão (α, λ) nas faixas etárias de, P3, P11, P21 e P120 dias. Os valores são respectivamente: 158µm, 1100µm; 167µm, 1300µm; 178µm, 1700µm; 165µm e 1900µm (LEHMENKUHLER et al, 1993).
O desenvolvimento pós-natal do cérebro de ratos é mais proeminente durante os primeiros 30 dias de vida (ARENDER e VELLIS, 1989; EAYRS e GOODHEAD, 1959). A gliogênese ocorre durante os primeiros 14 dias e a proliferação de astrócitos acontece do nascimento até 15 dias de vida. Em seguinda, até 55 dias ocorre diminuição da diferenciação dos astrócitos (RIOL et al, 1992). A proliferação dos astrócitos correlaciona-se com a diminuição do EEC, com o avanço da idade do animal.
A relação do EEC com o desenvolvimento do cérebro de rato afeta o acúmulo de íons, metabólitos e substâncias neuroativas no EEC. A diminuição do EEC, com o avançar da idade do rato, aumenta a concentração de todos os íons e outras substâncias no meio EEC (PHILLIPS e NICHOLSON, 1979; RICE e NICHOLSON, 1987).
O volume do EEC diminui rapidamente em P14 e P21 e isto se deve ao extensivo período de mielinização. Após P21 ocorre aumento da maturação cerebral do rato e aumento do raio entre o volume intracelular e extracelular, com conseqüente aumento da densidade celular, da migração de células, da proliferação axonal e dendrítica, além da maturação das células gliais (LEHMENKUHLER et al, 1993).
A sincronização neuronal e as atividades epileptiformes nas fatias do hipocampo são promovidas pelo aumento do [K+]e, com isso o reduzido volume do espaço extracelular promove aumento da concentração de K+ em animais adultos e aumenta a sincronização neuronal (TRAYNELIS e DINGLEDINE, 1989; CARVALHO, 2003).
O SNC de ratos imaturos é diferente de ratos maduros pela distribuição de vasos sanguíneos e pelas células gliais. A vascularização do sistema nervoso de ratos imaturos ainda é incompleta e a proliferação glial ainda não é restabelecida por completo, o que aumenta o volume do espaço extracelular (DOBBING, 1963; HENN et al, 1972). HEUMANN et al, (1978) afirma que ocorre proliferação glial até P180 dias, e que isto contribui para a diminuição da fração do volume do EEC.
II.4 – Maturação neuronal do hipocampo de ratos
No início do século XX ainda era postulado que o desenvolvimento do Sistema Nervoso Central (SNC) em seres humanos e mamíferos permanecia fixo e não alterava sua morfologia após o nascimento (KUHN, et al., 1996, SCORZA et al, 2005 apud KOELLIKER, 1896). Já na metade do século XX, foi sugerido por alguns
pesquisadores a existência de um processo mitótico no encéfalo de ratos após seu nascimento (HAMILTON, 1901).
Somente nos anos 90, com o desenvolvimento do bromodesoxiuridina - BrdU (análago sintético da timidina e substitui a mesma na fase S da divisão celular), foi possível identificar, com maior clareza, o processo de neurogênese (mitose neuronal após o nascimento) no SNC de algumas espécies adultas como os roedores (ALTMAN, 1965; NOWAKOWSKI et al, 1989).
Em ratos, na formação hipocampal, principalmente na zona subgranular do giro denteado (região de encontro da camada granular com o hilus), existem células progenitoras mitoticamente ativas que geram novos neurônios para a camada granular (figura II.11). As células granulares do giro denteado são originárias do hilus (GROSS, 2000).
III ventrículo
Hipocampo
Ventrículo Lateral esquerdo
Figura II.11 – Regiões ventriculares e subgranulares colaborando para a proliferação neuronal
na camada granular do giro denteando de ratos durante a fase adulta (SILVA e CAVALHEIRO, 2004).
O processo de neurogênese no SNC de ratos sofre influência de diferentes fatores, como por exemplo: a desnutrição pré-natal diminui o processo de neurogênese, animais que vivem em ambientes com mais estímulos externos aumentam este processo, ratos com modelos de diabetes diminuem a proliferação neuronal, exercício físico aumenta a proliferação neuronal, inflamação reduz a neurogênese e a maior taxa de estrógeno em ratas adultas estimula a produção de células granulares no giro denteado do hipocampo (KEMPERMANN et al, 1997; DEBASSIO et al, 1996; TANAPAT et al, 1999; VAN PRAAG et al, 1999; JACKSON-GUILFORD et al, 2000; EKDAHL,
2003). Em especial, no giro denteado de ratos, a neurogênese é influenciada por exercício, envolvimento ambiental, envelhecimento, esteróides, neurotransmissores glutaminérgicos e a morte natural das células neuronais (GAGE et al, 1998).
De acordo com ISGOR e SENGELAUB (1998) tem sido demonstrado que o tratamento com estrógeno durante o desenvolvimento afeta o volume das regiões de CA1 e CA3 do hipocampo. TANAPAT et al (1999) evidenciou um maior número de células marcadas com BrdU em ratas adultas em comparação com ratos. Este aumento no número de células da camada granular do giro denteado de ratas adultas é mais evidente na fase de proestro (fase de elevação nos níveis de estrógeno) do ciclo hormonal (figura II.12).
(A) (B)
Figura II.12 – (A)Estimativa do número de células marcadas com BrdU no giro denteado de
ratas e ratos adultos após dois dias de injeção; (B) Número de células marcadas com BrdU em ratas adultas fêmeas nas três fases do ciclo hormonal: diestro, proestro e estro. (TANAPAT et al, 1999).
Por meio de estudos com autoradiografia foi possível demonstrar que a maioria dos neurônios destinados ao GD são gerados dentro de um período de tempo bem definido. Mas ainda existem dúvidas sobre o pico da neurogênese e quando este processo cessa no encéfalo de roedores (ECKENHOFF e RAKIC, 1988).
Vários estudos sugerem que a neurogênese no giro denteado continua a se estender por toda a vida das espécies de roedores e que mais de 1000 novas células são geradas por dia na camada granular de roedores adultos (KAPLAN e BELL, 1983; CRESPO et al, 1986; BOSS et al, 1985). ALTMAN (1963) afirma que o aumento no volume da camada granular se deve ao aumento na proliferação de neuroblastos e este processo pode se prolongar de 3 a 11 meses depois do nascimento. KAPLAN e BELL
(1983) confirmam que a proliferação celular na camada granular do GD promove mudanças na morfologia do tecido no primeiro ano de vida dos ratos.
Em mamíferos, 85% das células da camada granular do GD são geradas no período pós-natal (ALTMAN e BAYER, 1990). De acordo com SCHLESSINGER et al (1975), o pico da neurogênese na camada granular do giro denteado de ratos ocorre nos primeiros 7 dias natal e continua com intensidade até as três primeiras semanas pós-natal. Após este período, a neurogênese continua, mas diminui drasticamente (SCHLESSINGER et al, 1975; GOULD et al, 1998; KUHN et al, 1996).
No trabalho realizado por HEATHER et al, (2005) com injeções de BrdU em ratos jovens até a meia idade foi observado um aumento na proliferação celular da camada granular do GD com 7 dias pós-natal e diminuição progressiva até 60 dias (figura II.13).
Figura II.13 – Média do número de células marcadas com BrdU do GD de ratos jovens e de
meia-idade (HEATHER et al, 2005).
A contribuição de células da região ventricular e da zona subgranular ocorre em ratos com período médio de vida de P58 e P90. (DUFFY e RAKIC, 1983). A partir de P90, a produção de células (neurônios e glia) é proveniente apenas da zona subgranular (NOWAKOWSKI e RAKIC, 1981; ECKENHOFF e RAKIC, 1983) A zona subgranular é progenitora das células granulares através de dois precursores importantes, o primeiro colabora com a proliferação de neurônios e o segundo com a de células gliais (astrócitos e oligodendrócitos).
Alguns trabalhos realizados com primatas e roedores demonstram diferenças abruptas no processo de neurogênese de ambas espécies. Isto pode ser esclarecido pela
variação na definição de adulto entre as duas espécies. O hipocampo de primatas diferencia-se do hipocampo de ratos (KAPLAN e HINDS, 1977; KAPLAN e BELL, 1984). A literatura propõe que a fase adulta de roedores é por volta dos dois meses de vida (KAPLAN e HINDS, 1977; KAPLAN e BELL, 1984)
A remodelação neuroquímica e neuroanatômica do hipocampo de ratos acontece até a vida adulta, mas estudos usando modelos de roedores adolescentes têm demonstrado um aumento na produção de axônios e sinapses durante a adolescência, isto é devido ao mecanismo natural de plasticidade do cérebro de ratos nesta etapa da vida (GIEDD et al, 1999; ANDERSEN et al, 2000; ANDERSEN e TEICHER, 2004). De acordo com HERRERA et al, 2003, a neurogênese no hipocampo de ratos diminui drasticamente da adolescência até a fase adulta. No estudo de HE e CREWS (2007) três espécies de camundongos transgênicos apresentaram aumento do número de células na camada granular do GD na fase da adolescência em comparação com a fase adulta (figura II.14).
Figura II.14 – Número de células marcadas com BrdU nas células da camada granular do giro
denteado em camundongos adultos e adolescentes de três espécies diferentes (HE e CREWS, 2007)
Neste estudo injeções de BrdU em camundongos adolescentes e adultos na camada granular do giro denteado do hipocampo mostraram um aumento no número de células dos camundongos adolescentes em comparação com os adultos (figura II.15). Aplicando outro método da imuno-histoquímica com o marcador endógeno neuronal (DCX), os camundongos apresentaram, após 30 dias da aplicação um maior número de neurônios em comparação com os de 120 dias de aplicação. (figura II.16).
Figura II.15 – Representação das células marcadas com BrdU no giro denteado do hipocampo
de camundongos. (A) hipocampo de adolescentes em 10X; (B) hipocampo de adultos em 10X; (C) hipocampo adolescentes em 60X; (D) hipocampo de adultos em 60X (HE e CREWS, 2007).
(A) (B)
Figuras II.16 – Marcação neuronal no hipocampo de camundongos. (A) após 30 dias de
aplicação; (B) após 120 dias de aplicação.
A partir de estudos de neurogênese no hipocampo de ratos adultos, tem sido proposto que a neurogênese também continua no cérebro de humanos (KAPLAN, 1985; NOTTEBOHM, 1985), e que a adição de novos neurônios pode contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos no aprendizado, memória e até mesmo na epilepsia (KAPLAN e BELL, 1984; NOTTEBOHM, 1984, 1985).
III – MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos consistiram na indução de bursts epileptiformes, utilizando o protocolo de baixo cálcio e alto potássio extracelular, nos quais foi analisado o registro eletrofisiológico, a histoquímica e a simulação computacional referente a nove faixas etárias de ratos.
III.1 – Preparação experimental para indução de atividades epileptiformes na CG do giro denteado
III.1.1 – Seleção dos animais
Para a realização do estudo foram selecionados ratas da raça wistar, nos quais foram realizados 66 experimentos, as faixas etárias foram distribuídas da seguinte forma: P09-11 ( 7 de 9, 10 e 11 dias); P21-23 ( 6 de 21, 22 e 23 dias); P35-37 ( 6 de 35, 36 e 37 dias); P49-51 ( 8 de 49, 50 e 51 dias); P70-72 ( 11 de 70, 71 e 72 dias); P91-93 (7 de 91, 92 e 93 dias); P111-113 ( 8 de 111, 112 e 113 dias); P125-127 ( 6 de 125, 126 e 127 dias); P139-141 ( 7 de 139, 140 e 141 dias).
Os animais, provenientes do Biotério da Universidade Federal de São João Del Rei, obedeceram a um ciclo claro-escuro de 12 horas (claro: 07:00-19:00), com a temperatura ambiente constante entre 21 e 22°C. Os ratos foram mantidos em gaiolas apropriadas, onde tiveram acesso livre à água e comida.
III.1.2 – Dissecação
Dois conceitos são necessários para uma boa preparação das fatias: uma técnica suave e rápida na dissecação do cérebro, a qual não deve exceder 5 minutos para a
retirada de cada hipocampo, e uma adequada acomodação das fatias em solução nutriente devidamente balanceada em constante oxigenação e sob temperatura controlada (TEYLER, 1980). A importância da oxigenação já foi ressaltada por LIPTON e WHITTINGHAM (1979), os quais verificaram que potenciais sinápticos registrados no GD do hipocampo se extinguem após a exposição das fatias a meios pouco oxigenados. NICHOLSON e HOUNSGAARD (1983) apontam também a espessura como fator limitante na oxigenação das fatias. Os cálculos da difusão do O2 sobre o tecido sugerem que as fatias devem ter no máximo 400 µm de espessura. A temperatura não tem influência tão crucial durante as preparações (DINGLEDINE et
al., 1980), mas é comum a utilização de solução semicongelada durante o procedimento,
principalmente para evitar um aumento na intensidade das atividades do tecido e, conseqüentemente, uma excitotoxicidade. Temperaturas mais elevadas, entre 34 e 36ºC, podem ter importante relação na conservação das fatias, podendo alterar suas características de morfologia e influenciar o registro das atividades.
Essas informações sugerem procedimentos indispensáveis à obtenção de fatias viáveis para o estudo in vitro.
Diferentes tipos de anestésicos podem ser utilizados e, sempre que possível, devem ser de rápida reversibilidade, evitando interferências sobre as medidas experimentais. Com esse intuito, a exemplo de outros trabalhos (GLOVELI. T. et. al., 1995 e WIESSINGER F. et. al., 2000) foi utilizado o éter etílico (comercial), que além de ser de fácil acesso, tem efeito rápido e eficaz. O éter é aplicado por inalação e produz respostas rápidas (2 min de administração são suficientes para anestesiar o animal em plano profundo).
Depois de anestesiados, os animais foram decapitados. Utilizando-se um bisturi, foi aberto o escalpo de modo a visualizar a parte superior do crânio. O osso occipital, sobre o cerebelo, foi cortado com ajuda de uma tesoura fina e pontiaguda em ratos menores de 10 semanas (P70-72). Já em ratos acima de 10 semanas utilizou-se um alicate específico para o corte da calota craniana. O corte foi então estendido mediana e lateralmente como mostrado na figura 3.1. Uma pinça foi utilizada para levantar e partir os ossos cranianos superiores que envolvem o encéfalo. Em seguida, uma espátula flexível foi inserida por sua base para separá-lo do sistema respiratório medular. Após ser cuidadosamente retirado, foi, então, depositado em um recipiente contendo solução
de perfusão (Ringer Normal – tabela 3.1) oxigenada e resfriada (0 a 2oC). A seguir, foi transferido para uma placa de Pétri contendo filtro de papel, onde foi constantemente banhado por solução normal, enquanto era dissecado com auxílio de um bisturi cirúrgico. O cerebelo foi retirado, figura III.2, itens A, B e C, e um corte mediano ficando separados os dois hemisférios, itens D e E. Enquanto um dos hemisférios foi dissecado, o outro foi mantido em solução de Ringer gelado. Com um corte inclinado separou-se a parte frontal do córtex cerebral. Utilizando micro-espátulas especiais, o tálamo foi removido, figura III.2 item F. Nesse ponto, foi possível distinguir o hipocampo que fica, em parte, coberto pelo tálamo. As micro-espátulas foram introduzidas por baixo e nas laterais do tecido, de forma bastante suave e, com movimentos laterais, pôde-se separá-lo do resto do córtex, figura III.2 itens G, H, I. O mesmo procedimento foi realizado para o outro hemisfério.
Figura III.1 – A remoção do cérebro de rato da cavidade craniana. A) abertura do escalpo; B) o
sentido de corte para a abertura do crânio; C) abertura da calota craniana; D) retirada do cérebro da cavidade craniana; E) remoção do cérebro para um Becker contendo solução nutriente resfriada. F) Materiais cirúrgicos necessários para a retirada do cérebro da
cavidade craniana e para o isolamento do hipocampo do restante do cérebro de rato. (modificado de PEREIRA, 2005).
Com o cérebro transportado para uma placa de Pétri, coberta com papel filtro, iniciou-se o procedimento de isolamento dos hipocampos. Sempre sob banho constante de toda a estrutura com solução de Ringer normal (descrita no item III.1.3), o cerebelo e os dois hemisférios cerebrais foram separados utilizando um bisturi. Para dissecação do primeiro hemisfério, manteve-se sempre o segundo em um recipiente com solução de Ringer gelada. O procedimento de dissecação foi iniciado com um corte para separação do córtex frontal, seguido do posicionamento do hemisfério sobre a face de corte. A seguir, utilizando-se duas micro-espátulas especiais para a remoção do tálamo, permitindo a visualização da estrutura hipocampal. Introduzindo, cuidadosamente, as micro-espátulas por baixo e pelas laterais, o hipocampo foi desligado do restante do córtex. O mesmo procedimento foi realizado para o outro hemisfério cerebral. Na figura III.2, são apresentadas fotos de cada etapa do procedimento descrito.
A) B) C)
E) F
D)
H) I)
G)
Figura III.2 – Preparação de fatias de hipocampo em cérebro de rato. Os itens A, B, C, D e E mostram os cortes realizados para facilitar a dissecação. No item F é mostrado um detalhe da separação do tálamo, com ajuda de micro-espátulas. Em
G, H e I o hipocampo é isolado do restante do córtex (maiores detalhes no texto) (Retirado de CARVALHO, 2003).
Após devidamente isolado, o hipocampo, com a face alveolar disposta para cima, foi levado ao fatiador, onde foi depositado sobre filtros de papel umidecidos com solução de ringer normal e gelada. Com ajuda de um pincel fino, o hipocampo foi posicionado de forma a se obter fatias em ângulos de aproximadamente 70º em relação ao eixo da fimbria. De acordo com TEYLER (1980), cortes nesse ângulo preservam as conexões intrínsecas do hipocampo (fibras mossy, Schaffer colateral e axônios da CA1) intactas, uma vez que em ratos as lamelas (fatias) estão dispostas transversalmente, com um ângulo de 70o, em relação ao eixo longitudinal do hipocampo. Após cada corte, fatias de 400 µm de espessura foram retiradas do terço médio do hipocampo e colocadas em uma câmara contendo solução de Ringer normal oxigenado à temperatura de aproximadamente 32oC. É importante que a lâmina do fatiador esteja bem ajustada, de forma que seu corte alcance metade da espessura do filtro de papel, permitindo um corte preciso das fatias. Através desse procedimento, entre 15 a 25 fatias foram conseguidas na preparação de cada hipocampo.
III.1.3 – Solução fisiológica
Para a sustentação das atividades metabólicas do tecido foi utilizada a solução de perfusão (Ringer Normal). A indução de atividades epileptiformes foi obtida elevando-se a concentração de K+ e zerando-se a concentração de Ca2+ da solução normal. No presente texto, denominaremos a segunda solução de “solução de indução” (tabela 3.1).
Tabela 3.1 – Composições das soluções de perfusão e de indução utilizadas nos experimentos com hipocampo de rato (valores em mM).
Substância Solução de Perfusão (Normal) Solução de Indução NaCl 127,0 127,0 KCl 2,0 7,0 MgSO4* 1,5 1,5 NaHCO3 26,0 26,0 KH2PO4 1,1 1,1 Glicose 10,0 10,0 CaCl2* 2,0 0,0
* sais adicionados após o ajuste do pH em 7,4
Para evitar floculação, o pH foi ajustado para 7,4, por meio de borbulhamento com carbogênio (95% O2 e 5% CO2), antes da adição de sais contendo íons divalentes. Após a adição desses, é feita a correção final para o volume perfundido e a solução é mantida continuamente borbulhada com carbogênio.
III.1.4 – Procedimento para conservação das fatias
Determinados procedimentos podem ser adotados para uma melhor conservação das fatias. Variações de temperatura, por exemplo, acima de 32o C, são críticas e devem ser evitadas ou corretamente empregadas no decorrer do experimento. Destoante à etapa de dissecação, onde foram empregadas temperaturas relativamente baixas, próximas de 0oC, o restante do experimento foi realizado em temperaturas mais elevadas, entre 31 e 34oC. Para contornar esse problema e amenizar os efeitos causados pela temperatura, preservando as características morfológicas do tecido, alguns procedimentos foram adotados.
Após o fatiamento, as fatias foram conduzidas para a câmara de perfusão, onde foram mantidas rigorosamente sob temperatura de 31,5oC, durante 40 minutos, como referenciado no item III.1.5.1. Em seguida, as mesmas foram transferidas para a câmara de interface (item III.1.5.2.), onde as atividades epileptiformes foram induzidas. A temperatura na câmara de interface foi previamente igualada à temperatura da câmara de perfusão. Um detalhe importante deve ser mencionado: como as fatias foram transferidas de um recipiente a outro, normalmente com auxílio de conta-gotas, esse instrumento deve também ser mantido à mesma temperatura, a fim de evitar choque térmico.
Iniciada a perfusão, com solução em alto K+ e zero-Ca2+, a temperatura foi elevada gradativamente até 33,5oC, ao longo de 60 min, novamente, a fim de evitar choque térmico.
Outro fator importante observado na prática experimental: ao se transferir as fatias para a câmara de interface, foi necessário elevar o nível da solução acima do nível da membrana que a sustenta. O tecido fica, então, submerso por até 15 min, antes de se iniciar o registro das atividades. Em seguida, o nível da solução foi reduzido novamente de modo a ajustá-lo ao nível da rede. Esse procedimento evita que as fatias fiquem precocemente ressecadas e acelera os efeitos da solução de interesse sobre o tecido (CARVALHO, 2003).
III.1.5 – Equipamentos utilizados para indução de atividades epileptiformes
III.1.5.1 – Câmara de perfusão
A câmara de perfusão é um recipiente intermediário para repouso das fatias. A câmara foi fabricada com conexões e tubos em PVC, os quais são arranjados formando uma estrutura em U (figura III.3). A região de maior diâmetro consiste em um compartimento subdividido por uma rede de nylon, sobre a qual as fatias descansam. Todo o sistema foi preenchido com solução normal continuamente oxigenada, com fluxo que foi estabelecido pelo borbulhamento com carbogênio, que permitiu uma perfusão suave e adequada das fatias. O pH da solução foi também mantido constante,
em torno de 7,4, devido à saturação promovida pelo carbogênio. As fatias foram mantidas submersas nessa câmara por no mínimo 40 min. Após esse período, as fatias estavam aptas ao protocolo de indução da atividade epileptiforme na câmara de interface. Solução Rede de nylon Água com temperatura controlada Entrada de carbogênio
Figura III.3 – Diagrama esquemático da câmara de perfusão montada com tubos e conexões
em PVC. A câmara é preenchida com solução de perfusão, mantida sob temperatura e oxigenação constante. As fatias são depositadas no ramo de maior diâmetro sobre uma rede de nylon.
III.1.5.2 – Câmara de Interface
A indução da atividade epileptiforme, bem como os registros, foram feitos em uma câmara de interface. Existe uma ampla variedade de câmaras de interface. A câmara utilizada nos experimentos de indução de atividade epileptiformes foi a mesma utilizada por CARVALHO, 2003. A câmara (figura III.4) consiste de dois módulos acopláveis: a cuba (figura III.5) e o banho-maria conectados a uma mesa estática . O banho-maria é composto de 4 resistores cerâmicos de 5 Ω, 20 W de dissipação, ligados em paralelo, encerrados em invólucros de vidro, e dois borbulhadores que dispersam carbogênio no interior do recipiente (figura III.4). Os resistores são submetidos a tensões contínuas até 12 V que fornecem o aquecimento da água do banho. As tensões são controladas via software desenvolvido em plataforma LABVIEW 6.1 (NATIONAL INSTRUMENTS), através de um programa desenvolvido especialmente para esse tipo
de controle. A intensidade da tensão foi calculada de acordo com a temperatura desejada. A interface, software/módulo, foi estabelecida por meio de uma placa AD/DA (modelo PCI-6071E – NATIONAL INTRUMENTS) e um módulo de controle eletrônico (vide apêndice). O equipamento é capaz de manter temperaturas constantes no entorno de 32oC. A água contida no banho-maria aquece as paredes do tubo, enrolado ao cilindro central no interior do recipiente, que conduz a solução normal para a cuba, permitindo a perfusão das fatias com a temperatura da solução devidamente controlada. Tubos de silicone conduzem o oxigênio ao interior do banho-maria. Os borbulhadores dispersam o carbogênio dentro da água, sendo assim aquecido e umidificado para, a seguir, ser direcionado sobre a face superior das fatias mantidas na cuba.
A cuba é composta por 2 cilindros e uma base em acrílico, acoplada superiormente ao banho-maria (figura III.5). O cilindro central, onde se encontra a rede de nylon para deposição das fatias, possui um volume bem reduzido, de aproximadamente 0.34 ml, permitindo que toda a solução em contato com as fatias seja constantemente renovada. O nível da solução pode ser controlado por meio de sucção com ajuda de uma bomba peristáltica (modelo PD5002 – HEIDOLPH). A base em acrílico apresenta alguns pequenos orifícios para que o carbogênio, depois de atravessar o banho maria, possa, já umidificado, atingir as fatias.
Uma tampa em forma de disco encobre o ambiente em torno das fatias, permitindo uma melhor oxigenação e contribuindo para homogeneizar a temperatura no interior da cuba. A tampa contém um orifício central que permite a inserção dos eletrodos de medida e de estimulação, bem como a exaustão do carbogênio. São comuns problemas com a condensação na superfície interna da tampa e na ponta do eletrodo de medição. Precipitações do condensado sob a tampa podem alterar a osmolaridade do meio e prejudicar a manutenção das fatias. O mesmo pode ocorrer com o eletrodo de medição. A formação de gotas de água na ponta da micropipeta, que compõe o eletrodo, prejudica a aquisição do sinal e pode até, caso venha a escorrer, lesionar localmente o tecido. Para solucionar esse problema, filtros de papel são colocados sob a tampa e enrolados nos eletrodos de aquisição de modo a conter a condensação.
101 9 2 4 5 6 8 7 3 1
Figura III.4 – Diagrama esquemático da câmara de interface (banho-maria e cuba). Em 1,
tem-se a repetem-sentação do tubo de silicone que conduz o carbogênio para o interior da câmara, em 2 , um dos dois borbulhadores de oxigênio existentes na câmara, em 3, está representada uma das quatro resistências envolvidas em envólucros de vidro, em 4 tem-se o tubo de silicone que conduz a solução até as fatias. Em 5 está repretem-sentada a cuba que pode ser vista em maiores detalhes na figura 3.5, em 6, a rede de nylon que sustenta as fatias, em 7 tem-se o tubo para sucção da solução, em 8, o terra da solução, em 9 o disco de acrílico com um orifício ao centro, que recobre a cuba e finalmente em 10 estão representadas as lentes do microscópio posicionadas ao centro da câmara de interface.
1 2 4 7 6 3 5
Figura III.5 – Esquema da cuba utilizada para indução das atividades epileptiformes. As fatias ,
em 1, são sustentadas por uma rede de nylon posicionada sobre o cilindro central representada em 2 . Em 3, tem-se a representação dos orifícios na base da cuba, que permitem que o oxigênio, depois de umidificado e aquecido, atinja as fatias, em 4, está representado o canal por onde a solução chega às fatias, em 5 , o tubo por onde ocorre a sucção da solução. Em 6 tem-se a representação do fio terra da solução, e finalmente, em 7 tem-se a representação do têrmometro que controla a temperatura da solução que chega às fatias.
III.2 – Registro do potencial extracelular sobre a CG do giro denteado do hipocampo
Para aquisição dos sinais do potencial elétrico extracelular (PE), foi utilizado um
eletrodo formado por filamentos de prata e micropipeta de vidro (modelo THINWALL, TW150F-3 – WPI). A pipeta foi estirada em um puxador de pipetas (modelo DMZ UNIVERSAL PULLER – ZEITZ-INSTRUMENTS) e preenchida com solução de NaCl 1,0 M, com impedância final de 5 a 10 MΩ, suficiente para proporcionar um baixo nível de ruído. Os filamentos de prata foram cloretados para se evitar o efeito de bateria provocado pela acumulação de cargas na interface metal-líquido. Após cloretado, o eletrodo foi conectado a uma headstage (modelo AI 402 х 50, ULTRALOW NOISE AMPLIFIER – AXON INSTRUMENTS) interligada a um amplificador (modelo CYBERAMP 380 – AXON INSTRUMENTS) para a aquisição do sinal. O programa SAE (Sistema Auxiliar de
