Escola de Medicina Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE BACTÉRIAS CANDIDATAS A PROBIÓTICOS EM ORGANISMOS
AQUÁTICOS
ISABELLE FRANCO
Salvador – Bahia 2009
ISABELLE FRANCO
ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE BACTÉRIAS CANDIDATAS A PROBIÓTICOS EM ORGANISMOS
AQUÁTICOS
Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Produção e Reprodução Animal.
Orientadora: Profª. Drª. Adriana Regina Bagaldo Co-orientador: Prof. Dr. Mateus Matiuzzi da Costa
Salvador – Bahia 2009
ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE BACTÉRIAS CANDIDATAS A PROBIÓTICOS EM ORGANISMOS
AQUÁTICOS
ISABELLE FRANCO
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos.
Salvador, 20 de março de 2009.
Comissão Examinadora,
__________________________________________ Profª. Drª. Adriana Regina Bagaldo
Orientadora
__________________________________________ Prof. Dr. Mateus Matiuzzi da Costa
Co-orientador
__________________________________________ Prof. Dr. Ricardo Castelo Branco Albinati
“Só se vê bem com o coração, o essencial é invisível para os olhos”. Antoine de Saint-Exupéry
À minha família, pelo amor que tenho a vocês.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me dado saúde e por todas as coisas que aconteceram ao longo da minha vida.
Aos camarões e peixes que contribuíram com suas vidas para a realização dessa pesquisa, meus agradecimentos e minhas desculpas.
A minha mãe, por apoiar meus estudos, por ser meu porto seguro, por todo amor que recebi em todos os momentos.
Aos meus irmãos, sobrinhos e demais familiares, pelo apoio, carinho e incentivo.
Aos meus amigos Rodolfo (Inho), Lu, Eliene, Nara, Márcia, Chirles, pela amizade, conselhos e paciência.
À professora Eugênia (in memorian), por acreditar na minha capacidade, por ser uma referência na minha vida, pelo modelo profissional e pessoal, carinho e amizade.
À professora Adriana, pela orientação, confiança e apoio. Ao professor Albinati, pelas sábias, sempre sábias palavras.
Ao professor Maurício, pelo apoio no momento em que mais precisei ao longo do Mestrado.
Ao professor Mateus, cuja conduta pessoal e profissional são para mim exemplo de vida, pelo auxílio, disposição, ensinamentos e amizade.
Ao Eduardo, pela ajuda incondicional no desenvolvimento das minhas análises. Aos colegas do Mestrado, pelos anos de convívio e batalha.
Aos professores do Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos – UFBA, pelos ensinamentos.
Aos funcionários do Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos – UFBA, pela amizade, dúvidas tiradas e pelos serviços prestados, Kátia e Angélica.
As meninas do Laboratório de Bacterioses da UFBA, em especial, Soninha e Eliene, pelo apoio e disposição na realização deste trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Microbiologia e Imunologia Veterinária da UNIVASF, pela convivência e companheirismo.
Aos amigos de sempre.
A Universidade Federal da Bahia, Universidade Federal do Vale do São Francisco, a CAPES pela bolsa concedida e a FAPESB pelo financiamento do Projeto.
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS... ix
LISTA DE TABELAS... xi
LISTA DE FIGURAS... xii
RESUMO... xiii
SUMMARY... xiv
1. INTRODUÇÃO GERAL... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA... 4
2.1. CARCINICULTURA... 4
2.2. BACTÉRIAS ENCONTRADAS EM AMBIENTE E ORGANISMOS AQUÁTICOS... 6 2.2.1. Bacillus spp... 6
2.2.2. Plesiomonas spp... 6
2.2.3. Aeromonas spp... 7
2.2.4. Vibrio spp... 9
3. RESISTÊNCIA A DROGAS ANTIMICROBIANAS UTILIZADAS NA AQUICULTURA... 10
4. PROBIÓTICOS... 12
5. ARTIGOS CIENTÍFICOS... 19
Caracterização molecular e susceptibilidade aos antimicrobianos de isolados bacterianos de camarões (Litopenaeus vannamei) com potencial utilização
probiótica... 20
RESUMO... 20
SUMMARY... 20
INTRODUÇÃO... 21
MATERIAL E MÉTODOS... 22
RESULTADOS E DISCUSSÃO... 26
REFERÊNCIAS... 30
Aeromonas spp. from aquatic organisms: biochemical, molecular and antimicrobial drugs sensitivity characterization………... 34
SUMMARY... 34
RESUMO... 34
INTRODUCTION... 35
MATERIAL AND METHODS... 36
RESULTS AND DISCUSSION... 37
REFERÊNCES... 41
6. CONSIDERAÇÕES GERAIS... 45
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 46
LISTA DE ABREVIATURAS
APA – Água Peptonada Alcalina APT – Água Peptonada Tamponada DNA – Ácido Desoxirribonucléico ºC – Graus Celsios
dNTPs – Mistura desoxirribonucleotídeos (A, C, G, T) GOF – Glicose Oxidativa/Fermentativa
HCl – Ácido Clorídrico MgCl2 - Cloreto de Magnésio min - Minuto
ml - Mililitro mM – Mili molar µl – Microlitro µg - Micrograma ng – Nanograma pb – Par de bases
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase rRNA 16S – Gene do RNA ribossômico 16S
RFLP – Restriction fragment lenth polymorfism (polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição)
seg - Segundo
Taq – Thermus aquaticus Taq buffer – Tampão de Taq
TCBS - Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrase TSA - Tryptone Soya Agar
TSI - Triple Sugar Iron Agar
KCl – Cloreto de Potássio
UFC – Unidade Formadora de Colônias u – Unidade enzimática
LISTA DE TABELAS
1.2. Probióticos utilizados na aqüicultura... 13 1.3. Bactérias identificadas em camarões da espécie Litopenaeus vannamei... 26 2.3. Restriction fragment length polymorphism of 16S rRNA identification and virulence genes prevalence among Aeromonas spp. isolates from
aquatic organisms... 38
LISTA DE FIGURAS
1.3. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de isolados de Litopenaeus
vannamei... 27 2.3. Susceptibility to antimicrobial drugs of Aeromonas spp. isolates from aquatic
organisms………... 40
FRANCO, I. Isolamento, identificação e caracterização molecular de bactérias candidatas a probióticos em organismos aquáticos. Salvador, Bahia, 52p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2009.
RESUMO
A carcinicultura marinha é hoje uma das principais atividades agroindustriais no Brasil, onde se concentra especialmente na região Nordeste. A presença de agentes bacterianos no ambiente aquático podem desencadear várias enfermidades nos animais, cuja prevenção está associada ao uso de um limitado número de agentes antimicrobianos. Os probióticos constituem-se em uma das alternativas de controle dessas doenças. O objetivo deste trabalho foi o isolamento, identificação e caracterização molecular de bactérias candidatas a probióticos em organismos aquáticos. A partir do material avaliado, foram identificadas Aeromonas caviae, A. veronii, Alcaligenes denitrificans, Bacillus cereus, Enterobacter spp. e Pasteurella spp.. Nenhum antagonismo foi encontrado entre as bactérias analisadas. O ácido nalidíxico e a norfloxacina foram as drogas antimicrobianas que apresentaram maior eficácia contra os isolados avaliados. Foram encontrados genes de virulência de Aeromonas spp. isoladas de organismos aquáticos, sugerindo o potencial de causar infecções nos peixes e seres humanos. Tendo em vista, a múltipla resistência e a possível transferência horizontal de genes entre bactérias de origem aquática, pesquisas devem ser realizadas na busca de terapias alternativas contra esses microrganismos.
Palavras-chave: bactérias, drogas antimicrobianas, organismos aquáticos, probióticos.
FRANCO, I. Isolation, identification and characterization molecular of probable probiotic bacterials in aquatic organisms. Salvador, Bahia, 52p. Dissertation (Master in Animal Science in the Tropics) - Veterinary Medicine School, Federal University of Bahia, 2009.
SUMMARY
Shrimp production is actually a main agro-industrial activities in Brazil, where is concentrated in northeast region specially. Presence of bacterial agents in aquatic environment can be associated to diseases in aquaculture. The prevention and treatment of infectious diseases is supported by a few number of antimicrobial drugs. Probiotic agents are an alternative for control these diseases. The aims of this study were perform isolation, identification and characterization molecular of probable probiotic bacteria from aquatic organisms. Were identified Aeromonas caviae, A. veronii, Alcaligenes denitrificans, Bacillus cereus, Enterobacter spp. e Pasteurella spp. in shrimps. No antagonistic activity was determinate among bacterial isolates. Nalidixic acid and norfloxacin were more efficient antimicrobial drugs against bacterial isolates. Virulence genes were founded in Aeromonas spp. isolated from aquatic organisms, suggesting a potential to human pathogenesis. Considering the multidrug resistance and the horizontal gene transference in aquatic bacteria the search for alternatives as probiotic bacteria may be performed.
Keywords: bacterials, antimicrobial drugs, aquatic organisms, probiotics.
FICHA CATALOGRÁFICA
F 825 Franco, Isabelle.
Isolamento, identificação e caracterização molecular de bactérias candidatas a probióticos em organismos aquáticos / Isabelle Franco. 2009.
52f.
Orientadora: Drª. Adriana Regina Bagaldo
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal da Bahia – UFBA. Salvador.
1. Bactérias. 2. Drogas antimicrobianas. 3. Organismos aquáticos. 4. Probióticos. I. Bagaldo, Adriana Regina. II. UFBA. III. Título.
CDD 574.232 2 CDU
1. INTRODUÇÃO GERAL
A produção mundial de camarão cultivado tem crescido de forma contínua, sendo que no Brasil, em 2005, alcançou 65.000 toneladas e na Bahia 6.196 toneladas (BAHIA PESCA, 2006). A produção de crustáceos em 2006 foi equivalente a 9% da produção aquícola total e a 23% do valor em dólares (FAO, 2009).
As enfermidades infecciosas têm sido uma das preocupações do carcinocultor, uma vez que as mesmas podem ser responsáveis por perdas significativas de indivíduos na população e, conseqüentemente, decréscimo sensível na produção de camarões (Bueno
& Gastelú, 1998). Tradicionalmente, o controle de doenças bacterianas nos tanques de larvicultura tem como princípio o uso de componentes químicos, principalmente as drogas antimicrobianas. Entretanto, o uso destes fármacos na aqüicultura pode selecionar bactérias resistentes e desta forma representar um risco para a saúde pública e para o meio ambiente (Chang & Liu, 2002). Além disso, o tratamento quimioterapêutico exige grandes quantidades de medicamentos que são onerosos do ponto de vista econômico (Sealey & Gatlin, 1999).
O equilíbrio ecológico é uma questão importante e existem debates acirrados. No oceano há uma vasta população de bactérias naturalmente na água e em tanques de aqüicultura há uma tendência do mesmo processo ocorrer. Quando se utiliza um antibiótico, a população de bactérias decresce rapidamente, porém em pouco tempo volta a se estabelecer (Maeda et al., 1997).
A antimicrobianoterapia pode ter como função somente a redução dos impactos da bactéria na saúde do hospedeiro. As consequências benéficas para o hospedeiro podem, portanto, ser esperadas somente quando a infecção é a principal causa da morbidade ou mortalidade da população. Desta forma, as medidas de diagnóstico não podem estar
pautadas somente na detecção de patógenos específicos, mas sim no entendimento do papel destes no desenvolvimento da enfermidade (Smith et al., 2008). Esta afirmação torna clara a importância da determinação da virulência bacteriana e dos fatores primários da doença antes da implementação de uma antimicrobianoterapia.
Em qualquer situação o sucesso da terapia antimicrobiana está em função da escolha do agente apropriado, mas existem poucos fármacos antimicrobianos de escolha para aquicultura. Entretanto, em muitos países não há somente a falta de profissionais treinados, mas também a indisponibilidade de agentes antimicrobianos para uso aqüicultura (Smith et al., 2008). Essa situação tem alertado para a necessidade da criação de medidas profiláticas e terapêuticas eficazes, ambientalmente corretas e que não tragam risco à saúde humana. O controle de doenças na aqüicultura exige, cada vez mais, uma abordagem efetiva e ambientalmente segura. O aumento da resistência bacteriana aos antibióticos utilizados mundialmente tem estimulado a investigação de meios alternativos para o controle de patógenos, como por exemplo, o uso de microrganismos benéficos. As restrições ao uso de antimicrobianos, mediante imposições legais, paralelo a uma maior conscientização quanto à necessidade de garantir produtos saudáveis e inócuos ao consumidor final, contextualizam a importância do desenvolvimento e utilização dos probióticos nesse setor (Sotomayor & Balcázar, 2003).
Segundo Verschuere et al. (2000), probiótico é um adjunto microbiano vivo que tem efeito benéfico sobre o hospedeiro, ao modificar a comunidade microbiana do ambiente ou associada ao hospedeiro, assegurando uso melhorado do alimento ou aumentando seu valor nutricional, ao acentuar a resposta do hospedeiro a doenças, ou ao aumentar a qualidade de seu ambiente imediato. Com base nessa definição, probióticos podem incluir adjuntos microbióticos que impedem patógenos de se proliferarem no trato
intestinal, nas estruturas superficiais, e no ambiente da espécie cultivada que asseguram o uso ótimo da alimentação ao auxiliar na digestão. Além disso, melhoram a qualidade da água e estimulam o sistema imune do hospedeiro.
O passo inicial para o desenvolvimento de um probiótico efetivo para qualquer sistema de produção de animais aquáticos é o conhecimento de probiontes que seriam normalmente encontrados tanto no ambiente aquático quanto no trato intestinal, é determinado que bactérias probióticas não devem ser patogênicas para seus hospedeiros (Verschuere et al., 2000). Um dos principais desafios em obter-se bactérias probióticas é usar métodos de seleção e colonização apropriados. Uma seleção criteriosa por bactérias probióticas deverá avaliar os métodos de colonização, a capacidade de competição contra patógenos e crescimento imunoestimulatório eficiente em camarões (Gullian et al., 2004).
Desta forma, nesse estudo, sabendo-se que o uso indiscriminado de antimicrobianos na carcinicultura, pode resultar em produtos destinados para o consumo humano com resíduos de antibióticos e bactérias resistentes que podem comprometer a saúde da população humana. O objetivo deste trabalho foi o isolamento, identificação e caracterização molecular de bactérias candidatas a probióticos em organismos aquáticos, com o intuito de contribuir para o uso de bactérias preventivas, como uma alternativa de reduzir a utilização de drogas antimicrobianas.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. CARCINICULTURA
A carcinicultura foi introduzida no Brasil na década de 1970, no estado do Rio Grande do Norte, aproveitando os tanques abandonados das salinas, mas somente após o desenvolvimento do pacote tecnológico do camarão originário da costa do Pacífico (Litopenaeus vannamei) entre 1996/1997, ocorreu crescimento intenso, principalmente, no final da década passada e início desta. Esse crescimento continua vigoroso e ocorreu em muitos aspectos, nos moldes do que já havia acontecido nos países do sudeste asiático, sem ordenamento adequado, sem regulamentação, com forte incentivo governamental e geração de impactos ambientais e sociais graves (IBAMA, 2005). A carcinicultura brasileira enfrentou uma crise econômica entre 2004-2007, chegando ao final do último ano mostrando sinais claros de superação de seus principais problemas, inclusive, apontando para uma retomada do crescimento já a partir de 2008 decorrentes da dificuldade econômica, doenças e política cambial. Evidentemente, que a perda de competitividade das exportações, decorrente da desvalorização cambial, associado ao amadorismo e a incipiente estrutura da cadeia de comercialização interna, juntamente com o descaso governamental na concessão de créditos e do próprio licenciamento ambiental, constituem sérios desafios que o setor precisa superar para restabelecer a normalização das condições de operacionalidade e, permitir um desenvolvimento econômico com a necessária sustentabilidade sócio-ambiental (Rocha, 2008).
A atividade do cultivo de camarão é um dos segmentos da aqüicultura que mais se destaca no contexto do setor pesqueiro mundial, tanto pela inclusão social, através da
viabilização de oportunidades para micro e pequenos empreendedores, como pela geração de empregos, renda e divisas para as populações desfavorecidas do meio rural litorâneo dos países em desenvolvimento. Em realidade, a carcinicultura se constitui a alternativa de maior viabilidade para o estabelecimento do crescimento econômico no setor primário, onde a qualificação prévia de mão-de-obra não representa um impedimento para a implantação dos seus empreendimentos, contribuindo de forma bastante positiva para o desenvolvimento de tecnologias que beneficiam toda a cadeia produtiva da aqüicultura mundial (Rocha, 2007; Carli, 2002).
A carcinicultura marinha é uma das atividades agroindustriais mais atrativas economicamente, já que nos últimos quatro anos registra taxa média de expansão territorial de 20% ao ano. No país, essa atividade está concentrada na região Nordeste, principalmente Rio Grande do Norte, Bahia, Ceará e Pernambuco, e com pequenas iniciativas nas regiões Norte, Sul e Sudeste (Morais, 2002). O clima tropical do Brasil, a sazonalidade e riquezas litorâneas (8.400 km de costa marítima e disponibilidade de água) proporcionam condições ideais para o cultivo de camarão marinho. O Brasil consolida-se entre os principais países líderes no que diz respeito, a produção de camarões no hemisfério ocidental (ABCC, 2005).
O crescimento da carcinicultura mundial, tem suscitado debates acirrados sobre a sustentabilidade ambiental dessa atividade em longo prazo e as vulnerabilidades dos ecossistemas brasileiros frente a grande quantidade e dimensão dos investimentos nessa área. Isso se deve às crises ambientais associadas ao rápido crescimento da carcinicultura em alguns países como Taiwan, China e Equador que contribuiu para a degradação dos ecossistemas estuarinos, na proliferação de doenças e conseqüente queda de produção do sistema (Figuerêdo et al., 2003).
2.2. BACTÉRIAS ENCONTRADAS EM AMBIENTE E ORGANISMOS AQUÁTICOS
2.2.1. Bacillus spp.
O gênero Bacillus é um dos componentes da família Bacillaceae, o qual abrange na atualidade mais de 60 espécies de bacilos gram-positivos aeróbios ou anaeróbios facultativos que produzem endosporos. As espécies de Bacillus são ubíquas, habitam o solo, a água e poeira; também encontradas na microbiota intestinal de humanos e outros animais, inclusive em animais aquáticos (Koneman et al., 2001). Apesar de não serem consideradas bactérias autóctones, fato que poderia tornar inviável sua utilização como probiótico, muitos bacilos apresentam um ciclo de vida duplo, que envolve germinação de esporos, proliferação e re-esporulação sob condições adversas, o que lhes permite crescer e sobreviver no meio ambiente e no intestino de animais, sendo este ciclo a base do seu efeito probiótico (Hong et al., 2005).
2.2.2. Plesiomonas spp.
O gênero Plesiomonas é composto pela espécie P. shigelloides, caracterizada como um bacilo gram-negativo, pertencente à família Enterobacteriaceae, anaeróbio facultativo que apresenta motilidade por meio de dois a sete flagelos polares. O principal habitat desta espécie é o ambiente aquático, incluindo a água doce e do mar, é comumente encontrada no intestino de peixes (Falcão et al., 2007). A espécie P. shigelloides é descrita como patógeno emergente de importância crescente em alimentos, como também em infecções intestinais e extraintestinais (Lehane & Rawlin, 2000).
Segundo Shama et al. (2000), Plesiomonas shigelloides foi a bactéria com maior percentual de isolamento, presente em 15% (15/100) dos jundiás (Rhamdia quelen),
principalmente nos rins e em algumas lesões externas. Em humanos, P. shigelloides causa a maioria das doenças gastrointestinais, geralmente são relatados surtos pelo consumo de alimentos do mar e água não tratada (Salerno et al., 2007). No experimento realizado por Boijink et al. (2001), estes demonstraram que apesar do número elevado de bactérias em jundiás não ocorreu desenvolvimento de manifestações clínicas e patológicas refletindo na ausência de virulência.
2.2.3. Aeromonas spp.
A presença de agentes bacterianos no ecossistema aquático, destacam aqueles pertencentes às famílias Aeromanadaceae e Enterobacteriaceae, cuja presença nesse ambiente pode ser reconhecida pela detecção na pele, brânquias e intestinos dos peixes e quando há desequilíbrio no sistema bactéria-hospedeiro-ambiente, podem estar envolvidos como agentes primários, inclusive desencadeando epizootias em piscicultura (Lehane & Rawlin, 2000).
Aeromonas spp. são microrganismos comumente encontrados em água do mar e ambientes estuarinos e vem sendo reconhecidas como patógenos oportunistas de répteis, peixes e diferentes mamíferos (Carnahan et al., 1991). O complexo Aeromonas reúne bactérias patogênicas importantes em peixes, que são responsáveis por septicemia e lesões ulcerativas, associadas a significativas perdas econômicas para a aqüicultura (Costa & Cyrino, 2006). Membros do gênero Aeromonas pertencem a família Aeromonadaceae e são bactérias anaeróbicas facultativas, bacilos gram-negativos, encontrados em diversos ambientes, incluindo solo e água (Nam & Joh, 2007).
Por muitos anos, a taxonomia da Aeromonas spp. foi desconhecida e depois de significativas revisões, parece razoavelmente esclarecida. As metodologias para identificação de espécies de Aeromonas spp. abrangem o estudo de complexas rotas
metabólicas, que refletem em diversos testes bioquímicos (Abott, 1992), de diferenças em componentes celulares e nas sequências de nucleotídeos (Figueras et al., 2000). As técnicas moleculares como, polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP), são vantajosas, rápidas e fáceis, contudo exibem discrepâncias na identificação de algumas espécies e para sua interpretação exigem pessoal treinado (Borrel et al., 1997). A técnica de amplificação do DNA por PCR (Reação em Cadeia pela Polimerase) fornece uma ferramenta altamente sensível e específica para a detecção destes microrganismos através de seus produtos de secreção (Cascón et al., 1996).
Métodos moleculares são de interesse especial, quando um grupo de bactérias patogênicas são difíceis de cultivar ou de crescimento muito lento (Harmsen & Karch, 2004; Dostal et al., 2003). Além disso, diagnósticos independentes de cultura são preferíveis no tratamento com antibiótico que já foi iniciado antes dos testes microbiológicos (Heijden et al., 1999).
Aeromonas spp. possuem elevada patogenicidade em humanos e alguns vertebrados, incluindo peixes (Abdulah et al., 2003). Estas foram causadoras de doenças em peixes, incluindo A. hydrophila, A. veronii biovar sobria, A. allosaccharophila e A. salmonicida. Destas, A. hydrophila, A. veronii biovar sobria, A. jandaei, A. schubertii, e A. caviae são os mais comumente encontrados em infecções intestinais humanas (Jacobs & Chenia, 2007). Nos jundiás, quando a infecção por Aeromonas hydrophila ocorrem lesões ulcerativas com significativas alterações histológicas e comportamentais (Boijink & Brandão, 2001).
As espécies Aeromonas secretam muitas proteínas extracelulares, incluindo amilase, quitinase, elastase, aerolisina, nuclease, gelatinase, lecitinase, lipase e protease. Estas proteínas são conhecidas como fatores de virulência que causam doenças em peixes e humanos (Nam & Joh, 2007). A. hydrophila pode causar diarréia através da produção de
enterotoxinas citotóxicas. Até agora, duas toxinas hemolíticas foram descritas: a A. hydrophila hemolisina (hlyA) e aerolisina (aerA). A maioria dos isolados hemolíticos de Aeromonas spp. descritos produzem uma destas toxinas. Isolados virulentos de A. hydrophila produzem hemolisinas (Aslani & Hamzeh, 2004). Além do mais, foi sugerido que variações na distribuição de genes de potencialidade virulenta entre isolados de Aeromonas spp. podem contribuir para o seu grau de virulência (Abdulah et al., 2003). Genes que codificam fatores de virulência foram isolados e sequenciados permitindo a detecção de regiões de assinaturas para estes genes e avaliação de sua presença em isolados clínicos e ambientais de Aeromonas spp. (Cascón et al., 2000; Chacón et al., 2003).
2.2.4. Vibrio spp.
Os membros do gênero Vibrio pertencem a família Vibrionaceae, são microrganismos aquáticos definidos como bastonetes retos ou curvos, móveis, gram-negativos e não- esporogênicos (Quinn et al., 1994). A maioria fermenta a glicose sem produção de gás e apresenta reação de oxidase positiva (Silva & Cristina, 1995). Estudos prévios mostraram que V. parahaemolyticus possui genes importantes de virulência contribuindo à patogênese bacteriana, tal como tdh, que codifica diretamente hemolisina termoestável (TDH); trh, codificando hemolisina de TDH-relacionando (TRH); e tlh, codificando hemolisina termolábil (Xie et al., 2005).
O uso de espécies de Vibrio como probiótico é controverso, uma vez que este gênero integra inúmeras cepas patógenas para o homem e para os animais (Vandenberghe et al., 1999). Entretanto, Vibrio alginolyticus, cepa Ili, tem demonstrado boas propriedades como probiótico pela exclusão competitiva (Gullian et al., 2004), atuando como agentes de controle biológico por redução de Vibrios patógenos (Sotomayor & Balcázar, 2003).
Portanto, deve-se ter muita cautela na seleção de vibrios, sendo essencial uma correta identificação genotípica das cepas utilizadas, evitando os perigos do uso daquelas patogênicas (Vandenberghe et al., 1999).
3. RESISTÊNCIA AS DROGAS ANTIMICROBIANAS UTILIZADAS NA AQUICULTURA
Redução do desempenho de camarões marinhos cultivados são desencadeados por desequilíbrio entre as condições ambientais dos viveiros, os agentes potencialmente patogênicos e a saúde geral dos camarões. Doenças causadas por agentes bióticos e abióticos interferem no estado imunológico dos camarões, podendo favorecer ataques de patógenos oportunistas, levando à debilidade e morte dos mesmos (Nunes & Martins, 2002). Uma das formas de tentar controlar a proliferação bacteriana e reduzir o risco do desenvolvimento de enfermidades consiste no uso profilático de drogas antimicrobianas (Sealey & Gatlin, 1999).
Evidências sugerem que a maioria dos antimicrobianos usados na aqüicultura são adicionados na ração, de modo generalizado e somente quando do estabelecimento da enfermidade nos animais. Contudo, existem muitos trabalhos profiláticos na larvicultura de camarão e moluscos. Entretanto, o uso de antimicrobianos como promotores de crescimento na aqüicultura é raro (Smith et al., 2008).
As conseqüências potenciais do uso de antibióticos na alimentação de animais levam ao desenvolvimento de drogas resistentes a bactérias, resistência antibiótica múltipla, transferência de resistência por bactérias patogênicas e redução da eficácia dos tratamentos antibióticos de doenças em humanos e animais causadas por patógenos resistentes (Frappaola & Guest, 1986).
As terapias antimicrobianas são aplicadas comumente na produção de peixes e crustáceos (camarões e larvas) nas doenças que acometem a aqüicultura comercial. Nas culturas de moluscos o uso de antimicrobianos ocorre nos estágios inicias da fase larval e em quantidades pequenas. O uso de antimicrobianos em peixes ornamentais não está regulamentado e pouco se sabe das dosagens e outros aspectos farmacológicos destas drogas, por isso, é de grande importância o estudo da terapêutica destes compostos nestes animais, já que há uma proximidade maior com os seres humanos (Smith et al., 2008).
As conseqüências negativas potenciais da utilização de drogas antimicrobianas na aqüicultura, tal como a seleção de bactérias resistentes as drogas antimicrobianas nos humanos e animais, estimulou a busca por bactérias não patogênicas que podem ser empregadas como probióticos e agentes controladores (Farfanzar, 2006). Uma série de alternativas ao uso de antibióticos no controle de doenças têm sido propostas e com sucesso na aqüicultura, sendo os probióticos uma das possíveis alternativas (Nikoskelainen et al., 2001; Gram et al., 1999). Alguns progressos têm sido recentemente desenvolvidos nos métodos padrões para determinação da susceptibilidade in vitro de bactérias associadas com as doenças em animais aquáticos (Smith et al., 2008). Embora estudos apontam que mais de 90% dos protocolos para testes de sensibilidade avaliem somente isolados clínicos, em aquicultura seria interessante o estabelecimento de parâmetros para sensibilidade baseados em estudos epidemiológicos da região do surto (Smith, 2006; Kronvall et al., 2003).
A prevenção e tratamento de doenças infecciosas em animais aquáticos, no Egito, inclui um número reduzido de antibióticos e quimioterápicos aprovados pelo governo, além de poucas vacinas que podem ser utilizadas para acompanhar o manejo ambiental (FAO, 2004).
Resistência a antibióticos é particularmente relevante em espécies patogênicas de Aeromonas spp. nas quais, além da resistência clássica a β-lactâmicos, múltipla resistência vêm sendo frequentemente identificado (Kampfer et al., 1999; Vila et al., 2002; Vila et al., 2003). Esta bactéria pode receber e transferir genes de resistência a antibióticos para outras bactérias gram-negativas (Marchandin et al., 2003).
Múltipla resistência antibiótica (MAR) foi registrada para Aeromonas hydrophila isoladas nas fazendas de peixes de água doce em associação com uma variedade de drogas, comumente usadas como aditivo alimentar. O principal problema envolvendo o uso de antibióticos contra infecções ocasionadas por Aeromonas é o desenvolvimento da resistência, geralmente relacionados a presença de plasmídeos; sendo um assunto importante para a saúde pública (Costa & Cyrino, 2006; Akinbowale et al., 2006).
4. PROBIÓTICOS
A utilização de probióticos vem ganhando espaço no sistema de produção brasileiro, graças a boa produtividade natural, que é complementada com o uso destes microrganismos na ração. Muitos estudos têm sido conduzidos com o intuito de mostrar o efeito positivo da utilização de probióticos na produção de camarões. Os relatos negativos estão associados ao uso de bactérias que não foram isoladas do trato digestivo do animal em estudo (Vieira, 2006).
“Probiótico” é derivado do Grego que significa “para vida”. Lilly e Stillwell (1965) introduziram o termo “probióticos” para fatores promotores de crescimento produzidos por microrganismos. O termo usado por Parker (1974) para “organismos e substâncias” com efeitos benéficos para animais por influência da microbiota intestinal. O termo
“substâncias” é impreciso e pode incluir até mesmo antibióticos. Portanto, Fuller (1989)
definiu probiótico como “um suplemento alimentar microbiano vivo que afeta beneficamente o animal hospedeiro melhorando seu balanço microbiano intestinal”. Essa é a melhor definição uma vez que os probióticos são restritos a microrganismos vivos.
Tabela 1.2. Probióticos utilizados na aqüicultura
Organismos aquáticos Microrganismos Autor Ano
Penaeus monodon Bacillus S11 Rengipat et al. 1998
Lates niloticus Pseudomonas fluorescens AH2 Gram et al. 1999 Truta arco-íris
(Oncorhynchus mykiss)
Vibrio fluvialis, Carnobacterium spp.
Irianto e Austin 2002
Anguilla Anguilla Enterococcus faecium SF68 Chang e Liu 2002 Turbot larvae Lactobacillus plantarum Gatesoupe 1994 Fenneropenaeus indicus Bacillus spp. Ziaei-Nejad et al. 2006
Diversas bactérias têm sido utilizadas no cultivo de camarões marinhos em substituição aos antimicrobianos, com o objetivo de promover a saúde dos cultivos. Essas podem ser adicionadas diretamente na água, ou por meio de carreadores vivos, como artêmias e rotíferos. Os principais grupos de bactérias testados no cultivo de camarões, caranguejos, ostras e peixes têm sido Vibrio spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp. e Lactobacillus spp. (Gomez-Gil et al., 2000). Entretanto, nem todas essas espécies foram isoladas do trato intestinal desses animais, e os resultados de desempenho são contrastantes.
Na aqüicultura, a microbiota intestinal está em constante interação com o ambiente e as funções dos hospedeiros. Cahill (1990) revisou resultados dessa relação em peixes, e evidenciou que a bactéria presente no ambiente aquático influencia a composição da microbiota no trato digestivo de peixes e vice-versa. A microbiota bacteriana intestinal
de organismos aquáticos, ao contrário dos organismos terrestres, é constituída predominante por bactérias gram-negativas (Gomez-Gil et al., 2000) podendo variar de acordo com o ambiente, escassez de alguns nutrientes ou pelo uso de bactérias probióticas (Ringo & Gatesoupe, 1998).
Das cepas candidatas ao uso como probióticos, deve-se fazer um teste in vivo para avaliar a capacidade destas em colonizar o trato intestinal observando se há algum efeito benéfico da adição destas cepas ao animal no cultivo com relação à infecção por patógenos (Gullian et al., 2004).
As características in vitro de espécies bacterianas nem sempre refletem a capacidade de isolados específicos demostrarem um efeito positivo no peixe durante condições padrões de criação. No caso das larvas marinhas de peixe, observaram mortalidades elevadas durante a primeira etapa de alimentação raramente são atribuídos a patógenos específicos. A seleção de bactérias probióticas para os estágios larvais baseados inteiramente em inibição in vitro de patógenos de peixe seria, portanto, errôneo (Munro et al., 1994).
Espécies probióticas têm inibido bactérias patogênicas tanto in vitro e in vivo por diferentes mecanismos. Estes incluem proteção criando um ambiente propício para patógenos pela produção de componentes inibitórios como as bacteriocinas, sideróforos, lisozimas, proteases, peróxido de hidrogênio, formação de amônia e diacetil, alteração nos valores de pH, competição por nutrientes, sítios de adesão e enzimas que resultam no melhoramento nutricional do cultivo animal. A adição direta de material orgânico dissolvido mediado pelas bactérias modulam interações com o ambiente e o desenvolvimento de respostas imunes benéficas (Gómez et al., 2007).
Alguns trabalhos demonstraram pouco tempo de fixação dos microrganismos favoráveis ao trato digestivo de peixes hospedeiros, sendo este achado comum para aquelas
espécies bacterianas não pertencentes à microbiota dominante. Como no caso de bactérias produtoras de ácido lático, utilizadas comumente em animais terrestres (Garcia et al., 1997; Gatesoupe, 1994; Gildberg et al., 1995). Excepcionalmente se o hospedeiro tiver sido exposto a uma quantidade limitada de microrganismos durante o seu desenvolvimento, é improvável que a adição de probiótico em uma comunidade microbiana já estabelecida resultasse numa colonização dominante num período longo (Verschuere et al., 2000).
Bactérias gram-positivas tal como Bacillus spp. oferecem uma alternativa a terapia antibiótica para a carcinicultura, estas espécies de bactérias são comumente encontradas em sedimentos marinhos e, portanto, naturalmente são engolidos por camarões que alimentam-se destes. Além do mais, uma das vantagens destes microrganismos como probióticos são a menor capacidade de aquisição de genes para resistência aos antimicrobianos e virulência nos hospedeiros oriundos de Vibrio spp. e outros patógenos gram-negativos (Moriarty, 1999).
Bacillus subtilis (B. subtilis) tem demonstrado possuir atividades antitumorais e imunomodulatórias (Cohen et al., 2003). Alguns estudos têm demonstrado que B. subtilis agem como probióticos promovendo crescimento e viabilidade de bactérias ácido láticas no trato intestinal de humanos e alguns animais (Hoa et al., 2000).
Em Fenneropenaeus indicus observou-se que as atividades das enzimas digestivas lipase e amilase foram superiores em camarões alimentados com Bacillus spp. (Ziaei- Nejad, 2006). Cepas de bactérias de Bacillus P64 e Vibrio P62 isolados do trato digestivo de camarões adultos de L. vannamei apresentaram ação exclusão competitiva contra a bactéria patogênica V. harveyi. Adicionalmente, estas cepas mostraram-se eficientes na estimulação da enzima fenoloxidase (Gullian et al., 2004).
Bactérias láticas são comumente utilizadas em probióticos para animais terrestres, e alguns trabalhos relatam o seu uso em espécies aquáticas. As bactérias ácido-láticas são gram-positivas, geralmente imóveis, não produtoras de esporos e produzem ácido lático como principal ou único produto do metabolismo fermentativo. São bactérias muito exigentes do ponto de vista nutricional, requerem inúmeros substratos para sua sobrevivência. Pertencem a este grupo os Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Carnobacterium spp. e Leuconostoc spp., entre outros, podendo ser encontrados na microbiota intestinal de peixes saudáveis. Apesar dos testes já realizados, a ação antagonista e mecanismo de colonização destas bactérias não foram satisfatoriamente esclarecidos, sendo necessários novos desafios, especialmente in vivo, para um melhor entendimento (Ringo & Gatesoupe, 1998; Gatesoupe, 1999).
Diferentes gêneros de bactérias láticas (Streptcoccus, Lactococcus, Vagococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Aerococcus) se adaptaram a crescer em diferentes condições ambientais (Farfanzar, 2006). Contudo, as bactérias ácido- láticas não são dominantes na microbiota inestinal de organismos aquáticos e muitas tentativas têm sido relatadas no intuito de induzir uma dominância artificial destes microrganismos nestes animais (Gatesoupe, 1999).
Em experimentos feitos por Gildeberg et al. (1995), alevinos de salmão atlântico (Salmo salar) suplementados com uma bactéria produtora de ácido lático (Carnobacterium divergens) foi desafiada com peixes coabitantes infectados com Aeromonas salmonicida demonstrando que bactérias produtoras de ácido lático administradas como suplemento no alimento seco podiam colonizar o intestino, mas nenhuma proteção contra infecção por A. salmonicida pode ser detectada ao contrário do que se esperava.
No Brasil, o probiótico mais comumente utilizado é o EM-4, que apresenta na sua composição bactérias ácido-láticas, fototróficas e leveduras. Segundo o fabricante, esse
probiótico cria um melhor balanço microbiano e pode ajudar a suprimir doenças e ainda criar um ambiente eficiente pelo decréscimo no uso de antibióticos e químicos. Padilha et al. (2005) verificaram que os efeitos do EM-4, em viveiros de cultivo de Litopenaeus vannamei, sobre os parâmetros físico-químicos e índices de produtividade dos viveiros, bem como a análise da interferência sobre as bactérias mesófilas, láticas, bolores, leveduras, Vibrio spp. e coliformes termotolerantes não corresponderam ao propósito do produto especificado no manual. Este também não melhorou os níveis de oxigênio, amônia, nitrito e nitrato. Além disso, o ganho de peso, conversão alimentar, produção por hectare e sobrevivência dos camarões não justificou o uso do produto, sendo sua aplicação não recomendada economicamente.
O uso de Vibrio alginolyticus como um probiótico foi recomendado para aumentar a sobrevivência e crescimento do camarão (Litopenaeus vannamei). Exclusão competitiva de bactérias potencialmente patogênicas efetivamente reduz ou elimina a necessidade para profilaxia antibiótica na larvicultura de sistema intensivo (Garriques & Arevalo, 1995 apud Gómez et al., 2007).
Recentemente, provas de inibição para patógenos do trato digestório (Carnobacterium piscicola, Vibrio alginolyticus, Vibrio pelagius e Vibrio splendidus) de peixes (Scophthalmus maximus), na presença de extratos de bactérias ácido láticas, foram realizadas para avaliar a ação das bacteriocinas, geralmente citadas como responsáveis pela ação antagonistas dessas bactérias sobre os patógenos. Um grande número de bactérias foi avaliado: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei ssp. casei, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis ssp. lactis, Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides e Pediococcus acidilactici. O estudo in vitro atribuiu o mecanismo de ação aos ácidos lático e acético produzidos pelas bactérias, e não às bacteriocinas,
conforme esperado, acentuando a importância de novas pesquisas (Vázquez et al., 2005).
Apesar de algumas cepas de bactérias láticas colonizarem o intestino de peixes, elas não são dominantes na microbiota intestinal nativa dos mesmos. Embora possa ocorrer colonização do trato digestivo via alimento artificial combinado com cepas ácido láticas, o número dessas bactérias tende a diminuir bastante ou desaparecer pouco tempo depois de cessado o fornecimento do probiótico, por não serem naturalmente encontradas no trato digestivo destas espécies (Lidbeck & Nord, 1993 citado por Ringo
& Gatesoupe, 1998). Contudo, há relatos bem sucedidos do emprego de diversas bactérias ácido-láticas na aqüicultura (Joborn et al., 1997; Nikoskelainen et al., 2001), sendo necessários maiores estudos quanto à relação custo-benefício e viabilidade do seu uso.
5. ARTIGOS CIENTÍFICOS
ARTIGO 1
Caracterização molecular e susceptibilidade aos antimicrobianos de isolados bacterianos de camarões (Litopenaeus vannamei) com potencial utilização
probiótica
Molecular caracterization and susceptibility to antimicrobial drugs of isolated bacterials from shrimps (Litopenaeus vannamei) with potential probiotic utilization
FRANCO, Isabelle1*, BAGALDO, Adriana Regina2, GIL, Laura3, OLIVEIRA, Eduardo Alves Gamosa de4, ALBINATI, Ricardo Castelo Branco1, COSTA, Mateus Matiuzzi da5
RESUMO
O objetivo desse trabalho foi isolar bactérias provenientes do trato intestinal de camarões da espécie Litopenaeus vannamei, avaliando sua caracterização bioquímica e molecular, atividade de inibição e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos. As espécies bacterianas identificadas foram Aeromonas caviae (n=7), Alcaligenes denitrificans (n=1), Bacillus cereus (n=1), Enterobacter spp. (n=3). Com relação aos demais antimicrobianos perfis de sensibilidade foram observados, sendo 68,7% a eritromicina, 50% a tetraciclina, 81,2% a sulfametoxazol/trimetoprina, neomicina e estreptomicina, 12,5% a lincomicina e ampicilina, 87,5% a enrofloxacina e a nitrofurantoína, 93,7% a ceftriaxona. Os camarões podem ser portadores de bactérias patogênicas. Bacillus cereus não apresentou atividade de inibição para as bactérias isoladas de camarões avaliadas. A caracterização molecular é útil para identificação dos microrganismos estudados. O ácido nalidíxico e a norfloxacina são drogas antimicrobianas com elevada sensibilidade, para bactérias isoladas de camarões.
Palavras-chave: antimicrobianos, bactérias, carcinicultura, Litopenaeus vannamei.
1*Universidade Federal da Bahia. E-mail do autor para correspondência: isafelinos@hotmail.com
2Universidade Federal do Recôncavo Baiano
3Instituto Aggeu Magalhães
4EMBRAPA Semi-árido
5Universidade Federal do Vale do São Francisco
SUMMARY
The purpose of present study was to isolate bacteria from gut of shrimps from Litopenaeus vannamei, by perform biochemical and molecular identification, inhibition activity and sensitivity pattern determination. The bacterial species isolated were: Aeromonas caviae (n=7), Alcaligenes denitrificans (n=1), Bacillus cereus (n=1), Enterobacter spp. (n=3). Regarding the too antimicrobial drugs, profiles of sensibility were observed, being 68,7% to erythromycin, 50% to tetracycline, 81,2% to trimethoprim:sulfamethoxazole, neomycin and estreptomycin, 12,5% to lincomycin and ampicillin, 87,5% to enrofloxacin and nitrofurantoin, 93,7% to ceftriaxone. The shrimps can carry pathogenic bacterials. Bacillus cereus do not have inhibitory activity to shrimps bacterials isolates evaluated. The characterization molecular is important to identification of the microrganisms studied. The nalidixic acid and norfloxacin were antimicrobial drugs with sensibility high, bacterials isolates of shrimps.
Keywords: Antimicrobial drugs, bacteria, shrimp production, Litopenaeus vannamei.
INTRODUÇÃO
A atividade do cultivo de camarão é um dos segmentos da aqüicultura que mais se destaca no contexto do setor pesqueiro mundial. A carcinicultura constitui uma das alternativas de maior viabilidade para o crescimento econômico no setor primário, onde a qualificação de mão-de-obra não representa um impedimento para a implantação dos empreendimentos, contribuindo de forma positiva para o desenvolvimento de tecnologias que beneficiam toda a aqüicultura mundial (Rocha, 2007; Carli, 2002). As enfermidades que acometem os animais têm sido uma importante preocupação dos carcinocultores, uma vez que podem ser responsáveis por perdas significativas de indivíduos na população e decréscimo na produção de camarões (Bueno & Gastelú, 1998). Tradicionalmente, o controle de doenças bacterianas nos tanques incubadores tem como princípio o uso de componentes químicos, principalmente as drogas antimicrobianas. Entretanto, a utilização destes fármacos na aqüicultura pode selecionar bactérias resistentes e desta forma representar um risco para a saúde pública e para o meio ambiente (Chang & Liu, 2002). As restrições ao uso de antimicrobianos, mediante imposições legais, aliadas a uma maior conscientização quanto à necessidade de garantir produtos saudáveis e inócuos ao consumidor final, contextualizam a importância de estudos sobre probióticos (Sotomayor & Balcázar, 2003).
Segundo Verschuere et al. (2000), probióticos são adjuntos microbianos vivos que têm efeito benéfico sobre um hospedeiro, ao modificar a comunidade microbiana associada a ele ou ao ambiente. Seu uso na criação animal pode melhorar o valor nutricional do produto, ao acentuar a resposta do animal a doenças, ou ao aumentar a qualidade de seu ambiente imediato. Em estudo sobre o uso de probióticos em peixes, Cahill (1990) evidenciou a relação e dependência direta entre a microbiota intestinal e do meio
aquático. A microbiota bacteriana intestinal de organismos aquáticos, ao contrário dos organismos terrestres, é constituída em sua maioria por bactérias gram-negativas e gram-positivas (Gomez-Gil et al., 2000), podendo variar de acordo com o ambiente, com a escassez de alguns nutrientes ou pelo uso de bactérias probióticas (Ringo & Gatesoupe, 1998).
Diversas bactérias têm sido utilizadas em substituição aos antimicrobianos no cultivo de camarões marinhos, com o objetivo de promover a saúde dos animais, podendo ser adicionadas diretamente na água, ou por meio de carreadores vivos, como artêmias e rotíferos. Os principais grupos de bactérias testados em criações de camarões, caranguejos, ostras e peixes têm sido Vibrio spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp. e Lactobacillus spp. (Gomez-Gil et al., 2000). Entretanto, nem todas essas espécies foram isoladas do trato intestinal desses animais, e os resultados de seu desempenho são contrastantes.
Na literatura, é possível encontrar estudos que identificam alguns microrganismos com ação probiótica que podem ser utilizados na criação de peixes em cativeiro, entretanto para a carcinicultura poucas são ainda as pesquisas realizadas (Boijink & Brandão, 2001; Gildeberg et al., 1995). Este trabalho teve como objetivo realizar a caracterização bioquímica e molecular de bactérias provenientes de camarões, bem como determinar a atividade de inibição e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados bacterianos candidatos a probióticos.
MATERIAL E MÉTODOS
Local e animais experimentais
Para a realização desta pesquisa, foram feitas seis coletas de camarões cinza (Litopenaeus vannamei), na Fazenda BAHIA PESCA, especializada em aqüicultura, localizada no município de Santo Amaro/BA.
Coleta da amostras
A partir dos espécimes coletados foram obtidos os conteúdos digestivos por meio da remoção de todo o trato intestinal dos camarões após a desinfecção dos mesmos com álcool a 70%, cujo excesso foi removido por evaporação. O material obtido foi então encaminhado para o isolamento e identificação no Laboratório de Bacterioses (LABAC) da UFBA.
Isolamento e identificação
Para o isolamento dos microrganismos, foi realizado quatro “pools” do trato intestinal (com cinco camarões em cada) que foi semeado em diferentes meios de cultura. Foram utilizados tubos contendo APA (Água Peptonada Alcalina) e APT (Água Peptonada Tamponada), meios selecionados para o pré-enriquecimento das bactérias ambos incubados a 25°C por 24 a 48 horas. Em seguida, uma alíquota de cada meio, retirada com alça de platina, foi semeada pela técnica de esgotamento por estrias, em placas de Ágar Sangue Ovino 5%, ágar TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrase) e ágar TSA (Tryptone Soya Agar), que foram incubados a 25°C por 24 a 48 horas.
A identificação das bactérias, após seu isolamento, foi realizada por meio de características morfológicas, bioquímicas (provas de catalase, oxidase, citrato, mobilidade, uréia, manitol, glicose, sacarose, adonitol, lactose, malonato, vermelho de metila, indol, inositol, esculina, gelatina, redução de nitrato, lisina, arginina, ornitina e oxidação/fermentação), e tintoriais conforme descrições de Quinn et al., 1994.
Caracterização molecular dos isolados
As bactérias com perfil fenotípico de Aeromonas spp. foram submetidas à técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de restrição enzimática, para caracterização da espécie bacteriana. Esta técnica seguiu descrições de Borrel et al. (1997) & Ghatak et al. (2007) e foi realizada no Laboratório de Microbiologia no Campus da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF). Na PCR foram utilizados primers AerRFLP/F 5'AGAGTTTGATCATGGCTCAG3' e AerRFLP/R 5'GGTTACCTTGTTACGACTT3' específicos para o fragmento de DNA que codifica o rRNA16S do gênero Aeromonas. Para realização da reação foram utilizados 2µl de DNA molde, primers (0,5 ng de cada),
Taq buffer (10mM Tris, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2), 1mM de dNTPs, 0,125 U de Taq DNA polimerase (Ludwig Biotech) e água ultra pura (Ludwig Biotech) q.s.p 20 µL. As condições para amplificação seguiram descrições de Borrel et al. (1997) & Ghatak et al. (2007), com algumas modificações e envolveram a desnaturação a 94°C por 2 min e 25 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 seg, anelamento a 46,7°C por 30 seg e um passo de extensão a 72°C por 2 min. Após a ciclagem, foi realizada uma extensão final a 72°C por 7 min.
Para os isolados com identificação fenotípica duvidosa, foi realizada uma reação de PCR utilizando primers universais para amplificação de um fragmento de aproximadamente 800pb correspondente a uma região que codifica a subunidade 16S do rRNA de bactérias (Fredricks & Relman, 1998). Os fragmentos amplificados foram purificados a partir de géis de agarose de acordo com a metodologia descrita por Li & Ownby (1993) e submetidos ao seqüenciamento automático em equipamento MegaBace500. A reação de terminação de cadeia foi implementada com o uso do kit DYEnamic ET. As seqüências obtidas foram analisadas e comparadas com as seqüências depositadas no GenBank (Benson et al., 2002), pelo programa BLASTn.
Para um alto nível de qualidade das seqüências, admitiram-se índices de confiança para cada nucleotídeo acima de 97% e níveis de identidade de seqüência acima de 93%, admitindo-se E = 1e-100.
Teste de Inibição
O teste de inibição de microrganismos foi realizado conforme descrições de (Spanggaard et al., 2001). As bactérias isoladas a partir dos camarões foram inoculadas em caldo Mueller Hinton e incubadas por 24 horas a 37ºC. Em seguida, com auxílio de swabs foram semeadas em placas de Petri contendo ágar Mueller Hinton, onde foram realizadas perfurações, para inoculação de 20µL, utilizando suspensão bacteriana do potencial probiótico (Bacillus cereus), ajustada de acordo com a escala 0,5 MacFarland (106 UFC/ml), sendo as placas incubadas por 24 horas a 37ºC. A avaliação da atividade inibitória foi realizada observando-se a formação de halos de inibição do crescimento das bactérias avaliadas.
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
O teste de sensibilidade dos isolados aos antimicrobianos foi realizado pelo método de difusão em disco Kirby-Bauer modificado, a partir de uma turvação microbiana na escala 0,5 de Mac Farland em caldo Mueller Hinton (Bauer et al., 1966; NCCLS, 2000). Essa cultura foi transferida com swab estéril para placas de ágar Mueller Hinton, onde foram aplicados os discos contendo os antimicrobianos: lincomicina (2µg), enrofloxacina (5µg), ceftriaxona (30µg), nitrofurantoína (300µg), estreptomicina (10µg), norfloxacina (10µg), neomicina (30µg), ampicilina (10µg), eritromicina (15µg), ácido nalidíxico (30µg), sulfametoxazol/trimetoprina (25µg), tetraciclina (30µg). As placas foram incubadas por 24 horas a 37ºC, e em seguida foi realizada a leitura dos resultados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados da caracterização bioquímica e morfo-tintorial dos isolados permitiu a identificação de Aeromonas spp. (n=2), Plesiomonas shigeloides (n=1), Pasteurella spp. (n=2), Enterobacter aerogenes (n=2), Bacilos gram-negativos (n=2), Aeromonas salmonicida (n=1), Vibrio alginolyticus (n=1), Vibrio parahaemolyticus (n=1), Bacillus spp. (n=1), Vibrio spp. (n=1), Alcaligenes denitrificans (n=1). Para identificação da espécie de alguns desses isolados, e confirmação de sua identidade a caracterização molecular foi realizada e evidenciou os seguintes microrganismos Aeromonas caviae (n=7), Alcaligenes denitrificans (n=1), Bacillus cereus (n=1), Enterobacter spp. (n=3) (Tabela 1.3). Na avaliação do Bacillus cereus como potencial probiótico, não foi observada atividade de inibição para nenhum desses microrganismos isolados dos camarões.
Tabela 1.3. Bactérias identificadas em camarões da espécie Litopenaeus vannamei Isolados Identificação Bioquímica PCR RFLP16S rRNA
Aeromonas spp.
Sequenciamento rDNA 16S
C2.5 Aeromonas spp. A. caviae NR
C3.5 Plesiomonas shigelloides A. caviae NR
C41.5 Pasteurella spp. NR NR
C42.5 Aeromonas spp. A. caviae NR
C11.6 Enterobacter aerogenes NR NR
C13.6 Enterobacter aerogenes NR NR
C41.6 Bacilos gram - Negativo Enterobacter spp.
C42.6 Bacilos gram - Negativo Enterobacter spp.
C1.6 Aeromonas salmonicida A. caviae NR
C2.6 Pasteurella spp. NR Enterobacter spp.
C3.6 Vibrio alginolyticus A. caviae NR
C4.6 Vibrio parahaemolyticus A. caviae NR
C1.6 Bacillus spp. NR Bacillus cereus
C4CVPE Vibrio spp. A. caviae NR
C3MAC Alcaligenes denitrificans NR Alcaligenes
denitrificans NR: Não Realizado; SC: Sem Caracterização.
Todos os 15 isolados de camarões cinza (Litopenaeus vannamei), foram sensíveis a norfloxacina e ao ácido nalidíxico. Com relação às demais drogas antimicrobianas testadas, os perfis de susceptibilidade obtidos foram de 68,7% a eritromicina, 50% a tetraciclina, 87,5% a nitrofurantoína, 81,2% a sulfametoxazol/trimetoprina, neomicina e estreptomicina, 12,5% a lincomicina e ampicilina (Figura 1.3).
Figura 1.3. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de isolados de Litopenaeus vannamei
O complexo Aeromonas agrega bactérias patogênicas importantes em peixes, causando infecções septicêmicas e perdas econômicas associadas ao cultivo mundial de peixes (Costa & Cyrino, 2006). Neste trabalho a espécie A. caviae foi encontrada nos isolados de camarões. As metodologias para identificação de espécies de Aeromonas spp. abrangem o estudo de complexas rotas metabólicas, que refletem em diversos testes bioquímicos (Abott, 1992), de diferenças em componentes celulares e nas sequências de nucleotídeos (Figueras et al., 2000). No presente estudo, o polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) (Borrel et al., 1997), foi utilizado para identificação de algumas espécies, bem como a técnica de amplificação do DNA por PCR para a detecção destes microrganismos através de seus produtos de secreção (Cascón et al., 1996).
Aeromonas spp. é um dos principais patógenos na aqüicultura e pode ocasionar infecções alimentares em seres humanos (Austin & Austin, 1993). Os isolados foram particulamente sensíveis a todos os antimicrobianos com destaque para o ácido nalidíxico e a norfloxacina (Figura 1.3), o que corrobora com resultados de Costa et al. (2008). Em nosso experimento foi observado que os isolados foram menos sensíveis a lincomicina e ampicilina. A resistência aos antimicrobianos pode ser disseminada por plasmídeos (Akimbowale et al., 2006), isolados de Aeromonas spp. possuem uma resistência inerente aos beta-lactâmicos, em particular a ampiclina (Saavedra et al., 2004).
O desenvolvimento de um probiótico efetivo, para qualquer sistema de produção de organismos aquáticos requer a identificação de probiontes normalmente encontrados no ambiente aquático e no trato intestinal, considerando a complexidade de relações entre hospedeiro e habitat (Verschuere et al., 2000). Nesse trabalho, a partir do intestino dos animais avaliados, foram encontrados isolados de Bacillus cereus, uma das principais espécies descritas na aqüicultura. Esses achados corroboram com os de Gomez-Gil et al. (2000) e apontam para o potencial uso deste microrganismo como probiótico.
Apesar de os bacilos não serem considerados bactérias autóctones, fato que poderia tornar inviável sua utilização como probiótico, muitos apresentam um ciclo de vida duplo, que envolve germinação de esporos, proliferação e re-esporulação sob condições adversas, o que lhes permite crescer e sobreviver no meio ambiente e no intestino de animais, sendo este ciclo a base do seu efeito probiótico (Hong et al., 2005). Não foram encontrados relatos que descrevam B. cereus como patogênico para camarões Litopenaeus vannamei.
Algumas espécies de Bacillus spp. têm mostrado atividade inibitória contra vários patógenos (Rengipat et al., 1998). Diversos estudos informaram que este microrganismo
produz antibióticos polipeptídeos, como a bacitracina, granicidina S, polimixina e tirotricidina, que são ativos contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (Perez et al., 1993). Ravi et al. (2007), revelaram que Bacillus cereus são eficientes na inibição de patógenos em larvas de camarões, como Vibrio spp. e Vibrio harveyi ambos in vitro e in vivo. No presente estudo não foi encontrada nenhuma atividade de inibição do Bacillus cereus para as bactérias testadas. Contudo, outros estudos devem ser realizados para confirmar atividade inibitória desta espécie, uma vez que vários fatores podem estar associados com a inibição de patógenos por probióticos, como a exclusão competitiva (Gullian et al., 2004).
Nesta pesquisa, observou-se o isolamento de microrganismos do gênero Enterobacter. Em seu estudo, McDaniel (1979) encontrou essas bactérias em 2% dos animais avaliados, sendo que não foram encontrados outros relatos de doenças causadas por esse microrganismo em peixes. Espécies de Enterobacter pertencem à família Enterobacteriaceae, sendo anaeróbios facultativos que apresentam motilidade por meio de dois a sete flagelos polares. O principal habitat desta espécie é o ambiente aquático, incluindo a água doce e do mar, é comumente encontrada no intestino de peixes (Falcão et al., 2007). A maioria das doenças gastrintestinais causadas por representantes desta família, envolvem surtos pelo consumo de alimentos do mar e água não tratada (Salerno et al., 2007), indicando seu impacto a saúde pública e fraco potencial probiótico.
Tendo em vista a crescente preocupação de técnicos e da população com a presença dos resíduos de antimicrobianos nos produtos para consumo humano e animal e com a seleção de bactérias resistentes (Cabello, 2006), a busca por técnicas alternativas para controle de doenças é muito importante. Neste sentido, o isolamento e caracterização de bactérias encontradas normalmente no ambiente aquático é fundamental para a investigação de potenciais probióticos (Verschuere et al., 2000). Contudo, os
microrganismos isolados do ambiente aquático possuem uma caracterização bioquímica laboriosa e em alguns pontos imprecisa (Harmsen & Karch, 2004). Neste sentido o uso de técnicas moleculares tem se mostrado eficaz como uma ferramenta de apoio, o que foi observado no presente estudo onde as técnicas moleculares, em particular o seqüenciamento do fragmento do gene que codifica para o rRNA 16S permitem a correta identificação dos microrganismos.
CONCLUSÃO
Os camarões podem ser portadores de bactérias descritas como patogênicas, tais como Aeromonas caviae, Alcaligenes denitrificans e Enterobacter spp. O isolado de Bacillus cereus utilizado no presente estudo não apresentou atividade de inibição para as bactérias isoladas de camarões avaliadas. As técnicas de PCR-RFLP e sequenciamento do fragmento que codifica para o rRNA 16S são úteis para reduzir problemas na caracterização fenotípica dos microrganismos estudados. O ácido nalidíxico e a norfloxacina são drogas antimicrobianas com elevada sensibilidade frente as bactérias isoladas de camarões.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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AKINBOWALE, O.L.; PENG, H.; BARTON, M.D. Antimicrobial resistance in bacteria isolated from aquaculture sources in Australia. Journal Applied Microbiology, v.110, p.1103-1113, 2006.
