Vânia Maria Arantes 2 Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia, Bloco 2T Campus Umuarama, Uberlândia.

COMPARAÇÃO DA EFICÁCIA DO ZIEHL-NEELSEN E DA REAÇÃO EM

CADEIA DE POLIMERASE (PCR) PARA O DIAGNÓSTICO DO

Cryptosporidium spp. EM BOVINOS E SUÍNOS PROVENIENTES DA

REGIÃO DE UBERLÂNDIA.

Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia, Bloco 2E – Campus Umuarama, Uberlândia.

mjuliarodrigues@hotmail.com Vânia Maria Arantes2

Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia, Bloco 2T – Campus Umuarama, Uberlândia.

Márcia Benedita de Oliveira Silva3

Departamento de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba. mbosilva@yahoo.com.br Márcia Cristina Cury4

Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Uberlândia, Bloco 2E – Campus Umuarama, Uberlândia.

cury@umuarama.ufu.br

RESUMO: O protozoário Cryptosporidium spp. é responsável por desordens gastrintestinais em animais domésticos, sendo de alta relevância por produzir perdas econômicas, havendo necessidade de métodos de diagnósticos sensíveis e de fácil execução. Esse trabalho objetivou, comparar a sensibilidade e a especificidade do Ziehl-Neelsen e da PCR para o diagnóstico do Cryptosporidium spp. em bovinos e suínos provenientes de propriedades rurais e criadouros comerciais da microrregião de Uberlândia – MG. Foram coletadas fezes de 732 bovinos e 242 suínos. A prevalência encontrada em bovinos para Ziehl-Neelsen foi de 9,3% e para PCR 10,12%; em suínos, a prevalência para Ziehl-Neelsen foi de 2,48% e para PCR 2,54%. Nas amostras de bovinos, a sensibilidade e a especificidade observadas para Ziehl-Neelsen foram de 87,5 e 97,5% e para PCR esses números foram de 82,3 e 98,3%. Nas amostras de suínos, a sensibilidade e a especificidade encontradas para Ziehl-Neelsen foram de 100 e 97% respectivamente e para a PCR esses índices foram de 50 e 100%. Conclui-se que a técnica Ziehl-Neelsen obteve maior sucesso na detecção de oocistos de Cryptosporidium spp. Porém ambas as técnicas possuem vantagens e desvantagens, cabendo ao pesquisador escolher aquela que é mais adequada aos objetivos de sua pesquisa.

PALAVRAS-CHAVE: Cryptosporidium spp., bovinos, suínos, Ziehl-Neelsen, PCR

11- _{Acadêmica do curso de Ciências Biológicas} 2- _Colaboradora

1. INTRODUÇÃO

Muitos parasitos são responsáveis por desordens gastrintestinais em animais domésticos, causando diarréia. Esses são de grande importância por produzirem perdas econômicas devido à óbitos, perda de peso, redução na produção de leite e gastos com medicamentos (De Graff et al., 1999). Dentre esses parasitos, o Cryptosporidium spp. tem relevância por ser oportunista e acometer vários hospedeiros. Infecções por Cryptosporidium são comuns em humanos, bovinos, cães, gatos, porcos, cavalos, carneiros, cabras e animais selvagens (Hamnes; Gjerd; Robertson, 2006).

Esse protozoário é classificado dentro do filo Apicomplexa por apresentar organelas especializadas, responsáveis pela penetração e invasão das células hospedeiras (Tzipori et al., 1980).

O gênero Crypstosporidium compreende 15 espécies e a transmissão zoonótica é dependente da espécie envolvida e da suscetibilidade do hospedeiro (Hurber et al., 2007).

O Cryptosporidium parvum e o Cryptosporidium andersoni foram as espécies identificadas em bovinos, apresentando características morfológicas e genéticas distintas. O genótipo do Cryptosporidium parvum, também, pode infectar outros mamíferos incluindo o homem, adquirindo potencial zoonótico.

Suínos podem, geralmente, ser infectados por três formas geneticamente diferentes de Cryptosporidium, estando dentre elas, a espécie zoonótica Cryptosporidium parvum. Um genótipo diferente foi encontrado no Canadá e na Austrália e foi subsequentemente chamado de genótipo de Suínos I ou C. suis (Suàrez-Luengas, 2007). Um terceiro genótipo nomeado Cryptosporidium “Genótipo II” foi mais tarde detectado em suínos do oeste da Austrália (Suàrez-Luengas, 2007).

O oocisto é o estágio infectante para os hospedeiros susceptíveis, pela rota fecal-oral. Para a maioria das espécies do filo o oocisto é de importância primária para dispersão, sobrevivência e infectividade do parasito, sendo, também, importante para detecção e identificação deste, utilizando parâmetros combinados de tamanho e forma.

A transmissão pode ocorrer pela ingestão de água ou alimentos contaminados, pela transmissão direta de hospedeiro para hospedeiro ou, possivelmente, por insetos vetores (Gow; Waldner, 2006). O contato com animais silvestres ou a contaminação da água pelas fezes destes, são considerados fontes de infecção para humanos (Fayer; Speer; Dubey, 1990).

Dados epidemiológicos sugerem que, a transmissão do genótipo bovino de Cryptosporidium parvum é sazonal, enquanto o genótipo humano, Cryptosporidium hominis, os surtos ocorrem em viajantes. O Cryptosporidium zoonótico (genótipo bovino) se transmite através da água e alimentos e pelo contato direto principalmente com animais de fazenda (McLauchlin et al.,2003).

Animais jovens, a partir de uma semana de idade, são mais susceptíveis. Bezerros usualmente se infectam entre uma a quatro semanas de idade e a duração da infecção é curta por volta de duas semanas. No Canadá e Estados Unidos o Cryptosporidium parvum é menos identificado em fazendas de criação intensiva de bovinos de corte (Ralston, Mcallister, Olson, 2003), entretanto quando ocorre ela é mais severa do que em bovinos leiteiros. Isso ocorre, pois devido ao manejo dos bovinos leiteiros, estes são mais expostos, desenvolvendo imunidade natural à infecção.

A diarréia é o caso clínico mais comum e os animais, principalmente os mais jovens, podem se tornar letárgicos, anoréxicos e desidratados. Os carreadores de criptosporidiose severa podem levar de 4 a 6 semanas para se recuperarem totalmente (Olson et al., 2004).

do Cryptosporidium e não são adequadas para a análise de uma grande quantidade de amostras (Ramirez; Sreevatsan, 2006).

Métodos moleculares baseados na detecção do material genético do Cryptosporidium por técnicas de amplificação de DNA, como PCR (Reação da Polimerase em Cadeia), também são utilizados na detecção do parasito, demonstrando maior sensibilidade e especificidade que as demais técnicas (Ramirez; Sreevatsan, 2006). Contudo, é técnica de alto custo, a qual a presença de várias substâncias orgânicas e inorgânicas nas amostras, pode inibir e afetar a sensibilidade (Ramirez; Sreevatsan, 2006).

Estudos comparativos entre técnicas foram realizadas no Brasil em amostras de fezes, contudo, existem poucos relatos deste estudo feito em amostras de fezes de animais domésticos.

Devido a gravidade da doença causada pelo Cryptosporidium, seu potencial zoonótico e pelo fato de Uberlândia – MG possuir significativo papel no cenário agropecuário do Brasil, diagnósticos parasitológicos com resultados verdadeiramente positivos são fundamentais para o controle, prevenção e tratamento da infecção causada pelo protozoário.

Esse trabalho objetivou, portanto, comparar a sensibilidade e a especificidade do Ziehl-Neelsen e da PCR para o diagnóstico do Cryptosporidium spp. em bovinos e suínos provenientes de propriedades rurais e criadouros comerciais da microrregião de Uberlândia – MG.

2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Área de estudo

O estudo foi realizado na Microrregião de Uberlândia que está localizada na Macrorregião Oeste (Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba) do Estado de Minas Gerais. A população total dos rebanhos da região é estimada em 5.866.693 cabeças, compreendidas entre criações de bovinos, suínos, eqüinos, ovinos, aves dentre outras espécies (IBGE, 2002).

2.2. Populações de estudo e coleta de amostras fecais 2.2.1. Bovinos

As amostras de fezes foram obtidas de bovinos provenientes de 24 propriedades rurais. Essas foram selecionadas aleatoriamente, não importando o tamanho, aptidão ou padrão tecnificado da mesma. As amostras fecais foram coletadas diretamente da ampola retal de bovinos de ambos os sexos, diferentes raças e aptidão e faixa etária entre 0 a 24 meses. Após a coleta os sacos plásticos contendo as fezes, foram identificados e transportados, em caixa de isopor com gelo, até a Universidade Federal de Uberlândia - Laboratório de Parasitologia onde foram processadas.

Os exames que não puderam ser realizados no mesmo dia ficaram sob refrigeração (4°C) por no máximo 24 horas.

2.2.1. Suínos

Para a coleta das fezes de suínos, oito suinoculturas tecnificadas foram indicadas pela Profa. Dra. Vânia Maria Arantes da Faculdade de Medicina Veterinária da UFU.

As coletas de fezes em granjas tecnificadas foram realizadas em “pool” nos leitões após o parto, recém desmamados (4ª semana) e em fase de terminação e coletas individuais nos adultos (fêmea gestante independente da idade, recém paridas e cachaços).

2.3. Processamento das amostras fecais

Após a chegada das fezes ao Laboratório, cada amostra foi homogeneizada e em seguida, as fezes foram divididas em duas partes. A primeira para exame coproparasitológico de oocistos, utilizando a técnica de Ziehl-Neelsen e a segunda foi colocada em bicromato de potássio (2%) para a utilização na PCR.

2.3.1. Pesquisa de oocistos de cryptosporidium

A pesquisa de oocistos de Cryptosporidium foi realizada utilizando a técnica de concentração de centrifugo-sedimentação pelo formol-éter segundo Ritchie (1984), modificado por Allen e Ridley (1970) e a coloração do esfregaço do sedimento foi realizado pelo Ziehl-Neelsen modificado por Henriksen & Pohlenz (1981) utilizando o corante de Kinyoun.

Para a leitura da lâmina foi utilizado óleo de imersão e objetiva no aumento de 100x. 2.3.2. Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)

O PCR foi realizado em todas as amostras fecais. A amplificação do DNA foi realizada em duas etapas, sendo a primeira destinada a amplificar um fragmento de aproximadamente 1.325 pb que codifica a região hipervariada da subunidade menor (SSU) do gene 18S rRNA (Xiao et al, 1999; Xiao et al, 2000), utilizando os iniciadores 18SX1F: 5´-TTC TAG AGC TAA TAC ATG CG-3´ e 18SX1R: 5´-CCC ATT TCC TTC GAA ACA GGA-3´. Os produtos amplificados na primeira etapa na diluição 1:2 foram utilizados como moldes para uma segunda amplificação pela nested PCR (nPCR), que produziu um fragmento específico de aproximadamente 819-825pb utilizando os iniciadores 18SX2F: 5´-GGA AGG GTT GTA TTT ATT AGA TAA AG 3’ e 18SX2R: 5´-AAG GAG TAA GGA ACA ACC TCC A 3’) (XIAO et al, 1999).

2.4. Análise estatística

O número de amostras foi determinado pela fórmula: N= Z2α/2 x P x q

---

e2

A prevalência foi proposta de acordo com Feitosa et al. (2004).

A comparação da eficácia das técnicas será realizada através do teste Qui quadrado com nível de significância de 95%.

3. RESULTADOS 3.1. Bovinos:

Nas 24 propriedades foram coletadas fezes de 732 animais. O número de animais, por propriedade, variou, sendo o menor de cinco e o maior de 58 animais.

Do total dos animais avaliados, 68 (9,3%) foram positivos no Ziehl-Neelsen e 236 negativos. Para a PCR, 42 amostras (10,12%) apresentaram resultados positivos e 373 negativos (Tabela 1). As 317 amostras restantes não amplificaram. O número de amostras simultaneamente

N = Número de propriedades Z = Tabelado (1,96)

positivas para Ziehl-Neelsen e PCR foi 42 e o número de amostras positivas para Ziehl-Neelsen e Negativa para PCR foi nove. As amostras que revelaram ser negativas para Ziehl-Neelsen e positiva para PCR somaram em seis. O número de amostras negativas para ambas as técnicas foi 358.

A sensibilidade e a especificidade observadas pelo emprego do teste Ziehl-Neelsen foram de 87,5 e 97,5% respectivamente, enquanto para a PCR foi de 82,3 e 98,3% respectivamente (Tabela 2).

3.2. Suínos:

Nas oito propriedades foram coletadas fezes de 242 animais. O número de animais, por propriedade, dos quais as fezes foram coletadas variou, sendo o menor de quatro e o maior de 83 animais.

Das 242 amostras avaliadas (”pool” ou individual), seis (2,48%) foram positivas no Ziehl-Neelsen e 236 negativas. Na PCR, três (2,54%) deram resultados positivos, 115 negativos (Tabela 3) e as 124 amostras restantes não amplificaram. O número de amostras simultaneamente positivas para Ziehl-Neelsen e PCR foi três e o número de amostras positivas somente para Ziehl-Neelsen e negativa para PCR foi três. Nenhuma amostra se revelou negativa para Ziehl-Neelsen e positiva para PCR (simultaneamente). As amostras negativas para ambas as técnicas foram 112.

A sensibilidade e a especificidade do Ziehl-Neelsen foram de 100 e 97% respectivamente. Em relação ao PCR, a sensibilidade e a especificidade observadas foram de 50 e 100%, respectivamente (Tabela 4).

Técnica População Positivos Negativos Prevalência (%)

Ziehl-Neelsen 732 62 236 9,3

PCR 415 42 373 10,12

Técnica _{Sensibilidade (%) Especificidade (%)}

Ziehl-Neelsen 87,5 97,5

PCR 82,3 98,3

Técnica População Positivos Negativos Prevalência (%)

Ziehl-Neelsen 242 6 236 2,48

PCR 118 3 115 2,54

Tabela 1: Prevalência de Cryptosporidium spp. nas fezes de 732 bovinos provenientes de fazendas particulares da microrregião de Uberlândia, diagnosticado pelo Ziehl-Neelsen e PCR.

Tabela 2: valores da sensibilidade e especificidade do Ziehl-Neelsen e da PCR no diagnóstico de oocistos de Cryptosporidium spp. em amostras fecais 732 bovinos provenientes de fazendas particulares da microrregião de Uberlândia.

4. DISCUSSÃO

A contaminação ambiental por Cryptosporidium spp. pode ser proveniente de fezes de animais e de seres humanos, representando fonte potencial de infecção humana e animal pela contaminação de alimentos consumidos crus (Fayer, 1997).

A criptosporidiose em bovinos e suínos é doença encontrada em todo o mundo e estudos têm demonstrado ampla variação na prevalência e no modelo de eliminação de oocistos (Maldonado-Camargo et al., 1998).

Para bovinos, a prevalência acumulativa em algumas propriedades pode chegar a 100% segundo Xiao e Herd (1994); O’ Handley et al. (1999). Essas diferenças de resultados podem ser devido à geografia, delineamento do estudo, época do ano, idade dos animais, número de amostras por propriedade, metodologia de diagnóstico empregada, dificuldade do reconhecimento o oocistos, porém o fator mais importante é o padrão de excreção dos oocistos de forma intermitente, que pode levar a subestimação dos dados, principalmente próximo ao final da infecção. Portanto, a comparação entre prevalências torna-se extremamente difícil. Neste estudo, a prevalência encontrada em bovinos, independente da técnica utilizada, foi considerada baixa quando comparada as de Watanabe, Yang, Ooi (2005); Castro-Hermida et. al. (2007); Geurdin et. al. (2008); Ederli, Carvalho, Sales, (2004).

Em suínos, a prevalência encontrada, independente da técnica empregada, foi inferior à observada por Suarez-Luengas et al. (2007); Xiao et. al. (2004); Madox–Hyttel et. al. (2007). Vários fatores podem ter contribuído para essa diferença nos resultados, como o número da amostra, método de coleta das amostras (individual/pool), clima, rotina de manejo, faixa etária estudada ou metodologia de diagnóstico. Estudos demonstram que suínos infectados eliminam oocistos de forma intermitente por quatro semanas. A detecção de oocistos tende a decrescer, quando apenas uma amostra por indivíduo ou em “pool” é examinada, podendo os resultados serem subestimados (Thompson, 2004).

Vários métodos de detecção de oocistos de Cryptosporidium em fezes têm sido utilizados por pesquisadores. O método Ziehl-Neelsen, baseado no reconhecimento da morfologia específica do parasito pela microscopia de luz (Arrowood, 1997) e a Polymerase Chain Reaction (PCR), técnica fundamentada na extração e amplificação do material genético do parasito (Taylor; Webster, 1998) são alguns exemplos, entretanto, Brook et al. (2007) afirmam que nenhuma técnica é 100% sensível e específica. Neste trabalho, o método Ziehl-Neelsen foi mais sensível tanto para amostras de bovinos como para de suínos quando comparado com a PCR.

A alta sensibilidade e especificidade encontradas para o Ziehl-Neelsen nessa pesquisa, corrobora com os achados de Brook et al. (2007) que observaram índices de 92 e 88% de sensibilidade e especificidade, respectivamente. O bom desempenho deste método, provavelmente, está associado ao grande número de oocistos presentes nas amostras fecais e pelo fato das lâminas terem passado por dois leitores antes do diagnóstico final, o que diminui a chance de resultados falso-negativos ou falso-positivos.

O teste Ziehl-Neelsen é muito vantajoso visto que depende da visualização dos oocistos com os reagentes de coloração. É método simples e de baixo custo, viabilizando, assim, seu uso em laboratórios de análises clínicas (Ripabelli et. al., 2004). Além disso, as lâminas confeccionadas por este teste podem ser armazenadas sem que haja nenhum tipo de alteração na morfologia dos oocistos (Brook et.al., 2007). Alguns autores, entretanto, alertam para os cuidados na utilização desta técnica. Mtambo et. al. (1992) observaram que a detecção de oocistos pelo Ziehl-Neelsen não foi possível quando o número de oocistos de Cryptosporidium é muito baixo. Os autores ainda

Técnica Sensibilidade (%) Especificidade (%)

Ziehl-Neelsen 100 97

PCR 50 100

relatam que alguns oocistos podem não corar e alguns ter a morfologia distorcida, podendo dificultar o diagnóstico.

Com relação a PCR, a baixa sensibilidade encontrada neste trabalho, pode estar associada a inibidores presentes nas fezes, à perda de parasitos durante a concentração e a purificação das amostras, à contaminação das mesmas ou até mesmo ao protocolo utilizado. Embora, estudos relatem que os métodos moleculares são mais sensíveis e específicos, eles devem ser utilizados apenas em amostras muito puras e com grande carga parasitária o que faz com que a amplificação dos oocistos seja facilitada. Porém, o elevado custo destes métodos opõe o uso desses em larga escala ou em diagnósticos clínicos (Brook et al., 2007). Segundo Castro-Hermida et. al. (2007) a amplificação de um grande número de amostras de bezerros e ovelhas não foi possível, o que corrobora com os achados deste estudo. Este fato pode estar associado a algum tipo de contaminação das amostras fecais.

A utilização de métodos laboratoriais que possuam elevada sensibilidade e especificidade, facilidade de execução e interpretação, bem como baixo custo, é de fundamental importância para a realização de um inquérito epidemiológico (Feitosa et al., 2004).

No presente trabalho a técnica Ziehl-Neelsen obteve maior sucesso na detecção de oocistos de Cryptosporidium spp. Porém é importante ressaltar que ambas as técnicas utilizadas neste estudo possuem vantagens e desvantagens, cabendo, assim, ao pesquisador escolher aquela que é mais adequada aos objetivos de sua pesquisa.

4. AGRADECIMENTOS

Agradeço a FAPEMIG pela bolsa de iniciação científica. 5. REFERÊNCIAS

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COMPARISON OF THE EFFECTIVENESS OF ZIEHL-NEELSEN AND

POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR) FOR DIAGNOSIS OF

CRYPTOSPORIDIUM SPP. IN CATTLE AND PIGS FROM THIS CITY.

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ABSTRACT: Protozoan Cryptosporidium spp. is responsible for gastrointestinal disorders in pets. It is considered of great importance to produce economic losses due to deaths, weight loss, reduction in milk production and spending on drugs. Laboratory methods that have high sensitivity and specificity, ease of implementation and interpretation as well as low cost, are fundamental for the control, prevention and treatment of infection caused by protozoan. This study aimed to compare the sensitivity and specificity of Ziehl-Neelsen and PCR for diagnosis of Cryptosporidium spp. in cattle and pigs from farms of the microregion of Uberlândia - MG. Feces were collected from 242 pigs and 732 cattle. The prevalence found in Ziehl-Neelsen for cattle was 9.3% and 10.12% for PCR, in pigs, the prevalence to Ziehl-Neelsen was 2.48% and 2.54% for PCR. The sensitivity and specificity observed on cattle samples for Ziehl-Neelsen were 87,5 e 97,5% and for PCR these values were 82,3 e 98,3%. The sensitivity and specificity found on pigs samples for Ziehl-Neelsen were 100 and 97% respectively. These indices were 50 and 100% for PCR. It follows that the Ziehl-Neelsen technique was successful in the detection of oocysts of Cryptosporidium spp. But both techniques have advantages and disadvantages, and the researchers must choose what is most appropriate to the goals of their research.