Departamento de Nutrição
Programa de Pós-Graduação em Nutrição Humana
LAYANE MILLENA SOARES CRISÓSTOMO
Efeitos de extratos de café na proteção contra oxidantes em Saccharomyces cerevisiae
BRASÍLIA-DF 2014
LAYANE MILLENA SOARES CRISÓSTOMO
Efeitos de extratos de café na proteção contra oxidantes em Saccharomyces cerevisiae
Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Nutrição Humana da Universidade de Brasília como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Nutrição Humana.
Área de concentração: Bioquímica Nutricional
Orientadora: Profa. Dra. Élida Geralda Campos Co-orientador: Prof. Dr. Túlio César Ferreira
BRASÍLIA-DF 2014
Universidade de Brasília Faculdade de Ciências da Saúde
Departamento de Nutrição
Programa de Pós-Graduação em Nutrição Humana
Comunicamos a aprovação da dissertação de mestrado da aluna Layane Millena Soares Crisóstomo, intitulada “Efeitos de extratos de café na proteção contra oxidantes em Saccharomyces cerevisiae”, submetida ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição Humana do Departamento de Nutrição da Universidade de Brasília.
Dra. Élida Geralda Campos
Orientadora – Departamento de Biologia Celular/ Instituto de Ciências Biológicas (UnB)
Dra. Alessandra da Silva Dantas
Membro - Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ)
Dra. Nathália Marcoline Pelucio Pizato Valério
Membro – Departamento de Nutrição – Universidade de Brasília (UnB)
Dra. Viviane Castelo Branco Reis
Suplente – Departamento de Biologia Celular (UnB)
Este trabalho é dedicado aos meus pais, Edson Inácio Crisóstomo e Ivete Soares Crisóstomo.
AGRADECIMENTOS
Inicio os meus agradecimentos a Deus pelo dom da vida, pela força que me conduziu até aqui.
À minha família. À minha avó Dalila, pela grande sabedoria, pelas conversas, pelo exemplo de vida. Aos meus pais, Edson e Ivete, pelo amor incondicional, pela preocupação, por apoiarem as minhas decisões, por me incentivarem nos estudos, no crescimento pessoal e profissional e pelo suporte diário. À minha irmã Luana, que tem seguido os passos da pesquisa, peço desculpas pela ausência.
Ao Rômulo, pela paciência na minha ausência, pela compreensão, por me acompanhar no laboratório nos fins de semanas, mesmo no cansaço e mesmo sem entender, pelo companheirismo. Nos momentos mais difíceis me confortou e me fez acreditar que tudo ficaria bem. Pelos momentos maravilhosos, pelas risadas, conforto, por tudo.
À Professora Dra. Élida, pela paciência, pelos ensinamentos, pela dedicação no ensino e por ter acreditado e me proporcionado o conhecimento da ciência.
Ao Professor Dr. Túlio, sempre disposto a esclarecer todas as dúvidas, pelos ensinamentos de bancada, pelo apoio e preocupação com o nosso grupo de pesquisa.
À Dra. Alessandra Dantas, que me ajudou muito (não sei como agradecer) no final da pesquisa, nos últimos momentos. O mundo precisa de pesquisadores como ela, que com humildade ensina e recebe as pessoas com o coração aberto.
Aos amigos do nosso grupo de pesquisa sobre Estresse Oxidativo, pela convivência diária, pelas risadas, pelos estudos, enfim, por tudo (Viviane, Diana, Mariângela, Carlos, Walyson, Raphael, Nestor, Artur, Samantha e Lucas).
Aos amigos da Biologia Molecular, a Patrícia, a Tayná, pelas horas de descontração. A todos os outros colegas de todos os outros laboratórios.
Ao grupo de Radicais Livres do Professor Dr. Marcelo Hermes, por ter concedido a utilização de seu laboratório para realização de alguns experimentos, especialmente a Luana e Daniel.
Às professoras Dra. Alessandra da Silva Dantas, Dra. Nathália M. P. Pizato Valério e Dra.Viviane Castelo Branco Reis por aceitarem participar da minha banca de defesa.
Aos funcionários da Biologia Molecular de fundamental importância, Dona Ivonildes, Dona Fátima e Thompson.
Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Nutrição Humana.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Superior (CAPES), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e ao Decanato de Pesquisa e Pós-Graduação da UnB (DPP-UnB) pela concessão da bolsa de estudos e fomento à pesquisa.
A todos que de alguma forma contribuíram para que esse projeto fosse concluído, meus agradecimentos.
“Deus me conceda falar com propriedade e pensar de forma correspondente aos dons que me foram dados, porque Ele é o guia da sabedoria e o orientador dos sábios. Em seu poder estamos nós, as nossas palavras, a nossa inteligência e as nossas habilidades. Ele me concedeu o conhecimento exato de tudo o que existe, para eu compreender a estrutura do mundo e a propriedade dos elementos...”
(Sabedoria 7, 15-17)
RESUMO
O aumento da população idosa traz preocupações importantes para as políticas públicas de saúde, devido à prevalência de doenças crônicas não transmissíveis e ao aumento dos gastos com saúde pública. Grande parte dessas doenças tem sido associada com o estresse oxidativo, que é causado pelo desequilíbrio entre pró-oxidantes e antioxidantes. Os antioxidantes estão presentes na dieta e, portanto, surgem como alternativa para prevenir ou reduzir os danos oxidativos. Nesse contexto, o café, uma bebida consumida mundialmente, contribui para a ingestão de antioxidantes, devido a compostos que ocorrem naturalmente nos seus grãos.
Vários estudos publicados investigaram in vitro as propriedades antioxidantes do café, no entanto, não tem sido descrito na literatura ensaios que avaliam o efeito da pré-exposição de extratos de café em Saccharomyces cerevisiae. O uso de células vivas representa um modelo adequado para avaliar o efeito antioxidante na capacidade de sobrevivência da célula em estado de estresse oxidativo. Considerando os danos que as espécies reativas de oxigênio (EROs) podem causar nas biomoléculas e que antioxidantes naturais podem diminuir ou prevenir estes danos, este trabalho teve como objetivo principal avaliar a capacidade do café orgânico, em comparação com o café convencional, em proteger as células de Saccharomyces cerevisiae contra o dano oxidativo na exposição ao peróxido de hidrogênio (H2O2). Para isso foram testados extratos aquosos e etanólicos de três diferentes cafés (café acaiá cerrado torrado, café acaiá cerrado verde e café convencional torrado) no ensaio de viabilidade celular pelo teste de “spot” usando a linhagem S288c de levedura. Os extratos dos três cafés testados conferiram uma proteção antioxidante em todas as concentrações testadas (0,18 mg/mL a 10 mg/mL). Especificamente, as menores concentrações tornaram as células menos susceptíveis à ação do H2O2 5 mM. Aparentemente, o extrato aquoso apresentou maior proteção em relação ao extrato etanólico. Não houve diferença significativa na proteção das células pelos diferentes extratos de café torrado. Portanto, o extrato do café acaiá cerrado torrado foi escolhido para avaliar a capacidade do café (na presença de H2O2 1mM) em reestabelecer o crescimento de S. cerevisiae em placa de 96 poços. Foram testadas oito concentrações (0,0009 mg/mL a 0,2 mg/mL) de extrato de café em quatro linhagens celulares (S288c, EG 103, EG 110 e EG 118). Nessas condições, nenhuma concentração de café foi capaz de reverter o dano causado pelo H2O2. Contudo, os resultados de teste de “spot” indicam que o café apresenta um significativo potencial antioxidante em células de leveduras pré-expostas a seus extratos, podendo servir como um importante alimento funcional com ação protetora. Como perspectivas, são necessários outros testes para avaliar diferentes solventes de extração e determinar quais as concentrações ideais para a prevenção do dano celular.
Palavras-chave: antioxidantes, café, peróxido de hidrogênio, Saccharomyces cerevisiae.
ABSTRACT
The increasing elderly population brings important concerns to the public health policies, due to the prevalence of non-transmissible chronic diseases and increased expenditure with public health. Many of these diseases have been associated with oxidative stress, which is caused by an imbalance between oxidants and antioxidants. Antioxidants are present in the diet, and thus appear as an alternative to prevent or reduce oxidative damage. In this context, coffee, a beverage consumed worldwide, contributes to the intake of antioxidants, due to naturally occurring compounds in its grains. Several published studies have investigated the in vitro antioxidant properties of coffee, however, assays that evaluate the effect of pre-exposure of coffee extracts in Saccharomyces cerevisiae have not been described. The use of living cells is an adequate model to evaluate the antioxidant effect on the survival ability of the cell in a state of oxidative stress. Considering the damage that reactive oxygen species (ROS) can cause to biomolecules and that natural antioxidants can reduce or prevent this damage, this study aimed to evaluate the ability of organic coffee, compared to conventional coffee, in protecting S. cerevisiae cells against oxidative damage on exposure to hydrogen peroxide (H2O2). Aqueous and ethanol extracts of three different coffees (roasted and green organic coffee and roasted non-organic coffee) were tested in the cell viability spot test using the S288C yeast strain. Extracts of the three coffees conferred an antioxidant protection at all concentrations tested (0.18 mg/mL to 10 mg/mL). Specifically, the lower coffe extract concentrations made the cells less susceptible to the action of 5 mM H2O2. Apparently, the aqueous extract showed higher protection compared to the ethanolic extract. There was no significant difference in the protection by the two roasted coffee extracts. Therefore, the roasted organic coffee extract was chosen to assess the ability of coffee (in the presence of 1 mM H2O2) to restore the growth of S. cerevisiae on a 96 well plate assay. Eight coffee extract concentrations (0.0009 mg / ml to 0.2 mg / ml) were tested in four yeast cell strains (S288c, EG 103, EG 110 and EG 118). Under these conditions, no concentration of coffee was able to reverse the damage caused by H2O2 and restore growth. However, the results of the spot test indicate that coffee has a significant antioxidant activity in yeast cells pre-exposed to its components, and may serve as an important functional food with protective action. As perspectives, other tests for evaluating different extraction solvents and determine the optimal concentrations for the prevention of cellular damage are needed.
Keywords: antioxidants, coffee, hydrogen peroxide, Saccharomyces cerevisiae.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Sequência da redução do O2 a H2O...19
Figura 2. Ilustração do metabolismo mitocondrial de EROs. Formação do ânion radical superóxido (O2·-) pela redução monoeletrônica do O2.....20
Figura 3. Orbitais moleculares de algumas EROs ...21
Figura 4. Evolução do consumo interno de café...27
Figura 5. Classificação dos polifenóis...30
Figura 6. Café Serrazul...33
Figura 7. Efeitos da pré-exposição (durante a noite) aos extratos aquosos dos cafés orgânicos Acaiá torrado e Acaiá verde e do café convencional no crescimento de Saccharomyces cerevisiae S288c...54
Figura 8. Efeitos da pré-exposição (durante a noite) aos extratos etanólicos dos cafés orgânicos Acaiá torrado e Acaiá verde e do café Convencional no crescimento de Saccharomyces cerevisiae S288c...57
Figura 9. Efeitos da pré-exposição (período de seis horas) aos extratos aquosos do café orgânico Acaiá torrado no crescimento de Saccharomyces cerevisiae S288c...60
Figura 10. Determinação da concentração de H2O2 que provoca parada de crescimento da levedura S. cerevisiae (a) S288c, (b) EG 103, (c) EG 110 e (d) EG 118...61
Figura 11. Crescimento de leveduras S. cerevisiae expostas a H2O2 1 mM...63
Figura 12. Determinação da concentração de extrato aquoso do café Acaiá torrado que exerce efeito de retorno ao crescimento quando incubado juntamente com H2O2 1 mM nas culturas de S. cerevisiae (a) S288c, (b) EG 103, (c) EG 110 e (d) EG 118...64
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição do café torrado (arábica)...28 Tabela 2. Teor de fenóis totais em vegetais e bebidas...31
LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS
●OH: Radical hidroxil
µg: Microgramas
µL: Microlitros
ABTS: Azino-etilbenzotiazilina-6-sulfonato ATP: Adenosina-5-trifosfato
CAT: Catalase
CGA: Ácidos clorogênicos
CTE: Cadeia transportadora de elétrons
CuZn-SOD: Superóxido dismutase que contém cobre e zinco DNA: Ácido desoxiribonucleotídeo
DPPH: Difenilpicril-hidrazil
EROs: Espécies reativas de oxigênio GPx: Glutationa peroxidase
GSH: Glutationa (forma reduzida) GSR: Glutationa redutase
GSSG: Glutationa oxidada GST: Glutationa S-transferase H2O2: Peróxido de hidrogênio KPi: Tampão fosfato de potássio L∙: Radical lipídico
LOO∙: Radical lipoperoxil LOOH: Hidroperóxido lipídico MDA: Malonaldeído
mg: Miligrama
mL: Mililitro
Mn-SOD: Superóxido dismutase que contém manganês NMP: N-metilpiridínio
O2●_
: Radical superóxido O2: Oxigênio molecular
OD: Densidade ótica (do inglês, optical density) OH-: Ânion hidroxila
SOD: Superóxido dismutase
TBARS: Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
SUMÁRIO
RESUMO ... viii
ABSTRACT ... ix
LISTA DE FIGURAS ... x
LISTA DE TABELAS ... xi
LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS ... xii
1. INTRODUÇÃO ... 16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 18
2.1 Radicais livres ... 18
2.2 Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) ... 18
2.3 Estresse oxidativo ... 22
2.3.1 Oxidação do DNA, proteínas, lipídios ... 23
2.4 Defesas antioxidantes ... 23
2.4.1 Defesa antioxidante enzimática ... 24
2.4.2 Defesa antioxidante não-enzimática ... 26
2.5 O café ... 26
2.5.1 História e importância econômica do café ... 26
2.5.2 Compostos fenólicos ... 29
2.5.3 Café orgânico ... 32
2.5.4 Café e qualidade de vida ... 34
2.6 Saccharomyces cerevisiae como modelo de estudo ... 35
3. OBJETIVOS ... 37
3.1 Objetivo Geral ... 37
3.2 Objetivos Específicos ... 37
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 38
4.1 Amostras de café ... 38
4.2 Linhagens de leveduras ... 38
4.3 Meios de cultura ... 38
4.4 Tampões ... 39
4.5 Reagentes e Soluções... 39
4.6 Preparos dos extratos etanólicos de café ... 40
4.7 Preparo dos extratos aquosos de café ... 40
4.8 Ensaio in vivo (placas de 96 poços) utilizando leveduras Saccharomyces cerevisiae para avaliação da atividade antioxidante das amostras de café orgânico torrado ... 41
4.8.1 Determinação da concentração de H2O2 que causa parada de crescimento da
levedura S. cerevisiae ... 41
4.8.2 Exposição imediata da levedura S. cerevisiae ao H2O2 e tratamento com o café ... 42
4.9 Avaliação de taxas de sobrevivência de leveduras após estresse oxidativo (Spot test) . 42 4.10 Análise estatística ... 43
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 44
CAPÍTULO I ... 45
6. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS ... 70
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 71
1. INTRODUÇÃO
Radicais livres são espécies que contêm um ou mais elétrons desemparelhados as quais apresentam alta reatividade. Em sistemas biológicos os radicais livres de oxigênio ou nitrogênio são os mais relevantes (Burton and Jauniaux, 2011). As espécies reativas de oxigênio (EROs), formadas por radicais livres e espécies não-radicalares, são produzidas no metabolismo celular aeróbico normal ou por células do sistema imune durante a resposta a patógenos (Migdal and Serres, 2011; Kalyanaraman, 2013). Para combater as EROs, as células possuem defesas antioxidantes. Antioxidantes são substâncias que, em baixas concentrações, impedem, atrasam, removem ou protegem contra a oxidação de uma molécula alvo (Pamplona and Costantini, 2011).
A deficiência de antioxidantes presentes na dieta (como, por exemplo, as vitaminas E, C, D, flavonóides e carotenóides) causa acúmulo de pró-oxidantes, o que pode resultar no estresse oxidativo, uma condição de desequilíbrio entre os níveis de oxidantes e antioxidantes.
Além da falta de nutrientes, a produção de EROs pode aumentar nas doenças inflamatórias crônicas (Kalyanaraman, 2013). Como resultado do acúmulo de EROs pode ocorrer extenso dano oxidativo nas biomoléculas (DNA, proteínas e lipídios) com perda de função e integridade das membranas, inibição de enzimas e mutações no DNA. As consequências desses danos podem ser disfunções celulares e danos nos tecidos, o que pode contribuir para a carcinogênese (Pamplona and Costantini, 2011; Veskoukis et al., 2012; Kalyanaraman, 2013;
Saeidnia and Abdollahi, 2013).
Com o aumento da população idosa há uma preocupação por parte dos governantes que elaboram as políticas públicas de saúde, no que diz respeito à prevalência de doenças relacionadas à idade e aos custos de saúde que essa população pode ocasionar (Martorell et al., 2011). Estudos epidemiológicos observacionais têm verificado que o consumo de alimentos ricos em componentes bioativos (como frutas e legumes) está relacionado à prevenção do desenvolvimento de diversas doenças (Butnariu and Caunii, 2013; Forbes- Hernandez et al., 2014). A busca pela alimentação equilibrada motiva as pesquisas que visam buscar alimentos que desempenham funções benéficas para o organismo. Uma das estratégias é a melhoria da capacidade antioxidante por meio da ingestão de antioxidantes para prevenir ou reduzir os danos oxidativos (Butnariu and Caunii, 2013). Dessa forma, alimentos com propriedades antioxidantes podem surgir como intervenção nutricional para promoção da qualidade de vida da população (Martorell et al., 2011).
O café é uma das bebidas mais consumidas no mundo, e contribui para a ingestão de antioxidantes pelas populações de muitos países (Ranheim and Halvorsen, 2005; Cruz et al., 2012). Ele possui compostos que ocorrem naturalmente no grão verde (ácido clorogênicos, trigonelina ou cafeína) e/ou moléculas formadas durante a torrefação (melanoidinas – produtos da reação de Maillard) (Verzelloni et al., 2011). Devido ao alto consumo do café, estudos relacionados à atividade biológica de seus componentes têm sido desenvolvidos indicando uma boa capacidade antioxidante de compostos do café, como os ácidos clorogênicos, melanoidinas e a cafeína (Lima et al., 2010; Ludwig et al., 2014).
Considerando os danos que as EROs podem causar nas biomoléculas e que antioxidantes naturais podem diminuir ou prevenir estes danos, este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade do café orgânico, comparando o verde e o torrado e, ainda, o convencional torrado, em proteger as células de Saccharomyces cerevisiae contra o dano oxidativo na exposição ao peróxido de hidrogênio (H2O2). Testamos a hipótese de que o café orgânico teria uma maior capacidade antioxidante quando comparado com um café convencional. Isto seria devido ao fato de que o café orgânico talvez tenha que induzir as defesas antioxidantes em um maior grau para combater agressores externos.
O presente trabalho possui os resultados e discussão em formato de artigo (Capítulo 1). O artigo é apresentado com introdução, materiais e métodos, resultados e discussão e referências bibliográficas (referentes ao artigo). A numeração das figuras do artigo segue a ordem do trabalho como um todo, com o objetivo de orientar o leitor quanto à lista de figuras.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Radicais livres
Radical livre refere-se a qualquer espécie, seja átomo ou molécula, capaz de ter uma existência independente, contendo um ou mais elétrons desemparelhados. A presença de elétrons desemparelhados torna os radicais livres altamente reativos. Essa reatividade ocorre devido à reação com outras moléculas, com o objetivo de adquirir estabilidade (Ferreira and Matsubara, 1997; Halliwell and Whiteman, 2004; Halliwell, 2006).
Os elétrons, nos átomos e moléculas, estão associados em pares. Cada um dos elétrons se movimenta em volta do núcleo, o denominado orbital atômico (Halliwell, 2006). Portanto, as ligações químicas podem ser rompidas de duas formas: os dois elétrons podem ficar presos a um dos fragmentos, processo denominado de heterólise (Equação 1), onde os dois fragmentos têm cargas diferentes e opostas e são chamados íons; ou, na quebra da ligação os dois elétrons são divididos de forma simétrica, processo denominado de homólise, cujos fragmentos são radicais, conforme mostrado na Equação 2 (Pryor, 1970; Ferreira and Matsubara, 1997). As reações de radicais são divididas em três fases: iniciação, propagação e terminação. Na fase de iniciação ocorre a formação dos radicais, na propagação o número destes radicais não é modificado e na fase de terminação ocorre a destruição dos radicais, fechando a cadeia (Pryor, 1970).
A --- B A+ + :B-(Equação 1) A --- B A
.
+ B
.
(Equação 2)
2.2 Espécies Reativas de Oxigênio (EROs)
As espécies reativas de oxigênio (EROs) são metabólitos de oxigênio altamente reativos e são produtos do metabolismo celular normal. Essas espécies são reconhecidas por desempenhar um papel paradoxal, porque podem ter efeito benéfico ou prejudicial, nos sistemas vivos (Valko et al., 2006; Migdal and Serres, 2011). Os níveis moderados de EROs são úteis na defesa imunológica contra patógenos e na sinalização celular, por exemplo (Bae et al., 2011; Kalyanaraman, 2013). Em concentrações baixas, o peróxido de hidrogênio
(H2O2) e o radical superóxido (O2
·-
) estimulam a proliferação e a sobrevivência celular (Valko et al., 2006; Bae et al., 2011). Além disso, durante a invasão de patógenos, as células fagocitárias defendem o organismo por meio da geração de oxidantes antimicrobianos, como o radical superóxido. Um dos efeitos prejudiciais ocorre, por exemplo, na formação de EROs no restabelecimento do oxigênio ao tecido que sofre isquemia (privação de oxigênio), provocando danos aos tecidos durante a reoxigenação (Kalyanaraman, 2013).
O termo EROs refere-se tanto aos radicais de oxigênio quanto a espécies oxidantes não radicalares (Halliwell and Whiteman, 2004; Kennedy et al., 2012). As principais EROs radicalares incluem o radical superóxido (O2
·-
) e o radical hidroxil (·OH) e as espécies não radicalares, o peróxido de hidrogênio (H2O2), por exemplo (Kennedy et al., 2012).
Na respiração celular as células utilizam o oxigênio para a geração de energia na mitocôndria. Durante este processo de produção de adenosina-5-trifosfato (ATP) o oxigênio pode ser parcialmente reduzido (Figura1) e produzir radicais livres. Isto pode ocorrer naturalmente ou em maior grau devido a uma disfunção mitocondrial, o que leva ao comprometimento do transporte de elétrons (Figura 2) (Pham-Huy et al., 2008; Alzoghaibi, 2013). A mitocôndria é uma importante fonte de EROs, os quais se formam devido ao escape de uma pequena quantidade de elétrons pela cadeia transportadora de elétrons (CTE), principalmente a nível dos complexos I e III, levando à geração do radical superóxido (Figura 2) (Kowaltowski et al., 2009). Um aumento na produção de EROS na mitocôndria pode ocorrer em condições patofisiológicas (Kalyanaraman, 2013).
Figura 1. Sequência da redução do O2 a H2O. Adaptado de Kalyanaraman, 2013.
Figura 2. Ilustração do metabolismo mitocondrial de EROs. Formação do ânion radical superóxido (O2·-) pela redução monoeletrônica do O2. Adaptado de Kowaltowski et al., 2009.
O gás oxigênio (O2), em seu estado fundamental, possui dois elétrons desemparelhados com spins paralelos, o que o impede de receber um par de elétrons de outra molécula, podendo receber somente um elétron (Hermes-Lima, 2005; Halliwell, 2006). Na Figura 3 há a ilustração dos orbitais moleculares das formas do oxigênio (O2), do radical superóxido (O2·-
.) e do peróxido de hidrogênio (H2O2).
Ao ocorrer a redução monoeletrônica do oxigênio molecular (O2) forma-se o radical superóxido (O2·-
). Grande parte deste radical é produzido pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. Em condições normais, aproximadamente 2% do oxigênio consumido na mitocôndria é convertido em O2·-
(Ferreira and Matsubara, 1997; Raha and Robinson, 2001;
Kowaltowski et al., 2009; Burton and Jauniaux, 2011; Migdal and Serres, 2011). Estes radicais são dismutados por meio de enzimas superóxido dismutases (SOD), gerando o H2O2,
que é uma espécie não radicalar e por isso é menos reativo que o O2·-
(Kohen and Nyska, 2002; Kowaltowski et al., 2009; Kanta, 2011). A redução do H2O2 por íons Cu+1 ou Fe2+ leva à formação do radical hidroxil (∙OH) e do ânion hidroxila (OH-) (Hermes-Lima, 2005).
Figura 3. Orbitais moleculares de algumas EROs (Halliwell, 2006).
O H2O2 pode ser reduzido à água ou gerar o radical hidroxil (∙OH) via reação de Fenton (Equação 3). A reação de Haber-Weiss (Equação 4) representa o somatório da reação de Fenton com a reação de redução do ferro pelo superóxido. A reação de Fenton é catalisada por metais de transição como ferro e cobre (Burton and Jauniaux, 2011). Nesta, os íons de ferro Fe2+ são oxidados a íons de Fe3+ pelo H2O2 produzindo ∙OH (Equação 3)(Farrugia and Balzan, 2012). O radical hidroxil reage com a maioria dos compostos biológicos, danificando lipídios, DNA, proteínas e carboidratos, e assim promove o dano oxidativo e inibe as funções celulares normais(Droge, 2002; Halliwell and Whiteman, 2004).
Fe2++ H2O2OH +OH- + Fe3+ (Equação 3)
H2O2 + O2- O2 + OH- +OH (Equação 4)
Os radicais livres são extremamente estudados, pois são de suma importância no processo de várias patologias como, por exemplo, nas doenças neurodegerativas. Na doença de Alzheimer as EROs provocam danos graves levando a perda neuronal, pois o cérebro é vulnerável ao estresse oxidativo devido ao aumento da demanda de oxigênio. Por isso, a mitocôndria, principal fonte de EROs, desempenha um papel importante para a manutenção e sobrevivência dos neurônios. No entanto, o alto consumo de oxigênio e, por consequência, a produção de radicais livres em excesso pode ocasionar alterações da integridade da membrana
mitocondrial, visto que sua estrutura pode ser susceptível à peroxidação lipídica (explicada no próximo tópico) (Padurariu et al., 2013). Um dos alvos das EROs são os lipídios insaturados, que podem ser danificados por meio da peroxidação lipídica (Nam, 2011; Yan et al., 2013).
Além disso, o cérebro possui uma alta concentração de ácido graxos poliinsaturados e fatalmente é um alvo para a peroxidação lipídica (Nam, 2011; Padurariu et al., 2013).
2.3 Estresse oxidativo
Os organismos são capazes de lidar com a geração de EROs e manter o equilíbrio entre sua quantidade e os sistemas de defesa antioxidante. Entretanto, quando há uma produção excessiva de EROs, os mecanismos de defesa podem não ser suficientes e os efeitos destas espécies acabam prevalecendo. O aumento de EROs ou a diminuição das defesas antioxidantes causa um desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes, conhecido como estresse oxidativo, condição onde ocorrem modificações funcionais e estruturais a diversas biomoléculas (Hermes-Lima, 2005; Burton and Jauniaux, 2011; Pamplona and Costantini, 2011; Kalyanaraman, 2013).
O estresse oxidativo pode ser causado por vários fatores de origem exógena ou endógena. Dentre os fatores de origem exógena podemos citar a intoxicação por metais pesados, a radiação e a falta de minerais provenientes da dieta (Zn2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+, Se).
Dentre os fatores endógenos podemos citar as anormalidades genéticas (Halliwell and Whiteman, 2004; Valko et al., 2007; Migdal and Serres, 2011; Gandhi and Abramov, 2012).
O estresse oxidativo tem implicações relevantes em processos de envelhecimento e na patofisiologia de várias doenças humanas como aterosclerose, diabetes, insuficiência renal crônica, transtornos neurodegenerativos e câncer (Young and Woodside, 2001; Droge, 2002;
Green et al., 2004). Foi proposto que, durante a hiperglicemia, o aumento de EROs mitocondrial pode ter um papel importante para a patologia da diabetes mellitus do tipo I e II, pois as células β pancreáticas são susceptíveis a danos oxidativos. Assim, são sugeridas estratégias terapêuticas, complementando as terapias convencionais, para diminuir ou impedir a produção de radicais durante a hiperglicemia e neutralizar os seus efeitos danosos (Brownlee, 2001; Green et al., 2004).
2.3.1 Oxidação do DNA, proteínas, lipídios
A peroxidação lipídica é dividida em três fases: iniciação, propagação e terminação. A peroxidação lipídica se inicia quando o radical hidroxil reage com os fosfolipídios na membrana das células, por meio da abstração de um átomo de hidrogênio de um ácido graxo poliinsaturado, formando um radical lipídico (L∙). Este radical, por conseguinte, forma um dieno conjugado com o O2 formando o radical lipoperoxil (LOO∙). A fase de propagação é iniciada com o radical lipoperoxil abstraindo um hidrogênio dos ácidos graxos poliinsaturados e formando o hidroperóxido lipídico (LOOH). A terceira e última fase culmina com a decomposição de LOOH, LO∙ e LOO∙ formando bioprodutos, entre eles o malonaldeído (MDA), cetonas, aldeídos e hidrocarbonetos (Hermes-Lima, 2005). O MDA é um produto altamente mutagênico em células de mamíferos e cancerígeno em ratos (Valko et al., 2007).
Portanto a peroxidação lipídica pode alterar as propriedades físico-químicas das membranas lipídicas, resultando em disfunção celular grave (Catala, 2009).
O radical hidroxil pode reagir com as bases purínicas (adenina e guanina) e pirimidínicas (citosina e timina) e com o açúcar 2-desoxirribose, formando produtos específicos e resultando em processos mutagênicos e carcinogênicos (Hermes-Lima, 2005;
Valko et al., 2007; Kalyanaraman, 2013). O ataque do .OH ao carbono C-8 da guanina forma o produto 8-hidroxi-guanina, que é uma modificação do material genético mais estudado (Valko et al., 2007).
Resíduos de cisteínas e metioninas em proteínas possuem um papel importante na defesa contra oxidantes e são constantemente alvos de oxidação pelas EROs. Os resíduos de metionina servem como proteção a outros resíduos da proteína que possuem funções críticas (Kim et al., 2014). Estudos mostram que após a exposição ao radical superóxido e ao H2O2 as proteínas são mais suscetíveis à proteólise, com um aumento estimado de 10 vezes (Valko et al., 2007).
2.4 Defesas antioxidantes
Para neutralizar os efeitos das EROs as células possuem mecanismos de defesa que envolvem mecanismos de prevenção, de reparo e as defesas antioxidantes. Antioxidantes são definidos como qualquer substância que, quando presente em baixas concentrações, impede ou atrasa os danos oxidativos a uma biomolécula alvo, e atuam por meio de mecanismo
seqüestrador de EROs ou como quelantes de metais, os quais favorecem a formação de EROs (Valko et al., 2007). A defesa antioxidante primária inclui os antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos. Dentre os antioxidantes enzimáticos encontram-se a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa-peroxidase (GPx), glutationa s-transferase (GST) e tiorredoxinas peroxidases (TPx). Os antioxidantes de origem não enzimática são, por exemplo, o ácido ascórbico (vitamina C), α-tocoferol (vitamina E), glutationa (GSH), carotenoides, flavonoides e outros (Valko et al., 2007; Gutteridge and Halliwell, 2010; Lu and Holmgren, 2014).
Existem vários métodos in vitro utilizados para avaliar o potencial antioxidante de diferentes compostos, tais como o ensaio de TBARS (Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico), DPPH (difenilpicril-hidrazil) e ABTS (azino etilbenzotiazilina-6-sulfonato).
No ensaio de TBARS prepara-se uma reação contendo Fe2+ e H2O2 que gera radical hidroxil na presença de uma molécula alvo (lipídios ou desoxiribose, por exemplo). A reação é então estudada na ausência e presença dos componentes cuja atividade antioxidante está sendo investigada (Dalvi, 2008). O método DPPH investiga a capacidade de antioxidantes naturais em sequestrar o radical estável 1,1-difenil-2-picrilhidrazil, utilizando espectofotometria (Roesler et al., 2007) e o chamado ensaio de ABTS é um método colorimétrico amplamente utilizado e baseado na captura do radical 2,2-azinobis, que é gerado através de uma reação enzimática (Erel, 2004).
2.4.1 Defesa antioxidante enzimática
Em Saccharomyces cerevisiae a enzima SOD está presente sob duas formas nas células. Uma isoforma contém manganês (Mn-SOD) no sítio ativo e está presente normalmente na mitocôndria e a outra contém cobre e zinco (CuZn-SOD), e está localizada no citoplasma. A SOD catalisa a dismutação de O2• -
em O2 e H2O2 (Equação 5) (Kowaltowski et al., 2009; Burton and Jauniaux, 2011).
SOD
O2•- + O2•- + 2H + H2O2 + O2 (Equação 5)
A principal função da catalase é catalisar a dismutação do H2O2, gerado nos peroxissomas, em água e oxigênio (Equação 6). A CAT tem sido encontrada em mitocôndrias do coração e do fígado (Cardoso et al., 2012).
CAT
H2O2 + H2O2 O2 + 2H2O (Equação 6)
A GPx (selênio-dependente) tem a função de catalisar a decomposição de peróxidos, como o H2O2, utilizando glutationa (um tripeptídeo, Gly-Cys-Glu) na forma reduzida (GSH) como substrato doador de hidrogênio. Na catálise, duas moléculas de GSH formam a glutationa oxidada (GSSG) (Equação 7) (Hermes-Lima, 2005; Kowaltowski et al., 2009;
Burton and Jauniaux, 2011).
GPx
H2O2 + 2 GSH GSSG + 2H2O (Equação 7)
A glutationa S-transferase (GST) catalisa a conjugação de glutationa (GSH) a eletrófilos, eliminando os produtos tóxicos provenientes da ação de radicais livres (Winyard et al., 2005). O metabolismo celular e detoxificação de xenobióticos (substâncias carcinogênicas, toxinas, poluentes ambientais e fármacos) ocorre em 3 estágios. No estágio I, as toxinas são ativadas por oxidação, redução, ou hidrólise para introduzir um grupo funcional. No estágio II, o grupo funcional é conjugado com glutationa (GSH), ácido glucurônico ou glicose. A conjugação com GSH é catalisada pelas enzimas glutationa S- transferases (GSTs). No estágio III, os conjugados de GSH são eliminados do citoplasma por bombeadores específicos (Choi et al., 1998). Além de atuarem como enzimas de detoxificação da fase II, as GSTs atuam também na defesa das células contra produtos do estresse oxidativo. Essas enzimas podem metabolizar aldeídos citotóxicos produzidos durante a peroxidação lipídica. O processo de detoxificação ocorre principalmente no fígado (Halliwell, 1999). As atividades das GSTs podem influenciar o crescimento celular e proteger contra moléculas indutoras de tumores (Raza, 2011).
As enzimas da família GST estão envolvidas na detoxificação de substâncias cancerígenas. Um estudo desenvolvido por Huber et al. (2004), verificou que o tratamento com os componentes Kahweol e cafestol, do café, aumentou a atividade das enzimas de detoxificação da fase II (glutationa S-transferase), reduzindo a taxa de câncer de cólon em camundongos (Huber et al., 2004). Nesse contexto, o café tem sido amplamente investigado por apresentar efeitos quimiopreventivos.
2.4.2 Defesa antioxidante não-enzimática
A defesa antioxidante não-enzimática, constituída por moléculas de baixa massa molecular, é subdividida em antioxidantes endógenos e exógenos. Esses antioxidantes têm a capacidade de “sequestrar” (do inglês “scavenge”) os radicais livres, por meio de seu potencial redutor, doando um elétron ou um hidrogênio à espécie reativa (Frei and Higdon, 2003). Os antioxidantes exógenos são provenientes da dieta como, por exemplo, a vitamina C, os carotenóides, os polifenóis e o alfa-tocoferol. Como exemplo de antioxidantes endógenos, podemos citar a glutationa reduzida (GSH), o ácido úrico, a melatonina, a melanina e a coenzima Q (Hermes-Lima, 2005; Veskoukis et al., 2012).
2.5 O café
2.5.1 História e importância econômica do café
Os primeiros cultivos de café tiveram origem na Etiópia, centro da África, mas foi a Arábia a responsável pela propagação cultural do café. Na cultura Árabe a fruta era consumida fresca e foi somente no século XVI, na Pérsia, que os primeiros grãos de café foram torrados, tornando-se a bebida que hoje nós conhecemos. Em 1727, o Sargento-Mor Francisco de Mello Palheta, a pedido do governador do Maranhão e Grão Pará, trouxe o café da Guiana Francesa (clandestinamente) para Belém, no Brasil. Graças às condições climáticas favoráveis da região, o cultivo do café foi espalhado com grande velocidade, e culminou com o Brasil sendo hoje o maior produtor mundial de café, responsável por 30% do mercado internacional. O Brasil acelerou o desenvolvimento e se inseriu nas relações internacionais de comércio graças ao café. O café da variedade arábica é plantado em São Paulo, Minas Gerais, Paraná, Bahia e Espírito Santo, e o café da variedade robusta é plantado no Espírito Santo e Rondônia (ABIC, 2009).
O consumo de café vem aumentando no Brasil a cada ano. Dados da Associação Brasileira da Indústria de Café (ABIC) indicam que houve um acréscimo de 3,11% entre Novembro/2009 – Outubro/2010 e Novembro/2010 – Outubro/2011. Entre Maio/2011 e Abril/2012 o consumo registrado foi de 19,975 milhões de sacas. No período anterior (Maio/10 a Abril/11) o consumo foi de 19,383 milhões de sacas (ABIC, 2011). A expectativa para 2013 era de um crescimento entre 2,5% e 3,0% em volume, elevando o consumo interno
anual para 20,9 milhões de sacas. Esse crescimento deve-se ao poder de compra das classes B, C e D e retomada da economia brasileira. Além disso, havia a previsão do aumento do consumo fora do lar, como conseqüência de um aumento no número de cafeterias e restaurantes. O consumo interno do café no Brasil, observando anos anteriores, tinha a tendência de aumentar. Devido aos grandes eventos esportivos esperavam-se oportunidades para as empresas de café intensificar esse crescimento (Figura 4) (ABIC, 2012). No entanto, segundo a ABIC (2013), houve uma retração em consequência de inúmeras opções para o café da manhã como, por exemplo, as bebidas prontas (sucos, bebidas a base de soja e achocolatados). A estimativa para 2014 é um aumento do consumo interno de 3% a 4%, elevando a procura por cafés de melhor qualidade (ABIC, 2013).
Figura 4 – Evolução do consumo interno de café (ABIC, 2013).
As espécies de café de relevância comercial são o Coffea arabica e Coffea robusta. A diferença entre estas espécies está na composição química do grão verde, sendo que a arábica contém mais lipídios e a robusta contém um maior teor de cafeína, sacarose, ácido clorogênico e seus derivados. A variedade arábica tem um sabor e aroma mais agradável, por isso constitui 80% do comércio mundial de café (Bonita et al., 2007). Os grãos de café torrado
possuem diversos compostos, tais como ácidos clorogênicos, cafeína, trigonelina, entre outros (Tabela 1).
Tabela 1. Composição do café torrado (Arábica)
Constituintes Teor (%)
Umidade 2,5
Proteína 9,0
Polissacarídeos, insolúveis em água 24,0
Polissacarídeos, solúveis em água 6,0
Sacarose 0,2
Glicose, frutose, arabinose 0,1
Lipídios 13,0
Ác. Clorogênico 3,7
Ácido fórmico 0,1
Ácido acético 0,25
Ác. Lático, pirúvico, oxálico, tartárico, cítrico 0,4
Cafeína 1,2
Trigonelina 0,4
Ácido nicotínico 0,02
Aromas voláteis 0,1
Minerais 4,0
Outros 35,0
Fonte: (Araújo, 2011)
O que torna o café desejável é o processo de torrefação (os grãos são aquecidos a 200- 240 C durante 10-15 minutos), o que causa alterações tanto em sua composição química quanto em suas propriedades biológicas (Daglia et al., 2000). De acordo com a Associação Brasileira da Indústria de Café (ABIC) a bebida de café deve ser preparada pela adição de água quente ao café torrado e moído, um processo chamado de infusão. A temperatura ideal da água deve ser próxima de 90 C, pois se a água ferver haverá a perda de oxigênio, o que altera a acidez da bebida. O grande interesse dos pesquisadores pelo café é devido à grande variedade de substâncias antioxidantes como, por exemplo, os compostos fenólicos (Farah and Donangelo, 2006).
A busca por antioxidantes naturais têm motivado muitos pesquisadores a estudar o café. No estudo de Jeong e colaboradores (2013), o pré-tratamento com extrato de café
torrado protegeu a cultura de células neuronais da linhagem PC12, contra a neurotoxicidade induzida por H2O2, analisado pelo ensaio de viabilidade celular com brometo de 3- (4,5- dimetil)difenil tetrazólio (MTT). Compostos antioxidantes presentes no café talvez possam prevenir a doença de Alzheimer uma vez que o estresse oxidativo está envolvido no aumento da degeneração dos neurônios (Jeong et al., 2013). Outro estudo demonstrou que o café reduz os danos ao DNA no tecido hepático, impedindo a indução de lesões pré-neoplásicas no fígado de ratos (Ferk et al., 2014).
2.5.2 Compostos fenólicos
Dentre as diversas classes de substâncias antioxidantes os compostos fenólicos têm recebido uma atenção considerável devido a sua alta capacidade antioxidante e por serem obtidos através da dieta humana (Xu and Chang, 2007; Leopoldini et al., 2011). O consumo diário de alimentos naturais que contêm compostos fenólicos pode ter efeito protetor contra metástases (Weng and Yen, 2012). Além disso, os polifenóis têm sido descritos como protetores contra a peroxidação lipídica, atuando como quelantes de metais ou impedindo a participação de metais na formação de .OH (Hermes-Lima, 2005).
Os compostos fenólicos não participam do crescimento e desenvolvimento do vegetal e, por isso são considerados metabólitos secundários. Estes compostos podem ser classificados de acordo com o grupo funcional e com o número de anéis aromáticos hidroxilados. Eles possuem estruturas bem diversificadas, desde moléculas simples até substâncias altamente complexas, sendo genericamente classificados como fenóis simples e polifenóis, com base no número de subunidades de fenóis. Neste caso, compreendem o termo fenol: os fenóis simples, os fenóis ácidos, cumarinas, flavonóides, estilbenos, taninos e lignanas (Araújo, 2011). Os ácidos fenólicos são divididos em 2 classes: 1- derivados do ácido benzóico; 2- derivados do ácido cinâmico. Os flavonóides contêm dois anéis benzenos ligados ao anel heterocíclico pirano e são divididos em 6 classes: flavonóis, flavonas, isoflavonas, flavanonas, antocianidinas e flavanóis (Figura 5) (Manach et al., 2004; Dai and Mumper, 2010a; Araújo, 2011; Weng and Yen, 2012).
Figura 5 - Classificação dos polifenóis. Adaptado de Forbes-Hernandez et al., 2014.
Os compostos fenólicos são encontrados em alimentos de origem vegetal (frutas, legumes, azeite) e em bebidas (chá, café, vinho, e outros) (Tabela 2). No café o ácido 5- cafeoilquínico, formado pelo ácido cafeico, na forma de éster, (representante dos ácidos hidroxinâmicos) com o ácido quínico, está presente em elevada concentração (Araújo, 2011).
Nas plantas, esses compostos estão envolvidos na proteção contra agressões mediadas por patógenos, parasitas, contra a radiação ultravioleta, absorção de luz, remoção de radicais livres formados durante a fotossíntese, entre outros (Dai and Mumper, 2010a; Araújo, 2011;
Weng and Yen, 2012).
Tabela 2 – Teor de fenóis totais em vegetais e bebidas.
Alimento
Fenóis totais (mg/100 g matéria seca)
Alimentos/bebidas
Fenóis totais (mg/100 g peso fresco)
Cereais Frutas frescas
Arroz 8 Maçã 27-298
Cevada 1.200-1.500 Uva 50-490
Milho 31 Laranja 50-100
Sorgo 170-10.260 Pera 2-25
Trigo 22-40 Abacaxi 67-72
Aveia 8 Morango 38-218
Acerola 861-888
Tomate 85-130
Vegetais Suco de frutas (mg/100 mL)
Ervilha 78-230 Maçã 2-16
Cebola 100 – 2.000 Laranja 370-7100
Repolho verm. 178
Alface verm. 170
Couve-de- bruxelas
6 – 15
Salsa 55 – 180 Bebidas
Aipo 95 Chá (mg/200 mL) 150-210
Feijão-preto 970 Café (mg/150 mL) 200-550
Vinho branco (mg/100 mL)
20 – 30
Vinho tinto (mg/ 100 mL)
100-400
Cerveja (mg/100 mL) 6-10
Mel (mg/100 g) 35
Fonte: (Araújo, 2011)
O café é considerado a bebida que possui a principal fonte de compostos fenólicos. A fração fenólica dos cafés verdes é composta pelo ácido caféico, ácido ferúlico, ácido p- cumárico e ácidos clorogênicos (CGA), sendo o CGA o mais frequente. Durante o
processamento dos grãos verdes, esses compostos sofrem modificações afetando a composição dos compostos fenólicos, ou seja, à medida que aumenta a intensidade de torra, diminui os teores totais de CGA (Farah and Donangelo, 2006; Araújo, 2011).
2.5.3 Café orgânico
A busca por alimentação saudável, alimentos naturais e conservação do meio ambiente é uma realidade em todo o mundo. De acordo com o Ministério da Agricultura (Brasil, 2014a), a sustentabilidade envolve desenvolvimento econômico, social e respeito aos recursos naturais e suas limitações. Ou seja, deve-se pensar nas gerações futuras, não comprometendo as suas necessidades. Assim, o Ministério da Agricultura desenvolve projetos que estimulam as boas práticas agropecuárias, com assistência técnica e financiamento.
Neste contexto surge a produção orgânica que objetiva promover a qualidade de vida com proteção ao meio ambiente. Para atingir este objetivo propõe-se a não utilização de agrotóxicos, adubos químicos ou substâncias sintéticas que agridam o meio ambiente. Existe uma fiscalização por parte do governo para avaliar o controle de qualidade e a não utilização das substâncias agressivas. Os alimentos orgânicos passam por essa avaliação e adquirem o selo SisOrg, por meio da Certificação por Auditoria ou por um sistema Participativo de Garantia (Brasil, 2014b).
O Brasil tem ganhado destaque na produção mundial de orgânicos e a comercialização dos produtos orgânicos foi aprovada pela lei 10.381, de dezembro de 2003, com regulamentação pelo Decreto Nº 6.323, de dezembro de 2007. A lei 10.831/2003 (Brasil, 2003) define o que é considerado sistema orgânico de produção agropecuária, estabelece a finalidade desse sistema e determina que este processo deve ser certificado por auditoria ou através de certificação participativa.
Os produtos orgânicos têm ganhado ênfase devido à preocupação da sociedade em melhorar a qualidade de vida e a saúde humana e em diminuir a agressão ao meio ambiente.
Nesse contexto, o cultivo e produção do café orgânico representam atividades com enorme potencial, desempenhando um papel na economia de países produtores (Ricci, 2006; Brasil, 2014a).
A temperatura ideal para o cultivo do café arábica fica entre 19 e 22 oC e para o café robusta fica entre 22 e 26 oC. Um ponto importante diz respeito à matéria orgânica que é fundamental para a manutenção das características físicas, químicas e biológicas do solo.
Uma forma eficiente e relativamente barata de se elevar o teor de matéria orgânica dos solos é
por meio da adubação verde (plantas cultivadas no local ou trazidas de fora e incorporadas ao solo), tendo como finalidade a preservação de sua fertilidade e adubos orgânicos (Ricci, 2006).
No DF (Distrito Federal) o café Serrazul (Figura 6) (variedades catuaí-rubi e acaiá- cerrado) é plantado a uma altitude de 1250 metros acima do nível do mar na chapada da Contagem, em Brasília, sendo cultivado dentro das rígidas normas da agricultura orgânica.
Após a colheita o café é armazenado na forma de grão de côco por um ano, onde o grão absorve açúcares e outras substâncias contidas na casca. O café obtido dessa forma chama-se café descansado e a sua torra é leve. As quantidades solicitadas do produto são descascadas e torradas somente sob encomenda (Serrazul, 2014).
Nosso grupo de pesquisa tem estudado a capacidade antioxidante de cafés orgânicos em sistema in vitro. Nossos resultados iniciais mostraram que as amostras de café orgânico foram eficazes na proteção contra a peroxidação lipídica, indicando a presença de antioxidantes e/ou quelantes de ferro, e que o café Serrazul apresentou maior capacidade antioxidante quando comparado a um café produzido pelo método convencional e de alta qualidade (tipo exportação) (resultados não mostrados). Consideramos que o processo de cultivo do café é importante e pode afetar o conteúdo de antioxidantes e criar compostos com propriedades relevantes (anti-cancerígenas, por exemplo) e únicas do café.
Figura 6 – Café Serrazul. Fonte: (Serrazul, 2014).
2.5.4 Café e qualidade de vida
Em um estudo de intervenção humana Bakuradze et al. (2011) verificaram que o consumo do café tem eficácia na redução do peso e gordura corporal. A intervenção foi feita analisando amostras de sangue de voluntários saudáveis, que ingeriram um café rico em constituintes do grão de café verde e em produtos da torrefação. Como resultado houve redução de dano ao DNA, aumento de GSH e da atividade de glutationa redutase (GSR). Os efeitos mais significativos, em relação ao aumento de GSH, foram em participantes cujo índice de massa corpórea (IMC) era < 25, ou seja, com o peso normal, quando comparado com participantes com excesso de peso. Esse resultado sobre os níveis de GSH pode ser atribuído à presença de constituintes fenólicos como ácidos cafeoilquínicos. A atividade antioxidante in vivo deve-se aos produtos torrados (N-metilpiridínio - NMP) (Bakuradze et al., 2011).
Choi et al. (2011) investigaram o efeito do café sobre o estado antioxidante e o perfil lipídico de camundongos durante o exercício. Segundo os autores, a ingestão de 0,12g de café/100 g de peso corporal por dia pode fortalecer o sistema antioxidante sob estresse oxidativo induzido por exercícios in vivo. Foi verificado neste estudo que as atividades de SOD, catalase e a razão GSH/GSSG aumentaram nos grupos que ingeriram café (Choi et al., 2011).
Um estudo de 2011 avaliou o efeito de uma dose única e pequena de bebida de café em camundongos. Foram investigadas as alterações hepáticas das enzimas SOD, CAT e GPx, a extensão e características das respostas ao consumo de café e determinadas possíveis alterações na capacidade antioxidante total do tecido hepático. Foi verificado que uma dose de 2 mL (correspondendo a 4 copos médios de café para uma pessoa de 70 kg) da bebida de café foi suficiente para aumentar a atividade das enzimas acima descritas. Estes resultados indicam que o café pode induzir fatores de transcrição que modulam enzimas antioxidantes, ou que componentes do café podem aumentar diretamente a atividade enzimática de tais enzimas (Vicente et al., 2011).
A maioria dos estudos com o café está relacionada ao café convencional, evidenciando uma carência de estudos com cafés orgânicos. Portanto, a pesquisa comparando os efeitos antioxidantes de cafés orgânicos e convencional é importante para determinar possíveis diferenças entre esses cafés. Além do mais, segundo Wu e colaboradores (2011), a utilização
de células de leveduras propicia a descoberta de novos antioxidantes para aplicações terapêuticas e/ou industriais.
2.6 Saccharomyces cerevisiae como modelo de estudo
Existem vários métodos in vitro para investigar a atividade antioxidante de compostos vegetais. Tais métodos, em sua maioria, fornecem uma indicação da capacidade de um composto em sequestrar metais ou reagir com EROs. Uma deficiência destes métodos é que eles não medem o efeito de um antioxidante sobre a sobrevivência da célula. Dessa forma o uso de Saccharomyces cerevisiae pode resolver esta deficiência. A levedura S. cerevisiae é um eucarioto unicelular que tem semelhanças com células de mamíferos em níveis de macromoléculas e organelas (Costa and Moradas-Ferreira, 2001). É um organismo de fácil cultivo sendo, portanto, amplamente utilizado como sistema modelo para muitas pesquisas, devido aos mecanismos celulares básicos e ao metabolismo. As leveduras são um objeto oportuno para estudar a resposta de adaptação ao extresse oxidativo, mecanismos moleculares e no desenvolvimento de abordagens terapêuticas e profiláticas (Lushchak, 2010).
As leveduras regulam a síntese de antioxidantes de acordo com a sua fase de crescimento. As fases conhecidas são: fase lag, onde as células estão em adaptação às condições de cultivo e estão se preparando para dividir; fase logarítmica ou exponencial, onde as células se dividem; fase estacionária, onde o número de células novas corresponde às que morrem; fase de morte da cultura, onde o número de células mortas é maior do que as que são novas. A maioria dos estudos utiliza as culturas de células nas fases exponencial ou estacionária. Na fase exponencial a S. cerevisiae utiliza a glicose como fonte de energia e carbono, onde a maior parte da energia é produzida pela glicólise ou fermentação. Nesta fase, a participação da mitocôndria é irrelevante, assim como o consumo de oxigênio é baixo.
Desta forma, nesta fase, a produção de EROs é reduzida e a atividade de enzimas antioxidantes é baixa (Drakulic et al., 2005; Lushchak, 2010).
Durante a mudança da fase exponencial para a estacionária há um aumento da utilização de etanol, formado na fase anterior, pela cultura de S. cerevisiae, como fonte de carbono e energia. Para oxidação completa do etanol é necessário o funcionamento da mitocôndria acentuando a geração de EROs, o que eleva a atividade de enzimas antioxidantes para manter os níveis de EROs dentro dos limites seguros. Portanto, essa mudança de fase pode potencializar a geração de EROs causando estresse oxidativo (Lushchak, 2010).
A levedura S. cerevisiae, ao entrar em contato com uma dose não-letal de um oxidante exógeno, promove a parada temporária do ciclo celular para se adaptar ao estresse oxidativo (Alic et al., 2001). Esta é uma característica importante, pois propicia o desenvolvimento de ensaios antioxidantes eficientes para facilitar a descoberta de antioxidantes com aplicação terapêutica e industrial (Wu et al., 2011).
O estudo de Wu e colaboradores (2011) descreve um sistema de análise biológica para medir a capacidade antioxidante de diferentes compostos usando a resposta de parada do crescimento induzida por oxidante apresentada por S. cerevisiae. O método pode medir a capacidade de um componente de proteger as células contra um oxidante evitando a parada do crescimento celular, medida por meio da absorbância a 600 nm, utilizando microplacas de 96 poços. Pode também medir a capacidade de um componente de induzir uma resistência celular aos efeitos danosos de diferentes oxidantes. Neste método de indução as células são incubadas com o composto antioxidante por determinado período e são lavadas para, em seguida, serem expostas ao oxidante. Por meio deste método os autores mostraram que o ascorbato e o ácido gálico possuem atividade sequestradora de EROs e induzem uma resistência de S. cerevisiae a vários oxidantes.
Visto que a levedura é um modelo de fácil cultivo e que possui semelhança com os organismos multicelulares, neste trabalho foram selecionadas as linhagens de S. cerevisiae do tipo selvagem (S288c e EG103) e, ainda, linhagens deficientes nas enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) contendo cobre/zinco (CuZnSOD, gene SOD1) e superóxido dismutase contendo manganês (MnSOD, gene SOD2). As linhagens selvagens e EG110 (não expressa a enzima SOD2) e EG 118 (não expressa a enzima SOD1) foram incubadas na presença de extrato de café e H2O2 para avaliar a capacidade do extrato em proteger as células deficientes em SOD.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar o potencial antioxidante de extratos de café orgânico e convencional em ensaios de crescimento da levedura S. cerevisiae.
3.2 Objetivos Específicos
- Avaliar os efeitos da pré-exposição das leveduras S288C aos extratos de café na proteção contra o estresse oxidativo induzido por H2O2.
- Avaliar se há diferença nos efeitos promovidos pelos extratos de cafés orgânico e convencional, e pelos extratos aquosos e etanóicos do café, na levedura S288C.
- Determinar o potencial antioxidante do extrato aquoso do café orgânico torrado, em leveduras selvagens (S288C e EG103) e mutantes SOD (EG110 e EG118), verificando o efeito do extrato, em diferentes concentrações, no crescimento das leveduras na presença de H2O2.
4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Amostras de café
Foram utilizadas neste experimento as amostras de café descritas abaixo:
A) Foram usadas amostras de café orgânico Serrazul (verde e torrado), safra de 2011 – Acaiá- Cerrado. O Café Serrazul, da espécie Coffea arabica, variedades catuaí-rubi e acaiá-cerrado, é plantado a uma altitude de 1250 metros acima do nível do mar na chapada contagem de Brasília (Núcleo Rural Lago Oeste, Rua 18 chácara 35), além de ser cultivado dentro das rígidas normas da agricultura orgânica, o processamento é feito de forma artesanal. Seus grãos são colhidos um a um, somente no estágio cereja, secados ao sol em solo cimentado, obtendo- se dessa forma um café natural 100% puro. As amostras de café Serrazul foram doadas pelo produtor Márcio Jório Veiga de Lima.
B) Café convencional Prima Qualitá Cooxupé. É um café gourmet torrado em grão da espécie C. arabica. Este café foi adquirido em supermercado (Lot.394/ Fab. 16-09-2013/ Val. 15-03- 2014).
4.2 Linhagens de leveduras
- S288c (MATa SUC2 mal gal2)
- EG 103 (MAT α, leu2-3, 11 his3∆1 trp-289a, ura3-52) - EG 110 (como EG103 exceto sod2∆::TRP1)
- EG 118 (como EG103 exceto sod1∆::URA3)
As linhagens EG103, EG110 e EG118 foram doadas pela Dra. Edith Gralla da Universidade da Califórnia em Los Angeles (UCLA). São linhagens mutantes de S. cerevisiae que não codificam a enzima CuZnSOD (EG 118) ou a enzima MnSOD (EG110).
4.3 Meios de cultura YPD
Extrato de levedura 1 % (p/v)
Peptona 2 % (p/v)
Glicose 2 % (p/v)
YPD ágar
Para o meio sólido foi acrescentado ágar bacteriológico na concentração de 2 % (p/v) ao meio YPD líquido.
4.4 Tampões Tampão PBS 1X
NaCl 136,9 mM
Na2HPO4 8,09 mM
NaH2PO4 1,76 mM
KCl 2,69 mM
Tampão KPi (fosfato de potássio) 50 mM pH 7,2
Solução estoque KPi 1M:
Fosfato de potássio dibásico 17,41 g/100 mL Fosfato de potássio monobásico 13,6 g/ 100 mL
Para o preparo da solução estoque de KPi 1 M, foram misturados aproximadamene 71,1 mL de solução de fosfato de potássio dibásico 1M com aproximadamente 28,3 mL de solução de fosfato de potássio monobásico 1M, medindo-se o pH no pHmetro até que atingisse 7,2.
4.5 Reagentes e Soluções
Etanol 95%
H2O2
Solução estoque H2O2 100 mM
