UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA
MARIA LUCIANA SILVA DE FREITAS
AVALIAÇÃO PROSPECTIVA DO GRAU DE ATIVAÇÃO CELULAR E DE IMUNOSENESCÊNCIA DOS LINFÓCITOS T EM PACIENTES COINFECTADOS
COM LEISHMANIOSE VISCERAL E HIV-1
Niterói 2014
ii
MARIA LUCIANA SILVA DE FREITAS
AVALIAÇÃO PROSPECTIVA DO GRAU DE ATIVAÇÃO CELULAR E DE IMUNOSENESCÊNCIA DOS LINFÓCITOS T EM PACIENTES COINFECTADOS COM
LEISHMANIOSE VISCERAL E HIV-1
Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Biomedicina da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Análises Clínicas.
Orientadora: Profª Drª JOANNA REIS SANTOS DE OLIVEIRA
Niterói 2014
iii Freitas, Maria Luciana Silva de
Avaliação prospectiva do grau de ativação celular e de imunosenescência dos linfócitos T em pacientes coinfectados com leishmaniose visceral e HIV-1.
Niterói: [s.n.], 2014. 97 f., 30 cm.
Monografia (Curso de Graduação em Biomedicina) – Universidade Federal Fluminense, 2014. 1. Coinfecção LV/HIV-1 2. Ativação Imune 3. Imunosenescência Bibliografia: f. 78-89.
iv
MARIA LUCIANA SILVA DE FREITAS
AVALIAÇÃO PROSPECTIVA DO GRAU DE ATIVAÇÃO CELULAR E DE IMUNOSENESCÊNCIA DOS LINFÓCITOS T EM PACIENTES COINFECTADOS COM
LEISHMANIOSE VISCERAL E HIV-1
Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Biomedicina da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Análises Clínicas.
Aprovada em 06 de Janeiro de 2014.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________________________________ Profa. Drª Claudia Maria Antunes Uchôa Souto Maior
Universidade Federal Fluminense
____________________________________________________________________ Profa. Drª Rosa Maria Ribeiro Vieira
Universidade Federal Fluminense
____________________________________________________________________ Profª. Dra Joanna Reis Santos de Oliveira - Orientadora
Universidade Federal Fluminense
____________________________________________________________________ Profª. Dra Luciana Souza de Paiva - Suplente
Universidade Federal Fluminense Niterói
v
À Deus, por me guiar e me ajudar a seguir
em frente nos momentos difíceis. Aos meus pais e a
minha irmã, por todo apoio, incentivo e por terem
acreditado em mim desde o princípio. Ao meu
esposo, por estar sempre ao meu lado e por ser meu
porto seguro.
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por está presente em cada passo que eu dou, por me proporcionar muitos momentos de alegria e me sustentar nos momentos de tristeza.
Agradeço aos meus pais (Verônica e Ageu) e a minha irmã Elizabety, que estiveram sempre presentes, me apoiando (seja emocionalmente ou financeiramente), acreditando em mim e se mostrando sempre orgulhosos das minhas conquistas. Agradeço a minha irmã por sempre me manter acordada nas vésperas de prova, rs. Amo muito vocês!
Ao meu esposo Rafael, que me acompanhou desde o vestibular até esse momento, e sempre se mostrou muito paciente, amoroso e tranquilizador nos momentos que mais precisei. Obrigada por cada momento de alegria que você me proporciona e por sempre ter acreditado tanto no meu potencial. Te amo!
Ao meu avô Pedro, minhas tias (Jaqueline, Fernanda e Selma) por sempre me lembrarem de que temos que correr atrás dos nossos sonhos e procurar sermos um exemplo e um motivo de orgulho para nossa família. A minha eterna “mamãe Nicinha” (in memorian), que mesmo ausente sempre me motivou a dar o meu melhor em tudo que faço.
Às minhas amigas de infância, Deborah e Maísa, que me proporcionaram momentos de muita alegria desde o colegial e tiveram muita paciência com os meus “sumiços” durante a faculdade. Agradeço também minha grande amiga Sônia pelos seus conselhos e por ser um exemplo de vida para mim.
Agradeço imensamente à minha orientadora, Joanna Reis, que aceitou o desafio de me orientar e que desde o princípio acreditou em mim e no meu potencial. Sem dúvida, se não fosse por você, nada disso teria acontecido. Obrigada por ser sempre tão paciente e por ser um grande exemplo para mim de profissionalismo e de pessoa.
Agradeço a professora Alda, que abriu as portas do laboratório para mim e foi sempre tão atenciosa e sábia, me fazendo ver o quanto é proveitosa a carreira científica. Agradeço aos meus colegas de laboratório, por serem sempre tão solícitos e por contribuírem com seus conhecimentos ao meu amadurecimento científico.
Às professoras Mariza Morgado e Carmem Gripp, à Priscila e à Fernanda, por serem sempre tão atenciosas e por terem contribuído com muita boa vontade para o desenvolvimento do projeto.
À Dra. Glaucia Cota pelo envio do material dos pacientes recrutados e pela valiosa colaboração para com o projeto.
Agradeço a minha turma Biomed2010.1 e, em especial, às minhas amigas Fernanda e Lorena, por terem me proporcionado momentos de muita alegria, diversão e amizade nesses quatro anos de curso.
Um agradecimento em especial aos meus coordenadores de curso Ronald e Claúdia e as secretárias, Nathália e Renata, por sempre estarem tão presentes e serem tão atenciosos com seus
vii
alunos. Agradeço também a todos os funcionários do instituto biomédico, principalmente, ao bibliotecário Joacir, que desde o início demonstrou muito carinho e atenção por nós alunos.
Agradeço também a todo corpo docente do curso de Biomedicina, por ter me proporcionado quatro anos de conhecimento acadêmico, sempre com muita dedicação e entusiasmo.
Agradeço as professoras Rosa Vieira, Claúdia Uchôa e Luciana Paiva por terem aceitado e confiado fazer parte da banca de avaliação deste trabalho.
Agradeço imensamente ao doutorando Hercules, por ter me colocado na área científica e por ter me passado grande parte do conhecimento que possuo hoje, mas por acima de tudo ter sido sempre um grande amigo. Agradeço também as minhas amigas, Maria Nathália e Marcelle, por me fazerem sempre lembrar com saudades de momentos tão alegres vividos.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de iniciação científica crucial para o início do meu desenvolvimento científico.
viii
“Porque Dele e por Ele, e para Ele, são todas as coisas; Glória pois a Ele eternamente. Amém.” Romanos, 11;36.
ix SUMÁRIO
Sumário ix
Lista de abreviaturas xi
Lista de Figuras xiii
Lista de Tabelas xvi
Resumo xvii
Abstract xviii
1. Introdução 1
1.1. Leishmaniose visceral 1
1.1.1. Epidemiologia da leishmaniose visceral 1
1.1.2. O parasito 3
1.1.3. Manifestações clínicas e imunopatogenia da leishmaniose visceral 4
1.2. Síndrome da Imunodeficiência adquirida – AIDS 6
1.2.1. Epidemiologia da infecção pelo HIV-1 6
1.2.2. História e bases da infecção pelo HIV-1 9
1.2.3. Curso clínico e Imunopatogenia da infecção pelo HIV-1 11
1.2.4. Exaustão da capacidade imunológica na infecção pelo HIV-1: Imunosenescência 17 1.3. Coinfecção Leishmaniose visceral/HIV-1 (LV/HIV-1) 19
1.3.1. Aspectos epidemiológicos da coinfecção 19
1.3.2. Imunopatogenia da coinfecção LV/HIV-1 22
2. Objetivos 25
2.1. Objetivo geral 25
2.2. Objetivos específicos 25
3. Metodologia 26
3.1. Casuística e Considerações Éticas 26
3.2. Obtenção de material biológico para ensaios laboratoriais 27
3.3. Contagem dos linfócitos T CD4+ e CD8+ 27
3.4. Determinação do número de cópias de RNA do HIV-1 no plasma sanguíneo. 28
3.5. Obtenção de células mononucleares de sangue periférico e caracterização fenotípica por citometria de fluxo 28
3.6. Análise estatística 32
4. Resultados 33
4.1. Características clínicas dos pacientes de coinfecção leishmaniose visceral e HIV/AIDS (LV/HIV) 33
x
4.2. Quantificação de linfócitos T CD4+ nos casos de coinfecção leishmaniose visceral e
HIV/AIDS. 35
4.3. Influência dos níveis plasmáticos do HIV na contagem dos linfócitos T CD4+ em pacientes de coinfecção leishmaniose visceral e HIV/AIDS 42
4.4. Avaliação do grau de comprometimento celular através da caracterização fenotípica dos linfócitos T de sangue periférico em pacientes de coinfecção leishmaniose visceral e HIV/AIDS. 45
4.5. Avaliação de perfis fenotípicos associados à diferenciação celular de linfócitos T de memória em pacientes de coinfecção leishmaniose visceral e HIV/AIDS. 51
4.6. Avaliação do grau de senescência replicativa dos linfócitos T de sangue periférico em pacientes coinfectados com leishmaniose visceral e HIV-1 (LV/HIV-1) 59
5. Discussão 64
6. Conclusão 76
7. Considerações finais 77
8. Referências Bibliográficas 78
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Humana Adquirida
APC aloficocianina
CCR5 Receptor de células humanas para β-quimiocinas
CD Cluster of differentiation
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CTL Células T Citotóxicas
CTLA-4 Cytotoxic T lymphocytes antigen 4
CXCR4 Receptor de células humanas para β-quimiocinas
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DST Doença Sexualmente Transmissível
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FITC Isotiocianato de fluoresceína
gp Glipoproteína do envelope do HIV-1
HAART Highly active antiretroviral therapy
HLA Antígeno leucocitário humano
HIV-1 Vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 1
IFN-γ Interferon gama
IL Interleucina
IQR Intervalo interquartil
xii
ITRNNs Inibidores da transcriptase reversa não análogos de nucleosídeos
LC Leishmaniose Cutânea
LCD Leishmaniose Cutânea Difusa
LM Leishmaniose Mucosa
LPS Lipopolissacarídeo
LV Leishmaniose visceral
MS Ministério da Saúde
OMS Organização Mundial da Saúde
P Paciente
PBMC Células mononucleares de sangue periférico
PD1 Programmed death protein 1
PE Ficoeritrina
PercP Peridina-clorofila
RNA Ácido Ribonucléico
RT-PCR Reação em cadeia da polimerase em Tempo Real
SVS Secretaria de Vigilância em Saúde
TARV Terapia antiretroviral altamente potente
TCR Receptor de células T
Th 1 e 2 Linfócitos T helper (auxiliar) do tipo 1 e 2
TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Distribuição do número de casos de leishmaniose visceral registrados no Brasil. (Fonte: Sistema de Informação de Agravos de Notificação/SVS/MS, 2010). ...3
Figura 2: Formas evolutivas de Leishmania sp. Adaptado de (Manual/MS/SVS, 2006). ...4
Figura 3: Manifestações clínicas da leishmaniose visceral Adaptado de (Manual/MS/SVS, 2006). ...5
Figura 4: Número de novos casos de infecção pelo HIV, de mortes por AIDS e de pessoas portadoras do vírus no período de 2001 a 2012, a nível global. Fonte: OMS, 2013. ...8
Figura 5: Distribuição por região da prevalência da infecção pelo HIV em adultos de 15 a 49 anos no mundo em 2011. Fonte: OMS, 2011...8
Figura 6: Taxa de incidência (por 100.000 habitantes) dos casos de AIDS em jovens de 15-24 anos de idade, segundo sexo, por ano de diagnóstico e razão de sexos, do período de 1990 a
2010. Fonte: Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais/SVS/MS,
2012...9
Figura 7: Esquema mostrando de forma simplificada o ciclo replicativo do HIV-1. Fonte: Adaptado de Nature Reviews Microbiology, 2012...11
Figura 8: Curso clínico, imunológico e virológico da infecção pelo HIV-1. CTLs: Células T Citotóxicas; PBMC: Células Mononucleares do Sangue Periférico (Adaptado de Goulder et al., Nature Review Immunology, 2004)... 12
Figura 9: Esquema demonstrando o aumento da proporção de linfócitos T chamados de altamente diferenciados e a exaustão dos recursos primários em indivíduos infectados pelo HIV-1 (Adaptado de Appay et al., 2007). ...HIV-19
xiv
Figura 10: Países com leishmaniose endêmica e com a coinfecção Leishmania/HIV. Distribuição global da leishmaniose (azul claro) e países com relatos de coinfecção (azul escuro). Reproduzido de Cruz et al., 2006. ...20
Figura 11: Modelo de análise da expressão fenotípica dos marcadores de ativação celular HLA-DR e CD38 dentro das subpopulações linfocitárias T CD4+ e T CD8+. ...30
Figura 12: Modelo de análise da expressão fenotípica dos marcadores de diferenciação celular CD45RO e CCR7 dentro das subpopulações linfocitárias T CD4+ e T CD8+. ...31
Figura 13: Modelo de análise da expressão fenotípica dos marcadores de senescência celular CD57⁺/CD27⁻ dentro das subpopulações linfocitárias de T CD4+ e T CD8+. ...32
Figura 14: Contagem absoluta das subpopulações de linfócitos T CD4+ de pacientes de
coinfecção leishmaniose visceral e HIV. ...36
Figura 15: Avaliação individual das contagens de linfócitos T CD4⁺ dos pacientes coinfectados
LV/HIV demonstrada de forma prospectiva. ...40
Figura 16: Contagens absolutas de linfócitos T CD4⁺ nos pacientes coinfectados LV/HIV, vistas
nas fases ativa, pós-tratamento, seis meses e doze meses pós-tratamento. ...41
Figura 17: Ganho de linfócitos T CD4⁺ em relação à fase ativa da LV em três diferentes períodos do acompanhamento: fase tratamento, seis meses tratamento e doze meses pós-tratamento. ...42
Figura 18: Correlação entre os níveis plasmáticos de RNA viral do HIV (carga viral) e as contsgens de linfócitos T CD4+ dos pacientes coinfectados na fase ativa e pós-tratamento da LV. ...45
Figura 19: Populações de linfócitos T CD8+ e T CD4+ expressando as moléculas CD38 e
xv
Figura 20: Avaliação prospectiva dos níveis de ativação celular representados pelas populações de linfócitos T CD8+ e T CD4+ expressando as moléculas CD38 e HLA-DR. ....49
Figura 21: Percentual de células CD38+ HLA-DR+ na população de linfócitos T CD8+ de todos
os pacientes coinfectados LV/HIV avaliados, visto nas fases ativa, pós-tratamento, seis meses pós-tratamento e doze meses pós-tratamento. ...50
Figura 22: Percentagem de linfócitos TMC CD45RO+CCR7+ em linfócitos T CD4+ e T CD8+ em
pacientes de coinfecção leishmaniose visceral e HIV/AIDS. ...53
Figura 23: Percentagem de linfócitos TME CD45RO+CCR7- em linfócitos T CD4+ e T CD8+ em
pacientes de coinfecção leishmaniose visceral e HIV/AIDS. ...55
Figura 24: Percentagem de linfócitos TME CD45RO+CCR7- em linfócitos T CD4+ e T CD8+ de
todos os pacientes coinfectados LV/HIV nas fases ativa, tratamento, seis meses pós-tratamento e doze meses pós-pós-tratamento. ...57
Figura 25: Avaliação prospectiva dos níveis de memória central (TMC – CD45RO⁺CCR7⁺) e
memória efetora (TME - CD45RO⁺CCR7⁻) nas populações de linfócitos T CD4⁺e T
CD8...58
Figura 26: Populações de linfócitos T CD4+ e T CD8+ expressando o fenótipo CD57⁺CD27⁻ em
pacientes de coinfecção leishmaniose visceral e HIV/AIDS. ...60
Figura 27: Populações de linfócitos T CD8+ e T CD4+ expressando o fenótipo CD57⁺CD27⁻de
todos pacientes coinfectados LV/HIV avaliados, visto nas fases ativa, pós-tratamento, seis meses pós-tratamento e doze meses pós-tratamento. ...62
Figura 28: Avaliação prospectiva do grau de senescência replicativa através da expressão do fenótipo CD57⁺CD27⁻ nas populações de linfócitos T CD4⁺ e T CD8⁺. ...63
xvi
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1: Critérios do CDC para a classificação da infecção pelo HIV, 1993. ...14
Tabela 1: Características clínicas e epidemiológicas dos pacientes infectados pelo HIV com leishmaniose visceral (LV/HIV). ...34
Tabela 2: Níveis de carga viral plasmática dos pacientes coinfectados LV/HIV nas quatro principais fases avaliadas. ...43
xvii RESUMO
A coinfecção Leishmania/HIV vem sendo considerada uma associação em várias regiões do mundo e a evolução da doença é agravada pelo comprometimento imune causado por ambos os patógenos. A ativação crônica é um dos principais substratos imunopatogênicos decorrentes da infecção pelo HIV-1 e também pela Leishmania infantum. Altos níveis de ativação linfocitária já foram observados na fase ativa de pacientes coinfectados LT/HIV, enquanto na fase de remissão estes foram baixos. Além disso, pacientes com a forma visceral da doença (LV/HIV) apresentaram níveis elevados de ativação celular apesar do uso de TARV e do tratamento
anti-Leishmania. Tal ativação crônica vem sendo associada ao alto turnover de células T, com
subsequente aumento de células senescentes e diminuição do output tímico pela exaustão dos recursos imunes primários, semelhante ao que ocorre em indivíduos idosos sadios. Neste contexto, este estudo teve por objetivo avaliar a influência da infecção por L. infantum no grau de comprometimento quantitativo e qualitativo dos linfócitos T e na ativação do sistema imune de pacientes coinfectados. Foram estudados 13 pacientes com coinfecção LV/HIV, acompanhados prospectivamente desde a fase ativa da LV até 12 meses pós-tratamento (oito visitas). Como controles, foram avaliados indivíduos portadores de LV negativos para o HIV-1 (n=6), indivíduos infectados pelo HIV-1 e sem história de leishmaniose (n=17), e indivíduos saudáveis para ambas as infecções (n=12). O comprometimento imune foi avaliado através das contagens absolutas de linfócitos T por mm3 (CD3+/CD4+, CD3+/CD8+) no sangue e pela expressão de moléculas associadas à ativação celular (CD38/HLA-DR), à senescência replicativa (CD57) e à diferenciação (CD45RO/CCR7) ex vivo por citometria de fluxo. Os resultados obtidos foram correlacionados a parâmetros clínicos e laboratoriais utilizados no acompanhamento desses pacientes de coinfeccão (contagens de linfócitos T CD4+, carga viral). Os pacientes coinfectados LV/HIV apresentaram baixas contagens de linfócitos T CD4+ durante a fase ativa da doença que foram mantidas nas fases pós-tratamento. Simultaneamente, altos níveis de ativação celular foram observados, especialmente na população de linfócitos T CD8+, porém esse achado não teve correlação positiva com a carga viral plasmática, já que esta se manteve baixa ou indetectável para a maioria dos pacientes. Por outro lado, os níveis de ativação celular em T CD8+ se correlacionaram negativamente com as contagens de linfócitos T CD4+. Os casos LV/HIV apresentaram freqüências elevadas de células T de memória efetora em TCD4+ e TCD8+. Os níveis de células T de memória central foram baixos nas duas subpopulações linfocitárias, embora tenham sido diferentes dos casos de HIV-1 apenas na fase ativa da doença. Finalmente, os altos percentuais de células senescentes/diferenciadas (CD57⁺CD27-) ex vivo na população de linfócitos T CD4+ e T CD8+ encontrados neste estudo refletiram um sistema imune cronicamente ativado nesses pacientes coinfectados, que não se modificou apesar da TARV e do tratamento anti-Leishmania. Os baixos níveis de T CD4+ na vigência de viremia baixa sugerem que mecanismos patogênicos associados à LV piorem a imunossupressão na AIDS. Além disso, o status de ativação celular contribui para a depleção de linfócitos T CD4+ nesses pacientes ao longo de todo o acompanhamento. Finalmente, o uso da profilaxia secundária para a LV não impediu as recidivas de alguns pacientes. Estudos prospectivos avaliando tais parâmetros frente aos antígenos parasitários e/ou virais poderão auxiliar a validar o papel de parâmetros imunológicos no prognóstico da associação
Leishmania/HIV.
xviii ABSTRACT
Leishmania/HIV co-infection has been considered as an association in various regions of
the world and the evolution of the disease is aggravated by immune impairment caused by both pathogens. Chronic activation is a hallmark of HIV-1 infection and also of Leishmania infantum. High levels of lymphocyte activation have been observed in the active phase of TL/HIV coinfected patients, while in remission phase these were low. Furthermore, patients with the visceral form of the disease (VL/HIV) showed elevated levels of cellular activation despite the use of HAART and anti-Leishmania. Such chronic activation has been associated with a high
turnover of T cells, with subsequent increase in the senescent cells and decreased thymic output due to exhaustion of primary immune resources, similar to what occurs in healthy elderly individuals. In this context, this study aimed to evaluate the influence of L. infantum infection in the degree of quantitative and qualitative impairment of T lymphocytes and in the immune system activation of coinfected patients. We studied 13 VL/ HIV coinfected patients who were prospectively followed from the active phase of VL up to 12 months post-treatment (eight visits). As controls, we evaluated subjects with VL negative for HIV-1 infection (n = 6), individuals infected with HIV-1 and no history of leishmaniasis (n = 17) and healthy subjects for both infections (n = 12). The immune impairment was evaluated by the absolute count of T-lymphocytes per mm3 (CD3+/ CD4+, CD3+/CD8+ cells) in the blood and the ex vivo expression of molecules associated with cell activation (CD38/HLA-DR), to replicative senescence (CD57) and to cellular differentiation (CD45RO/CCR7) by flow cytometry.The results were correlated with clinical and laboratory parameters used to monitor these coinfected patients (counts of CD4+ T lymphocytes and viral load). Coinfected patients showed low counts of CD4+ T lymphocytes during the active phase of the disease, which remained in the post-treatment phase. Simultaneously, high levels of cellular activation were observed, especially in the CD8+ T cells. Such levels seem to decrease over time after treatment for most patients. Despite this, no positive correlation with plasma viral load was observed, since this remained low or undetectable in the majority of patients. Moreover, the levels of cellular activation in CD8+ T cells were negatively correlated with the CD4+ T counts. VL/HIV cases presented high frequencies of effector memory T cells in both CD4+ T and CD8+ T cells. Levels of central memory T cells were low in both lymphocyte subpopulations, although they were different from HIV-1 cases only in the active phase of the disease. Finally, the high percentages of senescent/differentiated cells (CD57⁺CD27
-) ex vivo on CD8+ T cells may reflect a chronically activated immune system in these coinfected patients, which has not changed despite ART and anti-Leishmania treatment. Low levels of CD4+ T cells along with low viral load suggest that pathogenic mechanisms associated with VL can worsen the immunosuppression of AIDS. In addition, the status of cellular activation contributes to the depletion of CD4+ T lymphocytes in these patients throughout the follow-up. Finally, the use of secondary prophylaxis for LV did not prevent relapses in some patients. Prospective studies evaluating such parameters against parasitic and/or viral antigens may help to validate the role of immunological parameters in the prognosis of association Leishmania/HIV.
1
2. INTRODUÇÃO
2.1. Leishmaniose visceral
2.1.1. Epidemiologia da leishmaniose visceral
A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose caracterizada por uma evolução crônica e envolvimento sistêmico, que se não tratada resulta em morte de 90% dos casos. É causada por diferentes espécies do gênero Leishmania, e nas Américas, a espécie Leishmania (L.) infantum é o agente etiológico da doença. A leishmaniose visceral é transmitida por vetores da família
Psychodidae e do gênero Lutzomyia, e no Brasil a principal espécie do vetor é Lu. longipalpis
(Maia-Elkhoury et al., 2008). Os parasitos causadores desta doença infecciosa são intracelulares obrigatórios, infectando células da linhagem fagocítica mononuclear de mamíferos, dentre eles os seres humanos. Os reservatórios silvestres potenciais da LV são a raposa (Lycalopex vetulus and Cerdocyon thous) e o gambá (Didelphis albiventris). O cão (Canis familiaris) é considerado o reservatório doméstico de L. infantum e é identificado como a principal fonte de infecção para o vetor (Da-Cruz e Pirmez, 2005).
A LV é endêmica em 65 países, com aproximadamente 500.000 novos casos reportados anualmente (Maia-Elkhoury et al., 2008). Dados recentes da OMS estimaram que noventa por cento dos casos de LV ocorrem em Bangladesh, Brasil, Índia, Etiópia, Nepal e Sudão (OMS, 2013). Recentemente, uma revisão dos dados epidemiológicos sobre as leishmanioses revelou uma incidência anual de 0,2 a 0,4 milhões de casos de LV (Alvar et al., 2012). Levando-se em conta as subnotificações e o crescimento da população mundial nos últimos vinte anos, pode-se considerar que estes números sejam ainda maiores do que os relatados.
No Brasil, a LV é uma das maiores preocupações em saúde pública devido à sua alta morbi-mortalidade nos casos não tratados (Andrade-Barata et al., 2013), contabilizando aproximadamente 90% dos casos que ocorrem nas Américas. As leishmanioses, de um modo geral, encontram-se amplamente distribuídas, com maior incidência na zona rural, entretanto com expansão, principalmente no que se refere a LV, para as zonas peri-urbanas e urbanas. Acredita-se que a urbanização da LV resulte de alterações ambientais antropogênicas e da intensa migração das populações rurais para periferias urbanas (Maia-Elkhoury et al., 2008). Nas últimas décadas, essas alterações ambientais causadas pelo homem, tais como o desmatamento, juntamente com o crescimento desordenado das cidades, a presença concomitante de Lu.
2
longipalpis e do reservatório doméstico, além das precárias condições de habitação da
população, têm contribuído para a urbanização e expansão geográfica da LV no Brasil, bem como para a emergência de novos focos ou reemergência de focos antigos.
Atualmente, a LV encontra-se em constante expansão geográfica, estando distribuída em 21 unidades federadas, atingindo as cinco regiões brasileiras (Boletim Epidemiológico, MS/SVS, 2011). Com a constante urbanização da doença, dados apontam que o número de casos registrados no país aumentou de 700 em 1980 para 3500 em 2005 (OMS, 2007), onde no decorrer do período de 1980 a 2005 foram registrados 59.129 novos casos da doença, com uma média anual de 2.274 novos casos, sendo que 82,5 % (48.783) destes ocorreram na região nordeste (Maia-Elkhoury et al., 2008). No entanto, a LV se espalha gradualmente para as regiões centro-oeste, norte e sudeste, aumentando o número de casos nestas regiões de 15% em 1998 para 44% em 2005. Segundo o último boletim da Secretaria de Vigilância em Saúde, foram relatados 3.894 novos casos de LV em 2011, com incidência de 1,8 por 100.000 habitantes (Brasil, MS/SVS, 2013).
No que se refere à coinfecção Leishmania/HIV, esta emerge como uma entidade patológica grave e cada vez mais frequente em várias regiões do planeta, fazendo com que a coinfecção seja considerada como um agravo emergente, sobretudo no nosso país. O diagnóstico da coinfecção Leishmania/HIV pode ter implicações na abordagem da leishmaniose quanto à indicação terapêutica, ao monitoramento de efeitos adversos, à resposta terapêutica e à ocorrência de recidivas. No Brasil, conforme as recomendações do Ministério da Saúde deve-se oferecer a sorologia para HIV a todos os pacientes com LV e LT, independentemente da idade deste (Ministério da Saúde, 2011). Desta forma, quando um indivíduo é diagnosticado com LV, o teste rápido para diagnóstico da infecção pelo HIV-1/2 poderá ser oferecido nas Unidades de Pronto-Atendimento (UPAs) por médicos e/ou enfermeiros, independentemente da realização de teste anterior, e com os devidos aconselhamentos pré e pós-testes para os pacientes com idade superior a 18 meses (Coordenação municipal de DST-AIDS, 2012).
3
Figura 1: Distribuição do número de casos de leishmaniose visceral registrados no Brasil. (Fonte: Sistema de Informação de Agravos de Notificação/SVS/MS, 2010).
2.1.2. O parasito
Protozoários do gênero Leishmania são parasitos intracelulares obrigatórios que causam um amplo espectro de doenças conhecidas de um modo geral como leishmanioses humanas. As manifestações destas doenças variam entre diferentes formas clínicas, que são conhecidas como leishmaniose tegumentar (LT) e leishmaniose visceral. A LT é subdividida em: leishmaniose cutânea (LC), caracterizada por lesões cutâneas autolimitadas, leishmaniose mucosa (LM), afetando membranas mucosas de boca, nariz e faringe, leishmaniose cutânea-difusa (LCD), a forma anérgica da doença e a leishmaniose disseminada (LD), quando mais de oito lesões são encontradas, podendo estar associadas a lesões mucosas. A LV é a forma mais grave e potencialmente fatal (Bhattacharya e Ali, 2013).
A LV, portanto, é causada por parasitos do gênero Leishmania (filo Protozoa, supergrupo Excavata, subdivisão Kinetoplastea, ordem Kinetoplastida, família Trypanossomatidae), sendo este gênero dividido em dois subgêneros: Leishmania e Viannia, de acordo com o local de desenvolvimento do parasito no intestino do vetor (Shaw, 1994, Cupolillo, 2000). O subgênero
Leishmania inclui as principais espécies causadoras da leishmaniose visceral, Leishmania (Leishmania) infantum e Leishmania (Leishmania) donovani.
4
Os vetores, por sua vez, são representados por insetos denominados flebotomíneos do gênero Phlebotomus no Velho Mundo e do gênero Lutzomyia no Novo Mundo. O vetor infectado regurgita parte do conteúdo do seu tubo digestivo durante o repasto sanguíneo no hospedeiro vertebrado, transmitindo as formas promastigotas metacíclicas para este. As formas promastigotas são rapidamente fagocitadas por células de defesa, especialmente macrófagos, e dentro do vacúolo fagocítico (fagossomo) se transformam em amastigotas que, por sua vez, vão dividir-se por divisão binária e infectar outros macrófagos.
(A) (B)
Figura 2: Formas evolutivas de Leishmania sp. Adaptado de (Manual/MS/SVS, 2006). (A) Formas promastigotas flageladas; (B) replicação das formas amastigotas dentro do macrófago.
2.1.3. Manifestações clínicas e imunopatogenia da leishmaniose visceral
A LV, também conhecida como calazar, caracteriza-se como uma forma sistêmica da doença, de modo que as formas amastigotas apresentam acentuado tropismo pelo sistema fagocítico mononuclear do baço, fígado, medula óssea e linfonodos.
Um paciente com leishmaniose visceral apresenta sinais e sintomas como febre persistente de baixo grau, hepatoesplenomegalia, caquexia, pancitopenia e hipergamaglobulinemia (figura 3). O parasito reside, primariamente, dentro de macrófagos do fígado, baço e medula óssea, e o curso da doença indica uma deficiência subjacente em mecanismos imunológicos de defesa do hospedeiro (Bhattacharya e Ali, 2013).
5 (A) (B)
Figura 3: Manifestações clínicas da leishmaniose visceral. Adaptado de (Manual/MS/SVS, 2006). (A) e (B) Pacientes com LV apresentando uma hepatoesplenomegalia característica da infecção.
Estudos anteriores da infecção por Leishmania sugeriram que a resposta imunológica tanto em LC quanto na LV humana estaria associada com a interação de padrões de citocinas T helper 1 (Th1)/ T helper 2 (Th2) em ambos os tipos celulares e depleção das respostas linfoproliferativas (Bhattacharya e Ali, 2013). A imunopatogênese da LV, por sua vez, é bastante complexa, já que envolve o comprometimento de diferentes órgãos do sistema imune gerando, em consequência, alterações em outros compartimentos. A princípio, a infecção dos macrófagos pela Leishmania na LV leva a uma reposição dessa linhagem de células pela medula óssea e, consequentemente, desvia a produção de outras células como eritrócitos, plaquetas e até mesmo de progenitores linfócitos T, o que causa o aparecimento de sinais característicos da infecção como anemia, hemorragias e comprometimento da resposta celular. Dessa forma, a LV evolui com uma imunossupressão da resposta imunológica celular.
A natureza supressora da resposta imune durante a LV ativa seria principalmente específica para antígenos de Leishmania, já que testes de hipersensibilidade do tipo tardia (teste de Montenegro) para estes antígenos apresentam-se negativos (Goto e Prianti, 2009) e também ocorre a redução da resposta proliferativa de células T auxiliares mediante estímulo com antígenos do parasito in vitro (revisto por Saha et al., 2006). A incapacidade de produção de citocinas IL-2 e IFN-γ pelas células mononucleares, e a restauração dessa produção após a quimioterapia é bem documentada (Carvalho et al., 1985). Estudos imunológicos mais recentes apresentam a IL-10 como o principal fator da imunopatogênese da LV, evidenciada através de recentes observações a nível celular e de RNA mensageiro (Bhattacharya, 2013, Ali, 2013). A LV, portanto, está associada à produção de IL-10 juntamente com a produção de IL-4 que podem
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inibir a expansão de células do perfil tipo 1 e a ativação de macrófagos pelo IFN-γ (Carvalho et al., 1994). No entanto, os mecanismos que levam à imunossupressão ainda são amplamente desconhecidos, embora se tenha a convicção de que antígenos do parasito são cruciais neste processo. Ainda em relação ao perfil de citocinas, os níveis de INF-γ no soro permanecem altos, sugerindo que suas fontes podem ser os órgãos linfoides no qual os parasitos se proliferam (Bhattacharya, 2013, Ali, 2013). Além disso, pacientes com LV ativa apresentam maiores proporções de células T CD8+ do que células T CD4+ que poderiam estar relacionadas à secreção de IL-10 endógena e, consequentemente, à progressão da LV (Holaday, 2000).
Por fim, já foi visto que indivíduos que apresentam LV autoresolutiva ou até mesmo aqueles que são submetidos a uma quimioprofilaxia bem-sucedida manifestam uma intensa resposta de hipersensibilidade tardia mediada por células e, ainda, são capazes de apresentar maiores proporções de células T CD4+ do tipo Th1 específicas do que células T CD8+ (revisto por Goto et al., 2004; Saha et al., 2006). Além disso, combinação de citocinas, como IL-2 e INF-γ exógenos, pode restaurar a resposta linfoproliferativa, da mesma forma que a combinação de anti-IL-4 e anti-IL-10 não só restaura esta resposta, como também é capaz de restaurar a produção de IFN-γ em culturas de células de pacientes com LV (Carvalho et al., 1994). Dessa forma, tais resultados indicam que uma mudança no perfil de resposta para o tipo 1 poderia auxiliar a resolução da infecção na leishmaniose visceral.
2.2. Síndrome da Imunodeficiência adquirida – AIDS
2.2.1. Epidemiologia da infecção pelo HIV-1
De acordo com dados recentes da Organização Mundial de Saúde (WHO, do inglês World Health Organization), estima-se que aproximadamente 35.3 (32.2–38.8) milhões de pessoas no mundo estão infectadas pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV, do inglês
Human Immunodeficiency Virus) em 2012, sendo que o vírus do tipo 1 (HIV-1) é o responsável
majoritário por esta pandemia. Ainda em 2012, dados da OMS apontam que existiram 2.3 (1.9– 2.7) milhões de novos casos de infecções pelo HIV em todo o mundo, o que mostra um declínio de 33% no número de novas infecções quando comparados com dados de 2001, onde foram estimados 3.4 (3.1–3.7) milhões de novos casos. Ao mesmo tempo, o número de mortes pela Síndrome da Imunodeficiência Humana Adquirida (AIDS) também apresentou um declínio, com 1.6 (1.4–1.9) milhões de mortes por AIDS em 2012, comparado com 2.3 (2.1–2.6) milhões de
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mortes em 2005 (Figura 4). Além disso, se teve um aumento na adesão da terapia antiretroviral comparado aos anos anteriores, aumentando a expectativa de vida dos pacientes HIV positivos (OMS, 2013).
Na América Latina, estima-se que em 2012 existiam cerca de 1.5 (1.2 – 1.9) milhões de pessoas infectadas pelo HIV em todas as faixas etárias, ocorrendo aproximadamente 86.000 (57.000 – 150.000) novos casos de infecção neste mesmo ano (UNAIDS, 2012). Também em 2012, dados da OMS mostraram uma prevalência de 0.5% (0.3 – 0.5) de indivíduos HIV positivos entre 15 e 49 anos (figura 5), com a ocorrência de aproximadamente 85.000 (61.000 – 110.000) mortes por AIDS em todo o continente americano (OMS, 2011). No Brasil, assim como em outros países do mundo, os números desta epidemia também são bastante significativos. Desde 1980 até junho de 2012 já foram registrados 656.701 casos de AIDS, com uma taxa de incidência de 20,2 casos de AIDS (por 100.000 habitantes) em 2011, sendo notificados 253.706 óbitos durante este mesmo período (Boletim Epidemiológico do Ministério da Saúde - 2012). Estima-se que, atualmente, existam cerca de 600.000 (530.000 – 660.000) indivíduos infectados, com a ocorrência de uma margem de 11.000 a 19.000 óbitos no ano de 2012 (UNAIDS, 2012). Apesar desses dados alarmantes, o número de casos novos parece estar diminuindo desde 2001, o que pode ser devido ao maior uso de terapia antiretroviral ou mesmo mudanças no comportamento das pessoas e maior adesão às medidas preventivas (figura 5).
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Figura 4: Número de novos casos de infecção pelo HIV (A), de mortes por AIDS (B) e de pessoas portadoras do vírus (C) no período de 2001 a 2012, a nível global. Fonte: OMS, 2013.
Figura 5: Distribuição por região da prevalência da infecção pelo HIV em adultos de 15 a 49 anos no mundo em 2011. Fonte: OMS, 2011.
NÚ M E RO DE M ORT E S P OR AIDS
MORTES POR AIDS, GLOBAL, 2001-2012 N Ú MER O D E PES SO A S VI VEN D O C O M H IV
PESSOAS VIVENDO COM HIV, GLOBAL 2001-2012 NÚ M E RO DE N OV AS INF E CÇ ÕE S
NOVAS INFECÇÕES PELO HIV, 2001-2012 ESTIMATIVA ACIMA ESTIMATIVA ESTIMATIVA ABAIXO (A) (B) (C)
Prevalência da infecção pelo HIV em adultos (15-49 anos), por região. OMS, 2011.
Prevalência (%) por região, OMS:
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A disseminação do HIV-1 tem apresentado um importante impacto tanto demográfico quanto social e econômico, sobretudo nas áreas mais afetadas pela pandemia, como a África Subsaariana, bem como países em desenvolvimento. No Brasil, a epidemia se concentra em populações em situações de vulnerabilidade, tais como homens que fazem sexo com homens (HSH), travestis, profissionais do sexo e usuários de drogas, apesar de ocorrer uma constante heterossexualização, feminização (figura 6), pauperização e ruralização da epidemia. Além disso, está ocorrendo um aumento do número de casos entre pessoas com baixa escolaridade, o que reforça a necessidade de manter programas de prevenção e tratamento dessa infecção. Vale ressaltar que se observa uma tendência ao aumento na prevalência da infecção pelo HIV nos jovens (figura 6). A principal e mais forte estratégia de prevenção adotada pelo Brasil é a focalização das ações nas populações mais vulneráveis, oferecendo acesso ao preservativo, combinado com intervenções comunitárias, além da oferta de teste anti-HIV para um diagnóstico cada dia mais precoce (Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais/SVS/MS, 2012).
Figura 6: Taxa de incidência (por 100.000 habitantes) dos casos de AIDS em jovens de 15-24 anos de idade, segundo sexo, por ano de diagnóstico e razão de sexos, do período de 1990 a 2010. Fonte: Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais/SVS/MS, 2012.
2.2.2. História e bases da infecção pelo HIV-1
Em Junho de 1981, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC, do inglês Centers for Disease Control and Prevention) publicou o Relatório Semanal de Mortalidade e Morbidade (MMWR, do inglês Morbidity and Mortality Weekly Report) descrevendo casos de
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uma infecção pulmonar grave, causada por Pneumocystis carinii, em jovens homossexuais previamente saudáveis, nos Estados Unidos, além do relato da ocorrência de casos de sarcoma de Kaposi também em jovens homossexuais. Entretanto, somente após dois anos, em 1983, o HIV-1 foi isolado e definido como o agente etiológico da AIDS (Barré-Sinoussi et al., 1983; Gallo et al., 1984).
O HIV-1 pertence ao gênero Lentivirus, família Retroviridae, subfamília Lentivirinae. Com aproximadamente 100 nm de diâmetro, sua estrutura é formada por um núcleo protéico contendo duas cópias idênticas de RNA de 9,2 kb, que constituem seu genoma e enzimas virais (transcriptase reversa, integrase e protease), envolvidos por um envelope lipoprotéico, no qual se inserem as proteínas gp120 e gp41 (Grotto e Pardini, 2006). Caracteriza-se por se replicar através da transcrição reversa de seu material genético em molécula de DNA, ao qual é integrada ao DNA da célula hospedeira. A integração do DNA viral ao DNA da célula hospedeira garante a proteção contra a degradação por nucleases celulares, tornando-o parte do genoma humano (Morrow et al., 1994).
As células-alvo do HIV-1 são aquelas que expressam a molécula de superfície celular CD4, como monócitos, macrófagos, células dendríticas e células microgliais do sistema nervoso central, mas principalmente os linfócitos T CD4⁺. O início do ciclo replicativo viral ocorre com a ligação da proteína gp120 do envelope viral com a molécula de CD4 da célula-alvo. Após essa interação inicial, a alça V3 da gp120 torna-se exposta e apta à ligação com correceptores (receptores de citocinas), principalmente CCR5 e CXCR4. A distribuição desses correceptores permite não só a infecção de linfócitos T CD4+, bem como de células centrais para a apresentação de antígenos, como macrófagos e células dendríticas. Ocorre, então, uma fusão das membranas celular e viral, processo mediado pela gp41. O nucleocapsídeo viral penetra no citoplasma celular, liberando o RNA do vírus, que pela ação da transcriptase reversa é convertido em DNA. Uma vez sintetizado, o DNA viral é integrado ao cromossomo celular pela ação da enzima integrase (Grotto e Pardini, 2006). Na fase final da replicação viral é realizado o processamento das poliproteínas virais, a organização das proteínas virais na membrana plasmática celular, a formação e liberação de uma nova partícula viral imatura para o meio extracelular. Posteriormente, a partícula viral sofre o processo de maturação, tornando-se uma partícula viral madura infectante por meio da ação da enzima protease (figura 7).
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Figura 7: Esquema mostrando de forma simplificada o ciclo replicativo do HIV-1. Fonte: Adaptado de Nature Reviews Microbiology, 2012.
2.2.3. Curso clínico e Imunopatogenia da infecção pelo HIV-1
O curso clínico natural da infecção pelo HIV-1 divide-se em três fases: infecção primária ou aguda, fase assintomática ou de latência clínica e fase sintomática, também definida por AIDS (revisto por Pantaleo e Fauci, 1996). A fase primária é definida como o período inicial da infecção pelo HIV, sendo caracterizada pelo aparecimento de sintomas semelhantes aqueles apresentados por uma mononucleose, além de caracterizar-se pelo desenvolvimento de uma resposta imunológica de anticorpos (fase de soroconversão) detectáveis por testes específicos para diagnóstico. É na fase primária que também são encontrados altos níveis de replicação viral acompanhados por uma queda significativa do número de linfócitos T CD4+ circulantes e, como já mencionado, sintomas clínicos inespecíficos, comuns a diversas outras viroses. Após as mudanças dramáticas na contagem de linfócitos T CD4⁺ e na carga viral ocorridas na fase aguda de infecção, um equilíbrio relativo entre a replicação viral e a imunidade do hospedeiro é atingido e, com isso, os indivíduos infectados passam a apresentar pouca ou nenhuma
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manifestação clínica, caracterizando a fase assintomática ou de latência clínica da infecção. No entanto, esta fase apresenta uma perda contínua e gradual de linfócitos T CD4+, cujos valores não serão mais recuperados em ausência de terapia. O período entre a infecção inicial e o desenvolvimento de AIDS pode ser longo, durando até 10 anos, mesmo na ausência de terapia antirretroviral (Picker, 2006). A fase sintomática, ou AIDS, é definida de acordo com critérios estabelecidos pelo CDC, tais como, contagem de linfócitos T CD4⁺ <200 células/µL e o aparecimento e/ou reaparecimento de doenças oportunistas, bem como de neoplasias (CDC, 1993), os quais são favorecidos pelo quadro de imunodeficiência grave, caracterizando a fase de AIDS, que culmina em óbito do indivíduo na ausência de terapia (figura 8). Para a maioria dos indivíduos infectados, os chamados progressores típicos, este é o curso clínico observado para a infecção (Pantaleo e Fauci, 1996).
Figura 8: Curso clínico, imunológico e virológico da infecção pelo HIV-1. CTLs: Células T Citotóxicas; PBMC: Células Mononucleares do Sangue Periférico (Adaptado de Goulder et al., Nature Review Immunology, 2004).
A infecção pelo HIV prejudica o sistema imunológico, levando o indivíduo infectado a ser mais vulnerável a uma variedade de outras doenças infecciosas, chamadas de infecções oportunistas. Isso ocorre pelo fato dos linfócitos T CD4+ serem os principais alvos da infecção
FASE AGUDA FASE CRÔNICA AIDS
Tempo depois da infecção: Semanas Anos
Vírio ns p or m L de p la s m a Cél ul a s T CD 4 ⁺ p or µL de s a ng ue CTLs (% c é lu la s T CD8 ⁺/ c é lul a s T CD3 ⁺ e m PB M C fres c o) Células T CD4⁺ Vírus vÍRUS CTLs Anticorpo vÍRUS
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pelo HIV-1 e, por desempenharem um papel central no desenvolvimento da resposta imune específica contra o vírus, pode-se afirmar que a perda progressiva no número dessas células favorece o estabelecimento do quadro de imunodeficiência grave observada nesses pacientes (Pantaleo and Fauci, 1995). Portanto, o efeito da infecção pelo HIV-1 sobre o sistema imune é monitorado através da contagem dos linfócitos T CD4⁺ no sangue periférico, sendo o principal parâmetro imunológico utilizado no acompanhamento da infecção pelo HIV-1, e contribui para uma avaliação da progressão da doença, início de profilaxias para as doenças oportunistas e para a submissão à terapia antiretroviral, além de também ser utilizada na avaliação da reconstituição imune pós-tratamento (Miller et al., 1999). Desta forma, uma contagem normal de células T CD4⁺ (aproximadamente entre 600 e 1200 células/µL) indica que o sistema imune não tem sofrido danos o suficiente para que se tenham riscos de aparecimento infecções oportunistas (Hare, 2009).
A infecção pelo HIV é categorizada clinicamente segundo os critérios do CDC (Centers for Disease Control, EUA) de 1993 através da contagem de linfócitos T CD4⁺ no sangue periférico, definindo AIDS quando se tem <200 células/µL ou <14% de linfócitos totais, mesmo na ausência das condições clínicas listadas pelo CDC. Uma segunda classificação estabelecida pelo CDC para definição dos casos de AIDS se refere às categorias clínicas. Na categoria A são alocados os pacientes assintomáticos, os quais apresentam linfadenopatia generalizada persistente ou infecção aguda. Os pacientes que se enquadram na categoria C apresentam as doenças definidoras de AIDS, tais como candidíase oral, carcinoma cervical in situ, herpes zoster, neuropatia periférica, dentre outras. Os pacientes da categoria B são aqueles sintomáticos que não se enquadram na categoria A ou C (MMWR, 1992). Por outro lado, a categorização através da contagem de linfócitos T CD4⁺ deverá ser baseada na menor e mais precisa contagem dessas células, e não necessariamente na mais recente delas (Quadro 1). Desta forma, se um indivíduo apresentou em algum momento durante alguns meses de acompanhamento uma contagem de 180 células/µL, por exemplo, mas atingiu novamente uma contagem acima de 200 células/µL, este deve ser classificado na categoria 3, e não na categoria 2 (Hare, 2009).
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Quadro 1. Critérios do CDC para a classificação da infecção pelo HIV, 1993.
Os pacientes da categoria C ou com contagem de linfócitos T CD4+ menor que 200 células por mm3 são caracterizados como pacientes com AIDS, que se encontram hachurados em cinza no quadro acima.
Os mecanismos precisos envolvidos na depleção progressiva dos linfócitos T CD4⁺ ainda não estão bem caracterizados. Já foi demonstrado em alguns trabalhos que a infecção e morte direta dessas células pelo vírus contribuem parcialmente para essa depleção (Douek et al., 2002), pois mesmo após a terapia antiretroviral, a recuperação de células T CD4+ pode ser incompleta, apesar da supressão da carga viral para níveis abaixo de 50 cópias/ml. A partir disso, podemos sugerir que os efeitos indiretos da infecção viral sobre o sistema imune também são importantes. Dentre os outros mecanismos apontados como responsáveis por essa perda contínua estão o movimento alterado de células T para os órgãos linfoides secundários, que leva a uma aparente perda de células T, com mudanças no número e proporção de suas subpopulações na circulação, e a profunda ativação do sistema imune, que é representada pela ativação crônica dos linfócitos T, sendo, portanto, um preditor independente da depleção das células T CD4⁺ e, consequentemente, da progressão da doença em pacientes não tratados (McCune, 2011).
A ativação crônica do sistema imune, como já descrito anteriormente, é uma das principais características da infecção pelo HIV-1. Atualmente é amplamente aceito que este processo está diretamente relacionado à progressiva depleção de células T CD4+ e consequentemente à progressão para a AIDS (Douek et al., 2009). Vários mecanismos podem contribuir para a ativação do sistema imune na infecção pelo HIV-1, sejam eles direto ou indiretamente relacionados ao vírus.
A ativação policlonal de células B foi a primeira anomalia imunológica descrita em indivíduos infectados pelo HIV-1. Subsequentemente, foi demonstrado o aumento do “turnover” de células T, o aumento da percentagem de células T apresentando fenótipo de ativação e o aumento dos níveis de citocinas e quimiocinas no soro dos indivíduos infectados. Diante disto, o
Categorias clínicas
CD4/mm3 Categoria A Categoria B Categoria C
>500 A1 B1 C1 Categoria 1
200-499 A2 B2 C2 Categoria 2
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grau de ativação imune tem se mostrado um melhor preditor de progressão da infecção pelo HIV-1 do que a própria carga viral (Brenchley et al, 2006). Adicionalmente, tem sido bem descrito que durante a fase aguda da infecção, tanto pelo HIV-1 em humanos quanto pelo SIV em macacos Rhesus, o trato gastrointestinal é particularmente afetado pela própria infecção e pela intensa ativação do sistema imune. Isso se dá pelo fato de ocorrer uma destruição massiva de células T CD4⁺ de memória para o vírus já na fase aguda como resultado direto da infecção, mas que continua constantemente durante todo o curso da doença (Brenchley e Douek, 2008). Devido a essa depleção das células T de memória no trato gastrointestinal, e outros danos observados no tecido linfoide associado à mucosa (Brenchley e Douek, 2008), a consequente translocação de produtos microbianos vem sendo considerada no processo de ativação imune (Douek, 2007).Deste modo, microorganismos e produtos derivados dos mesmos, passariam para a circulação sistêmica, o que pode ser identificado por aumentos dos níveis plasmáticos de lipopolissacarídeos nos indivíduos infectados pelo HIV (Brenchley et al., 2006).A este processo associam-se intensa ativação de células da imunidade inata e adaptativa e níveis elevados de citocinas inflamatórias como fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina 6 (IL-6) e IL-8 (Suffedini et al., 1999), criando um ambiente cronicamente ativado e inflamatório.
Uma das maneiras de se reconhecer este ambiente de desorganização do sistema imune nos indivíduos infectados é através de uma variedade de alterações fenotípicas observadas para as células T, como o aumento da expressão de moléculas de superfície associadas à ativação do sistema imune (Benito et al., 1997, Giorgi et al., 2002, Benito et al., 2004). Essa expressão, em especial das moléculas CD38 e HLA-DR, está associada à progressão da infecção pelo HIV-1 para a AIDS, e a avaliação periódica do fenótipo dessas células pode auxiliar no monitoramento da infecção. O CD38 é uma ectoenzima multifuncional envolvida na regulação de cálcio intracelular, onde sua diminuição estaria relacionada com respostas imunológicas prejudicadas e distúrbios metabólicos, e o aumento da sua expressão na superfície celular é descrito como um marcador de ativação celular, que não está apenas ligado ao HIV-1, mas também a neoplasias de células B, tumores sólidos e diabetes tipo 2 (Chou et al., 2013).
Karim e colaboradores ao estudar um grupo de mulheres infectadas pelo HIV-1 e livres de AIDS, demonstraram a ocorrência de um aumento da expressão das moléculas CD38 e HLA-DR em linfócitos T CD4⁺ e T CD8⁺ quando foi analisado o perfil fenotípico destas pacientes, o que fez com que estas apresentassem um risco relativo de progressão para AIDS duas vezes mais alto, quando comparado com os demais grupos analisados (Karim et al., 2013).
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Alguns estudos demonstraram que a fração CD38+ das células T CD8+ aumenta progressivamente com o avanço da doença e que este aumento está associado com o declínio de células T CD4+ totais e aumento da carga viral plasmática (Benito et al., 1997; Giorgi et al., 2002; Benito et al., 2004). A ativação crônica não-específica inclui uma hiper-regulação de marcadores de ativação, como o CD38 e o HLA-DR, em linfócitos T CD8⁺, aumentando a produção de citocinas pro-inflamatórias e as alterações histológicas nos nódulos linfoides. Essa ativação persistente irá prejudicar de forma progressiva a organização funcional do sistema imune, reduzindo sua capacidade regenerativa e favorecendo a evolução viral, resultando em progressão para AIDS (Bartovská et al., 2011).
A ativação imune de células T, definida através da co-expressão de CD38 e HLA-DR, tanto em células T CD4⁺ quanto em células T CD8⁺ tem sido correlacionado com o aumento da morbidade e mortalidade entre pacientes infectados pelo HIV-1 em ausência de terapia anti-retroviral (TARV). A supressão virológica mediada pela TARV parece reduzir os níveis de ativação em ambas subpopulações de T CD4⁺ e T CD8⁺, embora os pacientes ainda exibam esses níveis mais elevados do que aqueles vistos em indivíduos sadios, indicando que a TARV pode reduzir, mas não completamente, a ativação imune durante a infecção (Jain et al., 2013). Tem sido descrito que a co-expressão destes marcadores de ativação é significativamente maior em pacientes não tratados com a TARV do que aqueles que fazem uso da terapia. Além disso, o aumento nessa co-expressão se correlaciona com a progressão da doença e com a depleção de células T CD4⁺ de forma mais significativa do que a própria carga viral (Bartovská et al., 2011). Desta forma, muitos estudos têm demonstrado que o MFI (Índice Médio de Fluorescência) de CD38 representa um parâmetro laboratorial confiável para o monitoramento de pacientes infectados com o HIV-1. Apesar disso, muitos autores têm relatado que a expressão deste marcador não possui sensibilidade e especificidade o bastante para o acompanhamento daqueles pacientes em uso da TARV (Bartovská et al., 2011).
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2.2.4. Exaustão da capacidade imunológica na infecção pelo HIV-1: Imunosenescência.
Em consequência dos sucessivos momentos de ativação celular ao longo da vida, verifica-se um processo natural do organismo de deterioração da competência imune, resultante do próprio envelhecimento. Isto explica, em parte, a morbidade e a mortalidade aumentada em indivíduos idosos imunocompetentes. Por analogia, vem sendo considerado que o intenso grau de ativação imune na infecção pelo HIV-1 pode acelerar o envelhecimento do sistema imunológico, fazendo com que indivíduos infectados exibam de forma mais grave e antecipada, características imunológicas apresentadas apenas por adultos em idades mais avançadas; este processo denomina-se imunosenescência e pode se manifestar de maneira clonal e/ou global (Appay et al., 2007). A deterioração de diversas funções fisiológicas em indivíduos infectados pelo HIV-1 e idosos imunocompetentes sugerem mecanismos paralelos de declínio imunológico, de modo que a ativação imune crônica e a inflamação se relacionam como sendo causas desse envelhecimento sistêmico (Appay & Sauce, 2008).
A ativação imune crônica e o processo de inflamação vêm sendo cada vez mais apresentados como causas do envelhecimento sistêmico das funções fisiológicas. Em resposta a diversas infecções e danos teciduais são produzidas citocinas pro-inflamatórias, tais como TNFα, IL-1β e IL-6, que agem como uma complexa cascata inicial de destruição de patógenos e reparo tecidual, atuando como uma resposta natural do organismo a estas situações de estresse. Porém, na infecção pelo HIV-1 se tem a produção e/ou o acúmulo excessivo desses mediadores, acarretando alguns efeitos adversos. Além disso, tem sido descrito que estes mediadores possuem um papel significativo no processo de envelhecimento, estando associados ao desenvolvimento de diversas doenças relacionadas ao avanço da idade e que, atualmente, vem sendo encontrados em altas concentrações no sangue de idosos. Esse processo é conhecido como envelhecimento inflamatório e é caracterizado pela hiper-regulação de respostas anti-estresse e produção de citocinas pro-inflamatórias. A ocorrência do envelhecimento inflamatório, em associação ao processo de imunosenescência, tem sido descrita na infecção pelo HIV-1 e, podem ambos estarem agravando o grau de imunodeficiência (Appay & Sauce, 2008).
A ativação crônica observada na infecção pelo HIV-1 vem sendo descrita como uma das principais causas da proliferação celular acelerada, expansão e morte de células T, inclusive de células específicas ao vírus (Grossman et al., 2006). Essa intensa proliferação celular gera inúmeros clones de células T CD4+ e T CD8+ terminalmente diferenciados, reconhecidos pelo
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fenótipo CD27-CD28- (figura 9) (Papagno et al., 2004). Embora muito já se tenha debatido sobre a dinâmica do turnover de células T, o consenso geral é que o tempo de vida de ambas as células T CD4⁺ e T CD8⁺ é diminuído em aproximadamente três vezes em indivíduos HIV positivos, comparados a indivíduos normais (Appay & Jones, 2002). Essas subpopulações tendem a perder a capacidade de secretar citocinas, como IL-2 e IFN-γ, apresentam menor diversidade do repertório de células T (TCR) e maior suscetibilidade à morte induzida por ativação (Appay et al., 2007). Neste cenário, o indivíduo pode perder o controle da resposta imune ao vírus, ou ainda, progredir mais rapidamente para a AIDS (figura 9) (Appay e Rowland-Jones, 2002, Brenchley et al., 2003).
Apesar da intensa proliferação mediante o processo de ativação celular, a limitação do tempo de vida das populações de linfócitos T conduz a um estado de senescência replicativa, que está diretamente relacionado ao número de divisões celulares. A senescência replicativa pode ser observada através da expressão da molécula CD57 na superfície das células T (Brenchley et al., 2003, Papagno et al., 2004) e da perda da capacidade replicativa das células in vitro frente a mitógenos (Brenchley et al., 2003). Além disso, o comprimento do telômero da população de linfócitos T CD8⁺ é significativamente encurtado em pacientes infectados pelo HIV-1, o que também deve conduzir a uma diminuição da capacidade proliferativa dessas células (Appay & Jones, 2002).
A princípio, o sistema imune seria capaz de compensar a perda de células T CD4+ depletadas, bem como substituir o pool celular altamente diferenciado, liberando para a periferia um repertório celular com novas e diferentes especificidades. Entretanto, outra importante consequência desse processo de ativação é a exaustão dos recursos imunes primários (Appay et al., 2007), de modo que a produção de células T CD4⁺ naive não é suficiente para compensar a destruição destas células pela infecção, o que pode ser resultado de uma disfunção a nível tímico (Appay & Jones, 2002), conduzindo a uma diminuição da geração de novas células T para a periferia (Appay et al., 2007). No entanto, se tem visto que ocorre um aumento modesto na saída de linfócitos T CD8⁺ para periferia (Appay & Jones, 2002), o que caracteriza a razão linfócitos T CD4⁺/ T CD8⁺ invertida nestes indivíduos infectados, mas que em sua maioria corresponde a populações de linfócitos T CD8⁺ com fenótipo de células terminalmente diferenciadas. Além disso, esses indivíduos infectados também passam a apresentar maior suscetibilidade a outras doenças infecciosas oportunistas, entre elas a leishmaniose que pode, por sua vez, acelerar o processo de ativação celular e envelhecimento da população de células T.
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Figura 9: Esquema demonstrando o aumento da proporção de linfócitos T chamados de altamente diferenciados e a exaustão dos recursos primários em indivíduos infectados pelo HIV-1 (Adaptado de Appay et al., 2007).
2.3. Coinfecção Leishmaniose visceral/HIV-1 (LV/HIV-1)
2.3.1. Aspectos epidemiológicos da coinfecção
Os protozoários intracelulares do gênero Leishmania têm sido reconhecidos como patógenos oportunistas em indivíduos imunocomprometidos, incluindo aqueles que estão desnutridos ou infectados com o vírus HIV-1, uma vez que ocorre o comprometimento da imunidade mediada por células.
A coinfecção Leishmania/HIV tem sido descrita em 35 países ao redor do mundo, correspondendo de 2 a 12% dos casos de leishmaniose visceral, estando essa proporção em constante aumento (OMS, 2007). Porém, é muito provável que esses dados estejam subnotificados, uma vez que a LV não está inclusa entre as doenças oportunistas definidoras de AIDS listadas pela OMS e, portanto, raramente é reportada no sistema de notificações da AIDS a nível global. Estima-se que um terço dos 35 milhões de pessoas infectadas com HIV no mundo viva em áreas com risco de transmissão de leishmaniose (Sousa-Gomes et al, 2011). A maioria dos casos de coinfecção LV/HIV relatados pela OMS é proveniente do sul da Europa, onde se
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teve o primeiro caso de coinfecção descrito, em 1985, sendo 90% dos mais de 2000 casos notificados em 2001 ocorridos na França, Itália, Espanha e em Portugal. Entretanto, essa estatística é provavelmente enganosa, já que uma grande proporção de casos em países da África e da Ásia não são notificados, devido à ausência de facilidade no diagnóstico e à deficiência nos sistemas de notificações destes países.
A LV é a terceira doença parasitária oportunista de maior prevalência entre os indivíduos infectados pelo HIV no Sul da Europa, só sendo superada pela toxoplasmose e pela criptosporidiose (Desjeux e Alvar, 2003). Assim, a LV vem sendo cogitada para ser introduzida entre as doenças indicadoras de AIDS pela OMS. Nas Américas, a maioria dos casos de coinfecção ocorre no Brasil, apesar de existirem bons sistemas de vigilância epidemiológica e de controle para ambas as doenças (figura 10) (OMS, 2007).
Figura 10: Países com leishmaniose endêmica e com a coinfecção Leishmania/HIV. Distribuição global da leishmaniose (azul claro) e países com relatos de coinfecção (azul escuro). Reproduzido de Cruz et al., 2006.
