Dois conceitos são necessários para uma boa preparação das fatias: uma técnica suave e rápida na dissecação do cérebro, a qual não deve exceder 5 minutos para a
retirada de cada hipocampo, e uma adequada acomodação das fatias em solução nutriente devidamente balanceada em constante oxigenação e sob temperatura controlada (TEYLER, 1980). A importância da oxigenação já foi ressaltada por LIPTON e WHITTINGHAM (1979), os quais verificaram que potenciais sinápticos registrados no GD do hipocampo se extinguem após a exposição das fatias a meios pouco oxigenados. NICHOLSON e HOUNSGAARD (1983) apontam também a espessura como fator limitante na oxigenação das fatias. Os cálculos da difusão do O2 sobre o tecido sugerem que as fatias devem ter no máximo 400 µm de espessura. A temperatura não tem influência tão crucial durante as preparações (DINGLEDINE et
al., 1980), mas é comum a utilização de solução semicongelada durante o procedimento,
principalmente para evitar um aumento na intensidade das atividades do tecido e, conseqüentemente, uma excitotoxicidade. Temperaturas mais elevadas, entre 34 e 36ºC, podem ter importante relação na conservação das fatias, podendo alterar suas características de morfologia e influenciar o registro das atividades.
Essas informações sugerem procedimentos indispensáveis à obtenção de fatias viáveis para o estudo in vitro.
Diferentes tipos de anestésicos podem ser utilizados e, sempre que possível, devem ser de rápida reversibilidade, evitando interferências sobre as medidas experimentais. Com esse intuito, a exemplo de outros trabalhos (GLOVELI. T. et. al., 1995 e WIESSINGER F. et. al., 2000) foi utilizado o éter etílico (comercial), que além de ser de fácil acesso, tem efeito rápido e eficaz. O éter é aplicado por inalação e produz respostas rápidas (2 min de administração são suficientes para anestesiar o animal em plano profundo).
Depois de anestesiados, os animais foram decapitados. Utilizando-se um bisturi, foi aberto o escalpo de modo a visualizar a parte superior do crânio. O osso occipital, sobre o cerebelo, foi cortado com ajuda de uma tesoura fina e pontiaguda em ratos menores de 10 semanas (P70-72). Já em ratos acima de 10 semanas utilizou-se um alicate específico para o corte da calota craniana. O corte foi então estendido mediana e lateralmente como mostrado na figura 3.1. Uma pinça foi utilizada para levantar e partir os ossos cranianos superiores que envolvem o encéfalo. Em seguida, uma espátula flexível foi inserida por sua base para separá-lo do sistema respiratório medular. Após ser cuidadosamente retirado, foi, então, depositado em um recipiente contendo solução
de perfusão (Ringer Normal – tabela 3.1) oxigenada e resfriada (0 a 2oC). A seguir, foi transferido para uma placa de Pétri contendo filtro de papel, onde foi constantemente banhado por solução normal, enquanto era dissecado com auxílio de um bisturi cirúrgico. O cerebelo foi retirado, figura III.2, itens A, B e C, e um corte mediano ficando separados os dois hemisférios, itens D e E. Enquanto um dos hemisférios foi dissecado, o outro foi mantido em solução de Ringer gelado. Com um corte inclinado separou-se a parte frontal do córtex cerebral. Utilizando micro-espátulas especiais, o tálamo foi removido, figura III.2 item F. Nesse ponto, foi possível distinguir o hipocampo que fica, em parte, coberto pelo tálamo. As micro-espátulas foram introduzidas por baixo e nas laterais do tecido, de forma bastante suave e, com movimentos laterais, pôde-se separá-lo do resto do córtex, figura III.2 itens G, H, I. O mesmo procedimento foi realizado para o outro hemisfério.
Figura III.1 – A remoção do cérebro de rato da cavidade craniana. A) abertura do escalpo; B) o
sentido de corte para a abertura do crânio; C) abertura da calota craniana; D) retirada do cérebro da cavidade craniana; E) remoção do cérebro para um Becker contendo solução nutriente resfriada. F) Materiais cirúrgicos necessários para a retirada do cérebro da
cavidade craniana e para o isolamento do hipocampo do restante do cérebro de rato. (modificado de PEREIRA, 2005).
Com o cérebro transportado para uma placa de Pétri, coberta com papel filtro, iniciou-se o procedimento de isolamento dos hipocampos. Sempre sob banho constante de toda a estrutura com solução de Ringer normal (descrita no item III.1.3), o cerebelo e os dois hemisférios cerebrais foram separados utilizando um bisturi. Para dissecação do primeiro hemisfério, manteve-se sempre o segundo em um recipiente com solução de Ringer gelada. O procedimento de dissecação foi iniciado com um corte para separação do córtex frontal, seguido do posicionamento do hemisfério sobre a face de corte. A seguir, utilizando-se duas micro-espátulas especiais para a remoção do tálamo, permitindo a visualização da estrutura hipocampal. Introduzindo, cuidadosamente, as micro-espátulas por baixo e pelas laterais, o hipocampo foi desligado do restante do córtex. O mesmo procedimento foi realizado para o outro hemisfério cerebral. Na figura III.2, são apresentadas fotos de cada etapa do procedimento descrito.
A) B) C)
E) F
D)
H) I)
G)
Figura III.2 – Preparação de fatias de hipocampo em cérebro de rato. Os itens A, B, C, D e E mostram os cortes realizados para facilitar a dissecação. No item F é mostrado um detalhe da separação do tálamo, com ajuda de micro-espátulas. Em
G, H e I o hipocampo é isolado do restante do córtex (maiores detalhes no texto) (Retirado de CARVALHO, 2003).
Após devidamente isolado, o hipocampo, com a face alveolar disposta para cima, foi levado ao fatiador, onde foi depositado sobre filtros de papel umidecidos com solução de ringer normal e gelada. Com ajuda de um pincel fino, o hipocampo foi posicionado de forma a se obter fatias em ângulos de aproximadamente 70º em relação ao eixo da fimbria. De acordo com TEYLER (1980), cortes nesse ângulo preservam as conexões intrínsecas do hipocampo (fibras mossy, Schaffer colateral e axônios da CA1) intactas, uma vez que em ratos as lamelas (fatias) estão dispostas transversalmente, com um ângulo de 70o, em relação ao eixo longitudinal do hipocampo. Após cada corte, fatias de 400 µm de espessura foram retiradas do terço médio do hipocampo e colocadas em uma câmara contendo solução de Ringer normal oxigenado à temperatura de aproximadamente 32oC. É importante que a lâmina do fatiador esteja bem ajustada, de forma que seu corte alcance metade da espessura do filtro de papel, permitindo um corte preciso das fatias. Através desse procedimento, entre 15 a 25 fatias foram conseguidas na preparação de cada hipocampo.