NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br
S237a Assis, Girley Francisco Machado de
Avaliação laboratorial e clínica de indivíduos chagásicos tratados com benzonidazol e não tratados residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, Brasil [manuscrito] / Girley Francisco Machado de Assis - 2011.
xvii, 128 f.: il., color; grafs.; tabs.; mapas.
Orientadora: Profª. Drª. Marta de Lana.
Co-orientadora: Profª. Drª. Rosália Morais Torres.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Imunobiologia de Protozoários.
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III
COLABORADORES:
PEDRO ALBAJAR VIÑAS
Departamento de Controle de Doenças Tropicais Negligenciadas,
Organização Mundial de Saúde
JOÃO CARLOS PINTO DIAS
Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ, MG.
OLINDO ASSIS MARTINS FILHO
Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ, MG.
MARIA TEREZINHA BAHIA
Laboratório de doença de Chagas, NUPEB, UFOP.
GEORGE LUIS LINS MACHADO COELHO
Laboratório de doenças Parasitárias, UFOP.
IV
Dedico este trabalho aos meus queridos pais (Geraldo e Vilma), aos meus irmãos (Girlaine, Géferson, Geomar e George), ao meu avô (José Antônio) e a minha noiva
Fernanda que sempre apoiaram as minhas decisões. Sem a compreensão de vocês
com certeza este caminho percorrido seria muito mais tortuoso...
V
É bem melhor arriscar coisas grandiosas,
Alcançar triunfos e glórias, mesmo expondo-se à derrota, Do que formar filas com os pobres de espírito Quem nem gozam muito e nem sofrem muito,
Porque vivem nessa penumbra cinzenta Que não conhece vitória nem derrota.
Teodore Roosevelt
Vale que vale cantar
Vale que vale viver
Vale do Jequitinhonha Vale eu amo você.
VI
obrigado pelos ensinamentos científicos e de vida, pois estes 10 anos de convivência foram muito gratificantes para a minha formação. Obrigado pelo incentivo, apoio permanente, pelo carinho, pela compreensão e pela confiança em mim depositada durante todos estes anos.
À Profa Rosália Morais Torres grande companheira e amiga em diversas excursões a Berilo. Dona de um coração gigantesco e apaixonada com o que faz. Muito obrigado por acreditar neste projeto e pelas infinitas conversas e apoio essencial para a conclusão deste trabalho.
Ao Dr. Pedro Albajar-Viñas pela dedicação e apoio incondicional prestado ao Projeto de Berilo. Muito obrigado pelos ensinamentos que com certeza levarei por toda a minha vida.
Ao Dr. João Carlos Pinto Dias pelo apoio, pelos exemplos de simplicidade, grandiosidade e profissionalismo.
Ao Dr. Olindo Assis Martins Filho pelas brilhantes idéias e por abrir as portas do seu laboratório quando sempre precisamos.
À Profa Maria Terezinha Bahia pela boa convivência nestes 10 anos, pelas conversas e apoio sempre que necessário.
Ao Prof. George Luis Lins Machado Coelho pela grande contribuição no desenho dos estudos e análises dos dados.
Ao Prof. Evandro Marques de Menezes Machado pelas conversas, atenção, apoio e ensinamentos. Exemplo de tranqüilidade e sabedoria.
Ao Prof. André Talvani pela amizade, convivência e boas idéias compartilhadas.
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nossas infinitas viagens não medindo esforços, em especial ao Rogélio, José Roberto, José Raimundo, Seu Paulo, Marcinho e Zezinho.
Ao padre José Nuno pela garra, dedicação, apoio e atenção. Pessoa fundamental para a manutenção dos projetos e exemplo de luta em pró dos pacientes chagásicos deste município.
Ao atual prefeito (Lázaro) e o secretário de saúde (Fábio) que receberam o projeto de braços abertos, apoiando todas as nossas iniciativas.
A todos os agentes municipais de saúde que sempre contribuíram para o bom funcionamento do serviço. Sem a ajuda de vocês não teríamos chegado até aqui.
A todas as pessoas de Berilo que contribuíram de diversas maneiras para o bom andamento do projeto, em especial a Elizabeth (pousada) e Nenem (restaurante).
A todos os funcionários da secretaria municipal de saúde, hospital municipal e equipes do PSF que sempre nos ajudaram no agendamento dos pacientes.
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AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao grande e eterno amigo Cláudio Waldete (in memoriam), vulgo Ioiô, que me recebeu em Berilo de braços abertos, apoiando todas as nossas iniciativas.
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Tabela I - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, segundo o critério clássico de cura (dois testes sorológicos negativos) ou o critério de três testes sorológicos negativos. ... 52
Tabela II - Idade, sexo, forma clínica (1997 – 2006 – 2010) e resultado dos métodos de hemocultura e PCR dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há 13 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 63
XII
Figura 1 - Divisão das mesorregiões e localização do município de Berilo no Estado de Minas Gerais. ... 34
Figura 2 - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol, há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, segundo a idade antes do tratamento e tempo pós-tratamento. ... 50
Figura 3 - Reatividade na sorologia convencional (ELISA, IFI e HAI) dos 94 pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 51
Figura 4 - Representação individual da reatividade dos soros de pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos, categorizados pelo critério clássico de cura e três testes sorológicos negativos versus rec-ELISA e FC-ALTA. TNC= tratado não curado, TEA= tratado em avaliação e TC= tratado curado. ... 53
Figura 5 - Distribuição dos pacientes chagásicos considerados tratados curados (TC) segundo o critério clássico de cura e o critério mais rigoroso (três testes negativos) frente aos resultados da sorologia alternativa. ... 55
Figura 6 - Percentuais de resultados positivos para a técnica de hemocultura e PCR realizada em amostras de sangue coletadas dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais 10 anos, categorizados segundo o critério de cura clássico e o critério de três testes sorológicos negativos. ... 56
Figura 7 - Percentuais de positividade da técnica de PCR em amostras dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há mais de 10 anos residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 57
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Figura 9 - Percentuais das formas clínicas encontradas nos pacientes chagásicos tratados há mais de 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 58
Figura 10 - Percentuais de formas clínicas dos pacientes chagásico tratados com benzonidazol há pelo menos 10 anos, categorizados em tratados não curados (TNC), tratados em avaliação (TEA) e tratados curados (TC) segundo o critério mais rigoroso (três testes sorológicos negativos). ... 59
Figura 11 - Distribuição dos pacientes chagásicos tratados e tratados curados (TC) pelo critério cura de três testes sorológicos negativos por faixa etária quando tratados (A) e por tempo pós-tratamento (B). ... 60
Figura 12 - Resultados das técnicas de hemocultura e PCR realizadas em pacientes chagásicos tratados com benzonidazol há pelo menos 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. POS= positivo NEG= negativo ... 61
Figura 13 - Absorbância de soros dos pacientes chagásicos obtidos antes do tratamento (AT – 1997), nove anos (PT – 2006) e treze anos (PT – 2010) pós-tratamento avaliados pelo teste de ELISA “in house” (diluição do soro 1:80). ... 62
Figura 14 - Percentuais de evolução clínica geral (A, B e C) e anual (D, E e F) dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol avaliados nos períodos de 1997 – 2006, 2006 - 2010 e 1997 – 2010. ... 64
Figura 15 - Percentuais de positividade da técnica de hemocultura e PCR entre os pacientes chagásicos tratados (CHt) e não tratados (CHnt) residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 66
Figura 16 - Absorbância dos soros dos pacientes chagásicos antes do tratamento e de seus respectivos controle e treze anos depois avaliados pelo teste de ELISA (A) e estratificados segundo a forma clínica (B). ... 68
XIV
AT – Antes do tratamento
BRD – Bloqueio de ramo direito BZ – Benzonidazol
CARD/DIG – Forma cardíaca ou digestiva CCC – Cardiopatia Chagásica Crônica
dATP 2’ - Desoxinucleotídeo de Adenosina-5’-trifosfato DCh – doença de Chagas
dCTP 2’ - Desoxinucleotídeo de Citocina-5’-trifosfato dGTP 2’ - Desoxinucleotídeo de Guanina-5’-trifosfato DNA – Ácido desoxirribonucléico
dNTP’s 2’ - Desoxinucleotídeos-5’-trifosfato DO – Densidade Óptica
dTTP 2’ - Desoxinucleotídeo de Timina-5’-trifosfato ECG – Eletrocardiograma
ELISA – “Enzime-linked immunosorbent assay” FC – Forma cardiaca
FC-ALTA – “Anti-live trypomastigotes antibody by flow-cytometry FD – Forma digestiva
FI – Forma indeterminada
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz FM – Forma mista
HAI – Hemaglutinação indireta HC – Hemocultura
ICT - Índice Cardiotorácico IFI – Imunofluorescência indireta IgG – Imunoglobulina G
kDa – quilodalton
LAFEPE – Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco LIT – “Liver infusion triptose”
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NFX – Nifurtimox
OMS – Organização Mundial de Saúde PBS – “Phosphate buffer solution”
PCR – Reação em cadeia da polimerase
PPFP – Percentual de parasitos fluorescentes positivos PT – Pós-tratamento
Rec-ELISA – ELISA recombinante Rx – Raio-X
SFB – Soro fetal bovino
SNA – Sistema Nervoso Autônomo TC – Tratados curados
TEA – Tratados em avaliação TNC – Tratados não curados
UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais UFOP – Universidade Federal de Ouro Preto WHO – “World Health Organization”
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1 - INTRODUÇÃO...1
1.1 – Aspectos gerais da infecção pelo Trypanosoma cruzi ...2
1.2 - Aspectos clínicos da infecção pelo Trypanosoma cruzi ...3
1.3 - Diagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi ...8
1.3.1 – Testes sorológicos ... 12
1.4 - Tratamento etiológico da infecção pelo Trypanosoma cruzi ... 16
1.5 - Critérios de cura na doença de Chagas ... 20
1.6 - Doença de Chagas no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG. ... 23
2 - OBJETIVOS ... 27
2.1 – Objetivo geral ... 28
2.2 – Objetivos Específicos ... 28
3 - CASUÍSTICA E MÉTODOS ... 32
3.1 – Características da área de estudo ... 33
3.2 – População em estudo ... 34
3.3 – Avaliação laboratorial ... 35
3.3.1 – Métodos parasitológicos ... 36
3.3.2 – Testes sorológicos convencionais ... 38
3.3.3 – Testes sorológicos alternativos ... 40
3.4 – Critério de cura ... 42
3.5 – Avaliação Clínica ... 43
3.5.1 – Avaliação Clínica – casuística completa ... 43
3.5.2 – Avaliação Clínica – casuística parcial ... 43
3.5.3 - Avaliações dos pacientes nove e treze anos após tratamento etiológico... 46
3.6 – Análise Estatística... 47
4 - RESULTADOS ... 48
4.1 – Avaliação da efetividade terapêutica (casuística completa) ... 49
XVII
4.1.2 – Avaliação laboratorial ... 50
4.1.4 - Idade quando tratado e tempo pós-tratamento versus cura ... 59
4.2 – Efetividade terapêutica e evolução clínica (coorte descritiva de pacientes tratados) ... 60
4.2.1 – Avaliação laboratorial ... 60
4.2.3 – Avaliação clínica ... 62
4.3 - Estudo de intervenção ... 65
4.3.1 - Avaliação laboratorial ... 65
4.3.2 – Avaliação clínica ... 69
5 - DISCUSSÃO ... 70
5.1 – Avaliação da efetividade terapêutica (casuística completa) ... 71
5.2 - Efetividade terapêutica e evolução clínica em parte da casuística: coorte descritiva de pacientes tratados (n=29) ... 81
5.3 – Estudo de intervenção: parte da casuística ... 85
6 - CONCLUSÕES ... 90
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 93
8 - ANEXOS ... 115
Anexo I... 116
Anexo II... 117
Anexo III ... 125
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1.1 – Aspectos gerais da infecção pelo Trypanosoma cruzi
A Tripanossomíase Americana resulta da infecção de várias espécies de mamíferos pelo protozoário Trypanosoma cruzi (CHAGAS, 1909) que pertence à família Trypanosomatidae (ordem Kinetoplastida). O nome doença de Chagas (DCh) para a doença humana homenageia seu descobridor, o médico e cientista brasileiro Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas, que entre 1907 e 1909, trabalhava no controle de um surto de malária no município de Lassance, em Minas Gerais, durante a construção da estrada de ferro Central do Brasil. Chagas percebeu que muitas pessoas daquela região apresentavam uma doença até então desconhecida e descobriu seu agente etiológico, o vetor, os reservatórios silvestres descrevendo ainda os efeitos da doença no organismo humano (CHAGAS, 1909; 1911). Já em 1911 ele antecipava as conseqüências sociais da doença e conclamava as autoridades para que considerassem a endemia como um problema do Estado.
Após cem anos de sua descoberta, a doença de Chagas ainda constitui um dos sérios problemas de saúde pública da América Latina. A infecção humana apresenta ampla distribuição no continente americano, sendo conhecida a existência de vetores da doença desde o sul dos Estados Unidos até Argentina (MILES et al., 2004). A doença ocorre em toda a América Latina, mas as manifestações clínicas e características epidemiológicas variam de uma região endêmica para outra, assim como as taxas de prevalência, a linhagem do parasita, os vetores e os hospedeiros.
Após a implementação de programas de controle em vários países, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estima uma prevalência de infecção pelo T.
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Um marco de considerável relevância foi assumido pelos ministros de saúde dos países do Cone Sul (Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Paraguai e Uruguai) reunidos em Brasília, em julho de 1991, onde aprovaram a Iniciativa Internacional de Controle da DCh. Esta iniciativa apresentava como objetivos a eliminação da infestação domiciliar por Triatoma infestans e interrupção de transmissão de T. cruzi por via transfusional (SCHOFIELD & DIAS, 1999; MONCAYO, 1999). Este exemplo foi seguido pelos países do Pacto Andino (Colômbia, Equador, Peru e Venezuela) e da América Central (El Salvador, Guatemala, Honduras e Nicarágua) a partir de 1997 (WHO, 1997; MONCAYO, 1999). A extensão desta iniciativa para outras áreas foi acompanhada de adaptações frente a realidades epidemiológicas locais (MONCAYO, 2003). Vale ressaltar que a Iniciativa dos países do Cone Sul das Américas não deve ser entendida como o marco inicial de todo o controle da DCh na sub-região, pois vários países já tinham um programa de controle antes mesmo da iniciativa.
A transmissão da doença de Chagas por vetores domiciliados e/ou transfusão sanguínea foi interrompida no Uruguai em 1997, no Chile em 1999 e no Brasil em 2006. No Brasil, 80% da área endêmica está sob vigilância epidemiológica, com taxas de infestação domiciliar por triatomíneos inferior a 5%. Da mesma forma, é observada uma forte redução da infecção entre doadores de sangue (MORAES-SOUZA, 1999; MONCAYO e SILVEIRA, 2009), nos casos de transmissão congênita (GONTIJO et al., 2009) e entre escolares (7-14 anos) como demonstrado pelo nosso grupo em trabalhos realizados nos municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas (BORGES et al., 2006) e em outras regiões do país (SILVEIRA & VINHÃES, 1999).
1.2 - Aspectos clínicos da infecção pelo Trypanosoma cruzi
Carlos Chagas definiu duas fases evolutivas na doença: aguda e crônica e fez a observação sobre o evidente contraste entre a elevada prevalência de casos crônicos frente à pequena incidência de casos agudos (CHAGAS, 1911).
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exame direto (LARANJA, 1953). O sinal de porta de entrada é geralmente uma lesão inflamatória da pele com uma formação cutânea ligeiramente saliente, arredondada, com alguns centímetros de diâmetro, eritematosa, dura, quente e circundada por edema elástico, assemelhando-se a um furúnculo que não chega à supuração, denominada chagoma de inoculação (MAZZA e FREIRE, 1940). Quando a porta de entrada se dá na região ocular, forma-se o sinal de Romaña (ROMAÑA, 1935) caracterizado por edema bipalpebral unilateral, elástico e indolor, de início geralmente brusco e coloração róseo-violácea das pálpebras. Depois que Romaña descreveu o sinal que leva o seu nome, individualizando-o, conceituando-o e realçando seu valor diagnóstico, difundiu-se mais o reconhecimento de casos agudos.
A fase aguda da doença é inaparente ou oligossintomática na grande maioria dos casos, com manifestações clínicas diversas tais como: febre, edema, hipertrofia dos linfonodos, hepatomegalia, esplenomegalia e insuficiência cardíaca. Casos graves são, geralmente, associados às crianças menores de dois anos de idade, com quadro de morbi-mortalidade mais intenso, representado por miocardite e meningoencefalite aguda (BRENER, 1992) e morte entre 1 a 45% dos casos (DIAS, 1984). O prognóstico da fase aguda da doença de Chagas depende da idade do paciente, bem como do tipo e da intensidade das manifestações. Após a fase aguda, o indivíduo evolui naturalmente para a fase crônica, caracterizada pela dificuldade de detecção do parasito no sangue periférico, desaparecimento das manifestações clínicas, desaparecimento progressivo de IgM e elevação dos anticorpos específicos da classe IgG.
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longo período assintomático que pode durar por toda a vida. Entretanto, mesmo após um longo período assintomático, 25% dos indivíduos podem desenvolver a forma cardíaca da doença de Chagas, 6% a forma digestiva e 3% podem sofrer envolvimento do sistema nervoso periférico (COURA 1983, 1985; PEREIRA 1985; MONCAYO, 1999).
A maioria dos casos agudos não tratados evolui para a forma clínica indeterminada, assintomática. De acordo com os critérios estabelecidos na I Reunião de Pesquisa Aplicada em doença de Chagas (1984), esta fase é caracterizada pela positividade sorológica e/ou parasitológica para T. cruzi, ausência de sintomas e/ou sinais da moléstia, eletrocardiograma convencional normal e estudos radiológicos do coração, esôfago e cólon normais. Na maioria das vezes, os indivíduos chagásicos portadores desta forma clínica da doença desconhecem a presença da infecção e apresentam bom prognóstico a médio e longo prazo, mas devem ser acompanhados regularmente (MACÊDO, 1997). Embora apresentem bom prognóstico, sabe-se que cerca de 2 – 5% desses pacientes evoluem anualmente para a forma cardíaca e/ou digestiva (MACÊDO, 1980; MANZULLO et al., 1982; DIAS, 1989; CASTRO et al., 1994). Entretanto, quando exames propedêuticos mais aprimorados, como a monitorização eletrocardiográfica contínua com o sistema Holter, teste ergométrico e ecocardiograma são executados, uma parcela de indivíduos nesta forma da doença apresentará alguma alteração (RASSI et al., 1992; DIAS, 1996).
A forma cardíaca, por sua vez, é responsável pela maioria dos óbitos decorrentes da infecção chagásica, sendo considerada a forma clínica mais grave da infecção pelo T. cruzi. Em áreas endêmicas, a maioria dos casos de cardiopatia é atribuída à tripanosomíase. Chagas em 1922, já descrevia a cardiopatia chagásica crônica (CCC) como uma característica especifica da Tripanossomíase Americana. Em colaboração com VILLELA descreveu as alterações cardíacas essenciais e as principais manifestações clínicas desta forma da doença (CHAGAS e VILLELA, 1922).
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inflamatório ativo. A hipertrofia, dilatação e alteração da arquitetura do músculo cardíaco induzem ao aumento do tamanho do coração caracterizado pela cardiomegalia. Em casos avançados de cardiomegalia, fenômenos tromboembólicos e sinais de congestão passiva são os principais achados patológicos. O aneurisma cardíaco apical é um achado freqüente e bastante característico da cardiopatia chagásica crônica (WHO, 2002).
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A partir da criação do Centro de Estudos da Moléstia de Chagas em Bambuí, em 1943, vários pesquisadores se dedicaram a mostrar a importância social da cardiopatia chagásica crônica (CCC). Importantes estudos clínico-epidemiológicos para avaliação da morbidade e a evolução da doença foram realizados no Brasil e em outros países do Cone Sul. Merece destaque o inquérito eletrocardiográfico realizado no Brasil com o objetivo de avaliar a prevalência da CCC, realizado por MACÊDO et al. (1982). Dados preliminares deste estudo permitiram estimar uma prevalência de alterações eletrocardiográficas entre os soropositivos de 37,4%. Foi possível também verificar uma maior prevalência de alterações eletrocardiográficas nos Estados de Minas Gerais, Bahia, Goiás e Piauí. Em outros estados como Rio Grande do Sul, não foram encontradas diferenças entre as freqüências de alterações eletrocardiográficas entre indivíduos chagásicos e não chagásicos. DIAS (1982) reexaminando após 27 anos, pacientes com quadros agudos conhecidos verificou uma associação significativa entre os quadros agudos clinicamente mais graves e a presença de ECG alterados. Entre outros achados, o autor chama a atenção para o caráter precoce e progressivo do bloqueio de ramo direito (BRD), que surge, em média 15 anos após a infecção, mas algumas vezes já está presente depois do primeiro ano da fase aguda.
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Vale a pena ressaltar que certa proporção de chagásicos crônicos apresenta a forma mista da doença que corresponde à associação da forma cardíaca e digestiva (REZENDE, 1997). Não se admite, atualmente, que exista a forma crônica nervosa da doença devido à ausência de evidências de um substrato anátomo-patológico que a justifique. Esta forma foi admitida naqueles indivíduos que apresentavam manifestações neurológicas diversas e, eventualmente, déficit mental, alterações que foram atribuídas a seqüelas da meningoencefalite da fase aguda (VIEIRA, 1966; QUEIROZ, 1973). HOFF et al. (1978) mostraram que a presença de T. cruzi pode ser detectada no líquido cefalorraquidiano na maioria dos pacientes com a forma aguda da doença de Chagas, mesmo na ausência de sinais clínicos de meningoencefalite. Esta invasão do sistema nervoso pelo T. cruzi pode ser, portanto, muito freqüente e silenciosa, restando saber mais e melhor sobre as suas seqüelas, e se de fato existem.
1.3 - Diagnóstico da infecção pelo Trypanosoma cruzi
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portadores da infecção. Para melhorar a sensibilidade e especificidade podemos utilizar de algumas estratégias, como empregar mais de um teste, repetir coleta de material, variar os valores de ponto de corte (cut-off), utilizar antígenos recombinantes e peptídeos sintéticos. Para isto, é necessário conhecer o objetivo do diagnóstico laboratorial para que as intervenções e/ou ajustes sejam bem conduzidas. Em relação aos métodos utilizados no diagnóstico da infecção pelo T. cruzi, os parasitológicos são de extrema especificidade (100%), pois o agente etiológico é direta ou indiretamente demonstrado. No entanto, esses testes apresentam baixa sensibilidade na fase crônica. Já os métodos sorológicos apresentam alta sensibilidade (95-100%) com a desvantagem de menor especificidade (92-98%), revelando assim a probabilidade e não a certeza do diagnóstico, já que temos as eventuais reações cruzadas, principalmente com Leishmania.
O diagnóstico parasitológico na fase aguda da doença de Chagas é facilmente realizado pela comprovação direta das formas tripomastigotas do T. cruzi em amostras de sangue examinado entre lâmina e lamínula. Devido à grande quantidade de parasitos circulantes nesta fase da doença, podemos utilizar diversos métodos diretos para a observação, tais como: exame a fresco, esfregaço sanguíneo, gota espessa, micro-hematócrito e técnica de concentração de Strout. Na fase crônica, devido à baixa parasitemia, os parasitos podem ser detectados utilizando métodos parasitológicos indiretos, tais como: hemocultura (HC), xenodiagnóstico e reação em cadeia da polimerase (PCR). Estes métodos não estão disponíveis em laboratórios de análises clínicas comuns, pois são métodos extremamente laboriosos, demorados, requerem equipamentos sofisticados e apresentam altos custos, sendo realizados apenas em centros de pesquisas. Apesar de serem extremamente específicos, os métodos parasitológicos apresentam baixa sensibilidade principalmente nos pacientes que se encontram na fase crônica da infecção (CHIARI et al., 1989; GALVÃO et al., 1993).
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Estes resultados estimularam outros pesquisadores como MOURÃO & MELLO (1975) que encontraram positividade de 45% e CHIARI & DIAS (1975) que encontraram positividade de 43,7%. O sucesso alcançado foi devido a modificações na técnica, como a retirada de plasma contendo anticorpos, coleta de maior volume (30mL) e o processamento a 4˚C (CHIARI et al., 1989; LUZ et al., 1994). Vários autores têm demonstrado também que quando a hemocultura é repetida duas ou três vezes no mesmo paciente, coletas seriadas, os resultados em termos de positividade aumentam de maneira considerável (CHIARI et al., 1989; LUZ et al., 1994; CASTRO et al., 2002).
O xenodiagnóstico foi descrito inicialmente por BRUMPT em 1914, sofrendo modificações sucessivas visando otimizar os resultados (SCHENONE et al., 1968; CERISOLA et al., 1974). Consiste basicamente na alimentação de ninfas do triatomíneo, livres de infecção, com sangue do paciente. Caso o parasito esteja presente, o mesmo multiplicará no tubo digestivo do triatomíneo sendo eliminado nas fezes e urina das ninfas examinadas 30 e 60 dias após o repasto sanguíneo. Pode ser natural, quando os triatomíneos são alimentados diretamente na pele do paciente, ou artificial, quando os triatomíneos são alimentados com o sangue coletado do paciente, mantido com anticoagulante até o momento do repasto. O xenodiagnóstico artificial tem sido cada vez mais empregado, com resultados equiparáveis ou melhores que o xenodiagnóstico natural (SANTOS et al., 1995; PINEDA et al., 1998; SILVA et al., 1998), sendo muito utilizado em caso de pacientes hospitalizados (onde não podemos entrar com triatomíneos), no caso em que indivíduos hiperalérgicos apresentem reações adversas e/ou recusa por parte dos mesmos. A positividade do xenodiagnóstico em pacientes chagásicos tem apresentado cifras em torno de 13 até 58.5%, com exame único, e depende da região, da quantidade de ninfas utilizadas e da espécie do triatomíneo aplicado (CERISOLA et al., 1974; BORGES e COURA, 1987). Outros autores têm demonstrado que quando este exame tem sido repetido, empregando uma série de aplicações, a taxa de positividade aumenta consideravelmente (COURA et al., 1991; CASTRO et al., 1993).
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diagnóstico devido à sua grande capacidade em detectar quantidades ínfimas de DNA (MOSER et al., 1989; ÁVILA et al., 1991, 1993; RUSSOMANDO et al., 1992; BRITTO et al., 1993; WINCKER et al. 1994; GOMES et al., 1998; CAMPOS et al., 2002). A aplicação da hibridização para detecção de DNA, amplificado pela PCR no sangue, tem demonstrado aumento na sensibilidade da técnica (SILBER et al., 1997; GOMES et al., 1998). O seu emprego como diagnóstico alternativo tem contribuído, por exemplo, na elucidação de casos com sorologia convencional discordante e controle pós-terapêutico (BRITTO et al., 1995; SILVEIRA et al. 2000, SOLARI et al. 2001, GALVÃO et al. 2003; SCHIJMAN et al., 2003; ZULANTAY et al., 2004; BRITTO, 2009). Atualmente, a técnica de PCR tem sido recomendada como complementar para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi devido à sua maior sensibilidade em relação aos métodos parasitológicos convencionais (MS, 2005). Assim como os métodos parasitológicos indiretos, xenodiagnóstico e hemocultura, os resultados obtidos pela técnica de PCR são bastante variáveis. Estudos realizados por diferentes autores têm demonstrado variações de 45 a 100% na sensibilidade da PCR em sangue de pacientes chagásicos crônicos quando comparados aos testes sorológicos (ÁVILA et al., 1993; WINCKER et
al., 1994; GOMES et al., 1998). Essas diferenças parecem depender dos iniciadores utilizados, do volume de sangue coletado, da origem geográfica dos indivíduos estudados, da faixa etária, dos níveis parasitêmicos, do método de extração de DNA utilizado e também de características genéticas das cepas do parasito (CASTRO et al., 2002).
Recentemente foi realizado um Workshop & Simposium em Buenos Aires, Argentina, patrocinado pela WHO-TDR e com a presença de diversos pesquisadores da América Latina e Europa, com o objetivo de padronizar e validar o uso da reação em cadeia da polimerase para detecção da infecção pelo Trypanosoma cruzi em amostra de sangue (TDR/WHO, 2008, SCHIJMAN et al., 2011).
O diagnóstico na fase crônica da DCh é realizado freqüentemente após suspeita clínica e/ou evidências epidemiológicas e confirmado pela presença de anticorpos
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imunofluorescência por citometria de fluxo (FC-ALTA) pesquisando os anticorpos análogos ao anticorpos líticos e denominados anticorpos anti-tripomastigota vivo (MATINS-FILHO et al., 1995).
Nos dias atuais, a maioria dos pacientes se encontra na fase crônica da infecção, onde a parasitemia é muito baixa, sendo assim os métodos sorológicos são os de primeira escolha para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi, sendo os mais econômicos, rápidos e eficazes. Mesmo na ausência do agente etiológico, após tratamento, os anticorpos específicos se encontram em concentrações elevadas durante vários meses ou anos em função do tempo de infecção do paciente. Por outro lado, temos a existência de reações cruzadas, pelas quais um estímulo antigênico similar, embora não idêntico, pode gerar anticorpos que sejam detectados por diferentes métodos utilizados proporcionando assim resultados falsos positivos. Esta situação pode ser observada em infecções concomitantes ou exclusivas com parasitos similares antigenicamente, como são as leishmanias e outros tripanosomatídeos. Diante do exposto, podemos perceber que embora a sorologia seja o método de escolha para o diagnóstico laboratorial, ela apresenta algumas limitações, inerentes à sua própria natureza.
Para assegurar o melhor desempenho dos testes sorológicos, a WHO (1991) preconiza a utilização de duas técnicas sorológicas de princípios diferentes para estabelecer o diagnóstico da infecção por T. cruzi.
1.3.1 – Testes sorológicos
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revelada através da leitura em espectrofotômetro indica a concentração de anticorpos existentes na amostra de soro avaliada.
O desempenho de diferentes conjuntos diagnósticos existentes no mercado para o teste imunoenzimático foi objeto de avaliação, obtendo-se sensibilidade de 97,7 a 100% e especificidade de 93,3 a 100% (ASTORGA et al., 1990; OELEMANN et al., 1998; CABALLERO et al., 2007).
O antígeno mais utilizado na sensibilização de placas é proveniente de extrato bruto de formas epimastigotas de cepa Y (mantidas em meio LIT), porém outros antígenos recombinantes, peptídeos sintéticos e antígenos semi-purificados estão sendo empregados atualmente revelando bons resultados de sensibilidade e especificidade (MENDES et al., 1997; UMEZAWA et al., 1999; FERREIRA et al., 2001; SILVEIRA et al., 2001; UMEZAWA et al., 2004)
O teste de IFI é utilizado universalmente para o diagnóstico sorológico de diversas doenças infecciosas desde 1950. Permite, com o auxílio de microscópio com luz ultravioleta e o conjugado de anticorpo anti-IgG humano com isotiocianato de fluoresceína para as diferentes doenças, com variação apenas do antígeno a ser utilizado (FIFE & MUSCHEL, 1959). Este teste foi estabelecido para o diagnóstico da doença de Chagas a partir dos trabalhos de padronização da técnica realizados por CAMARGO (1966). A IFI requer maior número de passos que o teste de HAI, assim como mais reagentes, aumentando as possibilidades de erros técnicos. A leitura é subjetiva, como no teste de HAI, sendo extremamente importante o equipamento de leitura, que deve estar bem ajustado. A grande vantagem é a extrema sensibilidade que o teste apresenta, proporcionando assim a visualização de títulos elevados de anticorpos nos soros da população infectada.
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variedades descritas de HAI, utilizando hemácias de diferentes espécies (humana, de aves, de carneiro, etc), assim como métodos de sensibilização e origem dos antígenos. No Brasil, o antígeno que tem sido comumente empregado é feito com a cepa Y, enquanto que na Argentina, com a cepa Tulahuen. Outra vantagem deste teste é a sua simplicidade de execução. Este teste aproxima-se do ideal devido à facilidade de execução, mas apresenta como limitação a sensibilidade, algo menor que a dos outros testes, motivo pelo qual sempre deve ser acompanhado de uma segunda prova, de maior sensibilidade, como o teste IFI ou ELISA.
Alguns trabalhos demonstram a dualidade de anticorpos em pacientes chagásicos crônicos infectados por T. cruzi (KRETTLI & BRENER, 1976; 1982). Os soros desses pacientes reconhecem epítopos de tripomastigotas vivos, sendo estes anticorpos protetores, denominados também de anticorpos funcionais ou líticos. Eles são identificados pelo teste de lise mediada pelo complemento (LMCo) que simula o mecanismo de resposta imune humoral fundamental no controle da parasitemia no indivíduo chagásico crônico. Os outros anticorpos não são protetores, não aderem aos epítopos da membrana dos tripomastigotas vivos, sendo somente detectados pela sorologia convencional. Com estas peculiaridades, foi possível estabelecer um critério de cura para animais ou pacientes baseado na pesquisa de anticorpos líticos pelo teste de LMCo (KRETTLI & BRENER, 1982).
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generalizada e rotineira deste método como ferramenta para o diagnóstico e controle de cura.
MARTINS-FILHO et al., (1995) introduziram a imunofluorescência indireta através da citometria de fluxo na tentativa de substituir a LMCo principalmente devido ao fato da LMCo ser uma técnica muito trabalhosa, que oferece risco ao operador e de leitura subjetiva. A citometria de fluxo é menos trabalhosa, apresenta maior sensibilidade, praticidade e maior segurança na leitura, além de não necessitar da adição de Complemento para a execução da técnica. Esta técnica foi em seguida validada em relação à técnica de LMCo em um estudo duplo-cego com 94 amostras de soro codificadas de pacientes chagásicos não tratados, tratados em diferentes fases da DCh (aguda, subaguda e crônica) classificados como tratados curados, tratados não curados e tratados sob avaliação. Os resultados obtidos mostraram alta sensibilidade para detecção de anticorpos anti-tripomastigota vivo pela citometria de fluxo (MARTINS-FILHO et al., 2002), confirmando os dados de MARTINS-FILHO et al. (1995) que sugerem o uso desta técnica principalmente no monitoramento da eficácia do tratamento. A citometria de fluxo é uma técnica de análise automatizada através da qual uma única partícula pode ser caracterizada física e bioquimicamente em meio líquido. A caracterização inclui tamanho, granulosidade (ou complexidade interna) e intensidade da fluorescência. Todos esses parâmetros podem ser detectados simultaneamente, medidos, armazenados e analisados no computador sendo visualizados na forma de um fluorograma. Esse método apresenta uma grande versatilidade, uma vez que permite o desenvolvimento de estudos que empregam tanto formas tripomastigotas vivas quanto formas epimastigotas fixadas (CORDEIRO et al., 2001; VITELLI-AVELAR, 2007).
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1.4 - Tratamento etiológico da infecção pelo Trypanosoma cruzi
Pouco progresso tem sido obtido no tratamento das pessoas infectadas pelo T. cruzi embora a incidência de novas infecções tenha diminuído em todo o continente Sul Americano (URBINA, 2001, MONCAYO, 2003). Apesar do grande esforço das autoridades sanitárias em conter a transmissão da doença de Chagas por via vetorial (com o uso de inseticidas de ação residual, que promoveram uma drástica diminuição na densidade triatomínica) e por via transfusional (DIAS, 1994), existe ainda um grande número de indivíduos infectados, principalmente na América Latina, que necessitam de diagnóstico, manejo clínico adequado e eventualmente tratamento etiológico (LUQUETTI, 1997; BLANCO et al., 2000).
O tratamento etiológico da doença de Chagas já ultrapassou a fase experimental e a sua aplicação clínica permitiu ao médico diante do paciente com doença de Chagas, assumir uma nova atitude, abandonando a prática de mero espectador de um fenômeno sabidamente conhecido, a evolução natural da doença, para tentar modificar esta evolução mediante o uso de um quimioterápico ativo (CANÇADO, 1997). No entanto, o problema ainda não está resolvido. Existem sérias dificuldades a vencer, a começar pela alta toxicidade dos medicamentos ativos e a incerteza ainda reinante na apreciação do grau de eficiência terapêutica na fase crônica da doença.
Os primeiros compostos empregados para o tratamento da doença de Chagas não apresentaram resultados efetivos contra o parasito, como os compostos de arsênico, tártaro emético e cloreto de mercúrio, empregados experimentalmente por MAYER & ROCHA LIMA (1912,1914). A primeira tentativa de tratamento etiológico em humano foi realizada por SALVADOR MAZZA (1937) utilizando um derivado quinolínico (Bayer 7602). Outros compostos como os derivados de bismuto (STEIN, 1933) e bisquinaldinas (JENSCH, 1937) foram testados em camundongos, mas não apresentaram efeitos tripanosomicida.
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vários antibióticos e alguns nitrofuranos (BRENER, 1968; CANÇADO, 1968), mas nenhum composto se revelou eficaz.
BRENER (1968) realizou uma avaliação experimental criteriosa de várias drogas “in vivo” e “in vitro” contra T. cruzi, registrando 27 compostos e mais de 30 antibióticos (ensaiados entre 1912 e 1962) que foram inativos. Dentre os compostos, alguns apresentavam um efeito supressor na parasitemia e na letalidade da doença, mas não proporcionavam cura parasitológica. Segundo BRENER (1984), os requisitos mais importantes para uma droga ideal para a quimioterapia da DCh são: capacidade para induzir cura parasitológica em ambas as fases (aguda e crônica) da doença, atividade oral em dose única ou em poucas doses, ausência de efeitos colaterais significantes, viável para tratamento ambulatorial com monitoramento mínimo e baixa probabilidade de desenvolvimento de parasitas resistentes.
Atualmente apenas duas classes de compostos apresentam eficácia comprovada na quimioterapia da doença de Chagas: nitrofuranos e nitroimidazólicos.
Em 1972, o laboratório Bayer anunciou a síntese de um nitrofurano (1,1-dioxido da tetraidro-3-metil-4[(5-nitrofurfurilideno)amino]-2H-1,4-tiazina) conhecido como nifurtimox. O mecanismo de ação do nifurtimox é mediado por radicais livres que são gerados pela droga, tais como ânions superóxidos e peróxidos de hidrogênio (DOCAMPO & STOPPANI, 1979). Este medicamento foi amplamente utilizado no tratamento da infecção pelo T. cruzi proporcionando bons resultados principalmente quando administrado na fase aguda da infecção (BLANCO et al., 2000; BAHIA-OLIVEIRA et al., 2000; SCHIJMAN et al., 2003).
Os trabalhos pioneiros de GRUNBERG et al. (1968) demonstraram a atividade quimioterápica contra o T. cruzi do derivado 2-nitroimidazólico (N-benzil-2-nitro-1-imidazolacetamida) conhecido como benzonidazol. Este fármaco, produzido a princípio pela Hoffman – La Roche sob a denominação de Rochagan, foi introduzido na
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1978). Este composto tem sido empregado no tratamento específico de pacientes chagásicos na fase aguda, promovendo curas parasitológicas de 50-70% (BRENER et al., 1993). Resultados significativamente inferiores são encontrados na fase crônica da doença.
Ambos os fármacos apresentados estão longe de ser o medicamento ideal devido aos efeitos colaterais observados em alguns pacientes, tais como anorexia, vômito, dermatite por hipersensibilidade, polineuropatia periférica e depressão da medula óssea.
O tratamento da doença de Chagas humana com o Benzonidazol (BZ) e o Nifurtimox (NFX) fornece resultados distintos tanto na fase aguda como crônica, principalmente em indivíduos chagásicos de áreas geográficas distintas. Um dos fatores que contribui para este fato é a cepa do parasito (FILARDI & BRENER, 1987). Geralmente cepas do Rio Grande do Sul, Argentina e Chile apresentam elevada susceptibilidade à droga (COURA & CASTRO, 2002). É sabido que nestas regiões, há um predomínio de T. cruzi II (TIBAYRENC & AYALA, 1988), especialmente do “clone maior” 32 ou T. cruzi 2b (BRISSE et al, 2000) ou T. cruzi II (Satellite Meeting, 2009), que se mostrou mais sensível a drogas tanto “in vitro” (REVOLLO et al., 1998) quanto “in vivo” (TOLEDO et al., 2003).
Embora haja divergência quanto às percentagens de cura no tratamento etiológico da doença de Chagas, há consenso sobre a sua utilidade salvo em condições onde é contra-indicado tais como na gestação, insuficiência hepática e renal grave e em idosos. A comprovação de cura, especialmente na fase crônica, depende de fatores como o tempo de seguimento e os exames laboratoriais utilizados.
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Segundo o Consenso Brasileiro (2005), na fase aguda o tratamento deve ser realizado em todos os casos e o mais rápido possível após confirmação diagnóstica, independentemente da via de transmissão (oral, congênita, transfusional ou acidental). Vale ressaltar ainda que a doença de Chagas aguda é de notificação compulsória.Tanto o BZ como o NFX, apresentam alta eficácia na fase aguda da infecção, revelando índices de cura que variam de 40% a 76% (ANDRADE et al. 1992; BAHIA-OLIVEIRA et al. 2000; CANÇADO, 2002, SHIKANAI YASUDA, 1990). De acordo com CANÇADO (2002), a negativação da sorologia nesta fase da infecção, ocorre entre 11 a 12 meses em 50% dos indivíduos chagásicos e que 14 meses pós-tratamento todos os indivíduos chagásicos já são soronegativos.
BAHIA-OLIVEIRA et al. (2000) avaliando 25 indivíduos tratados na fase aguda da infecção, seguidos clinicamente por 14-30 anos, encontraram 40% de cura e 28% de pacientes dissociados. Não foi observado nenhum sintoma clinico nem alteração cardíaca no grupo considerado curado e apenas dois pacientes considerados dissociados apresentaram alterações cardíacas leves enquanto 50% dos pacientes não curados apresentaram alterações cardíacas mais graves. Os autores sugerem também neste estudo que a persistência de células T reconhecendo antígenos de T. cruzi não seria suficiente para desencadear patologias cardíacas, reforçando assim a hipótese que a presença do parasita pode ser essencial para o desenvolvimento de miocardiopatia chagásica. Esses dados reforçam mais ainda a importância do diagnóstico precoce e do tratamento etiológico nesta fase da infecção.
Na doença de Chagas congênita, o tratamento precoce do recém-nascido com BZ ou NFX tem eficácia terapêutica que varia de 66% a 100% dos casos (RUSSOMANDO et al., 1998; BLANCO et al., 2000; SCHIJMAN et al., 2003).
Na última década, verificou-se que o BZ e o NFX têm apresentado altas taxas de cura que variam de 62% a 87% em infecções crônicas recentes tanto no Brasil como em outros países (ANDRADE et al., 1996; ANDRADE et al., 2004; SOSA-ESTANI, 1998; SILVEIRA et al., 2000; STREIGER et al. 2004).
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índices de cura alcançados pelos diversos autores variam de 0% a 19.1% (FERREIRA, 1990; VIOTTI et al., 1994; SUASNÁBAR et al., 2000; LAURIA-PIRES et al., 2000; BRAGA et al., 2000; GALLERANO & SOSA, 2001; BRITTO et al. 2001; CANÇADO, 2002; FABBRO et al., 2007; FERNANDES et al., 2009). Por outro lado tem sido verificado por alguns autores que indivíduos chagásicos tratados na fase crônica da infecção, embora não parasitologicamente curados, apresentam uma redução significativa no surgimento de alterações eletrocardiográficas (SUASNÁBAR et al., 2000; VIOTTI et al., 1994; ZULANTAY et al., 2005) e evolução clínica mais lenta (SEGURA et al., 1994, VIOTTI et al., 2006, SOSA-ESTANI & SEGURA, 2006) com reversão da fibrose em modelo murino (ANDRADE et al. 1991). Outros trabalhos vêm demonstrando o efeito benéfico do tratamento etiológico da doença de Chagas, proporcionando assim cura parasitológica ou retardo na evolução da doença (FRAGATA-FILHO et al., 1995; COURA et al., 1997; FABRO et al., 2000; LANA et al., 2009).
Embora haja divergências quanto às percentagens de cura no tratamento etiológico da doença de Chagas há certo consenso sobre a sua utilidade em certas circunstâncias, tais como: fase da doença, idade do paciente e condições associadas. A comprovação de cura, especialmente na fase crônica, depende de fatores como o tempo de seguimento e os exames utilizados. Por estas razões, o Consenso Brasileiro em doença de Chagas recomenda o tratamento a todo paciente soropositivo que se encontra na fase aguda, infecção congênita e fase crônica recente. Nos casos de fase crônica tardia ou de maior duração, o tratamento está indicado na forma indeterminada e nas formas cardíacas e digestivas leves. O tratamento está indicado também em casos de transplantes, infecção acidental e em pacientes imunodeprimidos caso haja reativação.
1.5 - Critérios de cura na doença de Chagas
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por hemocultura, xenodiagnóstico, inoculação em animais de laboratório ou métodos moleculares (PCR). Os testes sorológicos avaliam a presença de anticorpos específicos detectados por métodos imunológicos e são divididos em sorológicos convencionais (ELISA, HAI e IFI) e não convencionais (LMCo e FC-ALTA).
Os anticorpos líticos podem mediar à lise das formas tripomastigotas do T. cruzi, além de neutralizar estas formas evolutivas, impedindo assim, a infecção de novas células (KRETTLI & BRENER, 1976; 1982). Além disso, também são responsáveis pela citotoxicidade celular dependente de anticorpo, visto que apenas anticorpos líticos são capazes de mediar esta resposta (LIMA-MARTINS et al., 1985). Estes achados sugerem um papel protetor para estas imunoglobulinas na resistência do hospedeiro contra o T. cruzi (KRETTLI & BRENER, 1982). Esta hipótese foi corroborada em um estudo mais recente, desenvolvido por CORDEIRO et al. (2001), no qual os níveis destes anticorpos eram maiores nos pacientes que apresentavam a forma indeterminada, sendo baixos nos indivíduos portadores da forma cardíaca. Os anticorpos da sorologia convencional não apresentam esta função protetora (KRETTLI & BRENER, 1982), sendo amplamente utilizados para o diagnóstico sorológico da infecção pelo T. cruzi. A detecção destes anticorpos após tratamento etiológico gera discordâncias sobre a efetividade do tratamento. Isso ocorre porque o critério de cura atualmente estabelecido refere que a cura só é confirmada após negativação sorológica, porém a sorologia convencional pode permanecer reagente até mesmo por décadas pós-tratamento (CANÇADO, 1999; MS, 2005).
A definição de cura em doença de Chagas é polêmica. Segundo CANÇADO (1963), o indivíduo curado deve necessariamente apresentar testes sorológicos convencionais e parasitológicos persistentemente negativos. Já KRETTLI & BRENER (1982) consideram que a ausência de anticorpos líticos no soro de pacientes tratados é indicativa de cura, mesmo na presença de testes sorológicos convencionais positivos (GALVÃO et al., 1993).
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al.,1998; SILVEIRA et al., 2000; SOLARI et al., 2001; BRITTO et al., 2001; GALVÃO et
al., 2003).
A persistência da positividade da sorologia na grande maioria dos pacientes tratados na fase crônica tem levado alguns autores a considerá-la como memória imunológica com a manutenção de anticorpos na ausência do T. cruzi. ANDRADE et al. (1988) demonstraram através de imunoeletromicroscopia que antígenos parasitários retidos nas células dendríticas do baço podem ser responsáveis por esta memória imunológica, sendo assim capaz de manter o organismo em processo de estimulação antigênica constante.
Várias outras hipóteses são aventadas para explicar o porquê da permanência dos títulos positivos da sorologia convencional por longos anos, sendo descrita a possibilidade da existência de reações cruzadas entre antígenos do T. cruzi e moléculas do hospedeiro. Células cardíacas, células do endotélio cardíaco, células neuronais, neurônios do cerebelo, neurônios cerebrais e laminina; todos podem apresentar reação cruzada com Ags de T. cruzi (ANDRADE et al., 1991; BRENER, 1992). ANDRADE et al. (1991) demonstraram a presença de antígenos parasitários presentes nas células dendríticas de camundongos e que outros microorganismos (bactérias, protozoários) intestinais ou pulmonares induzem sorologia convencional positiva (GAZZINELLI et al., 1993).
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Segundo CANÇADO (2002) e de acordo com o Consenso Brasileiro em doença de Chagas (2005), a negativação da sorologia convencional tem sido considerado o único método tradutor de cura associado também a métodos parasitológicos persistentemente negativos. Não fica claro em nenhuma destas publicações quais testes da sorologia convencional devem ser utilizados (ELISA + IFI ou ELISA + HAI ou IFI + HAI) o que torna controverso a interpretação dos resultados de diferentes estudos.
1.6 - Doença de Chagas no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG.
Os primeiros trabalhos de combate à doença de Chagas no Vale do Jequitinhonha, no qual o município de Berilo está inserido, foram realizados em 1960 pelo Departamento Nacional de Endemias Rurais (DENERu).
No inquérito sorológico nacional (1975 – 80), o município de Berilo apresentou uma prevalência para a infecção pelo T. cruzi de 35,5% (CAMARGO, 1984) confirmada em inquérito sorológico posterior coordenado por DIAS et al., (1985).
No levantamento triatomínico realizado em 1982, constatou-se um índice de infestação das unidades domiciliares de 6% e um índice de infecção dos triatomíneos pelo T. cruzi de 10%. Neste momento, a principal espécie vetora capturada foi
Panstrongylus megistus seguida de Triatoma infestans, Triatoma sordida,
Panstrongylus geniculatus, Triatoma vitticeps e Triatoma pseudomaculata.
AGUILAR (1988) avaliando os aspectos relacionados à morbidade da doença de Chagas em um grupo de pacientes chagásicos e não chagásicos residente no município revelou que a mortalidade entre os soropositivos era de 1,9% ao ano, a letalidade da cardiopatia era de 2,6% ao ano, a morte súbita foi mais freqüente do que a morte por insuficiência cardíaca e constatou uma taxa de evolução progressiva de 2,8% ao ano nos pacientes chagásicos.
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soronegativos para a infecção pelo T. cruzi, uma prevalência de alterações eletrocardiográficas de 55,7% entre os pacientes com DCh e 13,7% nos indivíduos do grupo controle, demonstrando assim a alta prevalência de cardiopatia entre os indivíduos com a infecção pelo T. cruzi (MONTOYA, 1998).
Com o intuito de avaliar a vigilância epidemiológica implantada no município em 1997, BORGES et al. (2006) realizaram um estudo amostral em 1.412 escolares de 7 – 14 anos residentes no município (área rural e urbana) onde foi encontrado seis escolares soropositivos, revelando uma prevalência de 0.4%. Com estes resultados os autores concluíram que a transmissão vetorial estava interrompida neste município ou caso aconteça esteja ocorrendo em níveis baixíssimos.
Oito anos após a implantação da vigilância epidemiológica foi realizada uma pesquisa integral no município buscando avaliar o impacto do programa de controle instalado desde 1982. Neste estudo, 5.242 unidades domiciliares e 7.807 anexos foram vistoriados e 391 triatomíneos (280 Panstrongylus megistus e 111 Triatoma
pseudomaculata) capturados. Nenhum exemplar de triatomíneo apresentava infecção por T. cruzi. Naquele momento, foram avaliados os índices entomológicos que demonstraram resultados condizentes com a fase de vigilância epidemiológica no qual o município se encontrava (MACHADO-DE-ASSIS et al. 2009). Foi constatada também pela primeira vez no Estado de Minas Gerais a domiciliação pela espécie T.
pseudomaculata, o que demonstra a importância que esta espécie vetorial vem adquirindo na região e indica a necessidade de atualização e aperfeiçoamento da vigilância epidemiológica (MACHADO-DE-ASSIS et al., 2007).
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assintomática conforme recomendação do Consenso Brasileiro (2005) sobre o tratamento etiológico da doença.
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2.1 – Objetivo geral
Avaliar a efetividade terapêutica e a evolução clínica dos pacientes chagásicos tratados com benzonidazol e não tratados residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, através do desenvolvimento de três estudos epidemiológicos.
2.2 – Objetivos Específicos
2.2.1 – Avaliar por métodos laboratoriais a efetividade terapêutica empregando:
- Testes sorológicos convencionais (ELISA, IFI e HAI) isolados e em associações,
- Testes sorológicos alternativos (rec-ELISA e FC-ALTA) isolados e em associações,
- Métodos parasitológicos (hemocultura e PCR),
2.2.2 - Avaliar e comparar a evolução dos parâmetros laboratoriais e clínicos em diferentes períodos tratamento (antes do tratamento, nove e treze anos pós-tratamento).
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3.1 – Características da área de estudo
O município de Berilo está situado no Estado de Minas Gerais, na mesorregião do Vale do Jequitinhonha a uma distância de 660 quilômetros de Belo Horizonte
(Figura 1). Está inserido no domínio do cerrado a 16o 57’06”S e 42o 27’56”W e uma
altitude de 401m. Com uma área territorial de 581,5 km2 e uma população de aproximadamente 13.197 habitantes, destes 23,4% estão na área urbana e 76,6% na área rural, distribuídos em um distrito (Lelivéldia) e 35 comunidades (IBGE, 2007). Apresentando topografia bastante acidentada, sendo constituído por vales estreitos e regiões bastante onduladas, onde os níveis altimétricos variam de 400 a 800m. Limita-se com os municípios de José Gonçalves de Minas, Francisco Badaró, Virgem da Lapa, Chapada do Norte, Cristália e Grão Mogol. O clima é tropical, megatérmico e sub-úmido do tipo seco, com uma temperatura média anual de 24ºC. O volume anual de chuvas é normalmente inferior às taxas de demanda ambiental de água. A estação chuvosa é curta e muito concentrada em alguns poucos meses, o que provoca prolongados períodos de seca. A vegetação é composta de cerrados, capoeiras e chapadas, tendo ao norte plantações de eucaliptos. A principal atividade econômica de Berilo é a agricultura familiar de subsistência, não dispõe de nenhum beneficiamento ou processamento de matéria-prima, necessitando, portanto, de ser abastecido de produtos industrializados. O clima é desfavorável para a agricultura e pecuária em propriedades rurais que na sua imensa maioria são pequenas (menores que 100 hectares). A falta de investimento e apoio aos pequenos proprietários não garante a subsistência da população, acarretando uma migração sazonal intensa (SILVA et al. 1990).
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Figura 1 - Divisão das mesorregiões e localização do município de Berilo no Estado de Minas Gerais.
3.2 – População em estudo
A primeira parte deste trabalho constitui um estudo descritivo de 94 pacientes
chagásicos tratados com BZ há pelo menos 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, avaliados quanto à efetividade terapêutica e classificados segundo a forma clínica. Todos os indivíduos foram submetidos ao tratamento etiológico utilizando o benzonidazol (Rochagan®) seguindo todas as recomendações preconizadas pelo Ministério da Saúde. Durante o tratamento os indivíduos foram acompanhados pelos médicos locais e/ou médicos lotados na regional de saúde de Diamantina e Teófilo Otoni. A confirmação do tratamento foi realizada consultando os prontuários médicos (arquivados no posto de saúde municipal) e em entrevista com os próprios indivíduos. Foram excluídos da casuística os indivíduos que não comprovaram o tratamento através de receituários e/ou anotações consistentes nos prontuários médicos, aqueles que não realizaram o tratamento completo (mínimo de 50 dias de tratamento) e outros que não completaram a avaliação clínica e laboratorial proposta neste estudo.
A segunda parte deste trabalho constitui um estudo longitudinal (coorte
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FIOCRUZ, RJ. Estes pacientes foram submetidos a exames laboratoriais e clínicos antes do tratamento o que permitiu avaliá-los quanto à evolução laboratorial e clínica em estudos realizados por nosso grupo de pesquisa em 2006 (nove anos pós-tratamento) e agora no presente estudo (13 anos pós-pós-tratamento).
A terceira parte deste trabalho constitui um estudo de intervenção onde os 29
pacientes tratados com BZ, mencionados no estudo anterior, foram pareados por sexo, idade, forma clínica e procedência. Este pareamento foi realizado utilizando pacientes diagnosticados na mesma época e não tratados, sendo, portanto um estudo pareado retrospectivo.
Todos os participantes dos três estudos foram informados sobre os objetivos do projeto e confirmaram sua participação assinando o termo de consentimento livre e esclarecido, processo 07/2002 (Anexo I) aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa em seres humanos do Instituto René Rachou, FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG.
3.3 – Avaliação laboratorial
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3.3.1 – Métodos parasitológicos
3.3.1.1 – Hemocultura
A técnica de hemocultura foi realizada segundo CHIARI et al., (1989) com algumas modificações. A técnica consistiu na obtenção de um volume de 30 mL de sangue/60 kg peso corporal do paciente, coletado em tubo estéril contendo heparina (Vacuntainer BD) e processado em câmara asséptica. O processamento do sangue foi realizado imediatamente após coleta, fazendo-se inicialmente uma centrifugação a 3.000 rpm por 10 minutos. Em seguida, o plasma foi desprezado e a camada de célula foi lavada com igual volume de meio LIT. Após nova centrifugação, nas mesmas condições anteriores, o meio de cultura (LIT) foi desprezado e a camada de leucócitos foi retirada cuidadosamente e transferida para um tubo falcon de 15mL contendo 3mL de meio LIT. A papa de hemácia foi distribuída em 2 tubos falcon de 15mL contendo 5mL de meio LIT. Os tubos de cultura foram incubados em estufa B.O.D a 28oC, homogeneizados a cada 2 dias e uma gota do sedimento foi analisada ao microscópio óptico, objetiva de 40X, após 30, 60, 90 e 120 dias à procura de formas evolutivas de T. cruzi. O resultado da técnica de hemocultura levou em consideração o resultado obtido nas duas coletas realizadas, sendo considerado positivo quando a presença de T. cruzi foi verificada em qualquer uma das coletas e negativo quando em ambas as coletas não se constataram a presença de T. cruzi.
3.3.1.2 – Reação em cadeia da polimerase (PCR)
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do DNA utilizando o kit Wizard™ Genomic DNA Purification kit (Cat #A1125 Lot #262870) Promega seguindo todas as recomendações do fabricante.
A PCR foi processada de acordo com o protocolo de GOMES et al., (1998) modificada. A mistura reacional foi preparada contendo 10mM cloridrato de hidroximetilaminometano (Tris-HCl)/pH 9,0, 0,1% de Triton X-100 (Tampão PCR 10x, Invitrogen São Paulo, SP, Brasil), 75mM de cloreto de potássio (KCl - Tampão PCR 10x , Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 3,5mM cloreto de magnésio (MgCl2 – Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 0,2mM de cada desoxinucleotídeo (dATP, dCTP, dGTP, dTTP – Sigma, St. Louis, MO, EUA ), 0,5U de Taq Platinum DNA polimerase (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 10pmoles de cada iniciador #121
(AAATAATGTACGGGTGAGATGCATGA) e #122
(GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA) (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil) descritos por STURM et al. (1989) e modificado por WINCKER et al. (1994). A reação de PCR foi realizada com 9,0µL da mistura reacional + 2,0µL da solução de DNA extraído do sangue totalizando um volume final de 11µL.
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3.3.2 – Testes sorológicos convencionais
3.3.2.1 – ELISA (enzime-linked immunosorbent assay)
A reação de ELISA foi realizada segundo a metodologia padronizada em nosso Laboratório de Doença de Chagas do NUPEB/UFOP (ELISA in-house), empregando antígeno proveniente de formas epimastigotas da cepa Y do T. cruzi mantidas em meio LIT. Os flagelados foram isolados na fase exponencial de crescimento, tratados com solução de NaOH 0,15M, em banho de gelo por 18 horas e o pH neutralizado com HCl 0,15M (VÍTOR & CHIARI, 1987). O antígeno obtido foi dosado pelo método de LOWRY (1951) e depois conservado em congelador a -20ºC até o uso.
O teste de ELISA foi realizado segundo a metodologia de VOLLER et al. (1975) com amostras dos soros na diluição correspondente a 1:80, antígeno na concentração de 2,5µg/mL e conjugado anti-IgG humana (Sigma, St. Louis, MO, EUA), marcado com peroxidase na diluição 1:7.500 conforme padronização prévia. Para a realização da reação foram utilizadas microplacas de poliestireno de 96 poços de fundo chato, sensibilizadas com 100µL/poço de antígeno diluído em tampão carbonato pH 9,6 e incubadas “over-night” em geladeira. Após a incubação, o excesso de solução antigênica foi desprezado e as placas lavadas quatro vezes com solução de lavagem (PBS-Tween 0,05%). Em seguida, as placas foram bloqueadas com 100µL/poços de PBS com soro fetal bovino (SFB) e incubadas em estufa por 30 minutos a 37ºC. Na seqüência as placas foram novamente lavadas quatro vezes com solução de lavagem.
Na etapa subseqüente, as placas foram incubadas com 100µL/poços de soro diluído 1:80 durante 45 minutos a 37ºC. Em seguida as placas foram lavadas quatro vezes com solução de lavagem e incubadas por mais 45 minutos a 37ºC com 100µL/poços do conjugado anti-IgG humano e diluído em PBS-Tween 0,05%. Após incubação as placas foram lavadas novamente quatro vezes.
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A leitura da reação foi realizada em leitor de ELISA (Bio-Rad Model 680 – microplate manager 5.2.1) com filtro de 490nm. O ponto de corte (cut-off) foi determinado utilizando a média das absorbâncias de 10 soros padrões não reativos + 2 desvios padrão. A região considerada de zona cinza foi determinada e compreende o valor do cut-off ± 10%. O indivíduo que apresentava absorbância acima do cut-off +10% foi considerado positivo e abaixo do cut-off – 10% foi considerado negativo. O cut-off foi determinado para cada placa conforme descrição previamente e todas as amostras testadas em duplicata, sendo o valor final da absorbância a média da leitura das duplicatas.
3.3.2.2 - Reação de imunofluorescência indireta (IFI)
A reação foi realizada empregando antígeno de T. cruzi obtido por cultivo em meio LIT, sob a forma de epimastigota, produzido pela biolab-Mérieux (IMUNOCRUZI®).
