UNIVERSIDADEFEDERAL DE UBERLANDIA CENTRO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

L')

UNIVERSIDADEFEDERAL DE UBERLANDIA

CENTRO DE CIENCIAS

_BIOMÉDICAS

CURSO

DE CIENCIAS

_BIOLÓGICAS

Divergência Genética Interpopulacional em Tehagonisca

angus—alla

Latreille, 1811 (Hymenoptera,

:!

Apidae, Meliponinae)

Francis

de Morais

_{Franco Nunes}

Monografia apresentada -à _{Coordenação}

do Curso de Ciências Biológicas da Universidade Federal

de

Uberlândia _paga

a _obtenção do _{grau de Bacharel em} Ciências_Biológicas

Uberlândia

-

MG

tô

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLANDIA

CENTRO DE CIENCIAS

_BIOMÉDICAS

CURSO

_DE

_CIENCIAS

_BIOLÓGICAS

Divergência Genética Interpopulacional em Teh-agonia.?

_angusmla

Latreille, 1811 (Hymenoptera, Apidae, Meliponinae)

Francis

de Morais

_{Franco Nunes}

Orientador:

_{Prof. Dr. Warwick}

_Estevam

_Kerr

»

Monografia apresentada à _{Coordenação}

de'

Cursº» _{de Ciências Biológicas da}

Universidade Federal de _{Uberlândia para}

a obtenção do _{grau -de Bacharel em} Ciências Biológicas.

Uberlândia

-

MG

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLANDIA

CENTRO DE CIENCIAS

BIOMÉDICAS

CURSO

DE CIENCIAS

BIOLOGICAS

Divergência Genética Interpopulacional

em

Tetragonz'sca

_angustula

Latreille,

1811

_{(Hymenoptera, Apidae, Meliponinae)}

Francis

de Morais

Franco Nunes

Aprovada

pela Banca Examinadora

em

ª/º/M

Nota

10039 .

bm?/M

WProf.

Dr. Warwick Estevanln

ken

Orientador

”Qe/am &

Conab-a

dim

, x)“ ..,39 , . .

.

«_,; - aº S㺓 &“?» Profª. MSc.

Rosana

de Cassra Oliveira

O

(ªx Wºº “ “ «ªº

** .

ª

0 Gº““

Orientadora

Dea'ícatázz'a

Ao

_meu

_[má/así

Antônia,-Aas

meu.;

z'mtâw;

_Frarzcíaâ

_e

_Femrtzfg—

Aos meus avós,

_joão

(írz _mermm'arz),

_Tereza,

Assunção,

Maria

_{Aõacíia e Iníuí;}

Aos mew tios

e

primas;

Peú

conf'atzça

_újmz'fafp!

Especíaímente

à

7711571611

mãe,

Rosa

_Maria,

Pelo

amor

6

ii

AGRADECIMENTOS

Não _{queria nesse momento}

_ser

_{injusto, esquecendo nomes que colaboraramcomigo em} minha _{formação profissional e da minha personalidade. No entanto, não posso deixar de}

agradeceraos nomes que agora vêm & minha mente! Desculpem-me ESQUECIDOS, porém

MUITO OBRIGADO!!!

Ao _{amigo Carlos Gustavo Nunes Siiva, por apresentar—me, em Santa Luziado Itanhy}

— SE, 0 fascinante mundo das abelhas.

à _{amiga e orientadora Rosana de 'Câssiafºliveira, pelos}

ensinamentos, _{apoio e} constantes exemplos de boa _{conduta, determinação, responsabilidade, . Você foi uma} dádiva de _{Deus que cruzou o meu caminho. Todas as palavras seriam poucas}

para

agradecer—lhe tudo_que

_fez

_por mim

até

_hoje.

Ao Prof. Dr. Warwick Estevam Kerr, Cientista _{e Educador do século, pela formação}

político—científica, pelo modelode cidadão,—peloirradianteamorà Ciência _{e ao} Brasii _{e pela}

orientação desse trabalho. _{Obrigado pela paciência, por}

_ter

_{esperado tanto meu retorno, na} qualidade de orientado.

à _{Profa. Dra. Ana Maria Bonetti, com'quemconvivi}

e aprendi'muito'em _apenas *3

anos e 5 meses. A _Senhora & realmente umexempio _-a

_ser

_{seguido.- Honestidade, Ética,}

Sinceridade, Objetivos, Responsabilidade,

_(...)

foram valores _{importantes que me foram}

transmitidos e que espero jamais esquecer. Por tudoisso,? hoje sou muito feliz! Ã _{Escola PÚBLICA que me ensinou desde a infância. Ã}

todos os meus professores,

do pré—escolar & _{Universidade, por acreditarem na Educação}

como ferramenta

transformadora da nossa (triste) realidade social. Persistam em seus ideais! Ã _{família Bernardeli (Sr. Mauro, Da. Lúcia,}

Larissa, 'Mariinha' e Eduardo),“ _por

completaremo vazio de um estudante _{que mora} longe de casa. _{Obrigado pela receptividade,}

simplicidade e horas de humor.

A _{amiga Kátia Bernardeli, meu braço-dimim'desde o início do}

_cum.

Fica uma!

iii

à _{amiga Ana Paula de Oliveira Ribeiro, pela convivência sadia, pela sinceridade}

constante, pelas experiências de vida... Obrigado _{por todas as} lições (desculpe-me, nem

sempre fui um bom alunol). Obrigadoã-Da. Eliana, pelos“ papos—cabeça'.

Ao _{amigo Rodrigo Lemes Martins... nossas diferenças nos completam, traduzindo-se}

em crescimento _{pessoal.? Obrigado}

_por

- muitas vezes

ter

contestado—me, o que me

possibilitou _enxergar novos _{paradigmas. Se hoje sou uma pessoa um pouco melhor, devo}

muitoo yoc'e'.

à _{CAPES, por}

_ter

_{inventado o"ProgramaEspecial de Treinamento; talvez}

-a maior

conquista de minha vida!

Ao _{PET/BIOLOGIA, minha PRIORIDADE} NÚMERO _{1. O que eu idealízei na Carta de}

Intenção apresentada ao Grupo, antes da seleção,» foi

mito

pouco frente ao que este

Programa pôde oferecer—me e as possibilidades que juntos pudemos criar.

Aos _{amigos do} PET_{IBIOLOGIA, por terem que escutar alguém tão prolixo. Quantas}

histórias temos pra contar e relembrar! Obrigado: Bárbara, Fernando Biase, Elisângela, Luciana Paiva, Laiena, Braynner, Priscila, Cristiane, Kaila, Wilson, Raquel, _Fernado Lourenço, Jaqueline, Carlos _{Roberto, Luciana Londe e Bruno. Vocês fazem parte de uma}

passagemmuito _especial'da minha vida.

Aos _{amigos da 42“ Turma} de”_{Ciências Biológicas, especialmente}& Tatyana, Andreia,

Francislenee Fabiane _{Sebaio, pela amizade,} infindáveis horas de estudo e humor.

A todos _{os amigos do Laboratório}

_de

_{Genética, pelo conhecimento transmitida—e}

compartilhado. Ressalvo aqui as boas risadas _{que demos juntos, que acabaram minimizando}

meu stress. Aa _{Laboratório em si, pelo instrumental e aparelhagem necessários parana}

execuçãodeste trabalho.

A todos _{os meus grandes amigos de ITUIUTABA—MG, especialmente André}

e Aziz,

por entenderem minha ausência_{e pelos bons momentos que 'curtímos' juntos!}

A _{DEUS, pela vida}

_e

_{portudo isso-que relateiacima. Obrigadopelo}

aperto.

de

mão nas horas mais difíceis da minha caminhada!

Somente as lágrimas que

_morreram,

puderam

traduzir

silenciosamente_{a veracidade} ' de minhas _palavras.

SUMÁRIO

ABREVIAÇÓES... v

RESUMO_... I(í 1. INTRODUÇÃO_... 01

1.1- Sobre-abelhas ... Q1 1.2 - Tetragonisca angustu/a ... 03

1.3- _Biologia molecular... _Q? 2. _{OBJETIVOS... 10}

3. MATERIAL-EMÉTODOS _{... 11}

3.1 - Material biológico_{... 11}

3.2- Extração

de

DNA.-._{... 13}

3.3 - Qualificação e quantificação do DNA _{e preparação de soluções de} trabalho... 14

3.4- Amplificação doDNA _porRAPD_... 14

3.5- Análise de dados.... ... 1'7 4. RESULTADOSE _{DISCUSSÃO... 18}

5.

_{CONCLUSÓES... 25}

6.REFERÉNCIASBIBLIOGRÁFICAS_{... 26}

% ºC uL 2n ABS -MgCÍz cm cM dATP dCTP dGTP dNTP dTTP DNA EDTA HCI KCl Mers mg min ABREVIAÇÓES

por cento (porcentagem) grau(s) Celsius

microlitro(s)

micromplar

diplóide

absorbância

cloreto de magnésio centímetro(s). centimorgan(s) 5ª—desoxiadenosina trifosfato 5'—desoxicitosina trifosfato 5'—desoxiguanosina trifosfato, 57-desoxinucleotideotrifosfato 5'-desoxitimidinatrifosfato ácido desoxirribonucléico

ácido etilenodiaminotetra acético sal dissódico

hora(s) '

ácido clorídrico »

cloreto de potássio molar

bases

em fitas simples

miligramacs) minuto(s) mililitro(s) milimolar milímetro(=s) haplóide

cloreto

de

_sódio nanograma(s)' nanômetro(s)

pares de base

potencial hidrogeniônieo

pico-mol

ribonuclease-A

rotações

por minuto

segundoás)

dodecilsulfato de sódio unidade(s)-de enzima

ultra—violeta

unweighted pair-group method using arithmetic

_averages

volts

Vi

RESUMO

Tetragonisca

angustula

(jataí)

apresenta uma das mais amplas

distribuições

entre os

Meliponíneos,

abrangendo

praticamente

toda a

America do Sul, Central

e

México.» A técnica de RAPD _(Random'Amp/ifiedPo—lymorphic DNA)-tem sido utilizada

na

caracterização

de populações,

detecção

de polimorfismos genéticos,

análises

filogenéticas e, inclusive, confirmação

de

taxonomia

baseada

— em

dados

morfológicos.

Esse

trabalho objetivou-se estimar

a

diversidade genética entre

populações

de T. _angustula

de três regiões

_{(TriânguloMineiro/MGz-Uberlândia 'l, 2,} 3, 4

e

5, Ituiutaba 1, 2

e

3

e

Uberaba 1

e

_2; Sul de Minas/MG:

São

Miguel doAnta _1,

2, 3,

4a

ti;-Argentina:

Aristóbulo-delValle-e Posadas

1

e

2),

usando

Tetragoma

clavipes como outgroup. Foram feitos bu/ks com 5 _{individuos por} local de amostragem, utilizando-se »15

_primers

₍₁₃

curtos

e

2

_{longos) «com}

as

_seguintes

condições

de

reação: 10ng de DNA, 10pmoles de primer, 2mM de MgClz, 1.5U de Taq DNA _{polimerase, vloopM}

de

_cada

_{dNTP, 50mM}

_de

KCl

_e

iOmM

de

Tris—HCl _pH

8.0 .Os produtos

das

amplificações foram

_separados

_{em gel de}

_{agarose 12% e}

fotografados. Os resultados foram

_{analisadospelo}

método

de-

_porcentagem

_de

desacordo e

análise de cluster por UPGMA. Ao nível de

162%, as amostras

de jataí foram divididas em

duas

clades: uma

correspondente à

região do Triângulo Mineiro

e

outra

_{para as amostras}

_{da Argentina}

_e

Sul de Minas _{que, por}

_sua

_vez,

_se

divergiram em 2 grupos -a 14.2—%.-As

amostras

»do _{Triângulo Mineiro}

_apresentaram

divergência máxima

de

6,5%, com 3 genótipos (dois

de

Uberlândia

_e

um

de

ituiutaba) que não apresentaram?dissimilaridade genética. As

amostras

do- Sul _de Minas

_apresentaram

_{divergência genética máxima de 4.4%}

_{e as}

_{da Argentina de}

55%.

Tetragona clavipes divergiu em

69%das

amostras

de T. _{angustula. Os valores}

encontrados

_para T. _angustula foram similares

aos encontrados

_{na literatura dentro}

de

uma mesma região - (Triangulo Mineiro); No

entanto,-para regiões

geograficamente

distantes

(Sul de Minas _{e Triângulo} Mineiro), os valores

encontrados

foram superiores.

isto

pode

ser

devido

_ao

uso de DNA _{proveniente de}

bulks de cinco indivíduos, diferenças na Taq DNA _polimerase

_e

_{nos protocolos de}

extração. Novas-estimativas

de

divergência

_para

esta

espécie

usando—se bulks-odm maior número de indivíduos e maior número de primers forneceriam

dados

conclusivos

sobre

o número mínimo “ amostral- por

localidade e

taxa- de

1JNTRODUÇÃO

1.1 -

Sobre

abelhas

A

_{grande preocupação}

_com

_{a preservação}

_{dos ambientes naturais}

leva, hoje,

muitos

_{pesquisadores a}

_{estudarem os}

_sistemas

_{biológicos de várias}

_espécies,

_sejam

elas

animais,

_vegetais

_{ou microorganismos, na tentativa de}

_{conhece-las antes}

_de uma possível extinção ou ainda fazer

_{destes estudos ferramentas}

_úteis

_para

_mantê— Ias

_presentes

_{no planeta, assim como}

_entender

_suas

_{relações na}

_natureza.

Entre

_as

inúmeras

_espécies

_em

_questão,

_{encontram—se os insetos que,}

apesar

da

_{abundância de}

_populações

_{e espécies,}

_chegaram

_a

_um

_estado

_{crítico de} sobrevivência, colocando assim, outros organismos em risco, devido

às

várias

interações

dentro de

_comunidades

_e

_{ecossistemas.}

Pertencentes aos

insetos (ordem Hymenoptera),

_{as abelhas,}

_cujos

_fósseis

mais velhos datam do Cretáceo,

estão

intimamente

_{relacionadas ao}

_aparecimento

das

Angiospermas (CRUZ—LANDIM, _{1960). Dentre}

_essas,

_muitas

_{espécies estão}

ameaçadas

pela

ação

antrópica que

aitera

_{os habitats naturais por meio de}

desmatamentos,

_{uso indiscriminado de agrotóxicos}

_{e ação}

_predatória

_de

_meleiros, além

da

_{concorrência com Apis mellifera(BALESTIERI, 1989; KERR}

_et

_{al., 1996).}

As

_abelhas

_{sem ferrão brasileiras, classificam-se na subfamília Meliponinae.} WiLLE _{(1983) relata}

_{descobertas recentes}

_de

_{fósseis europeus}

por

KELNER-PILLAULT, do início doTerciário, _{sugerindo que os Meliponíneos surgiram na África,}

portanto, não

se

restringindo

às

Américas. A _{hipótese que tem sido mais aceita}

_é

_de

KERR

_e

MAULE ₍₁₉₆₄₎

_que

_{consideram a América do Sul como o centro de}

origem

África,

_{presença das espécies}

_{mais primitivas (n=9)}

_e

_também

_as

_mais

especializadas,

demonstrando

_que

tiveram mais tempo

_para

diversificação.

A _situação

_{é preocupante}

_quando

_se

_refere

_à

_{diminuição ou extinção de}

populações e espécies

de Meliponíneos,

responsáveis

por 40

a

90% da polinização de regiões de

vegetação

nativa,

_{dependendo do ecossistema.}

Um _exemplo

_{é a}

destruição,

cada

vez mais

acelerada, das

florestas nordestinas, em especial

a

Mata

Atlântica e, na mesma medida, o fim

das

_{populações de}

_tais

_abelhas

_(KERR

_et

_al.,

1996).

Nos meliponíneos, o _{comportamento classificado como eusocial, com relação}

ao tamanho

de

colônias, diferença entre rainha

e

operária, arquitetura do ninho,

complexidade

de

códigos de comunicação,

entre

outros,

é

bem próximo ou

semelhante

ao deApis mel/ifera (SAKAGAMI, 1971

_apud

BALESTIERI, 1989).

Os

_{Meliponinae, há muitos anos, foram}

domesticados

_{pelos povos} pre-colombianos que lhes deram nomes

ainda

vigentes na cultura popular brasileira.

Neste

_grupo

de abelhas

conhece—se mais

_de

300

_{espécies, das quais}

_{pelo menos}

100 _{correm risco de extinção.} A _{atual classificação zoológica}

_sugere

_que

_esta

subfamília subdivide-se em

duas

tribos: Meliponini

_e

Trigonini (KERR

et

al., 1996).

A _{haplodiploidia característica}

_{das abelhas}

_{e uma ferramenta valiosa}

_para

estudos de

genética,

sobretudo

variabilidade

_e

_manutenção

de polimorfismos, visto que a

segregação

alélica dos machos (haplóides) reflete o genótipo da fêmea

(diplóide) _{que os} originou (FALCÃO,-1984). _{Dados apontam}

_para

_{uma diminuição}

_da

1.2 -

Tetragonisca

angustula

Tetragonisca

é

um—dos 53

_{gêneros atuais da}

tribo Trigonini

_{que se destaca}

pela ampla distribuição geográfica,

_abrangendo

_{praticamente toda a Américado Sul,} Central

_e

_{México (BALESTlERl, 1989; FERREIRA,-1993; NOGUElRA-NETO, 1970).}

As

_espécies

mais

conhecidas são

_{Tetragonisca angustu/a} Latreille,

Tetragonisca buchwaldi

Friese

_e

Tetragonisoa pfeifferíFriese (MICHENER, 1990). .

Com _relação

_à

_{Tetragonisca angustu/a conhecem—se}

_{as subespécies}

Tetragonisca angustufa angustufa-- Latreille -

e

» Tetragonisca

angustu/a

fiebrigi

Schwarz,

sendo

_que

esta

última restringe—seao Estado

de

Santa Catarina, parte do Paraná, Argentina,

_Paraguaive

Vale do Rio

Paraná

em

São

Paulo (NOGUElRA-NETO, 1970).

A

_espécie

_Tetragonisca

_{angustuía possui}

=comportamentos muito

peculiares quanto

à

_{reprodução, enxameagem, principalmente com relação}

_a

_fisiologia comportamental

de

operárias

_e

rainhas virgens (FERREIRA, 1993).

NOGUEIRA—NETO _{(1997) observou um}

_processo

_de

_enxameação

_em

Tetragonisca

_{angustularque}

durou

_cerca

_{de 110 dias, tempo}

_bastante

_{longo quando} comparado, por exemplo, a Plebeia droryana, em torno de 15 dias.

MELLO _{(1981) estudou}

_a

_bionomia

_de

_{»Tetragom'sca angustu/a,»}

_descrevendo

relações

simples entre

as castas.

A _{existência de corte}

_{das operárias à}

_{rainha foi}

observada

e

_esta,

_por

_sua

_vez,

não —possui,»na colméia, local _{preferencial de}

permanência. As _{operárias, mesmo em condições normais da colônia, também}

podem ovipor. A autora

_compara

as—

características

_{vetológicas dev-Tetragonisca}

angustu/a com outros Trigonini

estudados

e verifica _uma

_{grande semelhança}

_com

Tetragona

e

Cepha/otn'gona.

GROSSO

_e

BEGO' _{(1992) estudaram. divisão}

_de

_{trabalho entre operárias de}

Tetragonisca

angustu/a

angustula, considerando

_a

relação idade do indivíduo _e

atividade por ele realizada. Verificou—se

_que

_o

_»grooming

_{é a}

_atividade

_de

_maior

frequência,

estendendo-se

dos primeiros dias de vida

_{até cerca}

do 55º dia. Outras atividades

_{apresentam duração}

variável:- »visitas

aos

_{potes de alimento} — 50 dias,

contato bucal — 49 dias, trabalho com cerume _— 30 dias, trabalho _{com resina — 29}

dias, trabalho com lixo — 29 dias-, participação no-

processo

de aprovisionamento.

_e

postura

das

células de cria _(POP)— 15dias. As operárias de Tetragonisca angustu/a

A _{longevidade média}

_{alcançada pelas}

_{operárias de Tetragonisca}

_angustula

angustu/a

foi

de

21901109?

_dias.

AlDAR_{(1999) em experimentos}

_deformação

_{de colônias filhas, observou que}

as

_{rainhas virgens de Tetragonisca angustu/a angustula levaram, em média, 20.9}

dias para acasalarem-se

e

iniciarem

_a

_postura.

PIGNATA

_e

_{STORT (1992) estudaram}

_a

_{quantidade relativa de coleta de}

polen em 4

_{espécies de}

_{Me/ipona, Soaptot-n'gona post/ca}

_e

_{Tetragonisca angustula.}

Entre

_as

_{meli'ponas,o transporte de polen}

_é

_{equivalente a 15% do}

_peso

_{da abelha. A} proporção

nos

Trigonini é maior,

sendo 193% para

8. _postica

_{e 337%}

_para

Tetragonisca angustu/a.

CORTOPASSl—LAURINO' _{(1989) relata}

_a

_{produtividade}

_de

_{Tetragonisça}

angustula

durante todo o ano. A autora observou

_a

visita

_dessa

_{abelha a 326% das}

190 plantas melíferas

_estudadas

_{em uma região do Estado de}

_São

_{Paulo. A} atividade de jataí

é

_{tão intensa que}

_{frequentemente}

_{pilha ninhos fracos de} Paratrigona

subnuda

_e

_{Me/ipona quadrifasciata.}

As _{populações de Tetragonisca angustu/a}

_{adaptam-se às}

_mais

_variadas

condições

físicas

_e

climáticas_{(BALESTIERI, 1989), com boa qualidade}

_de

_regulação de temperatura na

área

da cria

_e

_{expressiva faixa de tolerância térmica (—1}

_a

_41ºC),

tanto no inverno quanto no

verão

(PRONl, 1987).

Segundo

PRONI (1987), _{Tetragonisca angustu/a comporta—se como}

poiquilotérmicos típicos,

_aumentando

_a

_{taxa respiratória com}

_{a elevação}

_da

temperatura. A _{termorregulação, no entanto,}

_é

_{diferente entre}

_{as duas subespécies:}

para

Tetragonisca

_angustu/a

frebrigi

a

faixa ótima no inverno varia entre 15

_a

25ºC,

_e

no _{verão, 25 a 30ºC, enquanto que, para Tetragonisca angustu/a angustu/a, o}

melhor ajustamento térmico

_{situa-se na}

_faixa

_de

₂₅

_a

_{30ºC no inverno}

_e

_{40ºC no} verão.

Alguns

parâmetros

climáticosinfluenciam

_a

_{atividade externa}

_destas

_abelhas,

sendo a

temperatura,

a

_{intensidade luminosa e umidade relativa os mais importantes} na atividade

de

vôo. Os indivíduos

_de

_{Tetragonisca angustula não}

_{saem das}

colméias a baixas temperaturas, mesmo com boa intensidade luminosa (lWAMA,

1977).

KNOLL ₍₁₉₈₅₎

_{destaca que}

_{condições metereológicas, principalmente}

temperatura

e

_{pluviosidade, provocam}

_a

_variação do _{número de indivíduos em}

colônia.-Jataí, como

é

_{conhecida popularmente a}

_{espécie, é}

_uma

_{das abelhas}

indígenas

_sem

ferrão mais

_conhecidas

_e

_{mais facilmente}

_encontradas

_{no território} brasileiro, inclusive _{em centros urbanos, onde nidifica com alta frequência por}

possuir

_{hábitos de nidificação pouco exigentes,}

_bastando

_{um lugar}

_onde

_{haja uma} cavidade suficiente para construção de

_seu

ninho _{(BALESTIERI, 1989; FERREIRA,}

1993).

A _{estrutura interna do ninho de Tetragonisca}

angustula apresenta pequenos

potes

medindo

_cerca

de 1.5 cm de altura, onde

_{são estocados}

_mel

_e

_{pólen; favos de} cria horizontais ou heiicoidais

_e

_{células reais}

_na

_{periferia. O ninho}

_apresenta

_também

um invólucro

_bastante

_{desenvolvido e a}

_{entrada é}

_{constituída de um}

tubo de cerume maleável,

amarelado

_{(BALESTIERI, 1989).}

Em

_estudos

_{na região entre Piracicaba e Rio Claro /}

_São

Paulo, LINDAUER

_e

KERR ₍₁₉₆₀₎

_{descreveram que}

_as

_colônias

_são

geralmente populosas,

_contendode

2000 a 5000 indivíduos.

NOGUElRA—NETO _{(1997) incentiva}

_a

_{criação de}

_{jataí, por}

_ser

uma

abelha

muito _{higiênica, resistente, fácil de manter}

_e

_{multiplicar, além de produzir}

um mel _que

praticamente

_dispensa

_{pausterização.}

O mel

_{desta abelha}

_é

_{muitoapreciado pelas populações}

_rurais

e é

utilizado,

empiricamente, no tratamento de

_doenças

_{como glaucoma}

_{e catarata}

_{(IMPERATRIZ—} FONSECA

_et

_{al., 1984a).}

BAZLEN ₍₁₉₉₇₎

_apud

_{AiDAR (1999) demonstrou}

_ação

_{bactericida do}

mel de Tetragonisca angustu/a angustu/a quando colocados em meios de cultura para Escherichia coli

_e

_{Staphyfococcus}

_aureus.

Em _{Tetragonisca angustu/a, o pH médio do mel e}

4.2, _{possuindo coloração} muito

_variada

_entre

_as

_colméias,

_de

_{praticamente incolor}

a

castanho—escuro, _onde

encontram-se presentes

_{glicose, frutose, galactose, maltose, lactose,}

_sacarose,

melezitose

_e

refinose (lWAMA, _{1977), além}

_de

_{água, proteínas, enzimas}

_{e sais}

minerais.

KNOLL _{(1985) constatou}

_que

_a

_{proporção de indivíduos}

_de

Tetragonísoa

angustu/a encontrados

com

néctar

foi _{maiorno verão, com pólen no outono,}

_{sendo a}

coleta

de

_{resina, maior noinverno.}

Em

_estudos

_realizados

_no

_Campus

_da

_{Universidade de}

_São

_{Paulo (USP/SP);e}

abundante

no local, atrás,

_apenas,

de Trigona _spinipes

_e

_{Apis mellifera} (IMPERATRIZ-FONSECA

_eta/.,

_{1984b; KNOLL, 1985, 1990).}

RABELO ₍₁₉₉₇₎

_estudando

_{interação abelha—planta na}

_Reserva

_{Ecológica do}

Clube

_Caça

_e

_Pesca

_ltorcró

_de

_{Uberlândia-MG, considerou Tetragonisca angustula,} entre outras

_espécies

_{levantadas, como politróficas, por coletar néctar e/ou pólen em}

diversos recursos

florais— Em-

_seus

_dados,»

_esta

_{espécie aparece}

_{como o terceiro}

apideo

_{mais frequente na Reserva (128%),}

_atrás

_{de Apis mel/[fera (56%)}

_e

_Trigona spinipes (137%).

É _{notável o}

_sucesso

_de

_{dispersão da}

_{jataí, sobretudo em}

_áreas

urbanas. Contando com um _expressivo

_númerode

_alelos

_sexuais,

_{os efeitos}

_da

_endogamia

são

_{menos prováveis de ocorrer. KERR (1994) relata que em Ribeirão Preto, 0} número

de

colméias

_{de jataí é}

muito _{grande, facilitando}

_a

_{vida dos meliponicultores}

que criam

_essa

_abelha,

_bastando

_ter

_apenas

_{uma colônia em}

_{suas casas,}

_visto

que

a

área de

_{reprodução possui muito mais}

_do

_que

_as

_{44 colônias de meliponíneos}

sugeridas

porKERR _eVENCOVSKY _(1982).

KERR

_e

SlLVElRA ₍₁₉₇₂₎

_estudaram

_{() cariótipo}

_de

_várias

_espécies

_de

meliponíneos, encontrando 2n=34. POMPOLO _{(1992) refez}

_análise

_{citogenética em}

espécies de

Meliponinae, _{confirmando tais}

_{dados, e acrescentou}

_{o predomínio de}

cromossomos

_{submetacéntricose}

_{metacêntricos}

_para

_essa

_espécie.

0

controle genético da glicerol-B—fosfato

_{desidrogenase efeito, na}

_{maioria dos}

insetos, por dois loci: _um

_{gene que}

_se

_expressa

_{durante todoo desenvolvimento}

(G-3-PDH1)

e

outro, típico

da fase

adulta (G—3—PDH2). CONTEL

et

al. _{(1992) estudaram}

essa

enzima em 21

_{espécimes pertencentes a}

₁₂

_gêneros

_{de meliponíneos}

detectando

polimorfismo

_no

locus G-3—PDH1

_em

_{Tetragona clavipes-}

_e

_Tetragonisca

angustu/a angustu/a; polimorfismo doG-3—PDH2 foi _{detectado, também, em jatai.}

FALCÃO _{(1984) encontrou homologia' genética em Tetragonísca angustu(a}

1.3 - Biologia

molecular

BECKMANN ₍₁₉₈₈₎

_apud

_'FERREiRA

_e

_{GRATTAPAGLIA (1998) enfoca}

_a

mudança de paradigma genético,

da

GENÉTICA MENDELIANA _{(análise de}

genótipos

a

partir _{de fenótipos) para}

_a

_atual GENÉTICA GENÓMICA _{(análise direta}

das variações

do _DNA).

Com o advento

da

Biologia Molecular,— «as

técnicas de

_{trabalho com DNA}

constituem eximias

_ferramentas

_em

_estudos

_{aprofundados de genética, além}

_de

diversidade

_e

dinâmica

de

populações

_e

estudos

de

evolução pela

_capacidade

de

inferir

_dados

_{filogenéticos.}

KARY MULLIS, _na

_{década de}

_{80, desenvolveu}

_a

_tecnologia

_da

_Reação

_em

Cadeia da Polimerase (PCR—Polymerase Chain Reaction),

_que

_{lhe valeu o Prêmio}

Nobel

_de

_{Química em 1993. Tal técnica utiliza-se}

_de

_{uma polimerase termoestável}

(Taq DNA _{polimerase) que}

_atua

_{na amplificação de fragmentos de DNA.}

Em 1990, _em

_estudos

-

independentes,

WILLIANS

et

ai.

_e

_'WELSH

_e

McCLELLAND, utilizaram _{primers de}

_sequências

_{arbitrárias, de poucos}

_pares

_de

base,

_que

_{fianqueiam várias regiões complementares no DNA em estudo. A técnica}

foi _{denominada por DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD}

— Random

Amp/ified _{Polymorphic DNA) ou AP} — PCR _{(Arbitrariily Primed—Polymerase Chain}

Reaction).

A _técnica

_de

_RAPD,

_{baseada na}

_{amplificação de}

_segmentos

genômicos

múltiplos ao

_acaso,

a partir _{de primers arbitrários, tem sido muito utilizada}

_devidoà

sua

rapidez

e

facilidade. Eia tem sido

_{empregada para}

_{caracterizar populações,}

análises de

_pedigree,

_estudos

_{filogenéticos, mapeamento genético}

_e

_melhoramento

de plantas

e

animais domésticos (VALENTINi

et

_al.,1996).

WILLIAMS

_et

al. _{(1990) relatam}

_que

_diferenças

_{de apenas}

_{um par de}

_bases

são

suficientes

_{para não}

_{haver anelamento}

_dos

_primers.

Diz-se que

a

técnica RAPD

_apresenta

_{dominância dos marcadores, ou seja,}

para

um indivíduo _{homozigoto dominante para um determinado aielo, amplificam—se}

dois fragmentos de mesmo

_peso

_{molecular, que}

_se

_{sobrepõem. Da mesma forma,}

para os

heterozigotos, há amplificação

de

_apenas

_{um alelo, com o mesmo}

_peso

molecular, porém o _{fragmento gerado migrará como os do homozigoto. Neste caso,}

Na literatura, _{diversos trabalhos com}

_marcadores

_{RAPD têm sido}

encontrados, sobretudo com relação

_{rãutilidade para}

_{confirmação}

_da

_taxonomia

baseada

em

caracteres

morfológicos

de

muitas

_espécies.

KAZAN

_et

al. ₍₁₉₉₃₎

estudaram

o

_parentesco

_genético -

e

variação em

Sty/osanthes

guiamensis

(LEGUMINOSAE), GONZÁLEZ

_e

_{FERRER (1993) estudaram polimorfismos em}

Hordeum sp

e

HOWELL

_et

al. _{(1994)utilizaram a técnica de RAPD para identificação}

e

classificação

de

_{Musa sp} .

HUNT

_e

PAGE _{(1992) utilizaram-amplificação}

_{ao acaso de}

_{fragmentos de}

DNA _{polimórficos (RAPD) a partir de cruzamentos artificiais de machos}

e

rainhas de Apis mellifera. _{Eles definiram}

_{padrões de herança}

_para

_insetos

_{haplodiplóides,}

classificados em 4 tipos de polimorfismos: _{tamanho de fragmentos, manifestação de}

bandas

_{diplóide-especificas,}

_{presença/ausência de banda}

_{e intensidade de bandas.} Os dois últimos _tipos

_{são herdados}

_{de maneira dominante, observando}

segregação

mendeliana na progênie haplóide

e

diplóide.

Marcadores _{RAPD mostram—se muito eficientes no}

_mapeamento

_{genético. No}

clássico de

HUNT

_e

PAGE _{(1995) foram}

_mapeados

_{3110 CM do genoma}

_de

_Apis

mel/ifera, _{verificando grupos de}

_marcadores

_{ligados. Estimaram em}

aproximadamente 3450 CM _o

_tamanho

_{total do genoma}

_e

_{observaramumataxa}

de recombinação muito alta

_{para esta}

abelha.

STILES

_et

al. _(1993),

_estudando

_parentesco

_{entre cuitivares ,de mamão}

(Carica

_papaya

L.) _{por RAPD, consideraram a técnica rápida, precisa}

_e

_{sensível para}

análises

genômicas.

SCHlERWATER

_e

_{ENDER (1993) utilizaram=13}

_marcas

_{comerciais diferentes}

de

DNA _{polimerase termoestável, encontrando diferenças quantitativas}

e

qualitativas

nos padrões de

amplificação obtidos

_a

_partir

_das

_{várias combinações}

_testadas.

MEUNIER

_e

GRlMONT _{(1993) testaram a reprodutibilidade da técnica}

utilizando dois termocicladores,

_{três marcas}

_de DNA _{polimerase termoestável, DNA}

de

três

_espécies

_{de bactérias}

_e

_{encontraram diferenças nos}

_padrões

_de amplificação. Sugeriram

_que

_os

_{dados resultantes de}

_RAPD

_{somente são}

_confiáveis

com

_a

_{padronização da técnica, incluindo otimização}

_{das concentrações}

dos

reagentes e

utilização

constante da

_{mesma aparelhagem.}

WEEDEN

_et

al. _{(1992) analisaram}

_a

_{reprodutibilidade dos fenótipos RAPD}

Concluíram que tais modificações produzem diferenças nos

padrões

de

bandas,

mas

a

técnica foi útil _{na identificação de}

_{variedades e}

_{construção de}

_mapas

_genômicos.

Na _agricultura,

marcadores

RAPD têm sido

usados

na

caracterização

de germoplasmas, facilitando

a

escolha

dos indivíduos

_para

cruzamento e»

a

consequente expressão

de bons híbridos.

O número de primers fa

serernusados

_{numa análise}

de polimorfismo?deve

estar

relacionado

aos

modos de reprodução,

sistemas

de cruzamento

_e

níveis de variação genética

das espécies

estudadas

Isto- _porque,

_para

_espécies

muito

polimórficas talvez não haja

necessidade da

utilização de muitos primers, contrastando, porem, com o

grande

número

de

primers requeridos

_{para analise}

de indivíduos

_{resultantes de propagação}

_vegetativa (LIU

et

al., 1994). WlLKlE

et

al.

(1993)

ressalvam que

o perfil

de bandas do

RAPD não

se

torna mais complexo com

o aumento de tamanho do genoma.

Em Meliponinae, encontram=se

_poucos

-

estudos sobre

variabilidade por

marcadores

RAPD. OLIVEIRA _{(1998) em}

_{estudo sobre}

_{divergência genética por}

marcadores

RAPD em Tetragonisca angustu/a, provenientes

de

3

_países

(Brasil,

Argentina

e

Panamá), estimou

a

distância genética entre populações de diferentes

locais. A 13%

de

dissimilaridade

_genética

houve

a

formação

de duas clades

(entituladas de grupos 1

e

_2). Encontrou-se uma distribuição geográfica mais

abrangente

para o grupo 2,

correspondente

a

Tetragonisca

angustu/a

fiebngi, _{do que} o relatado pela literatura, além

de marcadores

moleculares que disoriminam

estes

2

10

2. _OBJETIVOS

Estimar & divergência genética, _por-

_marcadores

_{RAPD, -em}

populações

de Tetragonisca angustu/a

_e

correlacionar

_{as taxas encontradas}

_{com outros}

_dados

_de

11

3. MATERIALE MÉTODOS

3.17

-Materiai biológiço

Coletou—se_{operárias campeiras, na}

_{entrada das}

_{colônias, utiiizando-se puça.} As

_amostras

_{foram fixadas imediatamente em álcool absoluto, ou levadas}

diretamente

_ao

_freezer

— 80ºC. No total, trabalhou-se com 18 colônias de

Tetragonisca

_{angustu/a e}

_{uma de Tetragona clavipes,}

_esta

última _{funcionando como}

outgroup. As

amostras da

Argentina correspondem

à

Tetragonisca

angustu/a

fiebrigi,

enquanto as amostras

do Estado de Minas Gerais (Sul e Triângulo)

são

)

))))))))

))

)))))))

)

)))

TABELA 1: _Localidade

_e

_{identificação}

_{das amostras de}

Tetragona clavipes utilizadas no estudo. =

Bloco 2H "

raco-Nune

F M.

12

Tetragonisca angustu/a

_e

"

Uberlanda 1

Campus Umuarama1UFU

Horta _{experimental Nunes-Silva,C. G.}

Uberlândia2

Campus Umuarama/UFU

Bairro _{Umuarama Antunes,L.}

Uberlândia3 '

Uberlândia

(MG) _{Orelhão Bloco25}

Franco-Nunes, F.M. _Uberlândia4 Campus Umuarama/UFU

Almoxarifado _{Franco-Nunes,F. M. Uberlândia}

5 '

Campus 'UmuaramalUFU,

Bairro Marta _{Helena Muniz, C. Ituiutaba}

1

Ituiutaba _{Bairro Mana Helena}

Muniz,c. _{Ituiutaba 2} '

% (MG) _{Fazenda UEMG}

Muniz, c. _{Ituiutaba 3}

g, *

Grissom, R.A. _Uberaba 1

É Uberaba *

Grissom,R.A. _Uberaba2

"É, (MG)

É: _{20º43'666" S/42º44'862“ Bezerra, J.}

M. D. _{SãoMigueldoAnta 1}

E ww

São MigueldoAnta _{20º41'104" Sl42º43'441" Bezerra, J.}

M. D. _{São Migueldo Anta2}

(MG) _W

20º42'535" S/42º43'297" _{Bezerra, J. M. D. São Migueldo}

_Antª

W'

20º43º066" Sl42º44'862” _{Bezerra, J.,M. D. São,MigueldoAnta}

4

W ]

20º40*104" _{S/42º43'441" Bezerra, J.M. D. São}

Migueldo

Anta?

W

Aristóbulo del Valle *

(Argentina) _{Pascual, N. A.}

An'stóbulo deValle

Posadas *

Pascual, N. A. _Posadas1

(Argentina) *'

Pascual, N. A. _Posadas2 '

Bloco2D,

Tetragona clavipes _{Campus Umuarama/UFU Franco-Nunes,F. M.}

13

3.2 -

Extração de

_DNA

Antes

_de

iniciar

_a

_{extração,—utilizou—se lupa para}

_{análise das}

patas- _posteriores

de

_cada

_{abelha, afim}

_de

_{confirmar, pela}

morfologia _{da unha, não-bifurcadas,}

_{se os}

indivíduos. _{eram operárias.}

_Os

_{machos apresentam unhas}

bifidas.

_Cada

_colôniafpi

representada

_por um bulk de 5

_abelhas

_{operárias. Os indivíduos}

_conservados

em

álcool, _{foram reidratados em?}

_tampão

_{-(TrisCI-0.01M,—}

pH 8.0, NaCl 0.1M'

_e

_'—MgCI2

0.001M), _{para retiraro}

_excesso

_{de álcool.}

'

Para

_extração

_de

DNA

_genômica

_dos

_{iba/ks, utilizou-se}

_o

protocolo. de

PAXTON

_et

al. _{(1996), com modificações:} 1 _- Cinco

_abelhas

_foram

_colocadas

em

cadinhos de

_{porcelana, adicionando—se} nitrogêniolíquido

_{e maceradas}

_{em seguida;}

2 '- _{Adicionou—se 500pL}

_de

Tampão—-_{SET (NaCl 0.15M, Tris-HCl 0.02M, EDTA}

1mMpH 8.0), transferindo o _{material para microtubo estéril de 1.5mL;} 3 —Adicionou—se

em

cada

_{microtubo18pL}

_de

_{proteinase K'(10mg/mL) e 22uL}

de

_{SDS 25%, homogenizando}

_a

_{solução em vórtex,}

e incubando—a_por2h

_a

_55ºC;

4- Adicionou—se _{15pL de RNAse por microtubo}

_e

incubou-se por 1h

_a

_37ºC; ,

5 — Adicionou-se 430uL de

NaCl 5M _{por microtubo, centrifugando o material}

em seguida, por 10min

_a

_13000rpm; 6 — O

sobrenadante

foi

transferido

_para

_{um novo microtubo de}

1.5mL,

adicionando-se 215pL de _{Tris-HCI (0.01}M _{pH8.0) pormicrotubo; '}

7 — Completou—se

o

volume

_dos

_{»microtubos- com etanol}

_995%

(—20ºÇ),

estocando

o material em

freezer

—20ºC _{por 2h ouovernight;}

8 - _{Centrifugou-se os- microtubos por» 15min}

& _{13000rpm, retirando-se}

_em

seguida

o etanol

_{995% e acrescentando-se}

_{500pL de Tris-HCl (0.01M}

pH 8.0) _para

ressuspender

opel/et

_e

_completando

_o

_volume

_do

_{tubo comfenol,}

homogeneizando

() material em vórtex

_e

centrifugando-se, em seguida, por5min

_a

_10000rpm; 9 — O

sobrenadante

foi

transferido para

um novo tubo

_e

o _{volume completado}

com _{clorofil (clorofórmio/álcool isoamil, 24z1,}

respectivamente),

_{homogeneizandoo}

material em

vórtexe

_{centrifugando-se,}

_em

_{seguida,'por—-5mina}

10000rpm; 10 - Transferiu-se _o

_sobrenadante

_{para um novo}

microtubo, _{repetindo-se o}

14

11 — Retirou-se o etanol 99,5%

e

adicionou-se etanol 70%

_(20%),

invertendo-se

os

microtubos

_para

_{lavar bem-o pel/et}

_e

_{centrifugando—se, em seguida, por}

15min

a

13000rpm;

12 - Retirou-se

_{cuidadosamente}

o— etanol

70%

afim

de não deslocar

-o _pel/et, deixando o material

_{secar a}

_{vácuo por, no mínimo, 3h} ;

13 - Redissolveu—se

_opel/et

_{em 100 pL}

_de

_{Tampão TE (Tris—HCl lomMi}

EDTA

1mM).

3.3 »—

Qualificação e

quantificação

_{-do DNA}

-e

_{preparação 'de soluções.}

_de

trabalho

Confirmou-se

_a

_qualidade ,

das

'

amostras

em= gel

de agarose 08%.

A

quantificação do DNA foi _{feita em espectrofotômetro}

_para

_{leitura de}

_absorbância

&

260nm, utilizando-se 10 pL

de cada

_{amostra diluídos 100}

_vezes

_em

_água

_{ultra—pura.}

Calculou-se a

_{concentração}

de DNA

_a

_{partir da fórmula:}

[DNA]= _{ABS (260)=x50x}

_Fator

_de

_Diluição = _.

Em

_{seguida as amostras}

_{de DNA foram diluídas para uma}

concentração

de 5ng/pL

_e

constituiram

_as

_{soluções de}

_trabalho.

3.4 -

Amplificação do

_DNA

_por

_RARD

Por meio

_de

_uma

_bateria

_de-

_reações,

_{utilizando-se}

_{duas amostras}

de localidades diferentes, selecionou-se pn'mers longos

_e

curtos _{(10 Mers, da Operon} Technologies). Assim, utilizou—se _{15 primers informativos, ou seja,}

que

'denotaram

um bom

_padrão

_de

_bandas

_{para posterior análise. Os pn'mers utilizados}

)

)

)))))))))))))

)

)

))))))

))))))))))))))

)

)))))))

)

)

)

15

TABELA 2: Primers utilizados

e suas respectivas seqúências de

nucleotídeos.

OPC12 '

Tarcrccc

OPC13 AAGCCTCGTC

OPC 14 TGCGTGCTTG

OPC18 ' _TGAGTGGGTG »

OPF 09 . CCAAGCTTCC

.,, ? OPL 04 GACTGCACAC

É OPMos TCTG'ITCCCC *

3

opr

11 TTCCCCGCGA

OPU01 - ACGGACGTCA

OPU 05 GGGTI'TGGCA

OPV oz AGTCACTCCC

opv

03 CTCCCTGCAA '

opz

13 , GACTAAGCCC

8

MAU BZ GCCAGGCAGCAAG'ITCTCAGTAAT

—' _{MAU 502 CAGCATI'CAGGGCTAACATC}

Cada reação de

amplificação continha um volumefinal de 20pL, com:

10.2er deágua ultrapura,

2pLde Tampão (Taq) 10X

2pLde dNTPs4mM.(dATP, dCTP, dGTP;dTTP)

1uLdeMgCIz 10mMIpL

2.5pL de primer4pmo|lpL

0.3pL de Taq DNA _{polimerase5U/uL}

))

)

)

)

₎

)

)))))

))

)

)

)

)

))

16

Acrescentou-se uma gota de óleo mineral (w20pL) _{para evitar}

_{a evaporação}

da

solução.

Foram

feitas

amplificações- _{do material em termociciador} M. _{J. Research—inc.,}

modelo PTC 100, _{por meio dos}

_{seguintes passos:}

"DESNATURAÇÃO: 94ºcnmin

ANELAMENTO DOSPRIMERS:35ºc11 min

EXTENSÃODASFITAS: 72ºC/2min

DESNATURAÇÃO: 94ºc1105ec

,ANELAMENTODOS-PRWERS:40ºCí20sec

EXTENSÃO DASFLTAS;72Bc/2min

EXTENSÃO FINAL DAS FITAS;72ºC/5min

Os

produtos ampiificados foram

_separados

_{por eletroforese em gel-}

_de

agarose 12%

com

_tampão

Tris-borato EDTA (TBE) 0.5X. O corante de DNA foi

brometo

de

etídio, adicionando-se -1pL em

cada

100mL

de

gel. Os resultados _foram visualizados

_após

2 _{horas de corrida}

_a

_{150V, em transiluminador UV}

_e

_fotografados

emVDS _{Image System} —_Pharmacia.

As

_reações

_{contiverem um controie negativo- com todos os produtos}

_das

reações,

exceto DNA,

_para

verificar

_{se os reagentes}

_{não estavam contaminados}

comDNA _exógeno.

17

3.5 -

Análise de

dados

Apartir das bandas

obtidas foi_{«montada uma matriz binária (1 —}

_{presença de}

banda e

O —

ausência de

banda) para análise de distância genética pelo método de

Porcentagem de Desacordo

_{e análise de clusterpelo}

_{Método Não—ponderado} qe Agrupamento

_{aos Pares}

_{(UPGMA), com o auxílio do programa STATISTICA 4.5A.} Estimou-se

_a

_divergência

_{genética entre}

_as

18— colônias de Tetragonisca

18

4. _RESULTADOSE DISCUSSÃO

O _{protocolo de}

_extração

_{de DNA seguido}

_{v_}

_PAXTON

_et

_al.

_{(1996)_}

_é

_rápido

e

não utiliza _{produtos tóxicos.} No _{entanto, a qualidade do DNA}

_observada

_{por meio}

do pe/tet nos bulks não foi _comum,

_{apresentando-se}

_{“sujo”, quando deveria}

_ser

transparente.

_{Observou-se dificuldade em}

_ressuspender

_{o pel/et,}

_notando-se

_muitos fragmentos

_compactados.

-A

_{quantidade de}

_{DNA extraída também foi—relativamente}

inferior, _{comparada com}

_dados

_{obtidos com o uso de outros protocolos em}

_etapas

preliminares. As modificações feitas

_no

protocolo- foram

_as

inclusões

_de

_RNAse,

fenol

_e

clorofil

_(passos

_{4, 8}

_e

_{9, respectivamente), comuns em outros protocolos}

_e

ausente

neste.

Feitas

_as

modificações,—o

_presente

_{protocolo tornou-se eficiente na}

extração extração de DNA

das amostras estudadas.

Vários

_trabalhos

_{têm ressaltado a}

- dificuldade na

análise das bandas

polimórficas

_e

_{monomórficas produzidas por RAPD, visto que dois fragmentos de}

mes-mo

_peso

_{molecuiari comum-entre}

_duas

_ou-mais

_amostras,

_{podem—siginificar um}

alelo homólogo (herdado do ancestral) ou _{homoplásico (aparecimento}

_independente

na população). Assim como

_em

_outras

_{classes de marcadores}

_moleculares,

encontra-se

dificuldade na análise

_e

_{interpretação}

_{das bandas geradas.}

_{Na análise}

de

RAPD

_{deve haver}

_{flexibiiidade do pesquisador-em}

_{selecionaros marcadores}

_mais

informativos, _{ou seja, que}

_apresentam

_{melhor nitidez (FERREIRA}

_e

GRATTAPAGLIA, 1998).

Dessa

forma,

_{considerando apenas bandas intensas, pode-se}

_verificar

uma alta taxa de polimorfismo _{em Tetragonisca angustula}

_e

_{Tetragona clavipes, para}

cada

primer analisado.

Os

15 _{primers utitizados geraram 142}

_{posições de bandas}

informativas (Tabela 3), uma média

de

9.46

_posições

de

bandas

_por primer,

das

)

)

₎

)))

)')')ª)')')')))l)ª)')l)')')4)l)l)')l)º)l)l)l)!)lll)v)l)l)>)l)

)))))l)))')))))l)i)l)i)n

19

foram

detectadas

101

_posições

de

bandas

_para T. _{angustuia, com}

495% de

polimorfismo.

TABELA 3: Relação do

númerode posições de bandas

ampliticadas

para cada

,um

dos

primers utilizados.

,12 ' '

12 " 12 o

OPC13 10 9 1

OPC 14 6 1

OPC1'8 8' _7"'

1 '

QPF 09 , 10, , 9 1 ,

OPL04 7 2

OPM 08 8 O

OPT11 _{15 14} 1

CPU01 8 5 3

-OPU 05 10 7 3

OPV02 9 8 1

opv

03 11 11 _o

OPZ13 7 6 1

MAU 52, 7 7 o

MAU ₅₀₂ 11 _{9 2}

TOTAL 142 125 (88.03%) 17 (11.97%)

LU

e

RANK _{(1996) encontraram alta taxa polimórfica em Megachile}

rotundata, sugerindo

_que

«a

técnica

de

RAPD é mais

eficiente

na detecçãode

variabilidade genética quando

comparada aos

níveis obtidos por análise de aloenzimas. Os polimorfismos

genéticos encontrados

em Tetragonisca angustui/a têm sido mais representativos

_{para estudos}

de variabilidade que

os

descritos por

FALCÃO₍₁₉₈₄₎

_estudando

oito

sistemas

enzimáticqs.

C-HALMERS

_et

al; ₍₁₉₉₂₎

_{aflrmamque RAPDé}

_{uma ótima}

_{ferramenta para}

22

Essa

_{diferenças de valores de divergência}

_encontrados

podem

ser

decorrentes

_{de diferenças no número amostral}

_e

_{também da metodologia} empregada. As

_{seguintes observações}

_podem

_ser

_feitas:

1 - _{Enquanto OLIVEIRA(1998)utilizou *Taq DNA}

polimerase proveniente da Universidade Federal do Rio Grande do _{Sul (CENBIOT/RS),}

_{neste estudo a}

_mesma enzima foi _adquirida

_{da empresa}

P—ham1acia.-2 - As

amostras

_{utilizadas por OLIVEIRA (1998) foram}

representadas

por

apenas

um individuo

_{de cada}

_{localidade.Aqui, utilizou—se bulk}

_de

_{5 indivíduos}

para

representar cada

_{colônia amostrada, resultando numa maior diversidade genômica.}

No _{entanto, OLIVEIRA (1998)}

_estudou

_uma

_extensão

geográfica mais

_amplale

contínua, ao

_{passo que neste}

_trabalho

_{analisou-se apenas}

_{3 localidades,}

separadas

geograficamente

_e

com número

_amostral

_{diferente entre}

_elas

_{(dez do Triângulo}

Mineiro, cinco do Sul de Minas

_{e três}

_{da Argentina).}

3 - Os protocolos

_de

_extração

_de

_{DNA nos dois trabalhos foram distintos.}

4 - OLIVEIRA_{(1998) utilizou 18primers (11 curtos}

_e

₇

longos)

_enquanto

_que,

para

este

estudo, foram utilizados _{15 (13 curtos}

_e

_{2 longos).}

_Apenas

_{dois dos} primers utilizados em

ambos

os trabalhos foram

_{correspondentes, sendo}

_{um longo}

(MAU BZ)

_e

_{um curto (OPL 04).}

O _{número amostral para}

_cada

_{localidade não foi}

padronizado devido-a pouca disponibilidade de exemplares fora do Triângulo Mineiro. _{Preferiu-se utilizar muitas}

amostras

dessa

região,

visando

estimar

_a

_{divergência genética}

_{para-esta espécie}

_de forma precisa,

a

fim _{de fornecer subsídios para}

_estudos

_posteriores.

De

_qualquer

_forma,

_ambos

_{trabalhos detectaram polimorfismos-genéticos} significativos para Tetragonisca angustu/a, indicando diversidade biológica

dessa

espécie, seja

ecológica, comportamental,-

_metabólica

_e

_{ocorrência geográfica, que}

acabam

_{favorecendo a aclimatação}

_das

_{populações em}

_seus

_{nichos. As}

variações genotipicas

_encontradas

_dentro

_de

_uma

_espécie,

_expressa

_{pelo fenótipo,}

favorece,

_a

melhoria na

_{adaptação das}

_{populações em}

_seus

_habitats.

DOBZHANSKY

₍₁₉₇₀₎

_{apud- FALCÃO (1984) enfatiza que}

as

modificações ambientais poderiam

_{ser desastrosas}

_para

_{populações homozigóticas, por não} possuírem uma variabilidade alélica suficiente para

adequar-se às

_mudanças.

Apesar

de pertencerem

a

mesma-tribo,

_osdados

_{obtidos mostraram pouca} homologia entre Tetragonisca. angustula

e

_{Tarragona clavipes: 69% de} dissimilaridade

_genetica.

_{Dados similares foram obtidos por OLIVEIRA}

l

))))l

)

)))))))

)

o

cluster

_{Tetragonisca. angustu/a com Apis mel/ifera (51%) e Tetragonisca buchwaldi} (519%).

A

_{técnica de}

_{RAPD permite uma}

_análise

_mais

_acurada

em investigações de

parentesco

_{entre populações de uma mesma}

_espécie,

_{ao invés de}

espécies

menos relacionadas (GONZALEZ

_e

F_{ERRER,-19953).}

Um _exemplo

_de

_polimorfismo

_{genético pode}

serrcomprovado pelo

_padrão-de

posições

de

bandas

na Figura 2, _{resultado da amplificação}

_das

₁₈

_amostras

_de

populações de

Tetragonisca

_angustu/a

_e

-1 amostra

de

_população

_de

Tetragorra clavipes por meio _{do primer curto OPM 08.}

_{Para este}

_{primer foram}

analisadas-8

posições de bandas de

forte intensidade. A _{técnica eletroforétioa possibilita}

_a

detecção

_{de variantes alélioas, possibilitando o}

_{estudo de}

_{loci polimórficos}

e

monomórficos (FALCÃO; _{1984);HARTL-(1980)}

_apud

_{FALCÃO-(1984) considera}

—a

eletroforese como

_a

técnica mais útil_{já idealizada para revelar variação genética.} A _{variabilidade genética}

_é

_importante

_{à adaptação}

e/ou

_{à processos}

_de

especiação

e,=

dependendo

de

amplitude,-

denota oportunidade