i
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
TESE DE DOUTORADO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE MICROBIOTA ORIGINADA DE
RESERVATÓRIOS DE PETRÓLEO PARA BIORREMEDIAÇÃO
EVALUATION OF THE BIOREMEDIATION POTENTIAL OF
MICROORGANISMS ORIGINATED FROM PETROLEUM RESERVOIRS
Bruna Martins Dellagnezze
Campinas- São Paulo
Janeiro/ 2015
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
BRUNA MARTINS DELLAGNEZZE
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE MICROBIOTA ORIGINADA DE
RESERVATÓRIOS DE PETRÓLEO PARA BIORREMEDIAÇÃO
EVALUATION OF THE BIOREMEDIATION POTENTIAL OF MICROORGANISMS
ORIGINATED FROM PETROLEUM RESERVOIRS
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da UNICAMP,
obtenção do título de doutora em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética
de Microorganismos.
Thesis presented of Biology Institute of University of
Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Genetics and
Molecular Biology, in the area of Genetics of Microorganisms
Orientadora: Dr
a. Valéria Maia Merzel
Co-orientadora: Dr
a. Suzan Pantaroto de Vasconcellos
Este exemplar corresponde
á versão final da tese defendida pela aluna Bruna Martins Dellagnezze e orientada pela Dra. Valéria Maia Merzel
v Campinas, 22 de janeiro de 2015
BANCA DE EXAMINADORA
Dra. Valéria Maia Merzel
(orientadora)
Profa. Dra. Vânia Maria Maciel Melo __________________
Prof. Dr. Welington Luiz Araújo _______________
Dra. Lucélia Cabral __________________
Profa. Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte _________________
Profa. Dra. Fabiana Fantinatti-Garboginni ________________
Prof. Dr. Anderson de Souza Sant'Ana __________________
Prof. Dr. Fernando Dini Andreote _________________
vii
ABSTRACT
Pollution is a global environmental problem widely discussed, including oil spills that occur accidentally or due to human activities, which cause huge environmental and economic impacts. Bioremediation process uses biological agents, associated or not to other compounds like biosurfactants or even their enzymes, to mineralize or complex organic and inorganic pollutant compounds, transforming them into inert or non-toxic compounds. Thus, bioremediation represents an ecofriendly and effective way to treat impacted areas. In this work, the biodegradation potential of clones obtained from metagenomic libraries and bacterial isolates, all originated from Brazilian petroleum reservoirs, was evaluated in microcosm and mesocosm scale aiming at a future application in bioremediation process. In the first assay, microorganisms were evaluated as free cells, in 50 mL-volume of artificial seawater and using crude oil as sole carbon source. The experiment was monitored each seven days during 21 days. Further, the best performing microorganisms were selected, immobilized in chitosan beads and evaluated in microcosm assays, at different scales, during 21 and 30 days. Finally, in the last experiment, one consortium containing four metagenomic clones and a Bacillus subtilis strain was evaluated in mesocosmos assay in 3000 L-volume of non-sterile seawater. Parameters such as total counting of microorganisms by DAPI and biological oxygen demand (BOD) were evaluated, and petroleum degradation was monitored by chromatographic analysis. Results demonstrated the ability of the microorganisms to degrade aliphatic and aromatic hydrocarbons. In microcosms, using free cells, the strains of Dietzia maris and Micrococcus sp. showed the best performance, reaching 99% of aliphatic hydrocarbon degradation and 63-99% of aromatic compound degradation in 21 days. Among metagenomic clones, clone 2B presented the best performance to degrade aliphatic (47%) and aromatic hydrocarbons (94%). In chitosan beads, the microorganisms were also able to degrade crude petroleum, showing percentages between 90 and 100% for aliphatic hydrocarbons and 70 and 100% to aromatic. The results gathered in this work demonstrate that a microbial consortium containing metagenomic clones and one bacterial strain is able to achieve high extents of hydrocarbon degradation, offering a promising tool to be further used in bioaugmentation approaches for treating contaminated environments.
ix
RESUMO
A poluição é um problema mundial amplamente discutido, incluindo os derramamentos de petróleo ocorridos através de acidentes ou por atividades humana, os quais acarretam grande impacto ambiental e econômico. O processo de biorremediação utiliza micro-organismos, associados ou não a outros compostos como biossurfactantes e até mesmo enzimas, com o objetivo de transformar compostos orgânicos em inorgânicos, levando à formação de compostos inertes ou não tóxicos. Deste modo, a biorremediação representa um modo efetivo e sustentável para se tratar áreas contaminadas. Neste trabalho foi possível avaliar o potencial de clones metagenômicos obtidos a partir da construção de uma biblioteca fosmidial e de linhagens de bactérias, todos provenientes de amostras de petróleo de reservatórios brasileiros em escala de microcosmos e mesocosmos, visando futura aplicação em processos de biorremediação. Em um primeiro ensaio os micro-organismos foram avaliados na forma livre, em 50 mL de água do mar artificial e petróleo bruto como única fonte de carbono, a cada sete dias durante 21 dias. Posteriormente, os micro-organismos com melhor potencial de biodegradação foram selecionados e aprisionados em esferas de quitosana e testados novamente em microcosmos, em diferentes escalas, durante 21 e 30 dias. Com base nos resultados observados nos ensaios de degradação em microcosmos, um último ensaio foi realizado empregando-se um consórcio contendo quatro clones metagenômicos e uma linhagem de Bacillus subtilis, o qual foi avaliado em ensaio de mesocosmos em 3000 litros de água do mar não-estéril. Nesta etapa, parâmetros como a contagem total dos micro-organismos (DAPI) e a demanda biológica de oxigênio (DBO) foram avaliados, e a cromatografia gasosa (CG) foi empregada para avaliar a degradação de hidrocarbonetos do petróleo. Os resultados demonstraram a capacidade desses micro-organismos em degradar compostos do petróleo bruto, tanto hidrocarbonetos alifáticos como aromáticos. Em microcosmos, na forma livre, as linhagens de Dietzia maris e Micrococcus sp. apresentaram o melhor desempenho, alcançando ao final de 21 dias 99% de degradação de hidrocarbonetos alifáticos e de 63-99% de degradação de aromáticos (fenantreno e metilfenantreno). Dentre os clones, o clone 2B apresentou o melhor desempenho para degradar tanto hidrocarbonetos alifáticos (47%) como aromáticos (94%). Na forma aprisionada, os micro-organismos também apresentaram capacidade para degradar petróleo bruto em mesocosmos, exibindo valores de degradação de 90 a 100 % para hidrocarbonetos saturados e 70 a 100% para aromáticos, ao final de 30 dias de avaliação. Os resultados indicam um resultado promissor e inédito, onde um consórcio combinado contendo clones metagenômicos e Bacillus subtillis pode ser futuramente utilizado em estratégias de bioaumento, em sistemas de contenção, como ferramenta para biorremediação de ambientes contaminados com hidrocarbonetos.
xi SUMÁRIO página 1. INTRODUÇÃO...15 2. REVISÃO DA LITERATURA...,...17 2.1. Microbiologia do petróleo...17 2.2. Derramamentos de petróleo...19 2.3. Biorremediação...23
2.4. Bioaumentação utilizando organismos geneticamente modificados (OGM)... 29
2.5 Biorremediação e o uso de biossurfactantes...32
2.6 Genes de degradação de hidrocarbonetos...35
2.7 Metagenômica...41
2.8 Referências Bibliográficas...46
CAPÍTULO 1. Potencial de microbiota derivada de reservatórios de petróleo para biorremediação …………...53
CAPÍTULO 2. Avaliação e otimização da produção de biossurfactantes por micro-organismos de reservatórios de petróleo......63
2.1. INTRODUÇÃO...63
2. MATERIAL E MÉTODOS...64
2.2.1. Delineamento experimental para otimização da produção de biossurfactantes...65
2.2.2. Ensaios de tensiometria......66
2.2.3. Ensaios de emulsificação (E24)...66
2.2.4. Imobilização dos micro-organismos em quitosana...67
2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO...69
2.3.1. Otimização da produção de biossurfactante por planejamento Placket-Burman... 69
2.3.2. Ensaios de emulsificação (E24)...90
2.3.3. Imobilização dos micro-organismos em quitosana...95
2.4. CONCLUSÕES...98
2.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...98
CAPÍTULO 3.Avaliação da estratégia de imobilização microbiana para a degradação do petróleo em microcosmos...103
3.1. INTRODUÇÃO...103
3.2. MATERIAL E MÉTODOS...104
3.2.1. Ensaios de degradação em microcosmos...104
3.2.2 Ensaios de degradação em tanques...106
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO...109
3.3.1. Ensaios de degradação em microcosmos...109
xii
3.4.CONCLUSÕES...119
3.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...120
CAPÍTULO 4. Avaliação da estratégia de bioaumento utilizando micro-organismos imobilizados para biorremediação de petróleo em mesocosmos...123
4.1. INTRODUÇÃO...123
4.2. MATERIAL E MÉTODOS...124
4.2.1 Ensaios em mesocosmos ...124
4.2.2. Contagem total de micro-organismos...125
4.2.3. Demanda Biológica de Oxigênio (DBO)...125
4.2.4. Contagem dos micro-organismos heterotróficos...126
4.2.5. Análises de cromatografia gasosa (CG- FID)...126
4.2.6. Análise de Escalonamento Multidimensional não–métrico (nMDS)...127
4.2.7. Sequenciamento das amostras de DNA dos mesocosmos...127
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO...128
4.3.1. Contagem total de micro-organismos...128
4.3.2. Contagem dos micro-organismos heterotróficos...129
4.3.3. Demanda Biológica de Oxigênio (DBO)...130
4.3.4. Degradação dos hidrocarbonetos saturados...131
4.3.5. Degradação dos hidrocarbonetos aromáticos...132
4.3.6. Análise de Escalonamento Multidimensional não–métrico (nMDS)...136
4.3.7. Sequenciamento do gene RNAr 16S das amostras dos mesocosmos...138
4.4 CONCLUSÕES...143
4.5. CONSIDERAÇÕES FINAIS...146
4.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...146
xiii
Agradecimentos
Primeiramente a Deus, que sempre me conduz nos momentos bons e nos mais difíceis, pois sem Sua força, eu nada seria;
À minha família, meu porto seguro, meus amados pais Rene e Silvana, e minha querida irmã Beatriz, por todo amor, paciência e apoio, que mesmo de longe pude sempre contar;
Aos meus queridos tios e tias, primos e primas, que direta ou indiretamente me ajudaram nessa jornada;
À minha co-orientadora, Dra. Suzan Vasconcellos, pela paciência, apoio, atenção, dedicação e amizade e que tem me dado desde o mestrado e agora, mesmo mais distante, obrigada por toda a sua ajuda!
À minha orientadora Dra. Valéria Maia Merzel, uma pessoa que admiro muito, obrigada por todos esses anos de convivência, por toda a paciência, ensinamentos e por todo o apoio. Por ter me possibilitado enxergar as coisas de um modo novo! Obrigada pelas oportunidades que foram tão valiosas para a minha vida profissional, mas principalmente para minha vida pessoal!
Aos meus queridos amigos de longa data, Vanessa e Paulo, que há muito tempo estão na minha vida compartilhando tantos altos e baixos! Obrigada por estarem do meu lado também nessa jornada, sempre dando apoio e incentivo! E tenho certeza que estaremos compartilhando outras etapas de nossas vidas!
Flávia (Florzinha), e João Kléber amigos queridos que mesmo de longe, obrigada pelo apoio, amizade e incentivo!
Aos meus queridos do laboratório, Maria Rafa, Natália, Dai, Vivi (por todos os momentos!!), Alysson, Dani, Júlia, Éricka, Michel, Fernando, Mariana Neri, Mariana Barato, Gileno, Sanderson, Elmer, Milena, Milene, Jaque, Tulio, Babu, Pati, Claudia,
xiv Samantha. Com certeza meus dias no laboratório (e fora dele também) foram bem melhores com vocês por perto!
Á profa. Georgiana Feitosa da Cruz da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) pela parceria ao longo desse trabalho;
Á profa. Vânia Melo, Alysson Angelim e todos os colegas do laboratório de Ecologia Microbiana da Universidade Federal do Ceará (UFC) pelo apoio e parceria nesse trabalho;
Ao Dr. Simone Cappello do Instituto per l’Ambiente Marino Costiero (IAMC), em Messina (Itália), pelo empenho em auxiliar-me nos meus experimentos, por ter me recebido tão bem em seu laboratório e proporcionado muitos bons momentos de convivência no melhor estilo italiano!
Aos colegas do mesmo Instituto, Sanny, Gianluca, Anna, Giovanni, Saida, Martina, Francesco, Gabriele, Francesca, Daniela por tantos bons momentos e apoio nessa etapa do trabalho!
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte financeiro, indispensável à realização deste trabalho;
15
1. INTRODUÇÃO
O petróleo cru é uma mistura complexa e heterogênea contendo dezenas de milhares de compostos orgânicos quimicamente distintos (Fernandez-Lima et al., 2009). Geralmente são agrupados em quatro frações de acordo com sua solubilidade em solventes orgânicos: hidrocarbonetos saturados, hidrocarbonetos aromáticos, resinas e asfaltenos. Desde a primeira observação de micro-organismos viáveis em águas de campo de petróleo (Bastin et al., 1926), tem havido um debate sobre a existência de uma microbiota autóctone em reservatórios de petróleo (Magot et al., 2000).
Derramamentos acidentais de petróleo no mar vêm sendo reportados ao longo dos anos (Vieites et al., 2004; Wieczorek et al, 2007; Outdot & Chaillan, 2010). A liberação de grande quantidade de óleo em sistemas marinhos acarreta grande impacto ambiental, afetando de maneira geral toda a cadeia trófica envolvida, direta ou indiretamente. Desde o fitoplâncton até grandes mamíferos são afetados, sendo que o aproveitamento de recursos é comprometido, influenciando diretamente na alimentação e reprodução desses organismos (Perelo, 2010; Peterson et al., 2003). Esses danos podem ocorrer imediatamente e persistir, em alguns casos, por décadas. Além de danos causados ao meio ambiente, do mesmo modo, vazamentos acidentais de petróleo podem causar impactos aos seres humanos, ocasionando danos psicológicos e econômicos àquelas populações que dependem economicamente dos recursos marinhos, como por exemplo, comunidades de pescadores.
Técnicas de remediação já são descritas e aplicadas a ambientes contaminados, porém algumas tratam apenas fisicamente, promovendo a remoção da contaminação. A biorremediação é uma estratégia que utiliza micro-organismos e seu potencial metabólico para a despoluição e a restauração de ambientes, possibilitando a completa decomposição de compostos químicos. Essa técnica se apresenta como menos custosa, mais simples no manejo e ecologicamente mais adequada do que as outras (Lovely, 2003). O processo de biorremediação envolve duas técnicas principais: bioaumentação e bioestimulação. A bioestimulação consiste na adição de nutrientes, como fontes de nitrogênio e fósforo, e outros substratos, como água, oxigênio e até mesmo surfactantes
16 (ou biossurfactantes), com o intuito de promover o aceleramento do metabolismo dos micro-organismos em uma determinada área, aumentando assim a degradação de compostos xenobióticos (Luqueño et al, 2011). Biossurfactantes são moléculas estruturalmente diversas sintetizadas biologicamente e classificadas de acordo com sua estrutura química e sua origem. São constituídas por uma porção hidrofílica, compreendendo um grupo ácido, peptídeos, mono, di ou polissacarídeos, e uma porção hidrofóbica, composta por cadeias de ácidos graxos ou de hidrocarbonetos saturados ou insaturados. Essas estruturas conferem muitas propriedades, incluindo a capacidade de diminuir a tensão superficial e interfacial entre líquidos e também a formação de microemulsão entre duas fases diferentes (Banat et al., 2010). A biodegradação de hidrocarbonetos torna-se mais eficiente com a adição de biossurfactantes, os quais podem acelerar a biorremediação de solos e águas contaminadas por petróleo através da diminuição da tensão superficial óleo – água, aumentando a solubilidade e assim a mobilidade de compostos hidrofóbicos, tais como os hidrocarbonetos (Tango & Islam, 2002).
Bioaumentação consiste na adição de culturas microbiana especializadas, as quais são cultivadas sob condições ideais para desempenhar determinada função biorremediadora em um dado ambiente contaminado (in situ ou em biorreator) (Silva & Alvarez, 2010). Embora as técnicas de cultivo tenham sido aprimoradas, sabe-se que apenas uma pequena fração da diversidade microbiana presente na natureza pode ser hoje cultivada em laboratório (Amann et al., 1995). Metodologias moleculares desenvolvidas nas últimas décadas (extração de ácidos nucléicos, amplificação por PCR, clonagem e seqüenciamento de DNA) têm sido otimizadas e adaptadas para superar as limitações impostas pela abordagem clássica de estudo de populações microbianas, evitando o isolamento e cultivo dos microrganismos. A utilização destas metodologias vem permitindo uma avaliação mais precisa da diversidade microbiana no ambiente e a descoberta de novos grupos de organismos, nunca antes cultivados (Hugenholtz et al., 1998). O uso destas metodologias associado à estratégia de bibliotecas metagenômicas nos permite ter acesso ao potencial metabólico destes novos organismos. Neste contexto,
17 a utilização de OGM com potencial em biorremediação vem sendo relatada (Sayler & Ripp, 2000; Timmis et al., 1999; Pandey et al., 2005; Menn et al., 2008).
O presente trabalho apresenta a avaliação de oito micro-organismos, quatro linhagens isoladas de reservatórios de petróleo e quatro clones metagenômicos provenientes de bibliotecas metagenômicas construídas a partir de amostras de petróleo, em ensaios de biorremediação de petróleo e seus componentes em diferentes em escalas. Os resultados demonstraram o potencial de um consórcio microbiano contendo clones metagenômicos e uma linhagem de Bacillus subtilis imobilizados em quitosana para degradar petróleo bruto em água do mar contaminada, em ambas as escalas de microcosmos e mesocosmos. O emprego de clones fosmidiais e isolados provenientes de reservatórios de petróleo constitui uma estratégia inovadora, podendo ser aplicada em processos de biorremediação em sistema de contenção.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Microbiologia do PetróleoO petróleo é constituído por uma complexa mistura de hidrocarbonetos, como compostos aromáticos entre outros compostos como ácidos orgânicos, ácidos naftênicos, e vanádio e níquel (Van Hamme, 2003; Magot et al., 2000). Hidrocarbonetos são compostos formados por carbono e hidrogênio e podem ser classificados quanto à sua estrutura em cíclicos ou alifáticos e aromáticos (benzênicos e policíclicos) (Heider et al., 1999). Os hidrocarbonetos aromáticos são constituídos por um anel benzênico como parte de sua estrutura molecular. Os dois principais grupos de hidrocarbonetos aromáticos são os compostos monocíclicos (benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno) e os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), tais como naftaleno, antraceno, fenantreno, dentre outros (Holliger & Zehndert, 1996).
O uso do petróleo e seus derivados tem feito de seus hidrocarbonetos grande fonte contaminadora, tanto em prevalência como em quantidade no meio ambiente. Vários componentes dentre esses hidrocarbonetos são degradáveis, porém existem outros compostos de característica recalcitrante, dependendo de sua estrutura química e estado
18 físico. O petróleo bruto é composto principalmente de alcanos lineares e ramificados, cicloalcanos e aromáticos. No entanto, estão presentes também outros compostos associados a moléculas de oxigênio, nitrogênio, e enxofre, como fenol, indol e tiofeno, respectivamente. A classe dos alcenos está presente em muitos produtos provenientes do refino do petróleo, não ocorrendo no petróleo bruto, sendo obtidos principalmente através do processo de craqueamento em altas temperaturas. Compostos mais pesados, como asfaltenos, estão presentes no petróleo bruto, mas não em frações refinadas (Tyagi et al, 2011).
A capacidade de sobrevivência dos micro-organismos em reservatórios de petróleo depende das características físico-químicas deste ecossistema, como pH, salinidade e temperatura, sendo esta última o principal fator limitante para o crescimento microbiano. Diferentes tipos de dados sugerem que a presença de bactérias indígenas aos reservatórios estaria limitada a um intervalo de temperatura entre 80 e 90oC (Magot et
al., 2000).
Pesquisas realizadas sobre a microbiologia de reservatórios de petróleo têm evidenciado que a comunidade microbiana associada a este tipo de ambiente é representada por bactérias e arquéias de distribuição geográfica bastante ampla, e que diversos destes organismos têm potencial para transformar compostos orgânicos e inorgânicos, atuando na interface óleo-água dos reservatórios (Coates et al., 1997; Korda
et al., 1997). Na literatura é descrita uma ampla variedade de micro-organismos que tem
sido isolada e/ou identificada a partir de reservatórios de petróleo, incluindo grupos aeróbios (Bacillus sp., Halomonas sp., Acinetobacter sp.; Rhodococcus sp.) (Oliveira et al., 2008; Sette et al., 2007; Orphan et al., 2000), anaeróbios facultativos (Deferribacter,
Flexistipes) (Greene et al., 1997; Silva et al. 2012), redutores de sulfato (Desulfovibrio, Desulfobacter) (Kleikemper et al., 2002; Jing et al., 2013), metanogênicos (Methanothermococcus, Methanocalculus sp., Methanococcus sp.) (Takai et al., 2002;
Yoshida et al., 2003; Hui et al., 2007 ) e fermentativos.
Entretanto, geralmente, uma só espécie de micro-organismo não é capaz de promover a degradação completa da mistura de hidrocarbonetos, sendo necessária a
19 atuação de consórcios microbianos munidos de uma ampla variedade enzimática capaz de agir sobre os compostos aromáticos (por exemplo, benzeno, tolueno, naftaleno) (Okerentungba & Ezeronye, 2003; Kanaly & Harayama, 2000). Nesta situação, os produtos da biotransformação de um composto podem servir como fonte de carbono e energia para outras espécies da comunidade (Röling et al., 2003).
2.2 Derramamentos de petróleo
Derramamentos acidentais de petróleo no mar vêm sendo reportados ao longo dos anos (Vieites et al., 2004; Wieczorek et al, 2007; Outdot & Chaillan, 2010). A liberação de grande quantidade de óleo em sistemas marinhos acarreta grande impacto ambiental, afetando de maneira geral toda cadeia trófica envolvida, direta ou indiretamente. Desde o fitoplâncton até grandes mamíferos são afetados, sendo que o aproveitamento de recursos é comprometido, influenciando diretamente na alimentação e reprodução desses organismos (Perelo, 2010; Peterson et al., 2003). Esses danos podem ocorrer imediatamente e persistir, em alguns casos, por décadas. Além de danos causados ao meio ambiente, do mesmo modo, vazamentos acidentais de petróleo podem causar impactos aos seres humanos, ocasionado danos psicológicos e econômicos àquelas populações que dependem economicamente dos recursos marinhos, como por exemplo, comunidades de pescadores. Um estudo comparativo realizado no ano de 2012 avaliou a saúde mental de habitantes de comunidades afetadas nos casos Exxon Valdez e Deepwater Horizon. Foram observados quadros de elevado estresse e depressão, principalmente ligados à preocupação com a saúde por exposição ao óleo, perda da cultura com relação aos recursos naturais, assim como perda econômica e sobrevivência futura daqueles que não tinham mais os mesmos recursos para explorarem (Gill et al., 2012).
Alguns casos envolvendo derramamento de petróleo foram amplamente relatados ao longo dos últimos anos, no entanto nesta seção serão descritos em maior detalhe apenas os dois principais casos que ocorreram no continente americano, o caso do petroleiro Exxon Valdez, em 1989, e do poço de exploração Deepwater Horizon, um duto
20 que se rompeu, explodindo uma plataforma, envolvendo a empresa British Petroleum (BP).
O caso envolvendo o petroleiro Exxon Valdez na costa do Alasca, no ano de 1989, provocou grande impacto ambiental, com a liberação de mais de 40 milhões de litros de petróleo, que se espalhou por mais de 1300 km no golfo do Alasca. A aplicação de fertilizantes comerciais, como tratamento de bioestimulação, foi empregada ao longo da costa. Ao todo, 48.600 kg de nitrogênio (N) presente nos fertilizantes foram aplicados entre 1989 a 1991, envolvendo 2.237 aplicações separadas de fertilizante. Isto representa o maior uso de biorremediação já realizada. Uma pesquisa feita no período entre maio e junho de 1992 constatou que a maior parte do óleo foi removida da orla costeira e em 12 de junho de 1992 a Guarda Costeira dos Estados Unidos oficialmente declarou a limpeza concluída (Atlas, 2011). Porém, mesmo anos após o ocorrido, em estudo toxicológico, foram relatadas anormalidades em populações de algas, invertebrados, pássaros e mamíferos marinhos expostas à contaminação crônica do petróleo, mesmo em quantidades significativamente menores (subletais) (Peterson et al., 2003).
Outro caso mais recente, envolvendo a petroleira British Petroleum, ocorreu em abril de 2010 com o rompimento de uma tubulação, ocasionando a explosão de uma plataforma no Golfo do México, com onze funcionários mortos e consequente, vazamento de petróleo. O mesmo perdurou por 84 dias, com estimativa de liberação de aproximadamente 780 milhões de litros no oceano, que se espalharam por mais de 1100 Km da costa dos Estados Unidos. Muitas medidas para conter o óleo foram tomadas, como queima in situ, utilização de barreiras físicas de contenção, coleta do óleo e utilização de surfactantes comerciais (Chen & Denilson, 2011; Atlas, 2011. A aplicação de biorremediação não foi uma estratégia utilizada nesse caso devido à enorme quantidade de óleo, o que poderia levar ao fenômeno de eutrofização. Trabalhos que mencionam mudanças na microbiota marinha, aumentando significativamente o número de bactérias degradadoras presentes no oceano durante ou depois do acidente, já são relatados (Hazen et al., 2010; Kostska et al., 2011).
21 Após o vazamento de petróleo no oceano, muitos fatores podem influenciar o “destino” do óleo no mar e sua contaminação neste ecossistema. Isso está diretamente ligado com as condições físicas do ambiente, como a direção do vento e das marés (Figura 1). Como consequência do vazamento, o óleo se espalha pela superfície formando uma camada fina, que por sua vez prejudica a troca de nutrientes e até mesmo a penetração da luz, influenciando na fotossíntese do fitoplâncton (Carrera-Martínez et al., 2010; González et al., 2009). Compostos voláteis (geralmente mais tóxicos) e hidrocarbonetos mais leves acabam evaporando mais rapidamente, dependendo da natureza do próprio óleo e principalmente das condições ambientais, como temperatura, velocidade do vento e condições oceânicas. Outra pequena porção pode se aderir a materiais suspensos na coluna d’agua e contaminar o sedimento mais profundo.
Reações de oxidação pela radiação ultravioleta (UV) solar, chamada de fotólise, também podem ocorrer. Os produtos derivados dessas reações incluem compostos ácidos e fenólicos, os quais podem ser mais tóxicos do que os hidrocarbonetos originais. No entanto, geralmente esses acabam sendo diluídos em grandes quantidades de água, e as concentrações desses compostos para produzir algum efeito tóxico são muito baixas, não apresentando significância para o meio ambiente (Kingston, 2002).
Do mesmo modo, ocorre a dissolução dos hidrocarbonetos na coluna de água, principalmente os de baixo peso molecular, relativamente tóxicos. Essa dissolução é relativamente pequena, menos de 1%, sendo que aquilo que se torna facilmente dissolvido, por sua vez, é facilmente degradado. A dispersão é provavelmente responsável pela remoção natural da maioria do óleo sobre a superfície. O óleo é “particulado” em pequenas gotas que ficam misturadas à coluna de água até a degradação através de bactérias (Chen & Denilson, 2011).
Sob certas condições no mar, emulsões “água em óleo” podem ser formadas. Esse processo pode ocorrer quando gotículas são incorporadas ao óleo na superfície. Essas emulsões formam uma substancia viscosa denominada “mousse”, sendo que sua formação e estabilidade dependerá também do tipo de petróleo derramado. A formação
22 dessa substância pode aumentar a persistência da camada de óleo no oceano (Kingston, 2002).
Figura 1. Petróleo liberado em ambiente marinho e diversas maneiras de contaminação e
transformação. Fonte: Chen & Denison (2011).
A recuperação biológica de um ecossistema impactado por derramamento de petróleo está relacionada com o nível da toxicidade ou outros elementos que causam riscos às funções biológicas normais. Deste modo, a recuperação de um ambiente impactado pode se iniciar a partir da diminuição dos compostos tóxicos em um nível tolerável para a maioria dos organismos. No entanto, a recuperação dependerá de vários fatores ambientais, como a época do ano, disponibilidade dos organismos recolonizadores, interações biológicas e climáticas (Kingston, 2002; Chen & Denison, 2011).
23
2.3 Biorremediação
Existem muitas substâncias que são nocivas ao meio ambiente, tornando-se fontes poluidoras. Na categoria dos resíduos químicos orgânicos estão incluídos os pesticidas, solventes e óleos. Metais pesados como chumbo (Pb), cádmio (Cd), mercúrio (Hg), zinco (Zn) e ferro (Fe) também são poluentes e geralmente estão associados a atividades antrópicas, como a eliminação de resíduos em aterros sanitários, geração de resíduos químicos e lodo (Mulligan, 2005). A liberação de grande quantidade desses compostos pode causar sérios impactos no meio ambiente.
Técnicas de remediação já são descritas e aplicadas a ambientes contaminados. Algumas técnicas convencionais, como a escavação dos solos contaminados, seguida de tratamento ou disposição em aterros, têm sido utilizadas para efetuar a remediação de locais contaminados, apesar de apresentarem, muitas vezes, custos elevados, bem como possibilitarem impactos adicionais ao ambiente. Algumas dessas técnicas apenas removem ou atenuam áreas contaminadas, como, por exemplo, técnicas de remoção e redisposição de solos. Outras têm sido aprimoradas, testadas e avaliadas em relação a sua eficiência/eficácia e custo, incluindo a contenção, dessorção térmica, oxidação química, extração de vapores, bombeamento e tratamento de águas subterrâneas (Manual CETESB, cap X, 2000).
A fitorremediação também é uma técnica alternativa de remediação que já vem sendo descrita na literatura. Associada com micro-organismos (Ramos et al. 2005) ou aplicada isoladamente (Gerhardt et al., 2009), o conceito da utilização de plantas para despoluir ambientes contaminados não é novo. Cerca de 300 anos atrás a utilização de plantas foi proposta para tratamento de águas residuais (Hartman Jr 1975). As espécies aplicadas para remediação têm como característica o potencial de acumular, imobilizar e transformar contaminantes recalcitrantes, como os metais pesados. Do mesmo modo, também podem remover simultaneamente compostos orgânicos e inorgânicos (Pulford e Watson 2003; Rascio e Navari-Izzo, 2011). No entanto, apresenta baixa aplicação industrial devido à limitação de crescimento em ambientes contaminados com baixa
24 disponibilidade de nutrientes, baixa eficiência ocasional em acessar poluentes e tempo mais longo para remediação efetiva comparada aos outros métodos.
Diferentemente das técnicas que apenas removem ou atenuam áreas contaminadas, a biorremediação, que se utiliza de micro-organismos e seu potencial metabólico para a despoluição e a restauração de ambientes, é uma alternativa viável. Essa técnica se apresenta como menos custosa, mais simples no manejo e ecologicamente mais adequada do que as outras (Lovely, 2003). A biorremediação pode resultar na completa decomposição de compostos químicos ou ainda pode ser combinada com tratamentos alternativos, como, por exemplo, eletro-biorremediação, uma tecnologia híbrida de biorremediação e eletrocinética que vem sendo utilizada para remoção de compostos orgânicos hidrofóbicos (Li et al., 2010).
Boopathy (2000) descreve as técnicas envolvendo biorremediação em uma classificação mais ampla, entre ex situ (ou “on site”) e in situ. Tratamento ex situ consiste na remoção física do contaminante e tratamento em outro local, como por exemplo, a escavação (para solos) ou bombeamento (para águas subterrâneas) do substrato contaminado e seu acondicionamento em uma área de contenção para ser tratado. Nas técnicas in situ, o tratamento ocorre no próprio local de contaminação. Alguns exemplos de tratamento in e ex situ estão descritos abaixo:
1. Land farming: Sistema de tratamento para solos contaminados. Consiste na degradação biológica de resíduos em uma camada superior de solo, que é periodicamente revolvida para haver aeração. Pode ser realizado na forma in situ, como ex situ.
2. Compostagem: tratamento aeróbico termofílico no qual o material contaminado é misturado a um agente espessante. Pode ser feita com a utilização de pilhas estáticas ou aeradas.
3. Biorreatores: Biodegradação ocorre em um container ou reator. Pode ser aplicado para tratar líquidos ou lodo.
4. Bioventilação: Método de tratamento para solos contaminados aplicando oxigênio através do solo com intuito de estimular a atividade microbiana.
25 5. Biofiltros: Utilização de colunas microbiológicas para tratar emissões de ar.
6. Bioaumentação: Adição de culturas de bactérias em uma área contaminada. Usada tanto em sistemas in situ como ex situ.
7. Bioestimulação: Estimulação de população indígena (autóctone) em solos ou águas subterrâneas através do fornecimento de nutrientes.
8. Atenuação natural: Biorremediação natural de contaminantes sem a utilização de técnicas adicionais, baseadas apenas no monitoramento da microbiota autóctone.
Um exemplo de atenuação natural recente (biorremediação in situ) foi observada após o acidente ocorrido através da explosão na plataforma Deepwater Horizon (British Petroleum), fato citado anteriormente. Hazen e colaboradores (2010) relataram que a microbiota dos ecossistemas marinhos profundos rapidamente se adaptou à contaminação do óleo e se tornou dominada pelas bactérias da ordem Oceanospirillales, pertencentes à classe ϒ-Proteobacteria, a qual inclui os descritos degradadores de hidrocarbonetos psicrofílicos e micro-organismos provenientes de ambientes contaminados com petróleo.
O processo de biorremediação envolve duas técnicas principais: bioaumentação e bioestimulação. A bioestimulação consiste na adição de nutrientes, como fontes de nitrogênio e fósforo, e outros substratos, como água, oxigênio e até mesmo surfactantes com o intuito de promover o aceleramento do metabolismo dos micro-organismos em uma determinada área, aumentando assim a degradação de compostos xenobióticos (Luqueño et al, 2011). No entanto, para que isso ocorra, os micro-organismos devem ser capazes de degradar determinado composto tóxico, e sua quantidade (em unidades formadoras de colônias (UFC/mL ou grama de solo) deve ser abundante. Liu e colaboradores (2010) relatam a estratégia de bioestimulação em solo contaminado com hidrocarbonetos poliaromáticos (HPA), adicionado de adubo orgânico. Após 360 dias foi observada uma redução de 58% dos hidrocarbonetos, comparado ao controle sem a adição de nutrientes. No entanto, através do método de contagem total, foi possível observar um número menor de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos no controle
26 sem a presença de adubo, do que nas amostras com o tratamento. Os autores concluíram que na quantidade de bactérias abaixo de 105 UFC. g-1,o processo de biorremediação não ocorreria de forma significativa.Portanto, quanto maior a população de micro-organismos que degradam o contaminante dentro da área de remediação, mais rápido e mais eficiente será o processo de biorremediação.
Bioestimulação já é amplamente descrita na literatura, tanto em solos como em águas, mostrando ser eficiente na remoção de pesticidas (Kanissery et al, 2011), petróleo e HPA (Nikolopoulou & Kalogerakis, 2008; Nikolopoulou & Kalogerakis, 2009; Dellile et a, 2009; Yu et al, 2011), organohalogenados (Major et al, 2002; Naihiro et al, 2010).
Bioaumentação implica na adição de micro-organismos isolados ou de consórcios de micro-organismos, já sabidamente degradadores, carreando genes que possam ser transferidos à microbiota autóctone ou não, em uma determinada área contaminada. Segundo o documento “gerenciamento de áreas contaminadas” da CETESB, assim como em alguns trabalhos da literatura, essa técnica deve ser aplicada quando a atenuação natural ou a bioestimulação não se apresentaram efetivas, como no caso de ambientes que: (1) não possuem a quantidade suficiente de micro-organismos, (2) micro-organismos nativos não possuem rotas metabólicas necessárias para metabolizar os compostos poluentes (Fantroussi e Agathos, 2005; Tyagi et al., 2011).
Processos envolvendo bioaumentação vêm sendo utilizados em alguns setores. Na agricultura, a inoculação de legumes com bactérias fixadoras de nitrogênio Rhizobium spp. ocorre desde o século 19. A utilização de bioaumentação com células livres ou micro-organismos associados a plantas, como Azotobacter ou Azospirillum spp. para aumentar a produtividade, também já é utilizada. Outra aplicação do bioaumento inclui a inoculação de sementes de plantas com bactérias promotoras de crescimento ou ainda micro-organismos antagonistas a patógenos. A inoculação é também utilizada para transformar os produtos agrícolas em formas mais úteis como silagem de forragem. Em indústrias a bioaumentação é aplicada na preparação de alimentos, como processos de fermentações de leite e cerveja (Gentry et al, 2004; Lebeau 2011).
27 Bioaumentação pode ser aplicada de diversas formas. A primeira envolve a reinoculação das bactérias autóctones, onde algumas bactérias utilizadas com este intuito podem ser isoladas de um ambiente contaminado, posteriormente cultivadas sob condições laboratoriais e depois reintroduzidas ao mesmo ambiente. A outra possibilidade é a seleção de micro-organismos apropriados provenientes de ambientes contaminados similares a uma determinada área alvo para biorremediação, onde os mesmos serão empregados. Por último, existe ainda a utilização de organismos geneticamente modificados com o intuito de potencializar os processos de degradação de poluentes (Mrozik e Piotrowska-Seget, 2010, Hosokawa, 2009). Hosokawa (2009) relata a o processo de bioaumentação com micro-organismos autóctones (reintrodução dos micro-organismos) realizado na costa do Japão, na ilha de Hokaido.
Alguns micro-organismos, como bactérias e alguns fungos, já são descritos na literatura sendo utilizados em processos de bioaumentação para a degradação de vários compostos xenobióticos (Tabela 1).
Tabela 1: Micro-organismos utilizados em processos de bioaumentação na degradação de várias
substâncias poluentes.
Micro-organismo Composto Literatura
Alcanivorax Hidrocarbonetos de petróleo McKew et al, 2007; Gertler, 2009 Bacillus Óleo diesel; quinolona Bento et al., 2005; Bao-hua et al., 2012 Rhodococcus Óleo diesel Kuyukina et al, 2010; Lee et al, 2011 Pseudomonas Petróleo; simazina; tabaco Stallwood et al. 2005; Morgante et al.,
2009; Mei-zhen et al., 2012 Bulkhoderia sp Carbofurano; Etileno
diamino tetra acetato (EDTA)
Chen et al., 2005; Plangklang et al., 2011 Aspergillus sp. Metais pesados Braud et al., 2006
Penicilium sp. Petróleo Alleri, 2012;
28 Apesar de suas vantagens, como baixo custo e maior eficiência comparada a outras, essa técnica apresenta algumas limitações. A seleção das linhagens, a ecologia microbiana, tipo e concentração do contaminante, restrições ambientais, assim como o procedimento de inoculação dos micro-organismos podem influenciar na efetividade do processo. Para uma maior efetividade, além de uma microbiota capaz de degradar os contaminantes e competir e atuar com sinergia com a microbiota autóctone, outros parâmetros devem ser levados em conta, como água, oxigênio e fontes utilizáveis de fósforo e nitrogênio. A falta de qualquer um dos parâmetros mencionados pode acarretar a ineficiência da biorremediação sob condições naturais (Boopathy, 2000; Tyagi et al, 2011). Gentry (2004) relata algumas abordagens que podem aumentar a persistência e atividade dos micro-organismos e/ou genes introduzidos no ambiente: (1) métodos para aumentar a sobrevivência dos micro-organismos inoculados em ambientes contaminados, como a imobilização em matrizes; (2) o uso de genes “repórter” para monitorar a atividade ou presença dos micro-organismos introduzidos; (3) o uso de genes suicidas para controlar a dispersão dos micro-organismos transgênicos.
Trabalhos na literatura mencionam a avaliação tanto de bioestimulação como bioaumento para a remoção de contaminantes, como hidrocarbonetos, metais pesados e pesticidas. A combinação de bioaumentação e bioestimulação pode ser uma estratégia promissora para acelerar a biorremediação. Ambos micro-organismos autóctones e exógenos podem se beneficiar da bioestimulação devido à adição de nutrientes e aceptores de elétrons (El Fantroussi e Agos, 2005).
Yu e colaboradores (2005) demonstraram a degradação de três hidrocarbonetos poliaromáticos (HPA) em sedimentos de mangue contaminado, utilizando três estratégias: atenuação natural, bioestimulação e bioaumentação, durante 4 semanas. Os resultados variaram de acordo com o tipo de hidrocarboneto, sendo que para fenantreno e fluoreno, na primeira semana de avaliação a taxa de degradação foi mais significativa no tratamento utilizando a atenuação natural, porém ao final de quatro semanas, os três tratamentos foram estatisticamente equivalentes. No entanto, quando se avaliou a degradação de pireno, um hidrocarboneto mais pesado, contendo 4 anéis benzênicos, o tratamento com
29 maior eficiência foi de bioestimulação, no qual foi descrito 98% de degradação do composto.
Mrozik e Piotrowska-Seget (2010) relatam alguns trabalhos que obtiveram bons resultados utilizando a estratégia de bioaumentação e bioestimulação atuando em conjunto.
Como já descrito, ambas abordagens, combinadas ou não, podem ser utilizadas para a remediação de ambientes contaminados e sua eficiência dependerá também de fatores externos.
2.4 Bioaumentação utilizando organismos geneticamente modificados (OGM)
Ao final dos anos 1970 e começo dos anos 1980, se iniciou o aprimoramento de técnicas moleculares, como a clonagem e caracterização de genes bacterianos codificando enzimas catabólicas para degradação de compostos recalcitrantes. Logo, muitos microbiologistas e biólogos moleculares perceberam o potencial da engenharia genética para biodegradação. O trabalho pioneiro de Gunsalus e Chakrabarty sobre a base genética da degradação de um conjunto de compostos recalcitrantes por linhagens de
Pseudomonas culminou em 1981 com a concessão de uma patente para uma cepa
desenvolvida por conjugação que poderia degradar cânfora, octano, salicilato e naftaleno [US Patent 425944], o primeiro organismo vivo a ser submetido a um processo de propriedade intelectual (Cases e De Lorenzo, 2005).
A aplicação de organismos geneticamente modificados (OGMs) pode ser útil para o tratamento de ambientes altamente contaminados para fins de biorremediação. A modificação genética obtida através da clonagem de genes de vias envolvidas nos processos de biodegradação pode possibilitar o aumento das taxas de biodegradação. No entanto, é essencial verificar a estabilidade de qualquer OGM antes de sua aplicação no campo. O destino dos OGMs depende em grande parte da estabilidade do plasmídeo recombinante presente no organismo (Samanta et al, 2002).
Mesmo havendo micro-organismos naturalmente degradadores, ainda se pode observar a persistência de muitos compostos químicos no meio ambiente. Deste modo, vem sendo cada vez mais necessário o desenvolvimento de novos biocatalistas. Timmis e
30 Pieper (1999), na década de 90, já discutiam a necessidade do desenvolvimento dos mesmos, descrevendo várias implicações desse processo, incluindo a descoberta de novas rotas metabólicas (até então não descritas); ampliação de substratos para a expressão dessas rotas metabólicas; avaliação da possível síntese de produtos intermediários tóxicos ou altamente reativos; avaliação da utilização de substratos que não permitam a acumulação de produtos intermediários, como catecóis; o aumento da estabilidade genética das atividade catabólicas; e aumento da biodisponibilidade de poluentes hidrofóbicos. Estudos envolvendo OGMs, objetivando biorremediar compostos nocivos e recalcitrantes, já são descritos (Ford et al., 1999; Pandey et al., 2005; Menn et al., 2008). No entanto, a utilização de OGM para biorremediação se depara com a legislação restritiva que proíbe sua aplicação em ambientes na forma “in situ”. Como já descrito, a descoberta realizada em 1975 por Gunsalus e Chakrabart, patenteada em 1980, se encontra ainda sem comercialização.
Não obstante, a aplicação de OGM para biorremediação pode ser uma alternativa viável e efetiva. É descrito que alguns OGMs têm capacidade para degradar alguns componentes do petróleo de 10 a 100 vezes mais rápido do que outras linhagens não transgênicas (Ezekika & Singer, 2010).
Sayler e Ripp (2000) mencionam um estudo de campo realizado com uma linhagem transgênica de Pseudomonas designada HK44, aplicada para degradação de naftaleno em solo (em contenção). Essa linhagem continha em seu genoma um plasmídeo responsável pela degradação de naftaleno e adicionalmente um gene ligado a uma região promotora (genes da família lux) que produziam bioluminescência. Portanto, quando ocorria contato dessa linhagem com naftaleno (ou metabólitos intermediários da degradação do mesmo), ocorria o aumento da expressão de genes catabólicos e também uma resposta bioluminescente, podendo deste modo ser detectada a quantidade de naftaleno biodisponível assim como sua degradação no ensaio. Ainda, Strong e colaboradores (2000) realizaram um teste em escala de campo com uma linhagem de Escherichia coli superprodutora da enzima atrazina clorohidrolase a fim de degradar o herbicida atrazina, utilizado na agricultura.
31 Nos Estados Unidos, a Agência de Proteção Ambiental (US EPA) tem autoridade para regulamentar a liberação de organismos geneticamente modificados, sob a seção 5 prevista na Ata de Controle de Substâncias Tóxicas (TSCA). Para aqueles que objetivam produzir micro-organismos geneticamente modificados é requerido a submissão de um documento denominado Aviso de Atividade Microbiológica Comercial (“Microbial Commercial Activity Notice -MCAN”), no qual deve ser relatado o destino dos OGMs no meio ambiente, riscos à saúde e propriedades físico-químicas dos propostos micro-organismos. A modificação de micro-organismos é prevista como alto risco dentro das regulamentações da agência de proteção ambiental. Embora tenha havido um avanço no desenvolvimento de culturas agrícolas, novos fármacos e outras inovações biotecnológicas ao longo das duas últimas décadas, os micro-organismos geneticamente modificados desenvolvidos para biorremediação ainda não são comercializados. (Ezezika and Singer, 2010).
No Brasil, a legislação que rege a questão dos OGMs e transgênicos é a Lei de Biossegurança (Lei 11.105/05), em vigência desde 24 de março de 2005. A partir daí, alterações na regulamentação acerca dos transgênicos foram reordenadas bem como a ratificação da criação da CTNBio (Conselho Técnico Nacional de Biossegurança) e suas competências, além de criar o Conselho Nacional de Biossegurança (CNBS) e o Sistema de Informação de Biossegurança (SIB).
A Lei de Biossegurança determina os mecanismos de fiscalização sobre as condutas que envolvam os organismos geneticamente modificados, sendo elas a condução, cultivo, produção, manipulação, transporte, transferência, importação, exportação, armazenamento, pesquisa, comercialização, consumo, liberação no meio ambiente e descarte, conforme preconiza o art. 1°, de forma a proteger a vida e a saúde humana, dos animais e das plantas, bem como o meio ambiente (Giehl, 2008).
O processo de comercialização de OGM’s como culturas agrícolas de algodão, milho e feijão já liberadas para cultivo, envolve órgãos como a CTNBio e CNBS, assim como órgãos e entidades de registro e fiscalização do Ministério da Saúde, do Ministério da
32 Agricultura, Pecuária e Abastecimento e do Ministério do Meio Ambiente, e da Secretaria Especial de Aqüicultura e Pesca.
Uma das competências da CTNBio, descritas no Artigo 14 da Lei de Biossegurança, é emitir decisão técnica, caso a caso, sobre a biossegurança de OGM e seus derivados no âmbito das atividades de pesquisa e de uso comercial de OGM e seus derivados, inclusive a classificação quanto ao grau de risco e nível de biossegurança exigido, bem como medidas de segurança exigidas e restrições ao uso.
Ao CNBS cabe analisar, a pedido da CTNBio, quanto aos aspectos da conveniência e oportunidade socioeconômicas e do interesse nacional, os pedidos de liberação para uso comercial de OGM e seus derivados.
Por último, cabe aos órgãos e entidades de registro e fiscalização dos Ministérios da Saúde, da Agricultura, Pecuária e Abastecimento e do Ministério do Meio Ambiente, e da Secretaria Especial de Aqüicultura e Pesca registrar e fiscalizar a liberação comercial de OGM e seus derivados.
2.5 Biorremediação e o uso de biossurfactantes
Compostos tensoativos produzidos por micro-organismos (“microbial surface-active compounds”) são moléculas estruturalmente diversas classificadas de acordo com sua estrutura química e sua origem microbiana. São constituídas por uma porção hidrofílica, compreendendo um grupo ácido, peptídeos, mono, di ou polissacarídeos, e uma porção hidrofóbica, composta por cadeias de ácidos graxos ou de hidrocarbonetos saturados ou insaturados. Essas estruturas conferem muitas propriedades, incluindo a capacidade de diminuir a tensão superficial e interfacial entre líquidos e também a formação de micelas e microemulsão entre duas fases diferentes. Estes compostos podem ser divididos entre duas principais classes: compostos de baixo peso molecular, denominados biossurfactantes, como lipopeptideos, glicolipídeos, proteínas, e compostos de alto peso molecular, como polímeros complexos de polissacarídeos, lipopolissacarídeos ou lipoproteínas, denominados bioemulsificantes. Essa última classe de moléculas é mais efetiva em estabilizar emulsões óleo em água, mas não tão efetiva em diminuir a tensão
33 superficial (Banat et al. 2010).
Os surfactantes se concentram em interfaces (sólido-líquido, líquido-líquido ou vapor-líquido). A interface é formada entre duas fases imiscíveis, sendo que a porção hidrofóbica do surfactante se volta para a superfície, enquanto que a porção hidrofílica está em contato com a solução (Mulligan, 2005).
Como já descrito, biossurfactantes são surfactantes produzidos biologicamente. A atividade biossurfactante pode ser determinada através de mudanças nas tensões interfaciais e superficiais de alguns “sistemas”, ou interfaces, como, por exemplo, água/óleo e ar/água e essas mudanças podem ser medidas com auxílio de tensiômetro (Desai & Banat, 1997). Devido à sua estrutura anfifílica, as moléculas dos biossurfactantes tendem a se aglomerar e formar pequenas estruturas como vesículas, lamelas ou micelas quando adicionados a esses sistemas e, deste modo, reduzem a tensão superficial até um nível crítico (Figura 2). Esta medida é conhecida como “concentração micelar crítica” (CMC) e é utilizada para definir a qualidade e eficiência do biossurfactante, de acordo com suas propriedades como detergência, formação de espuma, emulsificação e dispersão. Esse processo dinâmico é baseado na habilidade dos biossurfactantes de reduzir a tensão superficial pelo rearranjo molecular, pelo qual ocorre o acúmulo de suas moléculas na superfície de compostos insolúveis, influenciando as ligações de hidrogênio e outras interações hidrofóbico-hidrofílicas.
34
Figura 2. Esquemas representando as estruturas formadas por biossurfactantes quando em
contato com interfaces (Fonte: Champion et al., 1995).
Surfactantes considerados eficientes apresentam baixa concentração micelar crítica (ou seja, menos surfactante é necessário para reduzir a tensão superficial). Um surfactante ideal seria aquele que apresenta baixa concentração micelar crítica e tensão superficial com valores menores que 30 mN/m (Ashby et al., 2008; Desai & Banat, 1997; Mulligan, 2005). As interações de surfactantes nas interfaces são objeto de muitos estudos. Essas reações não ocorrem somente em relação à porção hidrofóbica dessas moléculas, mas também com a parte hidrofílica, que pode apresentar carga elétrica aniônica, catiônica, anfotérica ou não-iônica (Neu, 1996).
Os hidrocarbonetos de petróleo e de outros óleos pesados, quando em contato com o meio ambiente, se aderem fortemente a partículas de solo. Dentre os hidrocarbonetos, a classe dos HAPs (Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos) são os maiores contaminantes (Mulligan, 2005; Bordoloi & Konwar, 2009). A biodegradação de hidrocarbonetos torna-se mais eficiente com a adição de biossurfactantes, os quais podem acelerar a biorremediação de solos e águas contaminadas por petróleo através da diminuição da tensão superficial óleo – água, aumentando a solubilidade e assim a mobilidade de compostos hidrofóbicos, tais como os hidrocarbonetos (Tango & Islam, 2002).
Calvo e colaboradores (2009) mencionam que a degradação associada ao emprego de surfactantes torna-se eficiente de acordo com alguns fatores, como por exemplo, a
35 taxa de nutrientes disponíveis no solo. Estes nutrientes (nas formas de nitrogênio e fósforo) promovem o crescimento e, conseqüentemente, o aumento da população indígena do solo contaminado, aumentando a taxa de degradação.
Vários trabalhos têm descrito o emprego de biossurfactantes na degradação de hidrocarbonetos, principalmente utilizando ramnolipídeos (Rahman et al., 2003; Nguyen
et al., 2008; Souza et al., 2014) e surfactina (Mulligan et al., 1999; Cubitto et al., 2004;
Whang et al., 2008).
Além de atuar em processos de biodegradação de hidrocarbonetos, alguns biossurfactantes são capazes de remover metais pesados, como cádmio, cobre, chumbo e zinco em solos contaminados (Mulligan, 2005; Asci et al, 2009). Ao contrário dos hidrocarbonetos, os metais pesados não são degradáveis e apresentam alta toxicidade, mesmo em quantidades pequenas, representando uma ameaça para a saúde e meio ambiente.
Mulligan e colaboradores (2001) analisaram a utilização de três diferentes biossurfactantes (surfactina, ramnolipídeos e soforolipídeos) na remoção de metais em sedimentos contaminados com cobre e zinco, onde os glicolipídeos (ramnolipídeos e soforolipídeos) apresentaram-se como mais efetivos.
2.6 Genes de degradação de hidrocarbonetos
Hidrocarbonetos são compostos constituídos exclusivamente de carbono e hidrogênio. Devido à ausência de grupos funcionais, os hidrocarbonetos são geralmente apolares e exibem baixa reatividade química em temperatura ambiente. As diferenças em reatividade são primariamente determinadas pelo tipo e arranjo das ligações insaturadas. Sua classificação geralmente se dá pelas características das ligações entre os carbonos: 1) hidrocarbonetos alifáticos, que incluem os de cadeia linear (n-alcanos); hidrocarbonetos de cadeia ramificada e compostos cíclicos e 2) hidrocarbonetos aromáticos que incluem hidrocarbonetos mono ou policíclicos, que também podem conter cadeias alifáticas, como os alkibenzenos (Sierra- Garcia & Oliveira, 2013).
Os hidrocarbonetos podem ser degradados de duas formas, aeróbica e anaerobicamente. Em organismos aeróbicos, como a maior parte fungos e algumas
36 bactérias, o ataque inicial de hidrocarbonetos sempre requer a molécula de oxigênio como um co-substrato (Heider et al., 1999). No entanto, em alguns ambientes o oxigênio não está presente, como em sedimentos profundos e reservatórios de petróleo, e deste modo a degradação pode ocorrer em condições anóxicas. Estudos têm demonstrado que o mecanismo de degradação por essas bactérias difere das aeróbicas. Nas bactérias aeróbicas o O2 não é somente um aceptor de elétrons para os processos respiratórios,
mas também um indispensável “reagente” na ativação do mecanismo de degradação. Através das monooxigenases (em hidrocarbonetos alifáticos) e dioxigenases (em hidrocarbonetos aromáticos) um ou dois átomos são incorporados, levando à geração de produtos hidroxilados (Widdel & Rabus, 2001).
Degradação aeróbica
Na maioria das rotas de degradação descritas na literatura, o substrato n-alcano é oxidado ao álcool correspondente através das enzimas substrato-específicas monooxigenases/ hidroxilases. O álcool é então oxidado ao correspondente aldeído e finalmente convertido em ácido graxo. Ácidos graxos são conjugados à coenzima A (CoA) e processados através de β – oxidação para gerar acetil- CoA. A hidroxilação terminal pode ser realizada por diversas enzimas pertencentes a diferentes classes: (1) propano-monoxigenase (C3), (2) classes diferentes de butano-monooxigenase (C2-C9), (3) CYP153 monooxigenases (C5-C12), (4) AlkB- relacionada com não-heme ferro monooxigenase (C3-C10 ou (C3-C10-C20), (5) monooxigenase ligada à flavina -AlmA (C20-C36), (6) monooxigenase LadA flavina-dependente (C10-C30), (7) dioxigenase cobre flavina-dependente (C10-C30). Entre as enzimas ativas ligadas à degradação de alcanos, a não-heme ferro (AlkB), presente em membranas, é a mais bem caracterizada.
Micro-organismos que degradam alcanos de cadeias médias (C5-C11) e longas (>C12) vêm sendo frequentemente relatados portando o gene alkB e a presença do mesmo tem sido utilizada como biomarcador para estudos de caracterização de populações envolvendo bactérias aeróbias degradadoras de alcanos em várias amostras ambientais, assim como em processos de biorremediação (Sierra- Garcia & Oliveira, 2013).
37 A degradação que envolve o sistema enzimático alk, sistema de degradação de alcanos, é o mais amplamente distribuído em procariotos (van Beilen et al., 2003; Marchant et al., 2006). Porém, outros dois sistemas implicados na oxidação inicial de alcanos existem em bactérias, embora menos comuns, como a citocromo P450 mononoxigenase e uma dioxigenase detectada em algumas cepas de Acinetobacter (Heiss-Blanquet et al., 2005).
Em particular, o sistema enzimático alk foi primeiramente descrito em
Pseudomonas oleovorans GPo1 (posteriormente classificada como cepa de Pseudomonas putida). Este contém dois operons: alkBFGHJKL e alkST (van Beilen et al., 1994), sugerindo
que um operon pode regular o outro. Em contraste, os genes que codificam o complexo
alkB em Acinetobacter sp. APD1 parecem ter um arranjo totalmente irregular. A
degradação de alcanos em Acinetobacter é altamente dependente da expressão de no mínimo cinco genes e alkR é conhecido por regular a expressão do cluster completo (Marchant et al., 2006). Em cepas de Rhodococcus Q15 e NRRI, no mínimo quatro alcano-monooxigenases têm sido identificadas (alkB1 a alkB4) (Marchant et al., 2006).
A Figura 3 mostra a principal reação enzimática da degradação aeróbica de hidrocarbonetos. O ataque inicial intracelular a poluentes orgânicos consiste em um processo oxidativo, no qual ocorre a ativação, assim como a incorporação de oxigênio, uma reação enzimática chave catalisada pelas enzimas oxigenase e peroxidase. Vias de degradação “periféricas” convertem poluentes orgânicos, passo a passo, em compostos intermediários. A síntese de biomassa ocorre a partir dos metabólitos precursores centrais, por exemplo, acetil-CoA, succinato, piruvato. Os açúcares necessários para biossíntese e crescimento são produzidos por gliconeogênese (Das & Chandran, 2010).
38
Figura 3. Esquema indicando a principal via de degradação aeróbica. Fonte: Das & Chandran, 2010.
Outro sistema enzimático, o que envolve a enzima citocromo P450, também já é descrito na literatura. Esse sistema foi encontrado envolvido com a biodegradação de hidrocarbonetos do petróleo inicialmente em eucariotos. A capacidade de várias espécies de leveduras em utilizar n- alcanos ou outros compostos alifáticos como fonte única de carbono e energia é mediada pela existência de múltiplas formas de citocromo P450. Essas enzimas têm sido isoladas a partir de algumas espécies de leveduras, como Candida
maltosa, Candida tropicalis e Candida apicola (Das & Chandran, 2011). Citocromo P450 é o
grupo mais comum de oxigenases utilizadas em processos de degradação em eucariotos, embora tenha um papel secundário em bactérias (Fuchs et al., 2011).
A degradação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) pelas bactérias também tem sido amplamente estudada. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) estão classificados em uma outra classe de compostos orgânicos constituídos de um ou mais anéis benzênicos ligados de forma linear ou angular. São encontrados no meio ambiente após o despejo de resíduos relacionados ao processamento de carvão, petróleo (lodo), asfalto, creosoto e madeira e podem persistir nos ecossistemas por anos, devido às suas características de baixa solubilidade e capacidade de adsorção em partículas sólidas.
39 A descontaminação de ambientes contaminados com HPA é de vital importância, pois além de sua intrínseca estabilidade química e resistência a muitas formas de degradação, muitos destes compostos tóxicos são conhecidos como carcinogênicos e mutagênicos (Collins et al., 1999; Habe & Omori, 2014). Como já descrito, algumas estratégias de remoção consistem na aplicação de micro-organismos que podem degradar os HPAs. Estes podem ser utilizados como fonte de carbono e energia por diversos micro-organismos que adaptaram suas habilidades de utilização desses substratos.
A degradação de HPAs por bactérias sob condições aeróbicas começa com a adição da molécula de oxigênio ao anel aromático pela enzima dioxigenase. As dioxigenases pertencem a uma grande família conhecida como dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos (ARHDs). Todos os membros dessa família possuem uma ou duas proteínas transportadoras de elétron, dependendo do substrato e da origem da enzima (Gibson & Parales, 2000).
ARHDs como benzoato, naftaleno, bifenilo, tolueno e benzeno dioxigenases são complexos enzimáticos formados por três ou quatro subunidades protéicas. Estes complexos catalisam uma reação redox na qual dois oxigênios moleculares são incorporados no anel aromático do substrato à custa da oxidação de NADH (Gibson & Parales, 2000). Posteriormente, intermediários podem ser catalisados por dois tipos de enzimas, intradiol e estradiol dioxigenases, que representam duas classes de proteínas relacionadas filogeneticamente. Essas enzimas têm papel chave na degradação de compostos aromáticos e muitas dessas proteínas e suas sequencias vêm sendo descritas, purificadas e caracterizadas nas últimas décadas (Sierra-Garcia & Oliveira, 2013).
Degradação anaeróbica
Muitos ambientes contaminados apresentam baixa ou nenhuma disponibilidade de oxigênio, como aquíferos, sedimentos aquáticos e solos submersos, ocorrendo desta forma a degradação de compostos poluentes através de micro-organismos estritamente anaeróbicos ou anaeróbios facultativos.
