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LAÍS ÍVINA SILVA DE PAULA
A INTERAÇÃO DO FATOR IX DA COAGULAÇÃO NO DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA ATEROSCLERÓTICA
CAMPINAS 2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Ciências Médicas
LAÍS ÍVINA SILVA DE PAULA
A INTERAÇÃO DO FATOR IX DA COAGULAÇÃO NO DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA ATEROSCLERÓTICA
Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
Orientador(a): Profª Drª Joyce Maria Annichino Bizzacchi
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO
ALUNO LAÍS ÍVINA SILVA DE PAULA, E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. JOYCE MARIA ANNICHINO BIZZACCHI
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Assinatura do Orientador
CAMPINAS
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RESUMO
Problemas associados à aterosclerose são a causa mais comum de morte na população ocidental. A aterosclerose é uma doença inflamatória, e existe uma associação da coagulação com processos inflamatórios e complicações da doença arterial.
Estudos populacionais inicialmente demonstraram uma diminuição do risco de infarto agudo do miocárdio em homens hemofílicos, quando comparados com controles pareados por idade e sexo. Contudo estudos subsequentes não confirmaram esses achados, havendo inclusive um estudo que mostrou aumento do risco de doença aterosclerótica e infarto em pacientes hemofílicos. Um dos fatores que deve ter tido importante papel nessa mudança foi o aumento da sobrevida dos pacientes a partir de 1999, com o advento de terapêuticas mais eficazes.
Este estudo teve como objetivo investigar o papel da deficiência grave de fator IX (FIX), no desenvolvimento da doença aterosclerótica, em um modelo de
dislipidemia, utilizando animais da linhagem C57Bl/6 deficientes de
apolipoproteína E (APOE -/-). Comparamos grupos de animais com deficiência de apoE com ou sem deficiência de FIX (hemofílicos B - HB), através da avaliação quantitativa das lesões, na raiz e em toda sua extensão aórtica; e caracterização histológica das lesões na raiz aórtica por imunofluorecência.
Nossos resultados mostraram que os animais com hemofilia B e deficiência de apoE apresentaram o mesmo grau de formação de placa aterosclerótica quando comparados com o grupo controle (APOE -/-), com 8 e 22 semanas de dieta. Portanto, a deficiência do fator IX não protegeu contra a formação de lesões
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ateroscleróticas na raiz e em toda extensão aórtica. O mesmo ocorreu na avaliação qualitativa, quando comparamos a porcentagem total de macrófagos e de células musculares lisas. Independente dos seus elevados níveis de colesterol e triglicerídeos. Contudo, foi evidente a diminuição na quantidade de macrófagos M1, através da produção de IL - 1β, em comparação aos camundongos controles, deficientes apenas de apoE.
Um dado intrigante é que apesar de termos observado uma diminuição de macrófagos M1 nos animais hemofílicos, isso não foi acompanhado por uma diminuição nas lesões ateroscleróticas. Portanto, apesar da hipocoagulabilidade e do perfil de resposta dos macrófagos, nossos resultados sugerem que outros fatores foram mais importantes no desenvolvimento da aterosclerose.
Nossos resultados corroboram os achados mais recentes de que pacientes hemofílicos também são susceptíveis ao desenvolvimento de doença aterosclerótica, incluindo doença coronariana.
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ABSTRACT
Problems associated with atherosclerosis are the most common cause of death in the western population. Atherosclerosis is an inflammatory disease, and there is a coagulation associated with inflammatory processes and complications of arterial disease.
Population studies initially demonstrated a decreased risk of acute myocardial infarction in men hemophiliacs compared with controls matched for age and sex. But subsequent studies have not confirmed these findings, including having a study that showed increased risk of atherosclerotic disease and stroke in hemophilia patients. One of the factors that must have played an important role in this change was the increased survival of patients since 1999, with the advent of more effective therapies.
This study aimed to investigate the role of severe deficiency of factor IX (FIX), in the development of atherosclerosis, dyslipidemia in a model using animals C57BL strain / 6 deficient apolipoprotein E (APOE - / -). Groups of animals compared with apoE-deficient or without FIX deficiency (hemophilia B - HB) by quantitative evaluation of lesions in the root and aortic its entire extension; and
histological characterization of the lesions in the aortic root by
immunofluorescence.
Our results showed that animals with hemophilia B and apoE deficiency showed the same degree of atherosclerotic plaque formation when compared with the control group (APOE - / -), with 8 and 22 weeks of diet. Therefore, factor IX deficiency does not protect against the formation of atherosclerotic lesions in the aortic root and throughout extension. The same occurred in the qualitative
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evaluation, when comparing the total percentage of macrophages and smooth muscle cells. Whatever your high cholesterol and triglycerides. However, it was apparent decrease in the amount of M1 macrophages by IL - 1β compared to control mice, apoE deficient only.
A given intriguing is that although we observed a decrease of M1 macrophages in hemophiliacs animals, this was not accompanied by a decrease in atherosclerotic lesions. Therefore, despite the hypocoagulability and macrophage response profile, our results suggest that other factors are more important in the development of atherosclerosis.
Our results support the latest findings that hemophilia patients are also susceptible to developing atherosclerosis, including coronary heart disease.
xi SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1 . Fisiopatologia da aterosclerose ... 2
1.2 . Fisiologia da coagulação sanguínea ... 5
1.3 . Relação da coagulação e inflamação ... 9
1.4 . Interação entre hipercoagulabilidade e doença arterial oclusiva vascular .... 12
1.5 . Interação entre hipocoagulabilidade e doença arterial oclusiva cardiovascular ... 13
1.6. Aterosclerose e hemofilia ... 16
1.7. Modelo animal para estudo de aterosclerose ... 17
1.7.1. Camundongo deficiente de apoliproteina E ... 18
1.8. Modelo animal de coagulação ... 19
1.8.1. Camundongo com hemofilia B ... 20
1.9. Resultados de estudos de aterosclerose em modelos animais associado à hipo ou hipercoagulabilidade ... 21 2. OBJETIVOS ... 24 2.1. Objetivo Geral ... 24 2.2. Objetivos específicos ... 24 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 25 3.1. Modelos animais ... 25 3.2. Dieta ... 26 3.3. Controles ... 26
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3.4. Genótipo dos animais ... 27
3.4.1. Genotipagem para os alelos do gene do fator IX ... 27
3.4.2. Genotipagem para alelos do gene da apoliproteína E ... 28
3.5. Sacrifício ... 28
3.6. Análise das lesões ateroscleróticas ... 29
3.6.1. Análise quantitativa e padrão de distribuição das lesões aterocleróticas ... 29
a) Aorta inteira ... 29
b) Raiz Aórtica ... 30
3.6.2. Análise qualitativa das lesões ateroscleróticas ... 30
3.7. Perfil lipídico ... 32
3.8. Análise estatística ... 32
4. RESULTADOS ... 33
4.1 A deficiência do FIX não influenciou os níveis de colesterol dos animais deficientes de apoE ... 33
4.2. A deficiência do FIX não influenciou os níveis de triglicerídeos dos animais deficientes de apoE ... 34
4.3 A deficiência do FIX não protegeu contra o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas em toda extensão da aorta, no modelo deficiente de apoE ... 34
4.4. A deficiência do FIX não protegeu contra o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas na raiz aórtica, no modelo deficiente de apoE ... 36
4.5. A deficiência do FIX alterou as características qualitativas da lesão aterosclerótica da raiz aórtica no modelo deficiente de apoE ... 39
5. DISCUSSÃO ... 42
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DEDICATÓRIA
Dedico essa dissertação aos meus pais. Eles me proporcionaram uma vida digna para crescer, acreditando que tudo é possível, desde que sejamos honestos, íntegros de caráter e tendo convicção de que desistir nunca seja uma ação contínua em nossas vidas; que sonhar e concretizar os sonhos só dependerá de nossa vontade.
xvi AGRADECIMENTOS
A Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dando força interior para superar as dificuldades, mostrando o caminho nas horas incertas e me suprindo em todas as minhas necessidades.
Á minha orientadora Dra. Joyce, por acreditar em mim, me mostrando o caminho da ciência, por ser exemplo de profissional e de mulher, a qual sempre fará parte da minha vida.
À Profª Carla Buzato e a Profª Helena Coutinho pela disponibilidade em seu laboratório.
Ao Dr. Erich, a Dra. Fernanda e a Dra Marina, por contribuirem para o meu crescimento profissional, e por serem também exemplos a serem seguidos.
Aos meus amigos de laboratório Kiara, Aline Urban, Stephany, Fernanda Bassora, Bruna Mazzeto, Josi, Maiara, Luis Fernando, Lucas, Ricardo, José Luis, Bruno, Francesca, Letícia, Caroline, Isadora, Cristina, Ucha, Aline Barnabé, Rodolfo, Gleice, Vanessa, Wilfred, Mariana, Silmara, Caroline Laís, Tânia, Priscila, Sandra, Susan.
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Agradeço especialmente a Deva, que participou em algumas etapas. Sua participação foi fundamental para a realização deste trabalho.
À Daniela, do departamento de histologia, pelo apoio e ensinamentos.
Aos amigos do Instituto Biológico, por me receberem tão bem.
À minha família, a qual amo muito, pelo carinho, paciência e incentivo.
Aos amigos que fizeram parte desses momentos sempre me ajudando e incentivando.
Ao Luis, com quem com amor, continuo essa história, obrigada pela paciência, carinho e incentivo.
xviii LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Etapas do desenvolvimento da placa aterosclerótica...05
Figura 2: Representação do modelo da coagulação baseado em superfícies celulares compreendendo as fases de iniciação, amplificação e propagação...08
Figura 3: Representação esquemática de ativação da coagulação e inflamação na ruptura da placa aterosclerótica...10
Figura 4: Figura 4: Aorta de animal deficiente de apoE e hemofílico B (HB/APOE -/-) submetido a 22 semanas de dieta com 1,25% de colesterol, corado com Sudan IV...35
xx LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Colesterol dos animais deficientes de apoE (NL/APOE -/-) e dos hemofílicos B deficientes de apoE (HB/APOE -/-) submetidos a dieta rica em colesterol...33
Tabela 2: Triglicerídeos dos animais deficientes de apoE (NL/APOE -/-) e dos hemofílicos B deficientes de apoE (HB/APOE -/-) submetidos a dieta hiperlípidica...34
xxii LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Quantificação da doença aterosclerótica dos animais sob 8 semanas de dieta com 0,15% de colesterol...35
Gráfico 2: Quantificação da doença aterosclerótica dos animais sob 22 semanas de dieta com 0,15% de colesterol...36
Gráfico 3: Quantificação da doença aterosclerótica na raiz aórtica dos animais que receberam dieta por 8 semanas...37
Gráfico 4: Quantificação da doença aterosclerótica no seio aórtico dos animais que receberam dieta por 22 semanas,...38
Gráfico 5: Porcentagem de células musculares lisas na raiz aórtica dos animais que receberam dieta por 22 semanas...39
Gráfico 6: Porcentagem de células musculares lisas na raiz aórtica dos animais que receberam dieta por 22 semanas...40
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LISTA DE ABREVIATURAS
APOE Apolipoproteina E
AT Antitrombina
CEMIB Centro multidiciplinar de investigacao biológica
CHOP “The Children’s Hospital of Philadelphia” dL Decilitros
DAPI 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride
DCV Doença Cardiovascular
DIC Doença isquêmica do coração
dNTP Desoxi-ribonucleotideos fosfatados
ERNs Espécies reativas de nitrogênio
EROs Espécies reativas de oxigênio
FvW Fator de von Willebrand
FVIII Fator VIII
FIX Fator IX
FT Fator tecidual
FVa Fator V ativado
FVIIa Fator VII ativado
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FXIa Fator XI ativado
FXIIIa Fator XIII ativado
HÁ Hemofilia A
HB Hemofilia B
HDL Lipoproteina de alta densidade
HIV “Human immunodeficiency virus”
IDL Lipoproteina de densidade intermediaria
LDL Lipoproteina de baixa densidade
LDLR Receptor de lipoproteina de baixa densidade
LDLox Lipoproteina de baixa densidade oxidada
mg Miligramas
NL Normal
OCT "Optimum cutting temperature"
OMS Organização Mundial de Saúde
PC Proteina C
PCa Proteina C ativada
PCR "Polymerase chain reaction"; reacao em cadeia da polimerase
PS Proteína S
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TFPI Inibidor da via do fator tecidual
TM Trombomodulina
TTPa Tempo de tromboplastina parcial ativada
VLDL Lipoproteina de muito baixa denisidade
1 1. INTRODUÇÃO
A aterosclerose é uma doença vascular crônica que acomete principalmente as grandes e médias artérias, podendo causar a oclusão desses vasos, consequentemente, levando ao infarto do miocárdio e isquemia vascular cerebral ou periférica (Schawartz et al., 1985).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), em 2012, as doenças isquêmicas foram as principais responsáveis por mortes no mundo, com 7,4 milhões por doença isquêmica do coração (DIC), e 6,7 milhões por acidente vascular cerebral (AVC).
No Brasil a prevalência dessas doenças é semelhante à de outros países, e as doenças cardiovasculares (DCV) foram as principais causas de morte, respondendo por aproximadamente 20% de todas as mortes em indivíduos acima de 30 anos. Segundo o Ministério da Saúde, as DIC foram responsáveis por 95.449 mortes, e as doenças cerebrovasculares por 97.860 mortes. Esses índices estão associados a elevados custos para o Sistema Único de Saúde (SUS), decorrentes de internações hospitalares (Mansur e Favarato, 2012).
Fatores de riscos relacionados ao desenvolvimento e progressão da aterosclerose estão bem estabelecidos. Entre ele podemos citar o tabagismo, a hipertensão arterial, o diabetes, a dislipidemia, a idade (homens acima de 45 anos e mulheres acima de 55 anos), sexo masculino, obesidade, sedentarismo, estresse excessivo, e doença coronariana em parentes 1º grau (homem < 55 anos; mulher < 65 anos) (Jackson , 2000; Hackam e Anand, 2003).
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1.1 . Fisiopatologia da aterosclerose
A aterosclerose é uma doença crônica inflamatória que geralmente se inicia na infância. O endotélio tem emergido como um regulador chave na homeostase vascular, e além da função de barreira, também atua como um transdutor ativo de sinais das alterações circulatórias que levam à modificação do fenótipo da parede do vaso (Vita et al., 2002). A alteração da função endotelial precede o desenvolvimento das alterações morfológicas, e contribui para o desenvolvimento da lesão e das complicações ateroscleróticas finais (Ross, 1993).
A exposição prolongada ou repetida a fatores de risco cardiovasculares pode exaurir o efeito protetor do sistema anti-inflamatório endotelial. Além do efeito disfuncional, com a progressão da doença as células endoteliais podem perder sua integridade, desprendendo-se para a circulação (Woywodt et al., 2002).
Na fase inicial de formação da placa aterosclerótica, ocorre o aumento da permeabilidade e efluxo de macromoléculas plasmáticas para a íntima, e recrutamento de monócitos. Devido a várias reações celulares e moleculares, que promovem a geração de radicais livres, a elevação das partículas de LDL (low density lipoprotein) e de LDL oxidada (LDLox), inicia-se a formação do ateroma (Kovanem e Pentikainen, 2003; Siqueira et al., 2006).
Uma pequena quantidade de LDL é oxidada ainda na circulação, e este processo continua após a penetração na camada íntima, em ambiente pró-oxidante (Kovanem e Pentikainen, 2003). Os responsáveis pela oxidação das LDL são os radicais livres, que podem se apresentar como espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs) (Singh e Jialal, 2006).
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As moléculas de LDL difundem-se através das células endoteliais e aderem-se à parede do vaso por interações entre a apolipoproteína B, presente na sua estrutura, e os proteoglicanos da matriz subendotelial (Lusis, 2000)
Os monócitos são recrutados para a lesão e transformados em macrófagos, contribuindo para a oxidação da LDL na camada íntima média, transformando-se em LDLox. Posteriormente a LDLox tem a sua porção proteica modificada, o que impede o seu reconhecimento pelo receptor de LDL. Essas moléculas modificadas serão apenas reconhecíveis pelos receptores scavengers (removedores), presentes nos macrófagos e células musculares lisas (Brown e Goldstein, 1990). Dentro dos macrófagos, a LDLox é degradada, e o colesterol livre é esterificado, conferindo às células o aspecto espumoso. O resultado é o grande acúmulo de colesterol e a formação de células espumosas, levando à primeira lesão da aterosclerose: a estria gordurosa (Steinberg, 1997).
A seguir as células musculares lisas começam a migrar da camada média da parede arterial para a íntima, proliferam-se e secretam colágeno, dando origem à lesão intermediária. Nesta fase, o espessamento da íntima provoca uma dilatação da artéria, ocorrendo o estreitamento do lúmen. As células do sistema imune local liberam enzimas, citocinas e fatores de crescimento que podem induzir a morte dos macrófagos. Ciclos repetidos de acúmulo e ativação de células mononucleares, migração e proliferação das células musculares lisas com produção de colágeno, levam ao aumento progressivo da lesão, até que se forme uma capa fibrosa sobre o núcleo lipídico, associada a tecido necrótico, conhecida como lesão avançada (Ross, 1999).
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As lesões avançadas estáveis são resistentes à ruptura e se caracterizam por células musculares lisas, de matriz densa de colágeno, com baixa quantidade de células inflamatórias e de lipídios no centro necrótico. Por outro lado, as regiões onde as lesões apresentam volumoso centro necrótico e um grande infiltrado de células espumosas, capa fibrosa frágil e fina, com pouca quantidade de colágeno, são mais propensas à ruptura (Lee e Libby, 1997).
A ruptura da placa aterosclerótica leva à exposição de um material trombogênico, e formação do trombo sobrejacente, processo denominado aterotrombose, que é um dos principais determinantes das manifestações clínicas da aterosclerose (Terra e Ehlers, 1998). A figura 1 apresenta esquematicamente as etapas de desenvolvimento da aterosclerose.
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Figura 1. Etapas do desenvolvimento da placa aterosclerótica. a) Disfunção endotelial; b) Lesão inicial; c) Lesão avançada; d) Placa instável (Adaptado de Ross,1999).
1.2 . Fisiologia da coagulação sanguínea
O controle de geração de trombina é o ponto principal da hemostasia, pois a trombina tem um papel chave na ativação das plaquetas e do fibrinogênio, levando à formação do coágulo sanguíneo. As fases de iniciação, amplificação, propagação e finalização da coagulação sanguínea compõem o processo que garante a circulação do sangue de forma fluida, apenas no leito vascular (Vine, 2009).
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A fase de iniciação ocorre quando as células que expressam o fator tecidual (FT) em sua superfície são expostas aos componentes do sangue no sítio da lesão (Handin, 2003; Vine, 2009). O FT próximo ao FVII, leva à sua ativação formando o complexo FVIIa/FT, responsável pela ativação de pequenas quantidades de FIX e FX (Monroe, 2009; Pérez-Gómez et al.; 2007). O FXa associado com o seu cofator, FVa, forma um complexo denominado protrombinase, na superfície da célula que expressa o FT. O FV pode ser ativado pelo FXa ou por proteases não coagulantes. O complexo protrombinase transforma pequenas quantidades de protrombina (Fator II) em trombina, insuficiente para completar o processo de formação de coágulo de fibrina. A fase de amplificação da coagulação apenas será deflagrada quando houver um dano vascular, permitindo que as plaquetas e o FVIII (ligado ao fator de vom Willebrand) entrem em contato com o tecido extravascular, onde vão se ligar às células que expressam o FT (Hoffman, 2003; Riddel, 2007). Pequenas quantidades de trombina produzidas pelas células que expressam o FT podem interagir com as plaquetas e o complexo FVIII/FvW. Esse processo hemostático culmina com a formação de fibrina estável, que consolida o tampão plaquetário inicial. Esse processo é denominado de hemostasia secundária (Handin, 2013; Monroe, 2009; Boucher, 2009).
A fase de propagação é caracterizada pelo grande número de plaquetas atraídas para o sítio da lesão, e pela produção dos complexos tenase e protrombinase na superfície das plaquetas ativadas (Vine, 2009). O complexo tenase é formado pelo FIXa e FVIIIa na superfície das plaquetas. Esse complexo gera quantidades adicionais de FXa. O FIXa também pode ser produzido pelo
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FXIa ligado às plaquetas (Hoffman, 2003). Finalmente, o FXa associa-se ao FVa ligado às plaquetas durante a fase de amplificação, resultando na formação do complexo protrombinase, o qual converte grandes quantidades de protrombina em trombina. Esta é responsável pela clivagem do fibrinogênio em monômeros de fibrina, que se polimerizam para consolidar o tampão plaquetário. A formação do coágulo de fibrina apenas sobre a área lesada evita a oclusão trombótica do vaso. Os fatores VIII e IX são de extrema importância para que quantidades ideais de trombina sejam geradas, para a formação de coágulos estáveis. O complexo FIXa/FVIIIa liga-se à superfície plaquetária, e é essencial para a sua ativação e geração de trombina. Essa importância é ilustrada pelo fenótipo característico das hemofilias A e B. As deficiências isoladas dos fatores VIII (hemofilia A) ou IX (hemofilia B) levam à redução da produção de trombina na ordem de 50.000 a 100.000 vezes do normal. Esses indivíduos apresentam sangramentos espontâneos em cavidades, tecidos moles e intra-articulares, quando a atividade residual dos fatores VIII ou IX é inferior a 1% do plasma normal (Batge et al.,1992).
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Figura 2. Representação do modelo da coagulação baseado em superfícies celulares compreendendo as fases de iniciação, amplificação e propagação. Fator tecidual (FT), ativado (a) (Adaptado de Vine, 2009).
Para controlar o processo de ativação da coagulação, intervêm quatro anticoagulantes naturais: o inibidor da via do fator tecidual (TFPI), a proteína C (PC), a proteína S (PS), e a antitrombina (AT). O TFPI é secretado pelo endotélio e forma um complexo quaternário FT/FVIIa/FXa/TFPI, inativando os fatores
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ativados. As proteínas C e S são anticoagulantes naturais dependentes da vitamina K, que compõem a via anticoagulante da proteína C, e responsáveis pela inativação dos cofatores procoagulantes FVa e FVIIIa (Valen et al., 1996). A proteína C (PC) é ativada pela trombina ligada à proteína transmembrana trombomodulina (TM), presente na superfície das células endoteliais intactas. A proteína S (PS) é um cofator da PC, que aumenta sua capacidade de inibição. No plasma humano, cerca de 30% da PS circula como proteína livre, que funciona como cofator da PC ativada (Dahlbäck, 1991; Gemmati et al., 1997).
1.3 . Relação da coagulação e inflamação
A inflamação e coagulação têm um papel central no inicio da doença vascular. Evidências crescentes apontam para extensa relação entre estes dois sistemas, e mostram que não apenas a inflamação ativa à coagulação, mas que a coagulação também pode modular substancialmente a atividade inflamatória, como podemos observar na figura 3.
O inicio da geração de trombina induzida pela inflamação, ocorre através da ativação do FT. O FT é uma proteína transmembrana de 45 kDa expressa em um grande número de células do organismo (Levi et al., 1993; Pixley et al., 1992). A maior parte do FT não esta em contato direto com o sangue, e este ocorre quando há ruptura da integridade vascular e as células presentes na circulação começam a expressá-lo. O papel do FT pode ser diferente em várias situações inflamatórias. Em placas ateroscleróticas, os macrófagos expressam grande quantidade de FT em sua superfície, e quando ocorre ruptura dessa placa há uma extensa exposição do FT, culminando com o processo de coagulação (Libby , 2002)
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As células musculares lisas tem um importante papel, pois produzem citocinas e fatores de crescimento que contribuem para o aumento da expressão do FT na placa aterosclerótica (Taubman et al, 1993), particularmente na presença da interleucina (IL)-6 (Moons et al, 2002).
Figura 3. Representação esquemática de ativação da coagulação e inflamação na ruptura da placa aterosclerótica (Adaptado de Levi et al, 2014).
Estudos in vivo mostraram que grandes quantidades de citocinas são capazes de induzir a expressão do FT pelas células mononucleares, mas a IL-6 é a de maior relevância. A inibição de IL-6 por anticorpos monoclonais bloqueou completamente a geração de trombina no tecido, enquanto que a inibição específica de outras citocinas pró-inflamatórias mostrou um efeito menor, ou nenhum efeito (Levi et a.l, 1997). Por outro lado, o aumento do FVIIa em seres
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humanos saudáveis provocou um aumento de 3 a 4 vezes nos níveis plasmáticos de IL-6 e IL-8 (de Jonge et al, 2003).
As plaquetas quando ativadas desempenham um papel importante na inflamação, em particular, na inflamação crônica, a qual está associada com a aterosclerose (Wagne et al., 2003). As plaquetas aderem-se à matriz subendotelial, levando ao rolamento de leucócitos através de moléculas de adesão, como a P-selectina; e na ausência dessa adesão há menor formação de placa aterosclerótica (Burger et al., 2003). Além disso, as plaquetas ativadas podem liberar várias citocinas pró-inflamatórias (tais como o CD40 e IL-1β), e quimiocinas (tais como RANTES e fator plaquetário 4 - FP4), o que pode resultar em um aumento da ativação dos monócitos e, seu recrutamento para placa aterosclerótica (Huo et al., 2003).
A PCa além de atuar como anticoagulante, também apresenta efeitos celulares, mediados em parte pela ligação a receptores ativados por proteases tipo 1 (PAR-1). Por meio desta via a PCa atua promovendo efeitos citoprotetores, ações antiinflamatórias, atividade anti-apoptótica, controle de expressão gênica e proteção da função endotelial de barreira (Mosnier et al, 2007).
Muito tem sido discutido sobre as funções anti-inflamatórias da PCa em diversas situações clínicas, inclusive na doença aterosclerótica, onde esse efeito poderia levar a uma melhora da doença vascular. Um estudo realizado em 2006, por Zorio e colaboradores mostrou que jovens sobreviventes de infarto agudo do miocárdio apresentavam níveis reduzidos de PCa, com uma correlação inversa entre a extensão e gravidade das lesão aterosclerótica coronariana e os níveis dessa proteína.
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Em outro trabalho, os autores associaram a diminuição da atividade de PCa à piora da aterosclerose carotídea, em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (Matsumoto et al., 2007).
Apesar do conhecimento sobre a inter-relação entre a inflamação e coagulação, ainda há muito a se avançar na compreensão desses mecanismos e a formação da placa aterosclerótica.
1.4 . Interação entre hipercoagulabilidade e doença arterial oclusiva vascular
Um estado protrombótico pode contribuir para eventos oclusivos arteriais. O fibrinogênio é um componente da coagulação determinante na viscosidade sanguínea, sendo um dos marcadores de risco mais importantes para a doença arterial. Estudos com indivíduos saudáveis mostraram uma associação direta entre os níveis de fibrinogênio e o risco de eventos coronarianos, de mortalidade cardiovascular e total. Em idosos o fibrinogênio é considerado um fator de risco para mortalidade cardiovascular e geral, AVC isquêmico e trombose venosa profunda (Deguchi et al., 2000; Van et al., 2003; Levi et al., 2004; Luc et al., 2003).
Níveis aumentados de fator de Von Willebrand (vWF) e FVIII também foram associados a trombose arterial. O vWF é essencial para a adesão e agregação plaquetária e atua como carreador do FVIII, e portanto, contribui para a formação do coágulo de fibrina, tendo um papel na oclusão arterial com estenose (Kamphuisen et al., 2001; Spiel et al., 2008).
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Os dímeros-D, fragmentos oriundos da degradação da fibrina também são marcadores de eventos arteriais agudos, relacionados tanto com a gravidade, como ao risco de recorrência das complicações oclusivas (Lee et al., 1995; Danesh et al., 2001).
De um modo geral, os estudos relacionam a hipercoagulabilidade ao evento isquêmico final, ou seja, ao infarto agudo do miocárdio e à isquemia cerebral ou periférica, mas a literatura é escassa em relação à investigação da relação entre a hipercoagulabilidade e a gravidade das lesões ateroscleróticas.
1.5 . Interação entre hipocoagulabilidade e doença arterial oclusiva cardiovascular
Se por um lado a hipercoagulabilidade tem sido associada ao risco de eventos oclusivos arteriais, a hipocoagulabilidade também pode ser investigada como um fator protetor para esses desfechos clínicos. Existem duas situações associadas à hipocoagulabilidade que devem ser consideradas no quadro clínico de trombose arterial: o impacto positivo da utilização de anticoagulantes sobre a mortalidade aguda e tardia do infarto do miocárdio, e a baixa incidência de obstrução arterial em pacientes com deficiências hereditárias dos fatores de coagulação. Essa proteção parece estar relacionada à diminuição na geração de trombina e na formação do trombo.
A hemofilia A (hemofilia clássica) e a hemofilia B (doença de Christmas) são coagulopatias hemorrágicas hereditárias, devido à deficiência quantitativa e/ou qualitativa dos fatores VIII e IX, respectivamente. As hemofilias são herdadas como condições recessivas ligadas ao cromossomo X, ocorrendo praticamente
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apenas em indivíduos do gênero masculino. Correspondendo a 80% dos casos, a hemofilia A tem prevalência de 1/5.000 nascimentos do sexo masculino, enquanto a prevalência da hemofilia B é estimada em 1/30.000 nascimentos do sexo masculino (Batge et al.,1992).
Em 1989 foi publicado um estudo sobre a mortalidade e causas de morte em pacientes hemofílicos na Holanda, evidenciando que a mortalidade por doença isquêmica coronariana foi menor que na população geral (Rosendaal, 1989). Este achado foi confirmado através de um estudo comparativo de fatores de risco para doença coronariana isquêmica entre hemofílicos e a população geral (Rosendaal, 1990). Um estudo realizado no Reino Unido demonstrou que a mortalidade por doença coronariana de pacientes hemofílicos não infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) estava reduzida (38%), em comparação com a população geral (62%) (Darby et al., 2007). É interessante que este estudo também mostrou que a proteção encontrada nas mulheres portadoras de hemofilia foi semelhante a dos pacientes hemofílicos (Srámek et al., 2003).
Vale ressaltar que a redução da doença coronariana nos pacientes hemofílicos, demonstrada no estudo de Rosendaal (1990), não foi atribuída a diferenças nos fatores de risco, como dislipidemia ou hipertensão arterial, sugerindo um efeito protetor relacionado à própria hemofilia.
Recentemente uma revisão que incluiu 15 estudos (incluindo os estudos citados anteriormente) com 19 242 pacientes, sendo 14 754 hemofílicos A, 3408 hemofílicos B, 965 portadores de hemofilia A e B, e 115 com doença de von Willebrand mostrou que apenas em 6 estudos houve redução significativa na mortalidade por doença cardiovascular em relação à população geral. Por outro
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lado, um dos estudos mostrou aumento de 3 vezes na mortalidade cardiovascular, mas sem uma causa aparente para essa discrepância (Biere-Rafi et, al., 2010).
Um estudo recente de análise de registro que incluiu 1431 pacientes com hemofilia A e B, e 7150 controles, mostrou diminuição na mortalidade cardiovascular, sem diferença na mortalidade por doença cerebrovascular. A % de altas hospitalares relacionadas à doença cardiovascular não fatal foi 50% menor em pacientes hemofílicos, em comparação à população geral. Além disso, a incidência de doença cardiovascular foi maior nos hemofílicos leves, em comparação aos moderados e graves (L¨ovdahl et al., 2013).
Um estudo publicado recentemente avaliou a prevalência de doença cardiovascular em 185 pacientes com hemofilia (102 HA e 83 HB), acompanhados por um período de 5 anos, e idade superior a 35 anos, em comparação à população geral nos Estados Unidos. A prevalência de doença cardiovascular foi de 19.5%, com uma mortalidade de 5.4%, o que significa quase o dobro da população geral. Não se observou diferença nos fatores de risco para doença arterial (Sharathkumar et al., 2011).
Um dado importante a ser considerado é que os estudos mais antigos foram retrospectivos, e não incluíam pacientes com idade superior a 55 anos, faixa etária em que aumenta a prevalência das doenças cardiovasculares coronarianas. Isto é explicado pela baixa sobrevida dos pacientes hemofílicos, antes da introdução das terapias com fatores recombinantes ou com inativação viral. Também deve ser considerado o número relativamente baixo de pacientes incluídos, a variabilidade nos fatores de risco para doença cardiovascular, a presença de doenças infecciosas e os regimes de tratamento de reposição dos fatores de coagulação.
16 1.6. Aterosclerose e hemofilia
A trombina tem um papel relevante em conjunção com as diversas alterações presentes no processo aterosclerótico, incluindo a disfunção endotelial, estresse oxidativo, apoptose, inflamação, ativação de plaquetas e leucócitos, proliferação de células musculares lisas e imunidade(Borissoff et al., 2011; Coughlin, 2000).
Portanto uma das hipóteses é que a hemofilia, que se caracteriza pela menor formação de trombina, estaria associada à redução da aterosclerose. A investigação de aterosclerose subclinica, através da medida da espessura intimal das artérias carótida e femural em pacientes com hemofilia e doença de von Willebrand não demonstrou diferença em comparação a controles pareados por idade (Biere-Rafi et al., 2010; Bilora et al., 1999; Sartori, 2008).
Um estudo multicêntrico que incluiu 51 homens hemofílicos A obesos, 47 hemofílicos com peso normal e controles pareados por idade e peso, com idade média de 50 anos e sem doença vascular coronariana prévia, mostraram uma associação entre o aumento da íntima carotídea e a presença de obesidade em controles e pacientes, mas sem relação com a coagulopatia. É importante citar que a hemofilia não impediu a formação de placa aterosclerótica na artéria carótida, presente em 33% dos pacientes (Biere-Rafi et al., 2010).
Um estudo que avaliou a calcificação da artéria coronária por tomografia computadorizada em 42 homens com hemofilia A grave ou moderada sem antecedente de doença cardiovascular, e 613 homens saudáveis com idade média de 66 anos, não evidenciou diferença entre os grupos (Tuinenburg et al., 2012).
Portanto, esses estudos clínicos sugerem que a hemofilia não protege os indivíduos do desenvolvimento de aterosclerose. Assim, há uma discrepância
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entre os achados de desenvolvimento de aterosclerose e de mortalidade por doença cardiovascular em pacientes hemofílicos, que talvez possa estar relacionado à faixa etária dos pacientes incluídos nos estudos de mortalidade. Nesse sentido, estudos empregando modelos animais hemofílicos e com tendência ao desenvolvimento de aterosclerose podem auxiliar no esclarecimento dessas questões.
1.7. Modelo animal para estudo de aterosclerose
Alguns modelos de animais são utilizados no estudo da doença aterosclerótica, como por exemplo, primatas, suínos, coelhos, hamsters e pombos. O modelo murino é o mais usado para o estudo fisiopatogênico da aterosclerose, pois tem alta reprodutividade com gestação de apenas 21 dias, possibilitando a realização de estudos que precisam de um grande número de animais; e existem modelos animais desenvolvidos pela técnica de knockout gênico que permitem o desenvolvimento de uma deficiência específica e grave da proteína que se pretende investigar (Veniant et al., 2001).
Foi introduzida, por volta dos anos 80, a utilização de animais geneticamente modificados como modelos para reprodução da doença aterosclerótica, na tentativa de se compreender os mecanismos de iniciação e progressão (Paigen et al., 1987; Armstrong et al., 1990; Breslow, 1993). Esses animais mostraram-se uteis não apenas para estudos das influências ambientais, de hormônios ou drogas, como também permitiram o estudo de eventos moleculares, assim como,
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de fatores relacionados à hemostasia, e o estudo in vivo das interações entre os diferentes mecanismos (celulares e plasmáticos) envolvidos na aterogênese.
1.7.1. Camundongo deficiente de apoliproteina E
Produzida principalmente no fígado e no cérebro, a apolipoproteína E (apoE) é um constituinte da superfície de lipoproteínas, principalmente VLDL, HDL e quilomícrons. (Davignon et al., 1999). Ela também pode ser sintetizada por monócitos e macrófagos, apresentando efeitos locais na homeostase do colesterol e nas reações inflamatórias que ocorrem nas artérias ateroscleróticas. (Meir e Leitersdorf, 2004). Além disso, a apoE inibe a agregação plaquetária, exerce efeitos antiproliferativos, contribuindo para o efluxo de colesterol das células nas lesões ateroscleróticas, e possui propriedades antioxidantes (Davignon et al., 1999).
O camundongo knockout para a apoE foi desenvolvido para representar um modelo de estudo da aterosclerose. Dois laboratórios produziram em 1992 um modelo de hipercolesterolemia. O gene que codifica a apoE foi inativado nas células tronco embrionárias de um camundongo saudável, e em seguida essas células foram inseridas em blastômeros de camundongos C57 (Plump et al., 1992; Piedrahita et al., 1992).
A função principal da apoE é retirar as lipoproteínas VLDL e IDL do plasma, através do receptor de LDL. Nos camundongos que apresentam esta deficiência ocorre o desenvolvimento prematuro e espontâneo de graves lesões ateroscleróticas (Plump et al., 1992). As lesões que podem ser encontradas nesse
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modelo animal para experimento mostram um caráter parecido com os seres humanos, não sendo observado rupturas de placas com consequente formação de trombo, pois esse animal normalmente apresenta lesões ateroscleróticas estáveis. Com o uso de dieta comercial, com cerca de 10 semanas de idade observa-se a presença de células espumosas, lesões intermediárias contendo células espumosas, e células musculares lisas; e placas fibrosas aparecem nos animais com 20 semanas de idade. O uso de dieta hiperlipídica acelera o processo aterosclerótico nesses camundongos (Meir et al., 2004).
Esses animais apresentam desenvolvimento espontâneo de aterosclerose e níveis extremamente elevados de colesterol, encontrados na hiperlipidemia tipo III (Nakashima et al., 1994). Assim, os animais deficientes de apoE (APOE -/-) tem sido empregados em estudos experimentais de aterosclerose, pois propiciam um rápido desenvolvimento da doença.
1.8. Modelo animal de coagulação
Apenas os cachorros apresentam mutações espontâneas para hemofilia. Para uma investigação in vivo, foram desenvolvidos camundongos deficientes de FVIII e FIX por knockout gênico. Esses animais mimetizam a doença hemorrágica em humanos, apresentam herança ligada ao cromossomo X, e se reproduzem normalmente. Há uma grande mortalidade entre os fetos do sexo masculino em relação ao feminino, mas nenhuma anormalidade foi observada. O desenvolvimento de sangramentos intracavitários, ou sangramento após procedimentos cirúrgicos são exemplos da semelhança com a doença em
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humanos. Existem reagentes laboratoriais que comprovam o genótipo. Apesar de apresentarem sangramentos espontâneos intrarticulares ou subcutâneos, a sobrevida é longa (~18 a 24 meses), o suficiente para a realização de experimentos. Esses animais têm sido utilizados em estudos experimentais para hemofilia, especialmente em terapia gênica.
1.8.1. Camundongo com hemofilia B
Para a hemofilia B, três modelos de grandes deleções do gene do FIX foram gerados, por laboratórios diferentes e com semelhanças quanto ao fenótipo e características reprodutivas (Lin et al., 1997; Huig-Feng et al., 1997; Kung et al., 1998)
Em 1997, utilizando-se o método plug-socket de manipulação de genes, Lin e colaboradores desenvolveram um modelo murino knockout deficiente de FIX, substituindo o promotor do exon 3 do gene do fator IX pelo neoHPRT, que é um gene funcional, mais o mini gene parcialmente deletado da hipoxantina fosforibosil transferase. Em um estudo realizado posteriormente, Kung e colaboradores (1998) demonstraram sucesso na utilização de camundongos da linhagem C57Bl/6 deficientes em FIX em seus experimentos, com correção do tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPa) e dos sintomas hemorrágicos, utilizando FIX purificado de plasma humano. Esses animais knockout para FIX não mostraram atividade coagulante residual do fator deficiente, demonstrado pelo TTPa.
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1.9. Resultados de estudos de aterosclerose em modelos animais associado à hipo ou hipercoagulabilidade
Estudos mostraram que a deficiência da apoE (APOE -/-) acelera a aterosclerose em camundongos, com menor desenvolvimento de lesões ateroscleróticas na fase inicial, quando associado à deficiência do FVIII (Eitzman et al., 2005; Khallou-Laschet et al., 2005). Por outro lado, em camundongos com mutação no receptor de lipoproteína de baixa densidade, outro modelo que acelera o desenvolvimento da aterosclerose, o efeito protetor da deficiência do FVIII não foi observado (Castellino et al., 2006).
O nosso grupo de pesquisa publicou recentemente um estudo em que o impacto da deficiência grave de FVIII foi avaliada em relação à progressão da aterosclerose por um período prolongado, de até 37 semanas, em camundongos com deficiência no receptor de LDL (LDLR -/-) ou da apoE (APOE -/-). Os resultados mostraram um efeito protetor da deficiência de FVIII sobre a aterosclerose, em camundongos apoE (APOE -/-), independente dos níveis séricos de colesterol. Em contrapartida, não se observou diferença na progressão da aterosclerose nos animais (LDLR -/-), fato que deve estar relacionado aos níveis lipídicos séricos (Fabri et al., 2011).
Embora os achados divergentes sobre o efeito protetor da deficiência de FVIII no desenvolvimento de aterosclerose em camundongos, o fenótipo oposto, da hipercoagulabilidade, parece estimular o desenvolvimento da aterosclerose, tanto por alteração quantitativa como qualitativa da placa aterosclerótica. Isso foi demonstrado no estudo com camundongos jovens com deficiência de apoE
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(APOE -/-), e com uma mutação no gene da trombomodulina, que altera a via de ativação da proteína C (Van de Wouwer et al., 2004).
Em outro estudo realizado com camundongos mais velhos do mesmo background genético, a aterosclerose avançada esteve claramente associada à instabilidade da placa (Zernecke e Weber, 2010). Ainda não existe dados na literatura sobre o efeito da hipocoagulabilidade presente em animais com deficiência do FIX no desenvolvimento e evolução da placa aterosclerótica.
Outro trabalho publicado em 2001, baseou-se no cruzamento de animais com genótipo para FVW (-/-), que é um modelo para sangramento, com animais deficientes de apoE (APOE -/-). Com uma dieta normal esses animais mostraram diminuição das lesões fibrogordurosas e das lesões em pontos de bifurcação (Methia, 2001). Outro estudo realizado com animais com hipercoagulabilidade, deficientes em plasminogênio, e deficientes de apoE (APOE -/-), mostrou em contrapartida, a aceleração das lesões na íntima (Xiao, 1998).
Portanto, diversos fatores podem influenciar o desenvolvimento da doença aterosclerótica nesses modelos animais, incluindo o tipo de alteração genética e de resposta nas diferentes situações.
Diante de tudo que foi exposto, como a discrepância na incidência de doença cardiovascular isquêmica e mortalidade em pacientes hemofílicos; a análise subclínica de aterosclerose por ultrassom com doppler de carótidas e angiotomografia coronariana que não evidenciou um efeito protetor da hipocoagulabilidade sobre o desenvolvimento da aterosclerose; e diferentes resultados observados em modelos animais com hemofilia A e aterosclerose, ainda há pontos a serem esclarecidos que podem contribuir para o melhor
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entendimento da fisiopatologia dessas doenças. Assim, neste estudo pretendemos avançar no conhecimento, utilizando modelos animais hemofílicos B associado ao desenvolvimento da aterosclerose pela deficiência da apoE (APOE -/-).
24 2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Este trabalho teve como objetivo determinar a participação do fator IX da coagulação na iniciação e progressão da doença aterosclerótica, através do uso de modelo animais deficiente de apoE e do FIX da coagulação.
2.2. Objetivos específicos
a) Avaliar o metabolismo do colesterol e triglicerídeos, dos modelos animais de doença arterial, quando submetidos à dieta hiperlipídica.
b) Avaliar o impacto da deficiência do fator IX na evolução da doença aterosclerótica de animais deficientes de apoE, por quantificação das lesões. c) Caracterizar histologicamente lesões ateroscleróticas por imunofluorecência, incluindo a caracterização de macrófagos, através da marcação de interleucina 1β.
25 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Modelos animais
Nossas matrizes dos modelos de aterosclerose foram doadas pelo Prof. Dr. Éder Quintão, do Laboratório de Lípides do Instituto de Biologia da Universidade de São Paulo (deficientes de apoE (APOE -/-). Esses animais knockout são disponíveis comercialmente e as colônias destes laboratórios são provenientes do Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME; EUA).
Os animais com hipocoagulabilidade são camundongos knockout da mesma linhagem C57Bl/6, caracterizados anteriormente como modelos para hemofilia B. Os animais com deficiência de FIX foram doados pelo The Children’s Hospital of Philadelphia (CHOP), seguindo as normas e regras do comitê de cuidados animais da instituição. Todos os animais utilizados provêm da quinta geração.
Os cruzamentos entre os diversos modelos foram realizados de acordo com as técnicas e normas do biotério central da UNICAMP (CEMIB), com aprovação da comissão de ética na experimentação animal (CEEA) do Instituto de Biologia da Unicamp, sob número 1393-1.
Foram obtidos através de cruzamento entre os animais dos diferentes genótipos iniciais, os seguintes grupos:
• 21 animais controles deficientes de apolipoproteína E (NL/ APOE -/-) • 21 animais hemofílicos B, deficientes de apolipoproteína E(HB/APOE -/-)
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Os animais foram mantidos em gaiolas, dentro de estantes ventiladas (Alesco, Monte Mor, SP)com troca de ar constante, controle de temperatura ambiente (entre 22-24°C), e de luz (ciclos de 12 horas claro-escuro). O procedimento realizado com os animais foi aprovado pelo CEUA/Unicamp, sob número 2713-1.
3.2. Dieta
Os animais foram mantidos em dieta normal até a idade de 8 semanas, a partir de quando os animais deficientes em apoE foram submetidos a dieta do tipo Western (com 21% de gordura e 0,15% de colesterol). As dietas foram elaboradas e fornecidas pela empresa PRAGSOLUÇÕES Biociência, com base na AIN-93 (Reeves et al, 1993)
3.3. Controles
Foram utilizados como controles, animais pareados de acordo com sexo e idade, deficientes de apoE, mantendo a mesma linhagem, dieta e condições de alojamento.
A linhagem dos animais (C57Bl/6) foi confirmada em todos os grupos estudados por avaliação de 150 polimorfismos característicos, de acordo com o Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EUA).
27 3.4. Genótipo dos animais
De todos os animais gerados foram coletadas amostras de sangue por coleta caudal, extraído DNA genômico pelo kit (GE Healthcare), e realizada a genotipagem por técnica de PCR (polymerase chain reaction).
3.4.1. Genotipagem para os alelos do gene do fator IX
Em nosso laboratório a reação foi padronizada de acordo com os reagentes habitualmente usados (para cada reação: água: 12 l, Buffer: 1,1l, MgCl2: 0,55 l, dNTP 10mM 0,25 l). A identificação do gene do FIX murino normal ou mutante é realizada a partir de 1,5 l do DNA genômico, utilizando-se os primers:
• WTMFIX-R: 5’-AACAgggATAgTAAgATTgTTgTTCC-3’ gene do fator IX normal (sense)
• WTMFIX-F: 5’- AgCTATggAATTACATgAAC-3’ gene do fator IX normal (antisense)
• MF9-F: 5’-ATATACAgTTACCAAATTCAgA-3’ gene do fator IX mutante (sense)
• MF-9-R: 5’-CAgTAATgTTgACTgTATTTTCCAA-3’ gene do fator IX mutante (antisense)
O gene do FIX mutante contém uma sequencia adicional (identificado pelo uso dos primers MF9-F e MF9-R), resultando em um fragmento de 1.4 kb. O produto do PCR correspondente à cópia normal do FIX é identificado por um fragmento de 1kb, utilizando os primers WTMFIX-F e WTMFIX-R.
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3.4.2. Genotipagem para alelos do gene da apoliproteína E
A PCR foi realizada conforme protocolo do Jackson Laboratory (www.jax.org), utilizando-se 2 μl de DNA genômico por reação com a utilização simultânea dos primers: oIMR0180 (5’-gCCTAgCCgAgggAgAgCCg-3’), oIMR0181 (5’- TgTgACTTgggAgCTCTgCAgC-3’) e oIMR0182 (5’-gCCgCCCCgATgCATCT-3’). O produto do PCR para o alelo normal apresenta um fragmento de 125 pb, e o alelo mutante um fragmento de 245 pb.
3.5. Sacrifício
Foram programados sacrifícios dos animais após 8 (10 animais hemofílicos B e 8 animais controles) e 22 semanas de dieta (11 animais hemofílicos e 11 animais controles, respectivamente). Os sacrifícios obedeceram a padrão de horário, e no momento do sacrifício foi coletado sangue caudal, sob anestesia inalatória e após aprofundamento anestésico, confirmado o óbito com deslocamento cervical.
Após o sacrifício, o animal foi aberto longitudinalmente e perfundido lentamente por punção em ventrículo esquerdo com 10 ml de PBS gelado. Então foi realizada a dissecção e retirada da aorta, que foi mantida em formalina tamponada 10% para posterior análise. O coração foi retirado e embebido em meio OCT (Optimum cutting temperature- Sakura Finetek, Torrance, CA, EUA),
congelado em gelo seco, e armazenado em freezer
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no criostato, localizado no Departamento de Histologia, do Instituto de Biologia/ Unicamp, concedido pela Profº Carla B. Collares Buzato.
3.6. Análise das lesões ateroscleróticas
Foram realizadas três análises distintas das lesões ateroscleróticas,
consistindo da determinação quantitativa, caracterização qualitativa e
representativa das lesões observadas.
3.6.1. Análise quantitativa e padrão de distribuição das lesões aterocleróticas
Para avaliação quantitativa da aterosclerose, utilizamos dois sítios distintos: as lesões na raiz aórtica, e da aorta inteira.
a) Aorta inteira
No momento do sacrifício, após a perfusão com PBS gelado, a aorta foi retirada da saída do coração até a bifurcação das ilíacas, e mantida em formalina a 10% para posterior coloração com Sudan IV. Após a coloração foi aberta longitudinalmente e presa em superfície de cera preta, coberta com água. As imagens foram obtidas e capturadas com o auxilio de uma lupa (Leica M205 FA), disponibilizada pelo Departamento de Histologia, do Instituto de Biologia/ Unicamp, concedido pelo Prof. Dr. Henrique Marques Souza.
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As imagens foram analisadas em computador, com auxilio do programa Image J ®, e os resultados foram obtidos contabilizando a porcentagem das áreas coradas sobre a área total da aorta.
b) Raiz Aórtica
Os corações congelados em meio tissue-tek OCT foram cortados em criostato, com cortes de 8 µm de espessura, e a região inicial da aorta foi utilizada para as análises histológicas do tecido cardíaco. Todos os cortes histológicos obtidos foram examinados com o objetivo de localizar as estruturas anatômicas referenciais da válvula aórtica e da raiz da aorta. De acordo com a presença dessas estruturas referenciais, o corte histológico no nível anatômico da válvula aórtica foi selecionado para as medidas. Para cada animal foram analisados 6 cortes, distantes 64 µm entre si, somando uma distância total de 448 µm entre eles. As lâminas posteriormente foram coradas com Oil Red-O e hematoxilina, e as imagens capturadas por uma câmera. As imagens captadas foram avaliadas com auxilio do programa Image J,e contabilizadas em mm².
3.6.2. Análise qualitativa das lesões ateroscleróticas
Realizamos ainda com o material obtido da raiz aórtica, reações de imunofluorescência, utilizando os seguintes anticorpos:
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CF 4/80: Marcador de macrófagos, para identificação do processo
inflamatório inicial, quando há migração destas células para formação das lesões iniciais (fatty streak).
Anti α-actina: Marcador de células musculares lisas, para identificação das lesões em progressão, tendo em vista que estas células se proliferam nas lesões intermediárias e estágios mais avançados da doença aterosclerótica. IL-1β: Marcador de Interleucina-1b (IL-1b), para identificação do tipo de
macrófago que está sendo secretado. As células M1 têm um fenótipo de alta excreção de citocinas inflamatórias, como a IL-1b, fator de necrose tumoral alfa (TNF-alpha) e interleucina-6 (IL-6).
As lâminas foram fixadas em parafomaldeído (4%) por 30 minutos, e após a fixação foram lavadas 2X com PBS por 5 minutos. Depois de retirar o excesso do tampão, circulamos com caneta hidrofóbica e aplicamos o bloqueador de proteínas BSA 5%, e incubamos por 1 hora em temperatura ambiente (TA). Depois realizamos novamente mais duas lavagens com PBS por 5 minutos. Aplicamos o anticorpo primário diluído sobre os cortes, e deixamos overnight a 4 ºC. Após esse período, lavamos 2X com PBS por 5 minutos. Depois adicionamos anticorpo secundário por 1 hora (sendo sempre um anticorpo contrário e correspondente ao primário), e lavamos 2X com PBS por 5 minutos. Adicionamos o 4’, 6’- Diamidino – 2- Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) (10 ml PBS + 20µl DAPI). Por fim adicionamos a lâmina de vidro e colamos.
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Para cada análise foram avaliados 3 a 5 animais de cada grupo, com imagem captada pelo sistema AxioCam, e analisadas posteriormente pelo programa Image J. Para marcação com o anticorpo F4/80 e IL-1β utilizamos cortes da raiz aórtica de animais submetidos a 8 semanas de dieta, e para o anticorpo α-actina utilizamos cortes da raiz aórtica de animais com 22 semanas de dieta.
3.7. Perfil lipídico
No momento do sacrifício, foram coletadas amostras de sangue retro-orbital com capilar heparinizado, e o colesterol e triglicerídeos foram dosados no plasma por método enzimático com kit Bioclin (Quibasa – MG/Brasil), conforme protocolo do Laboratório de Bioquímica do Hospital das Clínicas/Unicamp.
3.8. Análise estatística
Os resultados obtidos nos experimentos foram apresentados como média ± desvio padrão. A significância estatística das diferenças entre as medianas foi avaliada pelo teste de Mann-Whitney para variáveis não paramétricas. As diferenças foram consideradas estatisticamente quando o valor do p foi ≤ 0,05.
33 4. RESULTADOS
4.1 A deficiência do FIX não influenciou os níveis de colesterol dos animais deficientes de apoE
Os animais hemofílicos B deficientes de apoE (HB/APOE -/-), não apresentaram diferenças nos níveis de colesterol, quando comparados com os controles deficientes de apoE (NL/APOE -/-).
Tabela 1. Colesterol dos animais deficientes de apoE (NL/APOE-/-) e dos hemofílicos B deficientes de apoE (HB/APOE-/-) submetidos a dieta rica em colesterol. Os valores representam a média ± o desvio padrão.
Tempo de dieta (semanas) Genótipo Colesterol (mg/dL) n p 8 HB/APOE -/- 877 ± 59 10 0,14 NL/APOE -/- 804 ± 94 08 22 HB/APOE -/- 781 ± 159 11 0,10 NL/APOE -/- 864 ± 24 11
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4.2. A deficiência do FIX não influenciou os níveis de triglicerídeos dos animais deficientes de apoE
Os animais hemofílicos B deficientes de apoE (HB/APOE-/-), não apresentaram diferenças nos níveis de triglicerídeos, quando comparados com os controles deficientes de apoE (NL/APOE -/-).
Tabela 2.Triglicerídeos dos animais deficientes de apoE (NL/APOE -/-) e nos hemofílicos B deficientes de apoE (HB/APOE -/-) submetidos a dieta hiperlípidica. Os valores representam a média ± o desvio padrão.
Tempo de dieta (semanas) Genótipo Triglicerídeos (mg/dL) n p 8 HB/APOE -/- 329 ± 150 10 0,62 NL/APOE -/- 311 ± 52 08 22 HB/APOE -/- 328 ± 120 11 0,14 NL/APOE -/- 424 ± 165 11
4.3 A deficiência do FIX não protegeu contra o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas em toda extensão da aorta, no modelo deficiente de apoE
A figura 4 mostra a formação da placa aterosclerótica na aorta de um animal HB/APOE -/-. Os animais com deficiência do FIX (HB/APOE -/-) apresentaram lesões semelhantes ao grupo controle (NL/APOE -/-), após 8 semanas (1,8% e 1,6% respectivamente, p=0,74), e 22 semanas de dieta (8,1% e 7,2% respectivamente, p= 0,64). Os dados estão representados nos gráficos 1 e 2.
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Figura 4. Aorta de animal deficiente de apoE (APOE -/-) e hemofílico B (HB/APOE -/-) submetido a 22 semanas de dieta com 0,15% de colesterol, corado com Sudan IV. As áreas avermelhadas representam as extensas placas ateroscleróticas.
Gráfico 1. Quantificação da doença aterosclerótica dos animais sob 8 semanas de dieta com 0,15% de colesterol nos animais deficientes de apoE (NL/APOE -/-), e hemofílicos B deficientes de apoE (HB/APOE -/-).
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Gráfico 2. Quantificação da doença aterosclerótica dos animais sob 22 semanas de dieta com 0,15% de colesterol nos animais deficientes de apoE (NL/APOE -/-), e hemofílicos B deficientes de apoE (HB/APOE -/-).
4.4. A deficiência do FIX não protegeu contra o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas na raiz aórtica, no modelo deficiente de apoE
Na avaliação da raiz aórtica não houve diferença significativa na quantificação da doença aterosclerótica entre os animais NL/ APOE -/- e HB/APOE -/-, após 8 semanas (0,047 mm² e 0,053 mm²,respectivamente, p = 0,22), e 22 semanas de dieta (0,426 mm² e 0,423 mm², respectivamente; p = 0,64). Estes dados estão representados nos gráficos 3 e 4.
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Gráfico 3. Quantificação da doença aterosclerótica na raiz aórtica dos animais que receberam dieta por 8 semanas, hemofílicos B deficiente de apoE (HB/APOE -/-), e dos animais deficientes apenas de apoE (NL/APOE -/-).
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Gráfico 4. Quantificação da doença aterosclerótica na raiz aórtica dos animais que receberam dieta por 22 semanas, hemofílicos B deficientes em apoE (HB/APOE -/-), e dos animais deficientes apenas de apoE (NL/APOE -/-).
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4.5. A deficiência do FIX alterou as características qualitativas da lesão aterosclerótica da raiz aórtica no modelo deficiente de apoE
Os padrões entre os grupos (HB/APOE -/- e NL/ APOE -/-), tanto na avaliação qualitativa relacionada ao músculo liso (α-actina) (5,59% e 7,62% respectivamente p=017), como aos macrófagos (F4/80) (6,74% e 8,46% respectivamente p= 0,30) não foi diferente. Contudo, os animais hemofílicos, de forma representativa, apresentaram uma menor proporção de marcação da interleucina IL-1b, que corresponde aos macrófagos M1, quando comparados ao grupo controle, conforme podemos observar na figura 5.
Gráfico 5. Porcentagem de células musculares lisas na raiz aórtica dos animais que receberam dieta por 22 semanas, hemofílicos B deficientes em apoE (HB/APOE -/-), e animais deficientes apenas de apoE (NL/APOE -/-).
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Gráfico 6. Porcentagem total de macrófagos na raiz aórtica dos animais que receberam dieta por 8 semanas, hemofílicos B deficientes em apoE (HB/APOE -/-), e animais deficientes apenas de apoE (NL/APOE -/-).
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Figura 5. Marcação da interleucina IL-1b em imunofluorescência. A) Animais hemofílicos que receberam 8 semanas e B) Animais controles que receberam 8 semanas de dieta hiperlipídica. Observa-se marcação vermelha de F4/80 (macrófagos); azul referente ao DAPI (marcação do núcleo de células), e em verde marcação de IL-1b (M1).
42 5. DISCUSSÃO
O entendimento da fisiopatologia e a busca por novos mecanismos envolvidos na aterosclerose são de grande interesse, pois podem proporcionar novas medidas terapêuticas para essa doença, que está associada aos mais elevados índices de mortalidade na população ocidental, por sua relação com as doenças cardiovasculares. Atualmente existem várias abordagens, incluindo tanto a prevenção como o tratamento, mas que até o momento não propiciaram o impacto desejado na redução da morbi-mortalidade das doenças vasculares oclusivas. Essa constatação suscita a ideia de que além de mudanças dinâmicas nos fatores de risco, outros mecanismos podem estar atuando, além da incapacidade de bloqueio de todas as vias que favorecem o desenvolvimento da doença aterosclerótica, apesar de todo arsenal terapêutico hoje disponível.
O uso de modelos animais geneticamente modificados tem contribuído significativamente para a compreensão dos mecanismos fisiopatológicos das doenças vasculares, quer utilizando modelos com alterações genéticas isoladas ou combinadas. A possibilidade de estudos em meio controlado minimiza os efeitos ambientais, o que seria limitado nos estudos epidemiológicos humanos (Kung et al., 1998).
No final do século passado alguns estudos populacionais demonstraram que pacientes hemofílicos apresentavam menor mortalidade por doença coronariana isquêmica, em comparação à população geral, inclusive na presença de fatores de risco como a hipertensão arterial (Rosendaal, 1989 e 1990). Esses achados foram confirmados por outro estudo realizado no Reino Unido (Darby et al., 2007).
