CAPÍTULO 4. Avaliação da estratégia de bioaumento utilizando micro-organismos
4.5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste trabalho foi possível avaliar o potencial de clones metagenômicos obtidos a partir da construção de uma biblioteca fosmidial e de linhagens de bactérias, todos provenientes de amostras de petróleo de reservatórios brasileiros, em escala de microcosmos e mesocosmos, visando futura aplicação em processos de biorremediação.
Na primeira etapa, foram realizados ensaios em microcosmos para avaliação da degradação de petróleo, com quatro clones metagenômicos e quatro linhagens isoladas, avaliados na forma livre, em 50 mL de água do mar artificial e petróleo bruto como única fonte de carbono, a cada sete dias durante 21 dias. Os resultados foram satisfatórios e inovadores, uma vez que foi relatada a utilização de clones fosmidias portando vias de
144 degradação de hidrocarbonetos, para biorremediação, gerando a publicação do artigo “Bioremediation potential of microorganisms derived from petroleum reservoirs”, na revista Marine Pollution Bulletin. Neste artigo estão descritos os ensaios em microcosmos com água do mar e as taxas de degradação de petróleo obtidas através da ação dos micro- organismos, avaliada por Cromatografia gasosa-Espectrometria de Massas (CG-EM), nos quais se destacaram as linhagens isoladas Dietzia maris CBMAI 705 e Micrococcus sp. CBMAI 636, atingindo taxas de até 99% de degradação de hidrocarbonetos saturados (Capítulo 1). Foi possível verificar a capacidade dos clones metagenômicos e das linhagens isoladas para degradação de hidrocarbonetos presentes no petróleo, tanto para alifáticos, como para aromáticos em ensaios de microcosmos. Esses resultados foram relevantes, principalmente a performance dos clones 2B, 1A e 10A, uma vez que deve ser levado em conta que os genes presentes nesses clones atuam em sistema de expressão heteróloga.
Concomitante aos primeiros ensaios de degradação em microcosmos, foram realizados ensaios de tensiometria e emulsificação (E24) para a avaliação da produção de biossurfactantes pelos micro-organismos em estudo. Inicialmente foram realizados ensaios simples, utilizando apenas uma fonte de carbono, como hexadecano e glicerol (não mostrados ao longo desse trabalho), porém os baixos valores de tensiometria e emulsificação encontrados levaram à escolha de empregar o método de delineamento experimental, modelo Plackett-Burman (P&B), testando ao mesmo tempo várias fontes de carbono, nitrogênio e sais. Ainda assim, os resultados não foram muito satisfatórios, com valores não significativos com relação à redução da tensão superficial e formação de emulsão, através do teste E24, com a linhagem Bacillus subtilis CBMAI 707, já descrita quanto à degradação de hidrocarbonetos e produção de biossurfactantes, apresentando melhores valores de redução de tensão e de emulsificação em querosene. O método de delineamento experimental, modelo Plackett-Burman (P&B) foi eficiente para avaliar a produção de compostos tensoativos, no entanto a melhor linhagem isolada testada foi Bacillus subtilis, apresentando o menor valor de tensão superficial e melhor índice de emulsificação entre os clones e linhagens avaliadas. Baseado nos resultados de degradação descritos no artigo, as linhagens e os clones metagenômicos foram
145 selecionados para serem imobilizados em quitosana. Dietzia maris CBMAI 705 e
Micrococcus sp. CBMAI 636 não resistiram ao processo de encapsulamento. Seguiu-se
então com a imobilização dos quatro clones metagenômicos e da linhagem de Bacillus
subtilis CBMAI 707, a qual foi bem sucedida e permitiu dar continuidade aos experimentos
de degradação nas escalas de micro e mesocosmos. Os ensaios para a verificação da produção de biossurfactantes, assim como a descrição do processo de imobilização em quitosana estão descritos no Capítulo 2.
Na segunda etapa do trabalho foram realizados novos ensaios em microcosmos para avaliar a degradação de petróleo, utilizando os micro-organismos imobilizados. Nos ensaios envolvendo água do mar estéril, ao final de 21 dias, a taxa de degradação dos hidrocarbonetos saturados ficou em torno de 65 a 80% para o clone 2B e 95 a 100% para o consórcio. Nos ensaios em água do mar não-estéril, as taxas ao final de 40 dias, foram de 60 a 100% para o clone 2B, 80 a 100% para o consórcio e de 95 a 100% para o Bacillus
subtilis CBMAI 707. No último ensaio, realizado em tanques de 90L em água de mar não-
estéril, foi utilizado um consórcio em ágar contendo três linhagens isoladas, um consórcio imobilizado em quitosana contendo 4 clones metagenômicos e Bacillus subtilis e um clone 2B imobilizado isoladamente, e as taxas de degradação foram mensuradas baseando-se apenas na relação pristano/fitano, permitindo a seleção do consórcio com quatro clones metagenômicos e a linhagem de Bacillus subtilis, posteriormente avaliado em ensaios de mesocosmos. Foi possível observar que os micro-organismos, mesmo na forma imobilizada foram capazes de degradar os hidrocarbonetos do petróleo bruto. Algumas variações foram notadas quando avaliados juntamente com a microbiota autóctone em água do mar não-estéril e nas condições mais próximas da situação in situ. Mesmo assim, os micro-organismo avaliados foram capazes de degradar petróleo bruto.
Na última etapa do trabalho, foi avaliado um único consórcio imobilizado em quitosana, contendo quatro clones metagenômicos e a linhagem de Bacilus subtilis CBMAI 707 em sistemas de mesocosmos, em tanques de 3.000 L preenchidos com água do mar não-estéril. Esse consórcio foi selecionado baseando-se nos resultados de degradação de petróleo bruto nos experimentos já descritos. Parâmetros como quantidade total de
146 bactérias (utilizando DAPI), contagem heterotrófica, e demanda biológica de oxigênio (DBO) foram mensurados, assim como a degradação de petróleo através de cromatografia gasosa (CG), além da caracterização da microbiota através de sequenciamento de DNA em larga escala. As análises estatísticas revelaram similaridades nas taxas de degradação do petróleo entre o tratamento com bioaumentação e o controle, no caso dos hidrocarbonetos saturados. Porém, para os HPAs o tratamento com bioaumentação revelou taxas superiores de degradação, abrindo perspectivas para aplicação futura na remediação de contaminação com compostos recalcitrantes. Sequencias relacionadas aos gêneros Escherichia e Bacillus foram encontradas apenas no tratamento utilizando o consórcio, embora em baixas abundâncias. Porém ao final do experimento, foi observada a prevalência de alguns grupos em comum, como Caulobacter vibrioides, Holospora spp. e
Mesorhizobium spp. Isso pode indicar que o consórcio com clones metagenômicos e Bacillus subtilis pode não ter tido sucesso nas condições que simulam o ambiente natural,
contendo as bactérias autóctones da água do mar. Isso poderia ser explicado pelas condições ambientais adversas nos sistemas de mesocosmos, diferentemente das observadas em condições controladas de laboratório, assim como a competição com a microbiota indígena. É possível que mesmo estando imobilizados em quitosana, os micro- organismos não tenham tido muito sucesso na proliferação nos sistemas de mesocosmos. Ainda assim, a utilização do consórcio pode ser interessante, uma vez que esses clones possuem capacidade para degradar tanto hidrocarbonetos saturados como aromáticos, além de capacidade para produzir biossurfactante, deste modo abrindo perspectiva de ser utilizado em sistemas de contenção para o tratamento de ambientes contaminados.
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