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1. INTRODUÇÃO GERAL
A produção mundial de camarão cultivado tem crescido de forma contínua, sendo que no Brasil, em 2005, alcançou 65.000 toneladas e na Bahia 6.196 toneladas (BAHIA PESCA, 2006). A produção de crustáceos em 2006 foi equivalente a 9% da produção aquícola total e a 23% do valor em dólares (FAO, 2009).
As enfermidades infecciosas têm sido uma das preocupações do carcinocultor, uma vez que as mesmas podem ser responsáveis por perdas significativas de indivíduos na população e, conseqüentemente, decréscimo sensível na produção de camarões (Bueno & Gastelú, 1998). Tradicionalmente, o controle de doenças bacterianas nos tanques de larvicultura tem como princípio o uso de componentes químicos, principalmente as drogas antimicrobianas. Entretanto, o uso destes fármacos na aqüicultura pode selecionar bactérias resistentes e desta forma representar um risco para a saúde pública e para o meio ambiente (Chang & Liu, 2002). Além disso, o tratamento quimioterapêutico exige grandes quantidades de medicamentos que são onerosos do ponto de vista econômico (Sealey & Gatlin, 1999).
O equilíbrio ecológico é uma questão importante e existem debates acirrados. No oceano há uma vasta população de bactérias naturalmente na água e em tanques de aqüicultura há uma tendência do mesmo processo ocorrer. Quando se utiliza um antibiótico, a população de bactérias decresce rapidamente, porém em pouco tempo volta a se estabelecer (Maeda et al., 1997).
A antimicrobianoterapia pode ter como função somente a redução dos impactos da bactéria na saúde do hospedeiro. As consequências benéficas para o hospedeiro podem, portanto, ser esperadas somente quando a infecção é a principal causa da morbidade ou mortalidade da população. Desta forma, as medidas de diagnóstico não podem estar
pautadas somente na detecção de patógenos específicos, mas sim no entendimento do papel destes no desenvolvimento da enfermidade (Smith et al., 2008). Esta afirmação torna clara a importância da determinação da virulência bacteriana e dos fatores primários da doença antes da implementação de uma antimicrobianoterapia.
Em qualquer situação o sucesso da terapia antimicrobiana está em função da escolha do agente apropriado, mas existem poucos fármacos antimicrobianos de escolha para aquicultura. Entretanto, em muitos países não há somente a falta de profissionais treinados, mas também a indisponibilidade de agentes antimicrobianos para uso aqüicultura (Smith et al., 2008). Essa situação tem alertado para a necessidade da criação de medidas profiláticas e terapêuticas eficazes, ambientalmente corretas e que não tragam risco à saúde humana. O controle de doenças na aqüicultura exige, cada vez mais, uma abordagem efetiva e ambientalmente segura. O aumento da resistência bacteriana aos antibióticos utilizados mundialmente tem estimulado a investigação de meios alternativos para o controle de patógenos, como por exemplo, o uso de microrganismos benéficos. As restrições ao uso de antimicrobianos, mediante imposições legais, paralelo a uma maior conscientização quanto à necessidade de garantir produtos saudáveis e inócuos ao consumidor final, contextualizam a importância do desenvolvimento e utilização dos probióticos nesse setor (Sotomayor & Balcázar, 2003).
Segundo Verschuere et al. (2000), probiótico é um adjunto microbiano vivo que tem efeito benéfico sobre o hospedeiro, ao modificar a comunidade microbiana do ambiente ou associada ao hospedeiro, assegurando uso melhorado do alimento ou aumentando seu valor nutricional, ao acentuar a resposta do hospedeiro a doenças, ou ao aumentar a qualidade de seu ambiente imediato. Com base nessa definição, probióticos podem incluir adjuntos microbióticos que impedem patógenos de se proliferarem no trato
intestinal, nas estruturas superficiais, e no ambiente da espécie cultivada que asseguram o uso ótimo da alimentação ao auxiliar na digestão. Além disso, melhoram a qualidade da água e estimulam o sistema imune do hospedeiro.
O passo inicial para o desenvolvimento de um probiótico efetivo para qualquer sistema de produção de animais aquáticos é o conhecimento de probiontes que seriam normalmente encontrados tanto no ambiente aquático quanto no trato intestinal, é determinado que bactérias probióticas não devem ser patogênicas para seus hospedeiros (Verschuere et al., 2000). Um dos principais desafios em obter-se bactérias probióticas é usar métodos de seleção e colonização apropriados. Uma seleção criteriosa por bactérias probióticas deverá avaliar os métodos de colonização, a capacidade de competição contra patógenos e crescimento imunoestimulatório eficiente em camarões (Gullian et al., 2004).
Desta forma, nesse estudo, sabendo-se que o uso indiscriminado de antimicrobianos na carcinicultura, pode resultar em produtos destinados para o consumo humano com resíduos de antibióticos e bactérias resistentes que podem comprometer a saúde da população humana. O objetivo deste trabalho foi o isolamento, identificação e caracterização molecular de bactérias candidatas a probióticos em organismos aquáticos, com o intuito de contribuir para o uso de bactérias preventivas, como uma alternativa de reduzir a utilização de drogas antimicrobianas.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. CARCINICULTURA
A carcinicultura foi introduzida no Brasil na década de 1970, no estado do Rio Grande do Norte, aproveitando os tanques abandonados das salinas, mas somente após o desenvolvimento do pacote tecnológico do camarão originário da costa do Pacífico (Litopenaeus vannamei) entre 1996/1997, ocorreu crescimento intenso, principalmente, no final da década passada e início desta. Esse crescimento continua vigoroso e ocorreu em muitos aspectos, nos moldes do que já havia acontecido nos países do sudeste asiático, sem ordenamento adequado, sem regulamentação, com forte incentivo governamental e geração de impactos ambientais e sociais graves (IBAMA, 2005). A carcinicultura brasileira enfrentou uma crise econômica entre 2004-2007, chegando ao final do último ano mostrando sinais claros de superação de seus principais problemas, inclusive, apontando para uma retomada do crescimento já a partir de 2008 decorrentes da dificuldade econômica, doenças e política cambial. Evidentemente, que a perda de competitividade das exportações, decorrente da desvalorização cambial, associado ao amadorismo e a incipiente estrutura da cadeia de comercialização interna, juntamente com o descaso governamental na concessão de créditos e do próprio licenciamento ambiental, constituem sérios desafios que o setor precisa superar para restabelecer a normalização das condições de operacionalidade e, permitir um desenvolvimento econômico com a necessária sustentabilidade sócio-ambiental (Rocha, 2008).
A atividade do cultivo de camarão é um dos segmentos da aqüicultura que mais se destaca no contexto do setor pesqueiro mundial, tanto pela inclusão social, através da
viabilização de oportunidades para micro e pequenos empreendedores, como pela geração de empregos, renda e divisas para as populações desfavorecidas do meio rural litorâneo dos países em desenvolvimento. Em realidade, a carcinicultura se constitui a alternativa de maior viabilidade para o estabelecimento do crescimento econômico no setor primário, onde a qualificação prévia de mão-de-obra não representa um impedimento para a implantação dos seus empreendimentos, contribuindo de forma bastante positiva para o desenvolvimento de tecnologias que beneficiam toda a cadeia produtiva da aqüicultura mundial (Rocha, 2007; Carli, 2002).
A carcinicultura marinha é uma das atividades agroindustriais mais atrativas economicamente, já que nos últimos quatro anos registra taxa média de expansão territorial de 20% ao ano. No país, essa atividade está concentrada na região Nordeste, principalmente Rio Grande do Norte, Bahia, Ceará e Pernambuco, e com pequenas iniciativas nas regiões Norte, Sul e Sudeste (Morais, 2002). O clima tropical do Brasil, a sazonalidade e riquezas litorâneas (8.400 km de costa marítima e disponibilidade de água) proporcionam condições ideais para o cultivo de camarão marinho. O Brasil consolida-se entre os principais países líderes no que diz respeito, a produção de camarões no hemisfério ocidental (ABCC, 2005).
O crescimento da carcinicultura mundial, tem suscitado debates acirrados sobre a sustentabilidade ambiental dessa atividade em longo prazo e as vulnerabilidades dos ecossistemas brasileiros frente a grande quantidade e dimensão dos investimentos nessa área. Isso se deve às crises ambientais associadas ao rápido crescimento da carcinicultura em alguns países como Taiwan, China e Equador que contribuiu para a degradação dos ecossistemas estuarinos, na proliferação de doenças e conseqüente queda de produção do sistema (Figuerêdo et al., 2003).
2.2. BACTÉRIAS ENCONTRADAS EM AMBIENTE E ORGANISMOS AQUÁTICOS
2.2.1. Bacillus spp.
O gênero Bacillus é um dos componentes da família Bacillaceae, o qual abrange na atualidade mais de 60 espécies de bacilos gram-positivos aeróbios ou anaeróbios facultativos que produzem endosporos. As espécies de Bacillus são ubíquas, habitam o solo, a água e poeira; também encontradas na microbiota intestinal de humanos e outros animais, inclusive em animais aquáticos (Koneman et al., 2001). Apesar de não serem consideradas bactérias autóctones, fato que poderia tornar inviável sua utilização como probiótico, muitos bacilos apresentam um ciclo de vida duplo, que envolve germinação de esporos, proliferação e re-esporulação sob condições adversas, o que lhes permite crescer e sobreviver no meio ambiente e no intestino de animais, sendo este ciclo a base do seu efeito probiótico (Hong et al., 2005).
2.2.2. Plesiomonas spp.
O gênero Plesiomonas é composto pela espécie P. shigelloides, caracterizada como um bacilo gram-negativo, pertencente à família Enterobacteriaceae, anaeróbio facultativo que apresenta motilidade por meio de dois a sete flagelos polares. O principal habitat desta espécie é o ambiente aquático, incluindo a água doce e do mar, é comumente encontrada no intestino de peixes (Falcão et al., 2007). A espécie P. shigelloides é descrita como patógeno emergente de importância crescente em alimentos, como também em infecções intestinais e extraintestinais (Lehane & Rawlin, 2000).
Segundo Shama et al. (2000), Plesiomonas shigelloides foi a bactéria com maior percentual de isolamento, presente em 15% (15/100) dos jundiás (Rhamdia quelen),
principalmente nos rins e em algumas lesões externas. Em humanos, P. shigelloides causa a maioria das doenças gastrointestinais, geralmente são relatados surtos pelo consumo de alimentos do mar e água não tratada (Salerno et al., 2007). No experimento realizado por Boijink et al. (2001), estes demonstraram que apesar do número elevado de bactérias em jundiás não ocorreu desenvolvimento de manifestações clínicas e patológicas refletindo na ausência de virulência.
2.2.3. Aeromonas spp.
A presença de agentes bacterianos no ecossistema aquático, destacam aqueles pertencentes às famílias Aeromanadaceae e Enterobacteriaceae, cuja presença nesse ambiente pode ser reconhecida pela detecção na pele, brânquias e intestinos dos peixes e quando há desequilíbrio no sistema bactéria-hospedeiro-ambiente, podem estar envolvidos como agentes primários, inclusive desencadeando epizootias em piscicultura (Lehane & Rawlin, 2000).
Aeromonas spp. são microrganismos comumente encontrados em água do mar e ambientes estuarinos e vem sendo reconhecidas como patógenos oportunistas de répteis, peixes e diferentes mamíferos (Carnahan et al., 1991). O complexo Aeromonas reúne bactérias patogênicas importantes em peixes, que são responsáveis por septicemia e lesões ulcerativas, associadas a significativas perdas econômicas para a aqüicultura (Costa & Cyrino, 2006). Membros do gênero Aeromonas pertencem a família Aeromonadaceae e são bactérias anaeróbicas facultativas, bacilos gram-negativos, encontrados em diversos ambientes, incluindo solo e água (Nam & Joh, 2007).
Por muitos anos, a taxonomia da Aeromonas spp. foi desconhecida e depois de significativas revisões, parece razoavelmente esclarecida. As metodologias para identificação de espécies de Aeromonas spp. abrangem o estudo de complexas rotas
metabólicas, que refletem em diversos testes bioquímicos (Abott, 1992), de diferenças em componentes celulares e nas sequências de nucleotídeos (Figueras et al., 2000). As técnicas moleculares como, polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP), são vantajosas, rápidas e fáceis, contudo exibem discrepâncias na identificação de algumas espécies e para sua interpretação exigem pessoal treinado (Borrel et al., 1997). A técnica de amplificação do DNA por PCR (Reação em Cadeia pela Polimerase) fornece uma ferramenta altamente sensível e específica para a detecção destes microrganismos através de seus produtos de secreção (Cascón et al., 1996).
Métodos moleculares são de interesse especial, quando um grupo de bactérias patogênicas são difíceis de cultivar ou de crescimento muito lento (Harmsen & Karch, 2004; Dostal et al., 2003). Além disso, diagnósticos independentes de cultura são preferíveis no tratamento com antibiótico que já foi iniciado antes dos testes microbiológicos (Heijden et al., 1999).
Aeromonas spp. possuem elevada patogenicidade em humanos e alguns vertebrados, incluindo peixes (Abdulah et al., 2003). Estas foram causadoras de doenças em peixes, incluindo A. hydrophila, A. veronii biovar sobria, A. allosaccharophila e A. salmonicida. Destas, A. hydrophila, A. veronii biovar sobria, A. jandaei, A. schubertii, e A. caviae são os mais comumente encontrados em infecções intestinais humanas (Jacobs & Chenia, 2007). Nos jundiás, quando a infecção por Aeromonas hydrophila ocorrem lesões ulcerativas com significativas alterações histológicas e comportamentais (Boijink & Brandão, 2001).
As espécies Aeromonas secretam muitas proteínas extracelulares, incluindo amilase, quitinase, elastase, aerolisina, nuclease, gelatinase, lecitinase, lipase e protease. Estas proteínas são conhecidas como fatores de virulência que causam doenças em peixes e humanos (Nam & Joh, 2007). A. hydrophila pode causar diarréia através da produção de
enterotoxinas citotóxicas. Até agora, duas toxinas hemolíticas foram descritas: a A. hydrophila hemolisina (hlyA) e aerolisina (aerA). A maioria dos isolados hemolíticos de Aeromonas spp. descritos produzem uma destas toxinas. Isolados virulentos de A. hydrophila produzem hemolisinas (Aslani & Hamzeh, 2004). Além do mais, foi sugerido que variações na distribuição de genes de potencialidade virulenta entre isolados de Aeromonas spp. podem contribuir para o seu grau de virulência (Abdulah et al., 2003). Genes que codificam fatores de virulência foram isolados e sequenciados permitindo a detecção de regiões de assinaturas para estes genes e avaliação de sua presença em isolados clínicos e ambientais de Aeromonas spp. (Cascón et al., 2000; Chacón et al., 2003).
2.2.4. Vibrio spp.
Os membros do gênero Vibrio pertencem a família Vibrionaceae, são microrganismos aquáticos definidos como bastonetes retos ou curvos, móveis, gram-negativos e não-esporogênicos (Quinn et al., 1994). A maioria fermenta a glicose sem produção de gás e apresenta reação de oxidase positiva (Silva & Cristina, 1995). Estudos prévios mostraram que V. parahaemolyticus possui genes importantes de virulência contribuindo à patogênese bacteriana, tal como tdh, que codifica diretamente hemolisina termoestável (TDH); trh, codificando hemolisina de TDH-relacionando (TRH); e tlh, codificando hemolisina termolábil (Xie et al., 2005).
O uso de espécies de Vibrio como probiótico é controverso, uma vez que este gênero integra inúmeras cepas patógenas para o homem e para os animais (Vandenberghe et al., 1999). Entretanto, Vibrio alginolyticus, cepa Ili, tem demonstrado boas propriedades como probiótico pela exclusão competitiva (Gullian et al., 2004), atuando como agentes de controle biológico por redução de Vibrios patógenos (Sotomayor & Balcázar, 2003).
Portanto, deve-se ter muita cautela na seleção de vibrios, sendo essencial uma correta identificação genotípica das cepas utilizadas, evitando os perigos do uso daquelas patogênicas (Vandenberghe et al., 1999).
3. RESISTÊNCIA AS DROGAS ANTIMICROBIANAS UTILIZADAS NA AQUICULTURA
Redução do desempenho de camarões marinhos cultivados são desencadeados por desequilíbrio entre as condições ambientais dos viveiros, os agentes potencialmente patogênicos e a saúde geral dos camarões. Doenças causadas por agentes bióticos e abióticos interferem no estado imunológico dos camarões, podendo favorecer ataques de patógenos oportunistas, levando à debilidade e morte dos mesmos (Nunes & Martins, 2002). Uma das formas de tentar controlar a proliferação bacteriana e reduzir o risco do desenvolvimento de enfermidades consiste no uso profilático de drogas antimicrobianas (Sealey & Gatlin, 1999).
Evidências sugerem que a maioria dos antimicrobianos usados na aqüicultura são adicionados na ração, de modo generalizado e somente quando do estabelecimento da enfermidade nos animais. Contudo, existem muitos trabalhos profiláticos na larvicultura de camarão e moluscos. Entretanto, o uso de antimicrobianos como promotores de crescimento na aqüicultura é raro (Smith et al., 2008).
As conseqüências potenciais do uso de antibióticos na alimentação de animais levam ao desenvolvimento de drogas resistentes a bactérias, resistência antibiótica múltipla, transferência de resistência por bactérias patogênicas e redução da eficácia dos tratamentos antibióticos de doenças em humanos e animais causadas por patógenos resistentes (Frappaola & Guest, 1986).
As terapias antimicrobianas são aplicadas comumente na produção de peixes e crustáceos (camarões e larvas) nas doenças que acometem a aqüicultura comercial. Nas culturas de moluscos o uso de antimicrobianos ocorre nos estágios inicias da fase larval e em quantidades pequenas. O uso de antimicrobianos em peixes ornamentais não está regulamentado e pouco se sabe das dosagens e outros aspectos farmacológicos destas drogas, por isso, é de grande importância o estudo da terapêutica destes compostos nestes animais, já que há uma proximidade maior com os seres humanos (Smith et al., 2008).
As conseqüências negativas potenciais da utilização de drogas antimicrobianas na aqüicultura, tal como a seleção de bactérias resistentes as drogas antimicrobianas nos humanos e animais, estimulou a busca por bactérias não patogênicas que podem ser empregadas como probióticos e agentes controladores (Farfanzar, 2006). Uma série de alternativas ao uso de antibióticos no controle de doenças têm sido propostas e com sucesso na aqüicultura, sendo os probióticos uma das possíveis alternativas (Nikoskelainen et al., 2001; Gram et al., 1999). Alguns progressos têm sido recentemente desenvolvidos nos métodos padrões para determinação da susceptibilidade in vitro de bactérias associadas com as doenças em animais aquáticos (Smith et al., 2008). Embora estudos apontam que mais de 90% dos protocolos para testes de sensibilidade avaliem somente isolados clínicos, em aquicultura seria interessante o estabelecimento de parâmetros para sensibilidade baseados em estudos epidemiológicos da região do surto (Smith, 2006; Kronvall et al., 2003).
A prevenção e tratamento de doenças infecciosas em animais aquáticos, no Egito, inclui um número reduzido de antibióticos e quimioterápicos aprovados pelo governo, além de poucas vacinas que podem ser utilizadas para acompanhar o manejo ambiental (FAO, 2004).
Resistência a antibióticos é particularmente relevante em espécies patogênicas de Aeromonas spp. nas quais, além da resistência clássica a β-lactâmicos, múltipla resistência vêm sendo frequentemente identificado (Kampfer et al., 1999; Vila et al., 2002; Vila et al., 2003). Esta bactéria pode receber e transferir genes de resistência a antibióticos para outras bactérias gram-negativas (Marchandin et al., 2003).
Múltipla resistência antibiótica (MAR) foi registrada para Aeromonas hydrophila isoladas nas fazendas de peixes de água doce em associação com uma variedade de drogas, comumente usadas como aditivo alimentar. O principal problema envolvendo o uso de antibióticos contra infecções ocasionadas por Aeromonas é o desenvolvimento da resistência, geralmente relacionados a presença de plasmídeos; sendo um assunto importante para a saúde pública (Costa & Cyrino, 2006; Akinbowale et al., 2006).
4. PROBIÓTICOS
A utilização de probióticos vem ganhando espaço no sistema de produção brasileiro, graças a boa produtividade natural, que é complementada com o uso destes microrganismos na ração. Muitos estudos têm sido conduzidos com o intuito de mostrar o efeito positivo da utilização de probióticos na produção de camarões. Os relatos negativos estão associados ao uso de bactérias que não foram isoladas do trato digestivo do animal em estudo (Vieira, 2006).
“Probiótico” é derivado do Grego que significa “para vida”. Lilly e Stillwell (1965) introduziram o termo “probióticos” para fatores promotores de crescimento produzidos por microrganismos. O termo usado por Parker (1974) para “organismos e substâncias” com efeitos benéficos para animais por influência da microbiota intestinal. O termo “substâncias” é impreciso e pode incluir até mesmo antibióticos. Portanto, Fuller (1989)
definiu probiótico como “um suplemento alimentar microbiano vivo que afeta beneficamente o animal hospedeiro melhorando seu balanço microbiano intestinal”. Essa é a melhor definição uma vez que os probióticos são restritos a microrganismos vivos.
Tabela 1.2. Probióticos utilizados na aqüicultura
Organismos aquáticos Microrganismos Autor Ano
Penaeus monodon Bacillus S11 Rengipat et al. 1998
Lates niloticus Pseudomonas fluorescens AH2 Gram et al. 1999
Truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss)
Vibrio fluvialis, Carnobacterium spp.
Irianto e Austin 2002
Anguilla Anguilla Enterococcus faecium SF68 Chang e Liu 2002
Turbot larvae Lactobacillus plantarum Gatesoupe 1994
Fenneropenaeus indicus Bacillus spp. Ziaei-Nejad et al. 2006
Diversas bactérias têm sido utilizadas no cultivo de camarões marinhos em substituição aos antimicrobianos, com o objetivo de promover a saúde dos cultivos. Essas podem ser adicionadas diretamente na água, ou por meio de carreadores vivos, como artêmias e rotíferos. Os principais grupos de bactérias testados no cultivo de camarões, caranguejos, ostras e peixes têm sido Vibrio spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp. e Lactobacillus spp. (Gomez-Gil et al., 2000). Entretanto, nem todas essas espécies foram isoladas do trato intestinal desses animais, e os resultados de desempenho são contrastantes.
Na aqüicultura, a microbiota intestinal está em constante interação com o ambiente e as funções dos hospedeiros. Cahill (1990) revisou resultados dessa relação em peixes, e evidenciou que a bactéria presente no ambiente aquático influencia a composição da microbiota no trato digestivo de peixes e vice-versa. A microbiota bacteriana intestinal
de organismos aquáticos, ao contrário dos organismos terrestres, é constituída predominante por bactérias gram-negativas (Gomez-Gil et al., 2000) podendo variar de acordo com o ambiente, escassez de alguns nutrientes ou pelo uso de bactérias probióticas (Ringo & Gatesoupe, 1998).
Das cepas candidatas ao uso como probióticos, deve-se fazer um teste in vivo para avaliar a capacidade destas em colonizar o trato intestinal observando se há algum efeito benéfico da adição destas cepas ao animal no cultivo com relação à infecção por patógenos (Gullian et al., 2004).
As características in vitro de espécies bacterianas nem sempre refletem a capacidade de isolados específicos demostrarem um efeito positivo no peixe durante condições padrões de criação. No caso das larvas marinhas de peixe, observaram mortalidades elevadas durante a primeira etapa de alimentação raramente são atribuídos a patógenos