Aspectos imunoinflamatórios e da matriz extracelular na patogênese da macrovasculopatia diabética

Autor: Paulo Sérgio Abunader Orientadora: Professora Nadine ClauseU

Ao Citopatologia sua na sua a com em uma

Carlos pelo apoio logístico recebido no Laboratório Também aos Drs. Vinícius e Luize, e ao acadêmico Roberto

meus

PACIENTES E Delineamento

População em esuwo.

Coletas de dados clínicos e laboratoriais . ., .... , ..

~$••oee (>$11>0904\90040U00<t®<!t'&4@0$0G0Uéi$~J-Ueée&

Cálculo do tamanho da amosnra

1 10 16 18 18 18

na comum em outras acontece na H U U H \ J H L U U í H U < " - " " ' " ' -e UV,-UU<<..UV UVU-HíV teve em em sec:co(~S

com diabete va ... ,,..,.,, • ...,., não-diabéticos. Características histológicas de

fragmentação lâmina elástica cálcio e

semiquantitativamente graduadas nos dois tipos de Usando imunoistoquímica, através de análise semiquantitativa, também foram avaliados a presença de linfócitos T e macrófagos, o acúmulo de fibronectina, e a expressão do fator de necrose tumoral-a. Resultados - Foram estudados 20 pacientes com diabete melito tipo 2 (idade 68,9 ±

10,9 anos) e 16 pacientes não-diabéticos (idade 67,1

±

14,6 anos). Achados histológicos destas lesões ateroscleróticas avançadas foram similares nos dois tipos de

lS

hbrortec·tm, and expression tumor were quantitatively assessed in the two groups.

Results - type 2 diabetic patients 68.9

±

10.9 years) and 16

tumor two

patients (age 67.1 ± 14.6 years) were studied. Histological features o f

atherosclerotic lesions were similar in the two groups. By immunohistochemistry, a similar pattern ofT cell in:filtration (with positive staining in 12/19 diabetic

AGE

HDL

PAI-1 GAG TTOG HAS 1

finais de glicação avançada Lipoproteína de alta densidade

Inibidor da ativação do plasminogênio Glicosaminoglicano

Teste de tolerância oral à glicose Hipertensão arterial sistêmica

II

2 em corte

3

em corte

4 T

em corte graduação ausente

5 Fotomicrografia da detecção de macrófagos por imunoistoquimica em corte transversal de segmento arterial, graduação alta

Figura 6 Fotomicrografia detecção de macrófagos por imunoistoquímica 38

33

em corte transversal de segmento arterial, graduação ausente 3 3 Figura 7 Fotomicrografia da detecção de fibronectina por imunoistoquímica

mesmo moléculas, e é o é proposto e uma deficiência e é ou em como de nutrientes como glicose e oxigênio nestas áreas criticas da árvore arterial ser a causa principal disfunção endotelial e iniciação da lesão( 4). A análise imunohistoquírnica destas lesões revela que as estrias gordurosas são lesões ricas em lipideo, consistindo primariamente de ésteres de colesterol englobados por macrófagos, alguns linfócitos, e mesmo raramente por células da musculatura lisa. fibrosa

ao aumento

em uma

progressão lesão é

macrófagos cheios de lipídeos, proteoglicanos( 1).

à

a

e HlU.i:>'v~HUl

acúmulo de camadas de células musculares e além da síntese de colágenos, elastina e

Muitos estudos têm realizados nesta área, e o resultado é o marcado progresso na identificação de diferentes tipos celulares e várias moléculas que estão envolvidas na aterogênese.

ao como o aumento no a um e a um aumento tanto como nos e e como o aumento seu a é o excesso e ser pelos

através complexos mediados Fc (fragmento

imunoglobulina cristalizável)(l2), ou por fagocitose não específica, após agregação da lipoproteína induzida por oxidação(13). Os macrófagos secretam vários produtos que podem influenciar a ingesta de lipoproteínas, entre eles a lipase lipoproteica (LpL ), radicais livres de oxigênio e proteases que podem promover agregação e subseqüente fagocitose(14).

1 necrose e o certos na a secretar em e aumentar

Endotéiio, moléculas de adesão e células inflamatórias

O recrutamento intimai de monócitos desempenha um papel vital na aterogênese, e em parte, reflete a natureza inflamatória da doença. Múltiplos aspectos contribuem para o processo deste recrutamento, incluindo ativação endotelial, síntese de várias moléculas de adesão celular e migração transendotelial, mediada por fatores

como o 1 e e 1 e o Ul'-''UV'-'-Y'VH.<<CU é VVJlUIJ,J0 torna-se em é um

membro uma molécula de adesão celular,

serve como receptor celular para colágeno e laminina, ancorando a célula à matriz extracelular, e também é importante no extravasamento e acúmulo local de linfócitos na resposta inflamatória(25).

As células espumosas contendo colesterol, marca registrada na aterosclerose, são macrófagos, na maior parte das vezes derivados de monócitos da circulação sanguínea.

como

em uma

na

"'"''"'"''' .. mostraram

que a

(VCAM-1) em células endoteliais

um no

vascular umbilical humana (29,30). Além

o

nos

1

expressão da molécula de adesão intercelular tipo 1 (ICAM-1) e da VCAM-1 ocorre em artérias coronárias e no miocárdio em trasplante cardíaco heterotópico em coelhos, promovendo adesão e migração transendotelial de células inflamatórias. Entretanto, o bloqueio seletivo do TNF-a., com o uso de um receptor solúvel, diminuiu significativamente a incidência e a severidade de arteriopatia coronária neste

em aumentar a é uma permeabilidade o as e entre um a e e tem um na ao aumentando a

a produção de glicosaminoglicanos pelas células endoteliais e promover atividade pró-coagulante(34). Clausell e colaboradores demonstraram a presença de uma resposta imunoinflamatória em coronárias de corações transplantados de porcos, o que era associado à acúmulo de fibronectina e ao aumento da expressão de f3 e TNF-a(34-36) e que o efeito do TNF-a parece ser mediado via IL-lf3(37).

outras ""'J"~""""'·"· """'!-"''"'"'""''"'"''"'

o uma cascata

113

e

in e

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com uma ser

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os Vv~'.:>.:>\.JC> v•.<vv<v,_,,..,..._,._, na n<.!1rP<liP vaso

aos

a

peptídeos

a como uma estrutura nugrac<w e dtti::Jrel1Cl~tçã~o.

de cre~;cm1ent.o,

Boudreau e coJ.aOIOra,aores sobre o papel

em

ou reverter

o os

e interação celular com e

diferentes coJnponc:mt<es da matriz extracelular na proliferação intimai em modelos experimentais, demonstraram que no ductus arteriosus existe aumento da síntese de fibronectina, e isto foi associado com uma maior migração de células da musculatura lisa (39). Estas células também expressavam maior densidade do receptor para motilidade mediada pelo ácido hialurônico, um glicosaminoglicano presente na matriz extracelular ( 40). Também no

o o causou uma o aumento e a e um aumento e na o

considerar que as proteínas da ... L extra celular,

na

e

atuam

em a

exercerem um papel regulador no processo aterosclerótico, podem ser influenciadas mediadores biológicos imunes como as citoquinas, estabelecendo uma interação com elementos inflamatórios participantes do processo aterosclerótico.

e 1 como aumenta o vezes aos ateromatosas em em !JVIf.''-''"'-V<'<V extensas e mostram um uwcu"""'"' "-'""'·""' se uma rr.r<>f'<>1tn 0

é que contribuem para a disfunção endotelial Também há evidências de que um mecanismo imunoinflamatório possa desempenhar um papel importante(51,52). Por exemplo, o TNF-u tem sido recentemente implicado em mecanismos de resistência à insulina, pela inibição do receptor de atividade insulínica(53), o que sugere um papel desta citoquina no estado hiperglicêmico, sabidamente causador de lesão endotelial. Contudo, ainda não está claro se estas

e

exercem

tem

2 os

2 à e à

maepc~ndlen1terrten1te do aumento abdorninal(59).

evidências de que a insulina pode afetar diretamente a parede arterial, produzindo alterações compatíveis com o processo aterogênico. Efeitos diretos da insulina na parede arterial incluem a promoção de proliferação de células da musculatura lisa(60) e acúmulo de ésteres de colesterol. A insulina juntamente com outros fatores crescimento pode aumentar o depósito de colesterol intracelular pelo aumento

e a ). na o "';:;~'""';:;.:.,:uu ... uv ge11erau;~aao é aernm1str onmcmnte e "'V'""'''""" ~-'"""'"'""'"'" "'""'""'""''·''"''"'" aumentam o <U'-'JlUJU no UHJl<JvLv'" desenvolverem um com 11 anos estar ass:octaota a ocorre entre nas indicam que o aumento na co11ce:ntrac<:to VLDL e quilomicrons remanescentes, vistos nos diabéticos, são potencialmente capazes de aumentar a deposição de ésteres de colesterol nas células da parede arterial(64,65).

Tanto a LDL corno a HDL podem se tomar ricas em triglicerídeos corno efeito direto da hlpertrigliceridernia, mas também é verdade que o diabete rnelito sem hipertrigliceridemia não está associado com o enriquecimento do LDL por triglicerídeos.

em agregação que pode a em uma com o aumento em os

a""'u'"''"''"'"-com um aumento

e

e um

à

av•"uw•u~vu•~v se com plaquetas !J"'''"''"''H\•"' não au:mettcos, o

à

como 1

o à

A fibronectina é uma glicoproteína importante para a comunicação e ligação entre e componentes da matriz extracelular, e também para o crescimento e migração de células, processos fundamentais na aterogênese. Um estudo realizado em aortas obtidas de autópsia de pacientes com diabete melito e de pacientes não-diabéticos, mostrou uma presença aumentada de fibronectina na íntima dos vasos de pacientes

'"''"'·""""'"'· ""~'-"~""""'"'' somente nos '-'<.+'"''"'""·"" com com com ou sem ""'r•r<>>n um aumento com "'w'""·''-'U. com sem VWUUJlVHl\<, O em suas uma

extra~ e e 2. a uma e o linfócitos com 2 e submetidos à aterosclerótica

no com os

2-... u.5uv"''"'"''"· glicemia ao acaso >

à Glicose com a ingestão de de glicose via com glicemia após > 200mg/dl(80).

Grupo 2 - Pacientes não-diabéticos - Os critérios de inclusão para o grupo controle foram a ausência história de diabete melito e a dosagem de glicose em jejum:::; 120mg/dl.

Quatro pacientes do grupo controle que apresentavam glicemias de jejum em faixa duvidosa, entre 122 e 139mg/dl foram submetidos ao TTOG com de glicose

necrose '"'""'-'Hllv<ct.:> OU dos ~-"""'"'"'"""'" QlaiJíeUCOS. se i:>UU'Ui'v na como e, nos casos nr.:._,-,, .... o.r<>t·nrln e no momento "'"'"'.'"''""'" com tratamento a uma

.. .., ... uuu. lVll;mca<~oe:s em uso no Características bioquímicas avaliadas o ano à no estudo, tendo considerados os glicemia de jejum, creatinina sérica, hemograma, plaquetas, tempo de triglicerideos, colesterol total e frações de colesteroL

a

e um se eram Histologia a e ~vv,,..,,.. ... ..,,anao--se uma cortes com ._,, _ _,._,-.ll..J--u.., ... (Sigma).

erro

se U.Hll!JU.U.'\,,<1-V os se~;mcmtc>s

em

UU<~H0v Hl0.-JlV~l.,,U e

A seguir, os cortes histológicos foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e também com coloração tricromo. lâminas coradas com foram analisadas por microscopia óptica para detecção qualitativa de áreas de espessamento intimai, celularidade relativa e depósitos de cálcio nas lesões. Matriz extracelular, fragmentação da lâmina elástica interna e a presença de cristais de colesterol foram avaliados nas

e como as com e X O. remover à soro usados anticorpos ) e

macrófagos da Corporation, Carpinteria, CA

a detecção fibronectina anticorpo monoclonal específico anti-fibronectina origem celular em diluição 1:100 (clone DHl, sequencia anti-EDA, Chemicon Intl.Inc.). A expressão de TNF-a. foi avaliada usando-se anticorpo monoclonal anti-TNF-a

humano, MCA1385, em diluição 1:100 (IgGl da Serotec Ltd, 22Bankside, Station Approach, Kidlington, Oxford OXS England). As secções usadas como controle foram tratadas com imunoglobulina isotípica não-imune IgG (DAKO). as

mesma na aumentos a VV!"UIJ•<U o teste t a co1moara exato ou teste ou com ou mvensa. bicaudaL e e e entre os a os testes com os casos com 0,05 em teste

(p<O,OO era corno em com e e em

7

casos ao se co1noara ± 1 nos anos e o tratamento ~-'"'"""'"'"'" usavam

t _{± 1 ± 1} 4 8 8 1 t _{± 71 ±} ± ± t

*

entre os

~;unnnuanuu-:s~ os V<M-'~'-'"<M.Uo.>> as ''-''''-''""" n1rn\,'PTI1

na

com cortes 1

e

2 2 1 1 3 3 1

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4 2

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7 1 1

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8 2 1 1 2

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9 2 1 2 2 1

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1 NA 1

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2 2

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Y:z 2

o

19 2 lh

o

l!z 2

o

20 2 1

o

Yz 2

o

HE - Hematoxilina-eosina; Tricromo; EI Espessamento intimai; Cel. -Celularidade; LEI(F)- Fragmentação da lâmina elástica interna; Mz-Matriz extracelular.

2 1 1 2

o

o

4 2

o

2

o

o

6 2

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2

o

7 2

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2

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'l2 1

o

1 1

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1 2

o

HE-Celularidade; extracelular. NA- Não

O a

1 a 3

O

a

la3

O a Y2

la3

o

1 a 3

O a

la3

O a

la3 EI Cel. - Celularidade 1 19 7 13 3 2 18 17 3 3 8 8 3 2

o

0,31

Figura 1. Fotomicrografia ilustrativa da coloração por tricromo em corte transversal de segmento arterial. Aumento final de 40x.

Figura 2. Fotomicrografia ilustrativa da coloração por HE em corte transversal de segmento arterial. Aumento final de 40x.

T ou com 19 com 1 T em 6 casos em 2 e em tanto na como na T em cortes e em cortes e

Figura 4. Fotomicrografia ilustrativa da detecção de linfócitos T por

imunoistoquímica em corte transversal de segmento arterial, graduação ausente. Aumento final de lOOx.

Aumento final de lOOx.

Figura 6. Fotomicrografia ilustrativa da detecção de macrófagos por

imunoistoquímica em corte transversal de segmento arterial, graduação ausente. Aumento final de lOOx.

nas

e em

tanto na como na

Figura 7. Fotomicrografia ilustrativa da detecção de fibronectina po:r imunoistoquímica em corte transversal de segmento arterial, graduação Aumento final de 40x.

Figura 8. Fotomicrografia ilustrativa da detecção de fibronectina por

imunoistoquímica em corte transversal de segmento arterial, graduação leve. Aumento final de 40x.

estas

com

somente 2 casos entre os

sua vez na 2 na mostraram aumento e e e na

graduação alta. Aumento final de lOOx.

Figura 10. Fotomicrografia ilustrativa da detecção de TNF-a por imunoistoquímica em corte transversal de segmento arterial, graduação ausente. Aumento final de lOOx.

4 5 9 10 11 12 13 14

15

16 1 1 1 1

o

3 1 1 1

o

2

o

o

T

O a

1 a 3

O a

1 a 3

O a

1 a 3

O a

1 a 3 7 7 4 16 6 8 8 6

o

6

"""'"'""''-'"'· como errLOctuas. ao prc>cesso clínica entre os tabagistas no grupo a um eventos mesmo exposto a um outro importante fator de risco de modo significativo, se comparado ao grupo de pacientes com diabete melito, apresentava menor reação imune na

arteriaL Isto pode sugerir que o estado diabético

per se

proporciona um nn.1_-"""1_~"'

vasculatura. Isto vai ao encontro fato de que, embora os fatores de

à a

comum. nestas neste em e aumento o se somente a e estar no ou que o e as

com alguns achados específicos, como um grau de oxidado ou hiperinsulinismo podem um insulto ao endotélio(85). A possibilidade de que estes aspectos possam ser traduzidos em uma reação imunoinflamatória vascular mais proeminente permanece desconhecida no diabete melito.

a

as mostravam

mas eram

momento

entre OS rh-tAr<'•ni-<><> 00llllpaftHTieltltCíS

aumento na em um e com em constante ri!A<Or>T,P.U<>T<11TI a em ~-'""'"''"'"'L'-'" com 2 com 1 aos demcmstra.ralm aumento 2 mas somente em em nosso estudo a

observada em lesões ateroscleróticas em pacientes com diabete melito tipo 2 e no grupo sem diferença significativa entre os grupos. Portanto estes achados corroboram relatos anteriores e podem sugerir que em lesões de pacientes com diabete melito tipo 2 o aumento da fibronectina como observada por Rasmussen e colaboradores só é evidente em lesões precoces, antes da formação da placa, e que em lesões avançadas como em

em tem esta o aumento v'"''"''-"' entre os estas "'"''"'""" o aumento no Á"~""''""' um aumento no v.:~•!:tuv no esl:aao "'"V~UVV. aumentar

a em TNF-a(90). dissociação entre

citoquinas e o número células inflamatórias nas lesões vasculares também foi em estudo prévio em reestenose de artéria coronária( 42).

ver, o uso resumo, este como """'-""''"'"'"' um aumento um aumento como os com ruaJmeme '-''V'"''"'"·'" nos

uma menor menor o uso um se e em com

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