Estruturação genetica e variação de defesas quimicas em Brugmansia suaveolens (Solanaceae)

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Suzana Alcantara

“Estruturação Genética e Variação de Defesas Químicas em

Brugmansia suaveolens (Solanaceae)”

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia para obtenção do Título de Mestre em Ecologia.

Orientadora: Profa. Dra. Vera Nisaka Solferini

Co-Orientador: Prof. Dr. José Roberto Trigo

FICHA CATALOGRÁFICA

“Não há conhecimento que não seja intuitivo.” “O ser e o nada” - Jean-Paul Sartre

Agradecimentos

Agradeço à Vera, não só pela amizade e pelos conselhos, mas por aceitar orientar este trabalho; por me permitir aproveitar ao máximo o curso de mestrado, proporcionar a logística para o que fosse necessário e principalmente por seu senso crítico.

Ao Trigo, que além de co-orientador foi um grande amigo, por se interessar pelo estudo das bases genéticas de defesas químicas; pelo incentivo.

Ao Prof. Louis Bernard, um colaborador indispensável que sempre foi um exemplo de professor, de cientista e de ser humano. Pelo apoio em várias ocasiões durante o mestrado; pelos conselhos, muito além de profissionais; por ser alguém que me orgulho de ter conhecido e convivido profissionalmente.

Ao Prof. Roland Vencovsky, que me acolheu com minhas dúvidas estatísticas já na fase final do trabalho e por fornecer a orientação de que eu precisava. Por me proporcionar o contato com uma outra escola de genética, que acrescentou muito a esta dissertação. Pelo exemplo de profissional, pela dedicação à ciência demonstrada claramente na disponibilidade, no interesse e no empenho em contribuir para este trabalho.

Aos funcionários do CPQBA, em especial ao Marcos Alves, pela discussão do plano de trabalho inicial e por possibilitar a infra-estrutura para os experimentos de indução, e ao Benício, por tomar conta das minhas plantinhas.

À Ju, minha “segunda co-orientadora”, que seguramente foi quem mais sofreu com minhas dúvidas, por ser por inúmeras vezes minha “motorista particular”. Pela amizade incondicional, as conversas, as críticas, a paciência, a cumplicidade, a companhia maravilhosa e necessária.

À Pri, outra amiga sem a qual esse trabalho não seria o mesmo, por se meter no meio do brejo durante as coletas, ficar um mês tomando conta dos “meus bebês”, ajudar na

identificação e processamento dos indivíduos depois do campo; pela companhia na Unicamp nos vários finais de semana e feriados, por ouvir pacientemente sobre os problemas cotidianos, aturar minhas crises de mau humor e me levar pra praia quando eu não agüentava mais ver géis, cromatrogramas e planilhas pela frente!

Ao Will, pela paciência e as várias horas perdidas durante a programação das rotinas no MatLab; à Sònia e ao Mario, que me socorreram quando os programas resolviam brigar com minhas planilhas de dados.

À Fresia, por me proporcionar um grande aprendizado, relacionado tanto à experiência de ensino quanto ao “mundo dos fósseis”, pela amizade; e ao Edgar, que me ajudou com os mapas.

Aos membros da pré-banca, Prof. Sergio Russo Matioli, Prof. Antonio Salatino e Prof. Gonçalo Amarante Pereira, e à banca. Prof. Giancarlo Conde e Prof. Louis Bernard, pelos valiosos comentários.

A todos que me acompanharam durante as coletas: Joaquim, Carlinhos, Trigo, Baku, Tamashiro, Maína, Roque, Léo, Cris, Aluana, Mauricio, Lu, Renato, Pri, Keka, Guilherme. Aos que me levaram até o CPQBA, quase semanalmente por seis meses: Ju, Flávia Colpas, Herbert, Tá, Sónia. Aos que me ajudaram a carregar e transportar os (muitos!) vasos de plantas: Seu Pedro, Joaquim, Carlinhos, José Carlos, Flávia Colpas, Ricardo. E um agradecimento especial à Luzia e ao Baku, pela amizade, o incentivo, o auxílio em várias etapas do trabalho e o interesse demonstrado durante todo o mestrado.

Aos colegas do laboratório de Diversidade Genética: Karla, Tê, Sónia, Gu, Maína, Clau, Flávio, Karina, Tereza Grambone, Evandro, Flávia Fuchs, Véio, Renato, Cris, Déia, Joyce, Bruno, Camila, Kaiser. Ao pessoal do laboratório de Ecologia Química: José Carlos, Flávia Colpas, Marcela, Mariana, Kamila, Rodrigo, Gu.

Aos meus amigos, com quem sempre pude contar e que estiveram presente independente da distância e da correria: Tá, Pri, Ju, Mi, Nem, Carol, Gui e Marina, Gu, Gabriel, Mauricio e Lu Cordeiro, Tê e Bruno, Karla, Anders, Márcio Lorencini, Cris, Lu Jablowsky, Will, Luzia e Ângelo, Felipe e Maína, Tamashiro, Valéria, Túlio, Barrinho, Garça, Rafa, Clau, Marcela, Flávia, Tata, Flávio, Marisa, Sónia, Horácio, Márcio Araújo, Jiva, Mario e Aninha, Danilo, Trigo, Marcio Uehara. Alguns por serem pessoas iluminadas, outros por me fazerem rir; por estarem perto quando precisei; pela companhia nas viagens, cinemas, festas, bares, almoços e nos corredores do instituto, as conversas por telefone ou msn madrugadas afora, os e-mails longos ou aquele “oi” apressado. “E se esse trabalho não é melhor é por falta de memória (ou mesmo trabalho!), mas não por falta de amigos.”

Agradeço e dedico este trabalho àqueles sem os quais nada disso seria possível. Aos meus pais, claro.

Agradeço ainda ao curso de Pós-Graduação em Ecologia e a todos os funcionários da UNICAMP, que possibilitaram a realização deste trabalho. Em especial, aos funcionários dos Deptos. de Genética e Evolução e de Zoologia, e aos professores do Depto. de Botânica.

À CAPES, pela concessão da bolsa, e ao CNPq e à FAPESP, que financiaram o trabalho, incluído no projeto temático “Variabilidade genética em espécies de distribuição fragmentada” (04/09742-0), coordenado pela Profa. Dra. Vera Nisaka Solferini.

Sumário Epígrafe Agradecimentos Sumário Lista de Figuras Lista de Tabelas Resumo Abstract Introdução Geral

Estruturação da variabilidade genética

Evolução de caracteres quantitativos em populações estruturadas Estimativas de variabilidade genética

Organismo estudado Objetivos

Literatura citada

Capítulo 1 - Estrutura genética em populações de Brugmansia suaveolens Resumo Introdução Material e Métodos Resultados Discussão Literatura citada

Capítulo 2 - Herdabilidade de alcalóides tropânicos em Brugmansia suaveolens: inferências evolutivas sobre defesas químicas

Resumo Introdução Material e Métodos Resultados Discussão Literatura citada Considerações Finais Apêndice v vii xi xii xii xiii xv 1 1 5 9 14 18 18 29 31 33 36 40 42 51 67 69 71 75 81 83 91 107 111

Lista de Figuras Capítulo 1

Figura 1. Localização das populações amostradas.

Figura 2. Parentesco médio dos indivíduos por população. Figura 3. Padrão alélico das populações.

Figura 4. Distância genética versus distância geográfica.

Capítulo 2

Figura 1. Localização das populações amostradas.

Figura 2. Estrutura dos principais alcalóides tropânicos de B. suaveolens. Figura 3. Diversidade genética e herdabilidade dos caracteres por população.

Figura 4. A) concentração total de alcalóides antes do dano versus após o dano; B) razão de indução versus concentração constitutiva de alcalóides.

Figura 5. Concentração induzida versus constitutiva de alcalóides por população.

Figura 6. Razão de indução versus concentração constitutiva de alcalóides por população.

Prancha 1. Fotos de Brugmansia suaveolens.

Lista de Tabelas Capítulo 1.

Tabela 1. Identificação e localização das populações Tabela 2. Diversidade genotípica por população. Tabela 3. Resultados dos testes de bottleneck. Tabela 4. Estimativas de variabilidade genética. Tabela 5. Estruturação genética intrapopulacional. Tabela 6. Freqüências alélicas por população.

Tabela 7. Resultados dos testes de desvios de heterozigosidade a H.W. por amostra. Tabela 8. Estruturação hierárquica das populações.

Capítulo 2

Tabela 1. Heterozigosidade média esperada (He) e GST.

Tabela 2. Herdabilidade sensu-lato (H2) e diferenciação (QST) entre as populações.

Tabela 3. Média e desvio padrão dos caracteres mensurados em indivíduos de B. suaveolens. 60 61 62 65 97 98 100 101 102 103 105 59 59 60 61 62 63 64 64 99 100 101

Resumo

Populações espacialmente estruturadas tendem a apresentar alta diferenciação genética e forte evidência de processos micro-evolutivos. Indivíduos de Brugmansia suaveolens (Solanaceae) são restritos a manchas populacionais. Neste trabalho, a diversidade genética de nove populações de B. suaveolens foi estimada através de isoenzimas (capítulo 1). Nossos resultados demonstram alta variabilidade e estruturação genética entre as populações. O comportamento do polinizador e a dispersão hidrocórica parecem determinar a estruturação intrapopulacional. Existem evidências de que efeitos estocásticos (i.e.: fundação e migração) afetam o padrão de diferenciação interpopulacional. A maioria dos resultados pode ser esperada sob dinâmica de estabelecimento de metapopulações. Tais populações são bastante susceptíveis à diferenciação de caracteres quantitativos, seja devido à evolução fenotípica neutra (causada por deriva) ou ação de seleção (adaptação local). Para avaliar o papel da deriva e da seleção nessa diferenciação, a variação genética de caracteres pode ser comparada à variação neutra estimada por marcadores moleculares. Quatro caracteres foram avaliados em quatro das populações de B. suaveolens estudadas (capítulo 2), três deles relacionados à defesa química contra herbívoros (concentração de alcalóides). Nossos resultados mostram uma diferenciação genética ca. de três a quatro vezes maior que a estimada por marcadores neutros para três dos caracteres, embora essa diferença não seja significativa. A exceção ocorre para a razão de indução de alcalóides, que mostra sinais de seleção estabilizadora (ausência de diferenciação interpopulacional), contrariando o padrão esperado pela teoria.

Abstract

Populations patchily distributed tend to show high genetic structure and strong micro-evolutionary process evidences. Brugmansia suaveolens (Solanaceae) individuals are restrict to population patches. In this work, the genetic diversity of nine B. suaveolens populations was estimate by means of allozyme electrophoresis (chapter 1). Our results indicate high variability and genetic structure among populations. The pollinator behaviour and the hydrochoric dispersal seem determine the intrapopulation structure. There are signals that stochastic effects (i.e.: migration and foundation) affect the differentiation among populations. The most of genetic patterns found can be created by a metapopulational establishment. These populations are very susceptible to the quantitative traits differentiation, due to neutral phenotypic evolution (generated by drift) or selection action (local adaptation). To evaluate the relative action of drift and selection on population differentiation, the genetic variation in quantitative traits can be compared to neutral variation estimated by molecular markers. Four traits were evaluated in four of the B. suaveolens populations studied (chapter 2), and three of them were related to chemical defense against herbivores (tropane alkaloids concentrations). Our results show a genetic differentiation ca. three to four times higher than the differentiation estimated by molecular markers for three of characters analyzed, although no significant. The exception is “alkaloids induction” trait, which show stabilizing selection signals (absence of interpopulation differentiation), instead of differentiation pattern expected by theory.

Introdução Geral

Estruturação da variabilidade genética

A estruturação genética - distribuição não aleatória dos genótipos - em populações naturais é determinada principalmente pelo sistema reprodutivo das espécies (Loveless e Hamrick, 1984). Por exemplo, espécies que realizam autofecundação apresentam menor variabilidade genética que aquelas com reprodução cruzada (alogamia). Embora a alogamia tenda a aumentar o tamanho efetivo das populações (Ne) e diminuir subdivisões

populacionais, quando a dispersão é restrita podem ocorrer cruzamentos entre indivíduos próximos e aparentados (Loveless e Hamrick, 1984) e o endocruzamento resultante pode gerar uma estruturação genética intrapopulacional.

Schoen e Clegg (1984) descrevem quatro principais modelos de reprodução em espécies vegetais, que variam quanto à proporção e a origem de cruzamentos não-aleatórios que ocorrem na população: o modelo aleatório, o de autofecundação efetiva, o modelo misto e o de cruzamentos biparentais. Em espécies com sistemas mistos, nos quais é possível ocorrer tanto autofecundação quanto fecundação cruzada, a estruturação resultante tende a ser semelhante à de espécies alógamas, já que os intercruzamentos diminuem a diferenciação genética.

A estruturação genética que resulta dos sistemas reprodutivos também pode ser influenciada por processos ecológicos ou estocásticos aos quais essas populações estão sujeitas. Alguns dos fatores que influenciam diretamente a estruturação genética das populações são aqueles determinantes de sua distribuição espacial, como a capacidade de dispersão, eventos de extinção e colonização, ou seleção em ambientes heterogêneos. Dessa maneira, o estudo de padrões de distribuição espacial da variabilidade genética em populações vegetais tem se mostrado útil para a compreensão da influência dos processos

espaciais na distribuição da variabilidade genética em diferentes escalas (Heywood, 1991; Linhart e Grant, 1996; Rousset, 2001; Fenster et al., 2003; Diniz-Filho e Telles, 2000; Vekemans e Hardy, 2004).

A dispersão de sementes e a dispersão de pólen são consideradas os principais mecanismos de fluxo gênico em vegetais, já que mesmo em espécies que apresentam propagação vegetativa os clones ocorrem nas proximidades do indivíduo de origem. O fluxo gênico efetivo determina o papel da estrutura populacional no processo evolutivo (Wright, 1977; Fenster et al., 1997) e a escala em que ocorrem as adaptações locais (Endler, 1977). Em plantas, estima-se que o fluxo gênico seja relativamente limitado (Ehrlich e Raven, 1969; Levin, 1981; Linhart e Grant, 1996), o que causa isolamento gênico por distância entre populações e, em pequena escala, uma área de vizinhança genética muitas vezes menor do que as áreas populacionais aparentes. Segundo Wright (1943), a área de vizinhança genética (Nb) é definida como a menor área panmítica (onde os cruzamentos têm a mesma probabilidade de ocorrer entre quaisquer indivíduos) de uma população. Em uma população contínua, a vizinhança genética (Nb) também pode ser interpretada como o tamanho da vizinhança - em termo de número de indivíduos – que expressa o alcance da deriva genética local, e é definida por 4πDσ2, sendo D a densidade efetiva de indivíduos (Ne/N) e σ2 a variância do displacement gênico (metade da distância

espacial média entre pais e prole ao quadrado) (Vekemans e Hardy, 2004). Em populações subdivididas, a relação 4πDσ2 não caracteriza a área de vizinhança genética, e a taxa de migração por subpopulação (m) é tão importante quanto Dσ2 na caracterização do fluxo gênico (Rousset, 2001). Áreas de Nb restritas levam ao isolamento por distância (IBD), um padrão de distribuição da variabilidade onde a diferenciação genética é proporcional à

distância em populações espacialmente isoladas devido a restrições no fluxo gênico (Wright, 1943). Em pequena escala, a dispersão restrita causa o isolamento por distância entre pares de indivíduos, causando uma correlação espacial nos coeficientes de parentesco (Rousset, 2001; Vekemans e Hardy, 2004).

Os vetores de dispersão determinam a distância que o pólen pode atingir, embora somente uma pequena fração do pólen disperso efetivamente realize fluxo gênico. Em geral, a dispersão de pólen é leptocúrtica, levando ao isolamento por distância na escala determinada pela distância de dispersão (Kerster e Levin, 1968). Em espécies polinizadas pelo vento, geralmente as distâncias atingidas evitam a diferenciação populacional em áreas relativamente grandes (Jain e Bradshaw, 1966; Antonovics, 1968). Em populações densas e homogêneas, vetores animais podem apresentar diferentes comportamentos de forrageamento dependendo da fisiologia do animal e principalmente da estruturação espacial do recurso oferecido pelas plantas (Schmitt, 1980 e 1983; Webb e Bawa, 1983; Goverde et al., 2002). Pequenos animais geralmente têm movimentação restrita, enquanto grandes insetos, por exemplo, podem voar longas distâncias e visitar mais plantas. Em geral, animais que voam longas distâncias tendem a aumentar o Ne e a Nb, diminuindo a

diferenciação genética populacional (Zimmerman, 1982; Loveless e Hamrick, 1984). A dispersão de sementes também influencia a estruturação genética das populações: a dispersão por gravidade (barocoria) tende a aumentar a estruturação dentro das populações enquanto a anemocoria (dispersão pelo vento) impediria a diferenciação intrapopulacional, embora a dispersão efetiva pelo vento a longas distâncias seja raramente relatada (Loveless e Hamrick, 1984). A zoocoria (dispersão por animais) é afetada pelo comportamento do dispersor, mas em geral resulta em dispersão a longas distâncias e aumento do Ne (Godoy e Jordano, 2001). Dispersão por água (hidrocoria) permite um longo

alcance às sementes, embora possa ser restrita por condições locais (como o fluxo de água) e pelo tempo de viabilidade ou capacidade de flutuação das sementes (Kudoh e Whigham, 1997; DeWoody et al., 2004).

Segundo Wright (1940, 1943), as mudanças evolutivas em populações pequenas ocorrem devido à combinação de seleção local, deriva genética, migração e, por último, seleção interdêmica em populações pequenas e subdivididas. Assim, forças locais (seletivas ou estocásticas) afetariam a persistência e a viabilidade de demes (ou subpopulações) por afetar diretamente o número efetivo de indivíduos e a diferenciação interpopulacional.

Em um contexto ecológico, a dinâmica espacial de persistência de demes é abordada pela teoria de metapopulações (Hanski e Gilpin, 1997). Uma metapopulação é uma população subdividida que persiste por um equilíbrio entre extinção local de demes e seu re-estabelecimento através de dispersão e colonização. Entre os principais modelos de estrutura populacional, destacam-se o “continente-ilha”, no qual o fluxo gênico é unidirecional e as taxas de extinção variam (Slatkin, 1977), e o modelo clássico de Levins, no qual todos os demes têm as mesmas taxas de extinção e colonização (Levins, 1968 e 1969). Este tem sido o mais utilizado como base para inferências sobre as conseqüências genéticas da dinâmica metapopulacional e os modelos teóricos mostram que essa dinâmica afeta a diversidade genética dentro de e entre populações (Slatkin, 1977; Wade e McCauley, 1988; Whitlock e McCauley, 1990; Whitlock e Barton, 1997; Pannel, 2003). Os efeitos genéticos previstos para uma estrutura metapopulacional clássica, em longo prazo, são a perda da diversidade genética e da diferenciação entre os demes (Slatkin, 1977; Hedrick e Gilpin, 1997) embora, segundo Wright (1940), os processos de extinção recorrente diminuiriam o Ne das subpopulações, causando diferenciação entre as mesmas.

indiretamente pelo número efetivo de alelos - diminui em metapopulações, devido ao aumento da variância no sucesso reprodutivo entre os indivíduos (Wang e Caballero, 1999). Wade e McCauley (1988) demonstraram que, embora a diversidade genética e o tamanho efetivo diminuam, a diferenciação entre demes pode diminuir ou aumentar dependendo da origem e do número de fundadores de novos demes. Tais autores sugerem ainda que seriam mais freqüentes situações ecológicas em que a dinâmica metapopulacional aumenta a diferenciação entre demes.

Evolução de caracteres quantitativos em populações estruturadas

Evidências experimentais (Service e Rose, 1985; Goodnight, 1988; Holloway et al., 1990) e considerações teóricas (Goldstein e Holsinger, 1992) revelam a manutenção de grande variabilidade genética em ambientes temporalmente heterogêneos, presumivelmente acumuladas na forma de mutações neutras ou quase-neutras ou na forma de interações epistáticas (Ohta, 1972; van Tienderen e de Jong, 1994). A variação genética de caracteres fenotípicos tem conseqüências importantes para a evolução em ambientes que variam espacial ou temporalmente (Via, 1993; Pigliucci et al., 1995), situação comum em espécies que apresentam grande amplitude de distribuição e estruturação demográfica (espacial ou temporal). Dentro de demes, a deriva pode converter variância genética não-aditiva em variância aditiva (responsável pela evolução fenotípica), aumentando o potencial para adaptação local (Lande, 1992; Wade e Goodnight, 1998; Cheverud et al., 1999). Além disso, a endogamia decorrente de uma estrutura genética espacial pode aumentar a taxa de fixação de alelos ao acaso (Wright, 1978; Falconer e Mackay, 1996), e as diferenças surgidas por deriva genética entre os demes podem ser aumentadas por seleção natural (Wade e Goodnight, 1998).

A utilização de marcadores genéticos para avaliar a estrutura das populações juntamente com a determinação da variância genética de caracteres fenotípicos permite o teste da hipótese nula de que a diferenciação genética do caráter analisado deve-se à evolução fenotípica neutra (Falconer e Mackay, 1996; Felsenstein, 1986; Lande, 1992; Spitze, 1993). Recentemente, alguns trabalhos têm avaliado a relação entre divergência populacional de características fenotípicas e genéticas, estimada por isozimas (em plantas, ver Ritland e Jain, 1984; Ritland, 1996; Hamrick, 2004). A maioria desses trabalhos encontra maior diferenciação entre caracteres morfológicos do que entre isozimas e seus autores sugerem que essa diferença deve-se a ação de seleção local (Spitze, 1993). No entanto, Lewontin (1984) argumenta que a diferenciação maior em caracteres quantitativos é esperada devido à maior probabilidade de divergência em relação a loci únicos (isoenzimáticos). Por sua vez, Felsenstein (1986) indica que o modelo de evolução neutra (Wright, 1978) para caracteres quantitativos deve ser utilizado para avaliar se as divergências interpopulacionais entre caracteres fenotípicos e isoenzimas ocorrem devido a processos evolutivos semelhantes.

A diferenciação genética de caracteres quantitativos entre populações estruturadas evidenciaria padrões de seleção disruptiva, esperados em ambientes heterogêneos (Loveless e Hamrick, 1984; Felsenstein, 1986; Linhart e Grant, 1996), com uma alta heterogeneidade e estruturação espacial (Antonovics, 1971; Hedrick, 1986). Entretanto, segundo Linhart e Grant (1996), componentes bióticos e abióticos podem diferir quanto aos padrões de diferenciação gerados: fatores abióticos são tipicamente contínuos no espaço e no tempo, variando em geral como um gradiente; já componentes bióticos variam mais dinamicamente, porque os agentes que promovem a seleção (competidores, herbívoros e parasitas) podem mover-se rapidamente em uma determinada área. Conseqüentemente, um

padrão de diferenciação em micro-escala, gerado e mantido por forças bióticas, tende a ser menos definido que aqueles associados ao ambiente físico, levando à diferenciação espacial em mosaico (Via, 1991; Fritz e Simms, 1992). Em escalas maiores, é esperada uma grande diferenciação para caracteres relacionados à pressões bióticas (Thompson e Cunningham, 2002).

Assim, a seleção pode ser relevante na diferenciação de caracteres quantitativos mesmo em pequena escala espacial. Exceções a essa regra ocorrem em espécies com pouca variabilidade genética ou que são constituídas por metapopulações, onde os eventos estocásticos são particularmente relevantes (Linhart e Grant, 1996). Espécies invasoras ou oportunistas, que em geral apresentam ampla distribuição (sujeitas a grande variação espacial) e que também são bastante influenciadas por eventos de colonização, tendem a apresentar pouca variabilidade genética e baixa diferenciação populacional. Nesses casos, a plasticidade fenotípica seria a melhor adaptação à heterogeneidade ambiental temporal ou espacial (Bradshaw, 1965; Schlichting, 1986; Sultan, 1987; Stearns, 1989; West-Eberhard, 1989).

Plasticidade fenotípica pode ser definida como habilidade de um dado genótipo em expressar diferentes fenótipos em diferentes ambientes. Como pode haver variação genética para plasticidade entre genótipos ou populações - já que nem todos os genótipos respondem ao ambiente da mesma maneira - as relações entre genótipos / populações irão se alterar ao longo do tempo (Pigliucci et al., 1991), sendo que a evolução da plasticidade pode ser restringida pela arquitetura genética das populações naturais (Via e Lande, 1985). Entretanto, alguns trabalhos têm mostrado que a plasticidade fenotípica pode, eventualmente, manter a variação genética (Gillespie e Turelli, 1989) – se mais de um genótipo resultar em fenótipos vantajosos – ou ser selecionada positivamente - diminuindo

o potencial para evolução do caráter devido à perda de variabilidade genética (Levin, 1988). Isso ocorreria porque genótipos plásticos tenderiam a ser fixados quanto maior a variação ambiental e a variação fenotípica do caráter, conseqüentemente, não apresentaria componente genético que pudesse ser selecionado.

De acordo com a teoria de plasticidade fenotípica adaptativa, adaptações fenotípicas plásticas são mais vantajosas em ambientes variáveis que adaptações fixas. Vários autores discordam sobre a maneira como a plasticidade é selecionada: se diretamente, a partir da existência de “genes da plasticidade” que evoluiriam independentemente do caráter (Schilitching e Pigliucci, 1993 e 1995), ou indiretamente, uma vez que genótipos plásticos apresentariam maior valor adaptativo médio, situação em que a evolução da plasticidade dependeria do valor médio do caráter (Via, 1993; Via et al., 1995). Em interações bióticas, variáveis no tempo e no espaço, a evolução pode resultar em respostas plásticas adaptativas, e o alvo da seleção nesse caso depende do controle genético do caráter envolvido (Karban et al., 1999; Agrawal, 2001).

Em relações planta-herbívoro, respostas plásticas parecem ser relativamente comuns (Karban et al., 1999; Agrawal, 2001 e 2005), particularmente em sistemas que envolvem substâncias do metabolismo secundário (SMS) de plantas como defesa. Genótipos que apresentam resposta plástica, com indução de defesa em situações de risco, seriam seletivamente favorecidos (Via et al., 1995; Karban et al., 1999), o que diminui a variância genética tanto da resposta plástica quanto do caráter. Entretanto, genes relacionados às vias de SMSs sofrem seleção fraca mesmo quando influenciam significativamente o valor adaptativo, por dependerem diretamente das vias metabólicas primárias e acarretar custos energéticos aos indivíduos (Thompson, 1988). A variação genética em respostas plásticas, além de permitir avaliar o potencial evolutivo do caráter, pode ser testada sob modelo

neutro de evolução fenotípica (comparada aos padrões de variabilidade genética neutra), o que pode auxiliar o conhecimento de sua história evolutiva em um determinado táxon.

Estimativas de variabilidade genética

Quantificação da variabilidade genética neutra

A variabilidade genética total de um grupo de indivíduos pode ser estimada pelo número médio de alelos por locus (A) ou pelo número efetivo de alelos por locus (Ae) -

uma estimativa do número de alelos esperado, a partir da distribuição da variação genética da população. Ae pode ser considerada uma estimativa de diversidade gênica, análoga a He

(Slatkin, 1977). Além dessas medidas, também podem ser computadas: a porcentagem de loci polimórficos (P 95%), a heterozigosidade observada (HO) e a esperada (He) por

Hardy-Weinberg (HW). A heterozigosidade esperada, ou diversidade gênica, é considerada a melhor estimativa de variabilidade por representar tanto a variação genética em espécies alógamas quanto em autógamas (Weir, 1996; Hartl e Clark, 1997).

Distribuição da variabilidade genética neutra dentro e entre populações

Como uma maneira de medir a distribuição da variabilidade genética entre indivíduos de uma espécie estruturados hierarquicamente (em populações e subpopulações – ou metapopulações e demes), Wright (1978) criou as estatísticas F’s – ou índices de fixação. Esses valores medem o efeito de endogamia em cada nível de estruturação populacional e admite que todos os desvios à panmixia sejam devidos à deriva genética e ao endocruzamento gerado pelos sistemas de reprodução (Hartl e Clark, 1997).

Inicialmente, esses índices foram criados para serem aplicados a um único locus com 2 alelos. Posteriormente, foram desenvolvidas estimativas que pudessem ser aplicadas a loci com múltiplos alelos. As principais estimativas diferem quanto ao modelo de

diferenciação populacional pressuposto. A mais utilizada no estudo de populações naturais, criada por Weir e Cockerham (1984), assume um modelo aleatório – no qual as populações se originaram de uma mesma população ancestral e as diferenças populacionais devem-se à ação da deriva e do sistema reprodutivo. A segunda abordagem, criada por Nei (1973), se baseia na análise da diversidade genética em populações subdivididas e pode ser utilizada em qualquer população, uma vez que não pressupõe uma origem comum e nem um modelo evolutivo de diferenciação entre as populações (modelo fixo).

A diferenciação genética das populações está diretamente relacionada à sua distribuição espacial. Essa diferenciação não é uma variável independente, sendo esperada maior similaridade genética entre indivíduos próximos (Heywood, 1991; Rousset, 1997; Vekemans e Hardy, 2004). Dentre as maneiras de medir a diferenciação genética entre populações ou grupos de indivíduos, a mais utilizada é a distância genética (D) de Nei (1978). O FST de Wright também é uma medida de diferenciação genética entre pares de

populações, embora Wright (1978) o rejeite como medida de distância genética já que, ao contrário de D, o FST não considera as diferenças entre freqüências gênicas. Entretanto,

Slatkin (1991, 1993) defende o uso do FST como uma medida de diferenciação

particularmente útil quando o objetivo é medir a similaridade genética causada por padrões de fluxo gênico (ou isolamento por distância). Rousset (1997) sugere ainda que a regressão entre a relação FST / (1 – FST) sobre o logaritmo da distância geográfica entre pares de

populações seria uma maneira eficiente de testar a hipótese de isolamento por distância, uma vez que é esperada uma relação linear entre essas variáveis em populações com fluxo gênico bidimensional.

Slatkin (1993) chama a atenção para o fato de que o padrão gerado por isolamento por distância medido diretamente através do fluxo gênico (FST ou número de migrantes, M)

difere do padrão esperado para a correlação entre freqüências alélicas (D) ou na identidade por descendência dos alelos (parentesco). Entretanto, vários autores defendem que, num modelo bidimensional e em pequena escala, é esperado que o parentesco também diminua linearmente com o logaritmo da distância espacial (Maruyama, 1977; Rousset, 1997; Hardy e Vekemans, 1999). Nesse caso, a estimativa de fluxo gênico pode ser expressa em termos do tamanho de vizinhança genética de Wright (Vekemans e Hardy, 2004).

Tamanho populacional efetivo: Efeito gargalo e diversidade genotípica

O tamanho efetivo refere-se à representatividade genética das populações e pode ser medido em termos do tamanho de uma população que apresenta a mesma redução na variabilidade genética por endogamia ou deriva referente a uma população panmítica, de tamanho finito N. Reduções drásticas no tamanho efetivo populacional (efeito gargalo, ou bottleneck) podem afetar negativamente as gerações seguintes (Young et al., 1996), gerando perda de variabilidade que pode ser estimada através da relação entre a redução no número de alelos e na diversidade gênica. Populações que sofreram gargalos recentes tendem a perder alelos mais rapidamente do que He, causando um padrão de diversidade

gênica maior que a diversidade gênica esperada sob equilíbrio de mutação-deriva - Heq,

calculada atravé do número de alelos da população (Cornuet e Luikart, 1996).

Outro fator que pode influenciar a representatividade genética de uma população é a ocorrência de propagação vegetativa. Ao que tudo indica, esse é um modo de reprodução comum em B. suaveolens. A importância da reprodução clonal para a estrutura genética das populações pode ser estimada através da diversidade genotípica observada nas populações (GO) comparada à diversidade genotípica esperada sob panmixia (Ge) - calculada a partir

Parentesco

As estimativas de parentesco recentemente desenvolvidas com base em marcadores genéticos têm sido um refinamento da análise genética populacional. Uma vez que a genealogia entre indivíduos amostrados em condições naturais não é conhecida, os valores médios de coancestria (ou coancestralidade) entre indivíduos permitem inferências mais precisas sobre o comportamento genético de uma população (Miyazaki e Isagi, 2000; Vekemans e Hardy, 2004). Ainda, o parentesco fornece uma complementação à análise da distribuição espacial da variabilidade genética, uma vez que é possível avaliar a distribuição de alelos idênticos por descendência entre indivíduos (Ritland, 1996; 2000; Vekemans e Hardy, 2004). As estimativas de parentesco existentes baseiam-se na probabilidade de identidade entre dois alelos escolhidos ao acaso em uma população (ou Q), conforme definido por Malécot (1969), e foram desenvolvidas a partir do parentesco de Wright (1922), cujo cálculo era feito através da correlação de freqüências alélicas entre gametas de dois indivíduos. As estimativas atuais podem ser divididas entre as que estimam coancestria (Fij) e as que estimam parentesco (Rij – baseado no parentesco de Wright).

Dentre as estimativas de parentesco, a mais utilizada é a de Lynch e Ritland (1999) que estima o valor de Rij. Entretanto, essa estimativa pressupõe que o marcador utilizado

seja altamamente polimórfico e que as populações estejam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Para dados isoenzimáticos, a melhor estimativa foi desenvolvida por Nason (descrita em Loiselle et al., 1995), que estima diretamente a coancestria entre os indivíduos, tem baixo viés estatístico e não pressupõe que as amostras estejam sob equilíbrio de H.W. (ver Hardy, 2003; Vekemans e Hardy, 2004, para uma discussão mais ampla sobre as estimativas de parentesco).

Em geral, boas estimativas interindividuais de parentesco são obtidas com um mínimo de 80-100 alelos, uma situação bastante rara em estudos com marcadores alozímicos. Entretanto, a utilização de médias de coeficientes de parentesco pode diminuir o viés causado pelo cálculo de parentescos entre grupos de indivíduos com pequeno número de alelos. A estimativa de coancestria média recente das populações (quando se considera as freqüências gênicas de cada população separadamente) indica o parentesco causado por estruturação familiar devido à dispersão restrita, particularmente de sementes (Hamrick e Nason, 1996; Kalisz et al., 2001; Chung et al., 2004). Esse valor fornece uma indicação da proporção de indivíduos da população que é reprodutivamente ativa e do padrão de sobrevivência entre proles. A coancestria remota se refere à história demográfica afetando o tamanho efetivo das populações (Hardy et al., 2004), e é calculada com relação à freqüência gênica total.

Herdabilidade - Variância genética quantitativa intrapopulacional

Os componentes da variância fenotípica atribuíveis a fontes genéticas e ambientais podem ser obtidos diretamente através da soma de quadrados médio fornecidos por ANOVA de um fator (Falconer e Mackay, 1996), desde que seja conhecida a correlação genética entre os indivíduos amostrados. No caso da amostragem de clones – que compartilham o mesmo genótipo - a herdabilidade pode ser definida como:

H2 = VG / VP ,

sendo VP a variância fenotípica total, e VG calculada como:

VG = (MSB – MSE) / n0 ,

onde MSB e MSE são os quadrados-médios entre grupos clonais e erro, e n0 o número

[

]

∑

∑

∑

n

A estimativa de H2 (herdabilidade sensu-lato) fornece a estimativa do valor máximo da variância aditiva presente em um determinado caráter, uma vez que são somadas as variância aditivas, de dominância e de interação epistática.

Diferenciação genética populacional de caracteres quantitativos

Estimativas de variação quantitativa podem ser utilizadas para caracterizar a variância genética entre e dentro de populações. Para caracteres com base genética puramente aditiva que evoluem sobre neutralidade, Wright (1951) mostrou que:

σ2

GW = (1 – QST) σ2T ,

onde σ2T é a variância genética total que poderia ser exibida se todos os indivíduos

fizessem parte de uma população panmítica. Além disso, σ2

GB = 2 QST σ2T e

QST = ____σ2GB______ , (Sptize, 1993).

(σ2GB + 2 σ2GW)

O índice QST indica a proporção da variância que ocorre entre as populações, e é

análogo ao GST de Nei (1973). A expectativa neutra de QST é a média do valor de GST

calculado para loci neutros da mesma população (Felsenstein, 1986; Lande, 1992). Valores mais altos refletem a ação de diferentes forças seletivas locais sobre as populações e valores menores, seleção estabilizadora.

Organismo estudado

Brugmansia suaveolens (Humb. & Bonpl ex Willd.) Bercht. & J. Presl. é uma Solanaceae arbustiva da tribo Datureae (Prancha 1) (Smith, 1991), conhecida popularmente

como trombeteira ou trombeta-de-anjo. Há indícios de que o centro de origem do gênero seja a Amazônia Andina, embora Bristol (1966) relate a ausência de registros em coletas feitas em regiões sem atividade humana. Por essa razão, esse grupo é considerado por muitos botânicos como plantas de cultivo (Griffin e Lin, 2000), e B. suaveolens, uma espécie subespontânea em toda a América do Sul (Bristol, 1966). A espécie cresce em planícies e áreas alagadas e apresenta compostos da classe dos alcalóides tropânicos com propriedades medicinais e narcóticas, sendo amplamente utilizada por populações andinas ao longo de rios do sul da Colômbia e Equador (Schultes e Raffauf, 1992; Griffin e Lin, 2000).

B. suaveolens é uma planta ornamental, que atinge de 1-3m de altura; as folhas são alternas; com uma única flor grande de corola branca, tubular, pêndula ou inclinada (Smith, 1991). As flores são perfeitas, com ovários biloculares, e a espécie apresenta sistema homomórfico de incompatibilidade genético gametofítico (GIS), que permite até 50% de sucesso nas autofecundações (Walles e Han, 1998; Kao e Tsukamoto, 2004). O florescimento ocorre simultaneamente entre os indivíduos e várias vezes durante o ano, com produção de grande quantidade de flores que duram de cinco a nove dias e oferecem muito néctar, o que representa uma alta concentração de recurso aos visitantes florais. Devido à morfologia e à química floral (Kite e Leon, 1995), estudos em espécies correlatas (D’Arcy, 1986) e observações ocasionais (Sazima, M – comunicação pessoal), acredita-se que a polinização seja feita por mariposas noturnas da família Sphingidae, animais grandes para os quais existem relatos de vôos de até 13 km em uma única noite (Janzen, 1984).

Os frutos de B. suaveloens são cápsulas indeiscentes, com sementes numerosas, relativamente grandes (7-12 x 5-8 mm) (Smith, 1991). Quando estão maduros, as sementes são liberadas e podem cair no solo sob a planta mãe (barocoria) ou serem levadas pela água

(hidrocoria), devido à proximidade dos indivíduos a rios e lagos. As sementes apresentam revestimento rugoso, semelhante à cortiça, que permite flutuar por semanas e possiblita sua viabilidade em água, aumentando o potencial para dispersão a longas distâncias (Schultes e Raffauf, 1992; Kudoh e Whigham, 1997; DeWoody et al., 2004). É possível verificar a agregação dos indivíduos em habitats úmidos e alagados, o que é atribuído a uma grande demanda fisiológica por água e ao modo de dispersão das sementes. Além disso, quando submersos, ramos e troncos são capazes de emitir raízes e se desenvolverem independentemente. Dessa maneira, partes da planta que se soltam e são levados pela água podem enraizar em outros locais, dando origem a clones.

Na Mata Atlântica, densas populações de B. suaveolens também são observadas em bordas de rios e lagos e associadas a ambientes com algum grau de distúrbio antropogênico. Apesar do centro de origem ser a região andina, a estreita relação interespecífica existente entre Placidina euryanassa (uma borboleta da tribo Ithominae) e B. suaveolens sugere uma longa permanência ecológica dessa espécie na Mata Atlântica (Freitas et al., 1996; Willmott e Freitas, 2006). A agregação em ambientes perturbados é um indício de recentes aumentos populacionais. Por ser uma espécie ornamental, é difícil dizer se as populações são constituídas de indivíduos nativos oportunistas, ou se foram recentemente introduzidas pela ação humana. O padrão demográfico e as características ecológicas - o modo de dispersão hidrocórico e a agregação em manchas - fornecem indícios de que B. suaveolens apresenta uma estrutura metapopulacional, devido à importância que eventos de colonização / extinção e de migração devem representar para a sua estruturação genética (Hanski e Simberlof, 1997; DeWoody et al., 2004).

B. suaveolens foi escolhida para este estudo por apresentar indução de defesas químicas (alcalóides tropânicos) quando submetidas à herbivoria ou dano mecânico

simulando herbivoria (Alves, 2003). Alcalóides tropânicos são compostos tóxicos a artrópodes e vertebrados, e são produzidos em pelo menos sete diferentes famílias de angiospermas (Griffin e Lin, 2000). Estudos em espécies da tribo Datureae relatam que tais alcalóides atuam como substâncias de defesa contra ataque de insetos herbívoros (Berenbaum, 1995). Shonle e Bergelson (2000) estudaram o efeito seletivo desempenhado por insetos herbívoros sobre a via de produção de alcalóides tropânicos em Datura stramonium e concluíram que a diversidade de herbívoros determina a biossíntese dos alcalóides nessa espécie. Alves (2003) demonstra que em B. suaveolens, a distribuição de escopolamina (o alcalóide mais abundante) em diferentes partes da planta e a razão de indução diferencial nas mesmas concorda com o que seria esperado pela teoria de otimização de defesas em plantas – órgãos mais caros à planta, como flores e frutos, apresentam maior concentração constitutiva de defesas e menor indução. Além disso, esse estudo mostrou que a escopolamina diminui o desempenho de herbívoros generalistas e que plantas que apresentam maior concentração de escopolamina são menos consumidas. No entanto, para B. suaveolens há uma espécie de herbívoro especialista (P. euryanassa), um lepidóptero da tribo Ithominae capaz de seqüestrar os alcalóides tropânicos da planta e assimilá-los como substâncias que as tornam impalatáveis aos predadores (Freitas et al., 1996).

Os indícios sugerem que os alcalóides tropânicos evoluíram como uma defesa contra herbivoria em algum momento da história evolutiva da tribo Datureae, e levantam a questão sobre a importância da indução desses alcalóides em B. suaveolens. O estudo da variação genética da plasticidade química em populações naturais de B. suaveolens pode permitir inferir se a indução de alcalóides tropânicos é um caráter que sofreu pressão seletiva, e qual o sentido da seleção sofrida. A facilidade de cultivo, a possibilidade de

obtenção de clones por estaquia e o rápido desenvolvimento das estacas possibilitam que clones sejam submetidos a experimentos de indução, para determinação da herdabilidade sensu-lato (H2) nas populações. Dados de diferenciação genética neutra permitem inferências a respeito da história demográfica das populações, e a comparação com dados de diferenciação genética quantitativa permite testar hipóteses sobre o padrão evolutivo de defesas químicas nessas populações.

Objetivos

Esta dissertação foi desenvolvida para responder a duas questões principais:

- A estruturação espacial de populações de Brugmansia suaveolens influencia a distribuição da variabilidade genética nessas populações?

- A indução de alcalóides tropânicos nessa espécie apresenta padrões de seleção e pode ser considerada uma resposta plástica adaptativa?

Para responder a essas perguntas, esta dissertação foi dividida em dois capítulos, apresentados na forma de manuscritos:

1) Estrutura genética em populações de Brugmansia suaveolens (Solanaceae)

2) Herdabilidade da concentração total de alcalóides tropânicos em Brugmansia suaveolens: inferências evolutivas sobre defesas químicas.

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Capítulo 1

Estrutura genética em populações de Brugmansia suaveolens (Solanaceae)

Alcantara, S.1, Vencovsky, R.2 & Solferini, V. N.1

1 _{Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas}

(UNICAMP), CP 6109, CEP 13083-970, Campinas, São Paulo, Brasil

2

Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ), USP, CP 83, CEP 13400-970, Piracicaba, São Paulo - Brasil

Resumo

Em populações vegetais, a distribuição dos indivíduos é particularmente relevante à estruturação genética, assim como a ação de vetores de dispersão de pólen e sementes. Tais fatores causam estruturação da variabilidade genética por isolamento por distância (IBD). Populações isoladas são particularmente sensíveis aos efeitos de IBD, apresentando alta diferenciação e forte efeito de processos evolutivos. Indivíduos de Brugmansia suaveolens (uma Solanaceae arbustiva) são restritos a locais úmidos e alagados, ocorrendo em manchas populacionais na Mata Atlântica. Neste estudo, avaliamos a estruturação genética em nove populações localizadas em diferentes fragmentos de Mata Atlântica através de eletroforese de isoenzimas. Foram encontrados quinze loci polimórficos, que demonstraram alta variabilidade genética e genotípica para as populações estudadas. Além disso, há indícios de uma área de vizinhança genética bastante restrita e subestruturação das manchas intrapopulacionais, com efeito Wahlund em algumas das (meta?)populações. Aparentemente, os processos determinantes da estruturação genética em escala intrapopulacional são o comportamento do polinizador e a dispersão hidrocórica. Entre as populações, existem evidências de que efeitos estocásticos (i.e.: fundação e migração) influenciam diretamente a diferenciação genética. A maioria dos nossos resultados pode ser esperada sob situações de estabelecimento de uma dinâmica metapopulacional, e indica a ação de dinâmicas evolutivas próprias nas diferentes populações de B. suaveolens.

Introdução

A estruturação genética (distribuição não aleatória dos genótipos) em populações naturais é determinada principalmente pelo sistema reprodutivo das espécies. Em populações vegetais, o endocruzamento resultante dos sistemas reprodutivos gera estruturação genética entre e dentro de populações (Schoen e Brown, 1991; Loveless e Hamrick, 1984). Essa estruturação é influenciada por processos ecológicos e evolutivos, como a capacidade de dispersão de sementes e pólen, eventos de extinção e colonização, ou seleção em ambientes heterogêneos. Todos esses processos causam a estruturação genética no espaço, que pode ocorrer em populações contínuas ou em populações demograficamente estruturadas, distribuídas em manchas (Sokal, 1983; Sokal e Oden, 1991; Heywood, 1991; Lande, 1992; Rousset, 2000; Hardy e Vekemans, 1999; Vekemans e Hardy, 2004).

A estruturação espacial das populações afeta diretamente a dinâmica dos processos de dispersão gênica e a distribuição da variabilidade genética (Slatkin, 1993; Linhart e Grant, 1996; Wade e McCauley, 1988; Pannel, 2003). É esperado que a estruturação espacial cause estruturação hierárquica da variabilidade, devido à probabilidade de que o fluxo gênico entre as populações seja determinado pela distância entre as mesmas. Em plantas, estima-se que o fluxo gênico seja limitado, o que causa isolamento por distância e, em pequena escala, uma área de vizinhança genética menor do que áreas populacionais aparentes (Wright, 1943; Ehrlich e Raven, 1969; Levin, 1981; Linhart e Grant, 1996). Segundo Wright (1943), uma área de vizinhança genética (Nb) é definida como a menor área panmítica de uma população. Em populações contínuas, a área de Nb pode ser interpretada como o número de indivíduos que expressa o alcance da deriva genética local (Vekemans e Hardy, 2004). Em populações subdivididas, a taxa de migração pode ser tão importante quanto a ação da deriva, dificultando a determinação de Nb (Slatkin e Barton,