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3.1 – Características da área de estudo
O município de Berilo está situado no Estado de Minas Gerais, na mesorregião do Vale do Jequitinhonha a uma distância de 660 quilômetros de Belo Horizonte (Figura 1). Está inserido no domínio do cerrado a 16o 57’06”S e 42o 27’56”W e uma altitude de 401m. Com uma área territorial de 581,5 km2 e uma população de
aproximadamente 13.197 habitantes, destes 23,4% estão na área urbana e 76,6% na área rural, distribuídos em um distrito (Lelivéldia) e 35 comunidades (IBGE, 2007). Apresentando topografia bastante acidentada, sendo constituído por vales estreitos e regiões bastante onduladas, onde os níveis altimétricos variam de 400 a 800m. Limita- se com os municípios de José Gonçalves de Minas, Francisco Badaró, Virgem da Lapa, Chapada do Norte, Cristália e Grão Mogol. O clima é tropical, megatérmico e sub-úmido do tipo seco, com uma temperatura média anual de 24ºC. O volume anual de chuvas é normalmente inferior às taxas de demanda ambiental de água. A estação chuvosa é curta e muito concentrada em alguns poucos meses, o que provoca prolongados períodos de seca. A vegetação é composta de cerrados, capoeiras e chapadas, tendo ao norte plantações de eucaliptos. A principal atividade econômica de Berilo é a agricultura familiar de subsistência, não dispõe de nenhum beneficiamento ou processamento de matéria-prima, necessitando, portanto, de ser abastecido de produtos industrializados. O clima é desfavorável para a agricultura e pecuária em propriedades rurais que na sua imensa maioria são pequenas (menores que 100 hectares). A falta de investimento e apoio aos pequenos proprietários não garante a subsistência da população, acarretando uma migração sazonal intensa (SILVA et al. 1990).
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Figura 1 - Divisão das mesorregiões e localização do município de Berilo no Estado de Minas Gerais.
3.2 – População em estudo
A primeira parte deste trabalho constitui um estudo descritivo de 94 pacientes chagásicos tratados com BZ há pelo menos 10 anos, residentes no município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, avaliados quanto à efetividade terapêutica e classificados segundo a forma clínica. Todos os indivíduos foram submetidos ao tratamento etiológico utilizando o benzonidazol (Rochagan®) seguindo todas as recomendações preconizadas pelo Ministério da Saúde. Durante o tratamento os indivíduos foram acompanhados pelos médicos locais e/ou médicos lotados na regional de saúde de Diamantina e Teófilo Otoni. A confirmação do tratamento foi realizada consultando os prontuários médicos (arquivados no posto de saúde municipal) e em entrevista com os próprios indivíduos. Foram excluídos da casuística os indivíduos que não comprovaram o tratamento através de receituários e/ou anotações consistentes nos prontuários médicos, aqueles que não realizaram o tratamento completo (mínimo de 50 dias de tratamento) e outros que não completaram a avaliação clínica e laboratorial proposta neste estudo.
A segunda parte deste trabalho constitui um estudo longitudinal (coorte descritiva de pacientes tratados) de um grupo de pacientes (n=29) incluídos nos 94 acima mencionados, diagnosticados, tratados e acompanhados pelo Dr. Roberto Montoya durante a sua permanência no referido município quando ainda realizava sua tese de doutorado vinculado ao programa de pós-graduação do Instituto Oswaldo Cruz,
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FIOCRUZ, RJ. Estes pacientes foram submetidos a exames laboratoriais e clínicos antes do tratamento o que permitiu avaliá-los quanto à evolução laboratorial e clínica em estudos realizados por nosso grupo de pesquisa em 2006 (nove anos pós- tratamento) e agora no presente estudo (13 anos pós-tratamento).
A terceira parte deste trabalho constitui um estudo de intervenção onde os 29 pacientes tratados com BZ, mencionados no estudo anterior, foram pareados por sexo, idade, forma clínica e procedência. Este pareamento foi realizado utilizando pacientes diagnosticados na mesma época e não tratados, sendo, portanto um estudo pareado retrospectivo.
Todos os participantes dos três estudos foram informados sobre os objetivos do projeto e confirmaram sua participação assinando o termo de consentimento livre e esclarecido, processo 07/2002 (Anexo I) aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa em seres humanos do Instituto René Rachou, FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG.
3.3 – Avaliação laboratorial
A participação dos voluntários neste estudo consistiu na doação de sangue venoso coletado através do sistema a vácuo (vacuntainer, BD) para a realização dos testes sorológicos e exames parasitológicos. Um volume de 40mL de sangue foi coletado de cada paciente, sendo 30mL de sangue heparinizado para a técnica de hemocultura, 5mL de sangue sem anticoagulante para PCR e 5mL para obtenção de soro utilizado nas avaliações sorológicas convencionais (ELISA, IFI e HAI,) e não convencionais ou alternativas (anticorpos anti-tripomastigotas vivos por citometria de fluxo (FC-ALTA) e ELISA recombinante (rec-ELISA). Para obtenção do soro as amostras foram centrifugadas a 3.000rpm por 10 minutos e o sobrenadante coletado e armazenado em tubos eppendorf. Estes tubos foram imediatamente conservados a temperatura de -20oC e encaminhados ao laboratório de doença de Chagas da Universidade Federal de Ouro Preto onde foram realizadas as diversas metodologias. Durante o período do estudo foram feitas duas coletas de sangue venoso (2007 e 2010) em cada indivíduo para a realização de todas avaliações propostas.
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3.3.1 – Métodos parasitológicos 3.3.1.1 – Hemocultura
A técnica de hemocultura foi realizada segundo CHIARI et al., (1989) com algumas modificações. A técnica consistiu na obtenção de um volume de 30 mL de sangue/60 kg peso corporal do paciente, coletado em tubo estéril contendo heparina (Vacuntainer BD) e processado em câmara asséptica. O processamento do sangue foi realizado imediatamente após coleta, fazendo-se inicialmente uma centrifugação a 3.000 rpm por 10 minutos. Em seguida, o plasma foi desprezado e a camada de célula foi lavada com igual volume de meio LIT. Após nova centrifugação, nas mesmas condições anteriores, o meio de cultura (LIT) foi desprezado e a camada de leucócitos foi retirada cuidadosamente e transferida para um tubo falcon de 15mL contendo 3mL de meio LIT. A papa de hemácia foi distribuída em 2 tubos falcon de 15mL contendo 5mL de meio LIT. Os tubos de cultura foram incubados em estufa B.O.D a 28oC, homogeneizados a cada 2 dias e uma gota do sedimento foi analisada ao microscópio óptico, objetiva de 40X, após 30, 60, 90 e 120 dias à procura de formas evolutivas de
T. cruzi. O resultado da técnica de hemocultura levou em consideração o resultado
obtido nas duas coletas realizadas, sendo considerado positivo quando a presença de
T. cruzi foi verificada em qualquer uma das coletas e negativo quando em ambas as
coletas não se constataram a presença de T. cruzi.
3.3.1.2 – Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para a realização da técnica foram obtidos 5mL de sangue total de cada indivíduo. O sangue foi coletado em tubo estéril sem anticoagulante (Vacuntainer BD) e rapidamente adicionado a um igual volume de solução de cloridrato de guanidina (Guanidina-HCl) 6M/ácido etilenodietildinitritotetracético (EDTA) 0,2M/pH= 8,0 como descrito por ÁVILA et al., (1991). As amostras foram mantidas à temperatura ambiente durante sete dias e em seguida fervida a 100°C durante 15 minutos para a clivagem do DNA (BRITTO et al., 1993). Uma alíquota de 200 µL do lisado foi submetida à extração
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do DNA utilizando o kit Wizard™ Genomic DNA Purification kit (Cat #A1125 Lot #262870) Promega seguindo todas as recomendações do fabricante.
A PCR foi processada de acordo com o protocolo de GOMES et al., (1998) modificada. A mistura reacional foi preparada contendo 10mM cloridrato de hidroximetilaminometano (Tris-HCl)/pH 9,0, 0,1% de Triton X-100 (Tampão PCR 10x, Invitrogen São Paulo, SP, Brasil), 75mM de cloreto de potássio (KCl - Tampão PCR 10x , Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 3,5mM cloreto de magnésio (MgCl2 – Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 0,2mM de cada desoxinucleotídeo (dATP, dCTP, dGTP, dTTP – Sigma, St. Louis, MO, EUA ), 0,5U de Taq Platinum DNA polimerase (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), 10pmoles de cada iniciador #121
(AAATAATGTACGGGTGAGATGCATGA) e #122
(GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA) (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil) descritos por STURM et al. (1989) e modificado por WINCKER et al. (1994). A reação de PCR foi realizada com 9,0µL da mistura reacional + 2,0µL da solução de DNA extraído do sangue totalizando um volume final de 11µL.
A amplificação foi processada em um termociclador PTC-150 (MJ Research, Ramsey, MA, EUA) nas seguintes condições: uma etapa inicial de desnaturação do DNA a 95°C por 5min, seguida de 35 ciclos de amplificação constituído de um passo de desnaturação a 95ºC por 1min, um de anelamento a 65°C por 1min e um de extensão a 72°C por 1 minuto finalizando com uma etapa de extensão a 72ºC por 10min. O DNA amplificado foi visualizado por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% e revelado utilizando a coloração pela prata (SANTOS et al., 1993). Controles positivos, negativos e de reagentes foram incluídos em cada um dos ensaios realizados. Todas as amostras com resultados negativos foram reavaliadas utilizando os primers PCO3 (ACA CAA ACT GTG TTC ACT AGC) e PCO4 (CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC) da beta-globina humana como controle da amplificação da reação.
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3.3.2 – Testes sorológicos convencionais
3.3.2.1 – ELISA (enzime-linked immunosorbent assay)
A reação de ELISA foi realizada segundo a metodologia padronizada em nosso Laboratório de Doença de Chagas do NUPEB/UFOP (ELISA in-house), empregando antígeno proveniente de formas epimastigotas da cepa Y do T. cruzi mantidas em meio LIT. Os flagelados foram isolados na fase exponencial de crescimento, tratados com solução de NaOH 0,15M, em banho de gelo por 18 horas e o pH neutralizado com HCl 0,15M (VÍTOR & CHIARI, 1987). O antígeno obtido foi dosado pelo método de LOWRY (1951) e depois conservado em congelador a -20ºC até o uso.
O teste de ELISA foi realizado segundo a metodologia de VOLLER et al. (1975) com amostras dos soros na diluição correspondente a 1:80, antígeno na concentração de 2,5µg/mL e conjugado anti-IgG humana (Sigma, St. Louis, MO, EUA), marcado com peroxidase na diluição 1:7.500 conforme padronização prévia. Para a realização da reação foram utilizadas microplacas de poliestireno de 96 poços de fundo chato, sensibilizadas com 100µL/poço de antígeno diluído em tampão carbonato pH 9,6 e incubadas “over-night” em geladeira. Após a incubação, o excesso de solução antigênica foi desprezado e as placas lavadas quatro vezes com solução de lavagem (PBS-Tween 0,05%). Em seguida, as placas foram bloqueadas com 100µL/poços de PBS com soro fetal bovino (SFB) e incubadas em estufa por 30 minutos a 37ºC. Na seqüência as placas foram novamente lavadas quatro vezes com solução de lavagem.
Na etapa subseqüente, as placas foram incubadas com 100µL/poços de soro diluído 1:80 durante 45 minutos a 37ºC. Em seguida as placas foram lavadas quatro vezes com solução de lavagem e incubadas por mais 45 minutos a 37ºC com 100µL/poços do conjugado anti-IgG humano e diluído em PBS-Tween 0,05%. Após incubação as placas foram lavadas novamente quatro vezes.
A seguir foi adicionado às placas, 100µL/poços de solução de substrato (3mg de Orto-fenileno-diamino [OPD] + 3µL de H2O2 vol. 30 + 15 mL de tampão citrato-fosfato).
Estas placas foram incubadas a 37ºC por 15 minutos. A reação foi interrompida com a adição de 32µL/poços de H2SO4 2,5M.
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A leitura da reação foi realizada em leitor de ELISA (Bio-Rad Model 680 – microplate manager 5.2.1) com filtro de 490nm. O ponto de corte (cut-off) foi determinado utilizando a média das absorbâncias de 10 soros padrões não reativos + 2 desvios padrão. A região considerada de zona cinza foi determinada e compreende o valor do cut-off ± 10%. O indivíduo que apresentava absorbância acima do cut-off +10% foi considerado positivo e abaixo do cut-off – 10% foi considerado negativo. O cut-off foi determinado para cada placa conforme descrição previamente e todas as amostras testadas em duplicata, sendo o valor final da absorbância a média da leitura das duplicatas.
3.3.2.2 - Reação de imunofluorescência indireta (IFI)
A reação foi realizada empregando antígeno de T. cruzi obtido por cultivo em meio LIT, sob a forma de epimastigota, produzido pela biolab-Mérieux (IMUNOCRUZI®).
Para a realização da reação foram utilizadas lâminas de microscopia para fluorescência contendo 12 poços que foram sensibilizados com 10µL/círculo de suspensão antigênica. A secagem das lâminas foi feita à temperatura ambiente. Depois foram colocados nas lâminas 20µL de soro de cada paciente na diluição 1:40. Em seguida as lâminas foram incubadas em câmara úmida a 37ºC por 30 minutos. A seguir as lâminas foram lavadas duas vezes com tampão PBS, cinco minutos cada, por imersão e uma vez com água destilada e posteriormente secada a 37ºC por 5 minutos. Em seguida foram adicionados 20µL do conjugado anti-IgG humano marcado com fluoresceína (FLUOLINE G®) na diluição de 1:100. As lâminas foram incubadas a 37ºC por 30 minutos, depois foram lavadas duas vezes com tampão PBS e uma vez com água destilada e, em seguida secadas a 37ºC por 5 minutos. As lâminas foram montadas com glicerina tamponada e lamínulas, e a leitura foi realizada ao microscópio de imunofluorescência. Foram consideradas positivas as amostras de soro que apresentaram fluorescência na diluição igual ou superior a 1:40. Em cada lâmina foi adicionado um controle positivo e um negativo.
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3.3.2.3 - Reação de hemaglutinação indireta (HAI)
Esta reação foi realizada utilizando o Kit Hemacruzi® (bioMérieux) e seguindo rigorosamente as recomendações do fabricante. Resumidamente, a reação consiste na diluição das amostras de soro em diluente apropriado (PBS 0,01 M pH 7,2) utilizando placas de poliestireno de 96 poços com fundo em “U”. Em seguida, os soros diluídos foram transferidos para uma placa de fundo em “V” e adicionado o antígeno, constituído de hemácias de carneiro sensibilizadas com antígeno de T. cruzi. A seguir as placas foram mantidas em repouso à temperatura ambiente por uma hora até realização da leitura. Todas as amostras foram testadas na diluição 1:20 e as amostras positivas e duvidosas nesta diluição foram testadas novamente na diluição de 1:40. Quando a amostra apresentava um resultado positivo ou duvidoso da diluição 1:20 e positivo na diluição 1:40 era considerada reativa. E quando apresentava resultado negativo na diluição 1:40 era considerada não reativa. A leitura é visual e foi feita de acordo com a imagem obtida em cada poço comparando-se com os soros controles reativos e não reativos. Quando foi visualizada imagem puntiforme sedimentada no fundo do poço de dimensão menor que o soro controle, a reação foi considerada não reativa. Quando foi observada a formação de um “tapete” de hemácias de dimensão igual ou superior ao soro controle não-reativo, a reação foi considerada reativa.
3.3.3 – Testes sorológicos alternativos 3.3.3.1 – ELISA recombinante
O teste ELISA recombinante foi realizado utilizando o kit comercial Chagastest- Wienner (ELISA recombinant v.3.0). Os soros dos pacientes foram diluídos com PBS- Tween 20 (0,05%) + 1% de soro fetal bovina na proporção de 1:20. Em seguida 200µL de cada amostra diluída foi adicionado à placa contendo os antígenos de T. cruzi fixados. As placas foram incubadas a 37°C por 30 minutos. Na seqüência foram lavadas e incubadas novamente a 37°C por 25 minutos com 50µL/poço do anti-IgG humano conjugado com peroxidase na diluição de 1:40.000. Após lavagens sucessivas foi adicionado às placas 100µL/poço de solução reveladora e as mesmas incubadas a
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25°C por 25 minutos. Em seguida foi adicionado às placas 50µL/weel de solução para finalizar a reação (stopper) e as mesmas foram lidas em espectrofotômetro (Bio-rad, Model 680) à 450nm. Controles positivos e negativos foram incluídos em paralelo. O valor do cut-off foi calculado utilizando a média das absorbâncias dos controles negativos mais 0,3 DO, A zona cinza ou de indeterminação foi definida como sendo aquela que compreende o valor do cut-off ±10%.
3.3.3.2 - Reação de imunofluorescência indireta por citometria de fluxo (FC-ALTA)
A pesquisa de anticorpos anti-tripomastigotas vivos por meio da citometria de fluxo foi realizada em amostras de soro segundo a metodologia de MARTINS-FILHO et
al., (1995) adaptada para microplacas por Cordeiro et al., (2001). Como antígeno foi
utilizado à cepa CL do T. cruzi, mantida no Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração (LBDM/CPqRR/FIOCRUZ). As formas tripomastigotas de cultura de tecido foram obtidas a partir do sobrenadante de culturas de células LLC- MK2 infectadas com T. cruzi da cepa CL. Os parasitos foram separados por centrifugação diferencial. Para a obtenção da massa de parasitos, a suspensão de células foi centrifugada a temperatura ambiente, 200rpm por 10 min. Posteriormente, os tubos foram mantidos a 33ºC por 30 minutos para que as formas flageladas pudessem se deslocar do sedimento para o sobrenadante. O sobrenadante foi coletado e centrifugado a 4ºC, 2.200 rpm por 10 minutos. Os parasitos foram lavados em PBS- 10% SBF, três vezes, por centrifugação nas condições anteriores. As preparações de tripomastigotas apresentando contaminação com formas amastigotas superior a 5% foram descartadas. A suspensão de parasitos foi então quantificada em câmara de Neubauer e ajustada para o ensaio de imunofluorescência por citometria de fluxo na concentração de 5 x 106 parasitos/mL.
Em placas de 96 poços com fundo em “U”, 50µL do soro diluído em PBS-3% SFB (1:128 / 1:256 e 1:512) foram incubados a 37ºC por 30 minutos e ao abrigo de luz, na presença de 50µL da suspensão de parasitos (5 x 105 parasitas/mL/poço). Após a
incubação, os parasitos foram lavados duas vezes com PBS-3% SFB, por centrifugação (2.200rpm, 10mim, 18ºC) e o sobrenadante desprezado. Para análise de
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IgG total, os parasitos foram novamente incubados (na mesma condição anterior) na presença de 50µL de anticorpo anti-IgG humano marcado com isotiocianato de fluoresceína – FITC (Sigma) diluídos em PBS-3% SFB. Os parasitos foram novamente lavados duas vezes com PBS-3% SBF (2.200rpm, 10mim, 18ºC) e o sobrenadante desprezado. Após a incubação os parasitos foram novamente lavados duas vezes e fixados com 200µL de solução fixadora para citometria - MFF (Para 10mL; 5mL de Paraformaldeído 20X e 5mL de Cacodilato 20X e o pH ajustado para 7,2). As amostras foram mantidas durante pelo menos 30 minutos, a 4ºC e ao abrigo de luz até o momento da leitura no citômetro de fluxo (FACScan-Becton Dickson, San Jose, CA, EUA), empregando-se o software Cell Quest. As leituras das amostras foram realizadas num período máximo de 24 horas após a fixação dos parasitos. Para cada ensaio de imunofluorescência por citometria de fluxo foi feito um controle interno da reação (controle do conjugado) onde os parasitos foram incubados na ausência de soro humano, porém na presença de anticorpo secundário, para monitorar ligações inespecíficas. Em todos os testes foram incluídas amostras controles de soros positivo e negativo para a doença de Chagas. As amostras de soro foram consideradas negativas quanto a porcentagem de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) foi menor que 20% e positivas, quando a PPFP foi maior que 20%.
3.4 – Critério de cura
Para avaliar a efetividade terapêutica aplicou-se o critério clássico de cura (soronegativação de dois testes sorológicos convencionais) e um critério mais rigoroso que preconiza a soronegativação dos três testes da sorologia convencional (ELISA, IFI e HAI).
Com os critérios estabelecidos acima foi possível classificar os pacientes em tratados não curados (TNC), tratados em avaliação (TEA) e tratados curados (TC). Em seguida os grupos categorizados pela sorologia convencional foram analisados frente aos resultados da sorologia alternativa (rec-ELISA e FC-ALTA), HC e PCR.
Os pacientes que apresentaram hemocultura positiva foram considerados como apresentadores de falha terapêutica ou tratados não curados (TNC),
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independentemente de outros resultados. Os pacientes que apresentaram dois ou três testes sorológicos convencionais e hemocultura negativos foram considerados tratados curados (TC) segundo os critérios anteriormente mencionados e aqueles que apresentaram resultados sorológicos discordantes foram considerados tratados em avaliação (TEA).
3.5 – Avaliação Clínica
3.5.1 – Avaliação Clínica – casuística completa
Na primeira parte deste estudo adotou-se a classificação clínica preconizada pelo Consenso Brasileiro em doença de Chagas (forma indeterminada, forma cardíaca, forma digestiva e forma mista), sendo os pacientes classificados segundo a forma clínica apresentada em 2010.
A classificação da forma clínica da doença de Chagas apresentada pelos pacientes em estudo foi realizada de maneira independente e cega (triplo cego) por três pesquisadores distintos, com larga experiência no assunto, após análise sistemática do eletrocardiograma basal, da radiografia do tórax e do estudo radiológico contrastado do esôfago e do intestino. A forma clínica foi determinada pela concordância entre dois observadores. Na análise do esôfago e cólon foram adotados critérios descritos por REZENDE, 1960.
3.5.2 – Avaliação Clínica – casuística parcial
Este critério foi utilizado para classificar os pacientes que compõem a segunda e terceira parte deste trabalho.
Nesta avaliação clínica foram seguidos os mesmos Protocolos utilizados pelo pesquisador Roberto Montoya em seu trabalho em campo, antes de iniciar o tratamento específico dos pacientes selecionados para estudo, em 1997. Os dados desse Protocolo foram comparados com as avaliações clínicas realizadas nove e treze anos pós-tratamento pela equipe médica do nosso Grupo de Pesquisa. A avaliação dos pacientes foi feita mediante cuidadoso preenchimento de ficha clínico-epidemiológica
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(Anexo II) na qual constam anamnese, exame físico, laudo de radiografia do tórax em PA e laudo de eletrocardiograma de repouso (ECG).
A definição do estado funcional cardíaco baseou-se em informações clínicas contidas no Protocolo utilizado por MONTOYA et al. (1998) utilizando-se como referência os critérios preconizados pela New York Heart Association (NYHA) (Anexo
III).
3.5.2.1 - Estudo eletrocardiográfico
O estudo eletrocardiográfico dos pacientes foi realizado mediante obtenção de dois traçados eletrocardiográficos em repouso, com registro das doze derivações clássicas. Os traçados eletrocardiográficos foram avaliados segundo critérios propostos por MAGUIRE et al. (1983), adaptando-se a terminologia e a classificação das arritmias para os critérios atualmente aceitos e reconhecidos pela Sociedade Brasileira de Cardiologia (PASTORE et al., 2009).
A normalidade do registro eletrocardiográfico foi definida de acordo com os critérios de MAGUIRE et al. (1983) e as recomendações constantes nesta última diretriz. Os resultados foram utilizados para classificar os indivíduos antes do
tratamento e nas avaliações de nove e treze anos pós-tratamento. Foram