i
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
(FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA)
Nayanna de Mello Amorim
AVALIAÇÃO DE DERIVADOS SINTÉTICOS (TRIAZÓIS
DISSUBSTITUÍDOS)
CONTRA
AÇÕES
TÓXICAS
DE
VENENOS DE SERPENTES
Niterói
2019
ii
Nayanna de Mello Amorim
AVALIAÇÃO DE DERIVADOS SINTÉTICOS (TRIAZÓIS
DISSUBSTITUÍDOS) CONTRA AÇÕES TÓXICAS DE
VENENOS DE SERPENTES
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biomédicas (Farmacologia) da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biomédicas. Área de concentração: (Fisiologia ou Farmacologia).
Orientador: André Lopes Fuly
Niterói
2019
iii
iv
Nayanna de Mello Amorim
AVALIAÇÃO DE DERIVADOS SINTÉTICOS (TRIAZÓIS
DISSUBSTITUÍDOS)
CONTRA
AÇÕES
TÓXICAS
DE
VENENOS DE SERPENTES
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biomédicas (Farmacologia) da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biomédicas. Área de concentração: (Fisiologia ou Farmacologia).
Aprovada em: de de .
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________________
Prof. Dr. André Lopes Fuly (Orientador)UFF
__________________________________________________________
Profa. Dra.Valéria Laneuville TeixeiraUNIRIO
__________________________________________________________
Profa. Dra. Karen de Jesus OliveiraUFF
__________________________________________________________
Dr. Eduardo Coriolano de OliveiraUFF
__________________________________________________________
Prof. Dr. Jorge Saad NehmeUNIRIO
__________________________________________________________
Profa. Dra. Sabrina Baptista Ferreira (Suplente)UFRJ
__________________________________________________________
Dra. Elisabeth Marostica (Suplente)v
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, que com imenso amor me concedeu a vida e a proteção em trilhar todos os caminhos até a presente data.
Aos meus amores Rosa e José Carlos por serem sempre um exemplo de caráter e honestidade a serem seguidos por mim. Obrigada pela vida e por cada sofrimento enfrentado para que eu pudesse hoje, concluir mais uma etapa da minha vida. Eu amo vocês mais que tudo.
A minha avó Carmita (in memoriam), que enquanto esteve presente entre nós, não cansava de dizer o quanto sentia orgulho por mim e o quanto me amava. Vozinha, sempre foi recíproco.
Ao meu orientador Andre Lopes Fuly por todo suporte e incentivo, permitindo que eu chegasse à conclusão do presente trabalho. Obrigada, chefe.
Aos membros da banca que disponibilizaram tempo e aceitaram participar da conclusão de mais uma etapa.
Aos colaboradores Dr. Eládio Sanches (FUNED) por fornecer o veneno das serpentes, e a Dra. Sabrina Baptista Ferreira (UFRJ) por fornecer os derivados sintéticos necessários para os experimentos.
Aos colegas de laboratório por sempre me incentivarem a seguir, mesmo quando o cansaço batia e a vontade de desistir era intensa.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biomédicas (Fisiologia e Farmacologia) por todo o auxílio e disposição.
Aos órgãos de fomento (CAPES, FAPERJ, CNPq) pelo incentivo à pesquisa.
A Universidade Federal Fluminense por me acolher e permitir meu enriquecimento acadêmico.
vi “Todas as vitórias ocultam uma abdicação”.
vii
RESUMO
De Mello Amorim, Nayanna. AVALIAÇÃO DE DERIVADOS SINTÉTICOS (TRIAZÓIS DISSUBSTITUÍDOS) CONTRA AÇÕES TÓXICAS DE VENENOS DE SERPENTES. 2018. Tese (Doutorado em Ciências Biomédicas - Farmacologia) – Instituto Biomédico, Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2019.
Os acidentes envolvendo animais peçonhentos são de grande risco à saúde pública no Brasil. O envenenamento ofídico resulta em hemorragia, hemólise, necrose, distúrbios de coagulação, neurotoxicidade e óbito. A atual terapia preconizada pelo Ministério da Saúde é realizada através da administração intravenosa de soro heterólogo, seja monovalente ou polivalente, que é produzido pela hiperimunização em equinos. Porém, com esta terapia podem surgir reações adversas nos pacientes, além de não neutralizar com eficácia os efeitos locais do envenenamento, podendo evoluir para um quadro de deformidade e amputação do membro acometido pela picada. Em decorrência das morbidades, podem surgir problemas socioeconômicos para o indivíduo e/ou comunidade, pois o levará a uma incapacidade para o trabalho. Por isso, a procura por novas moléculas e tratamentos se faz necessária como terapia alternativa ou complementar à soroterapia, com a finalidade de neutralizar as principais atividades tóxicas dos venenos das serpentes. Dados da literatura evidenciaram propriedade antiveneno de plantas e demais bioprodutos. Entretanto, as investigações de moléculas obtidas por síntese orgânica na inibição das ações bioquímico-farmacológicas dos venenos de serpentes ainda são pouco exploradas. Resultados do nosso grupo demonstraram que derivados sintéticos da família triazol inibiram a hemólise causada pelo veneno da serpente Lachesis muta. Desta forma, este trabalho teve como proposta avaliar o efeito de derivados sintéticos (sulfonamidas e triazóis dissubstituídos) na inibição de certas atividades tóxicas in vivo (hemorragia e edema) e in vitro (hemólise, coagulação e proteólise) do veneno das serpentes L. muta e B. jararaca, pois são espécies importantes nas estatísticas de severidade e incidência de acidentes ofídicos no Brasil. Além disso, este trabalho visou racionalizar o desenho de novas moléculas orgânicas para utilização como protótipos para o desenvolvimento de substancias com propriedade antiveneno para substituir e/ou complementar a atual soroterapia. Como resultado, foi possível observar que os derivados sintéticos inibiram as atividades tóxicas do veneno de L. muta e B. jararaca, porém, com potências diferentes.
Palavra-chave: Triazol, venenos de serpentes, Lachesis muta, Bothrops jararaca,
viii
ABSTRACT
De Mello Amorim, Nayanna. EVALUATION OF SYNTHETIC DERIVATIVES (DISSUBSTITUTED TRIAZOLS) AGAINST TOXIC ACTIONS OF SNAKE VENOMS.
. 2018. Thesis (Doctorate degree in Biomedical Sciences - Pharmacology) - Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2019.
Accidents involving venomous animals are a health public problem in Brazil and worldwide, as well. Snake bite results in hemorrhage, hemolysis, necrosis, coagulation disorders, neurotoxicity and death. In Brazil, current therapy recommended by the Ministry of Health is performed by the intravenous administration of heterologous antivenom serum, be monovalent or polyvalent, produced by hyper immunization in equines. However, therapy may induce side effects to patients and it does not prevent efficiently local effects (as tissue necrosis), leading deformities and/or amputation of the affected limb of the victim. Besides that, snake bites may become a socioeconomic problem and an inability of victims to work. Therefore, the search for new molecules and treatments are need as an alternative to aid serum therapy to neutralize the toxic activities of snake venom. Literature has described antivenom effect of molecules derived from natural sources, as plants. However, such investigation on molecules obtained from organic synthesis is poorly investigated. Thus, the aim of this study was to analyze some derivatives of sulfonamides and dissubstituted triazoles to inhibit some in vivo (hemorrhage and edema) and in vitro (hemolysis, coagulation and proteolysis) toxic activities of
Lachesis muta and Bothrops jararaca snake venom, since these species produce the
highest severity and frequency of accidents in Brazil, respectively. Moreover, this work also aims to rationalize the design of new organic compounds to be used as prototypes to develop molecules able to neutralize toxic activities of venoms to replace, and even use them as a complement to serum therapy. As a result, it was possible to observe that the synthetic derivatives inhibited the toxic activities of L.
muta and B. jararaca venom, but with different potencies.
Key-words: Triazol, snake venoms, Lachesis muta, Bothrops jararaca,
ix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Número de acidentes e óbitos envolvendo animais peçonhentos...16
Figura Percentual de Acidentes Ofídicos indicados por Gênero em 2016...18
Figura 3: Frequência da ocorrência de acidentes em cada profissão...19
Figura 4: Exemplar da espécie Lachesis muta no Brasil e suas escamas em formato de espinhos...21
Figura 5: Exemplar da espécie Bothrops jararaca no Brasil e suas escamas em pares...22
Figura 6: Diferentes tipos de dentição... ...23
Figura 7: Componentes do veneno das serpentes...25
Figura 8: Produção do soro antiofídico...27
Figura 9: Estrutura química dos derivados e seus códigos...34
Figura 10: Esquema representativo da atividade proteolítica...35
Figura 11: Esquema representativo da atividade coagulante...36
Figura 12: Esquema representativo da atividade hemolítica...38
Figura 13: Esquema representativo da atividade hemorrágica...39
Figura 14: Esquema representativo da atividade edematogênica...40
Figura 15: Curva de veneno bruto de L. muta para a atividade proteolítica...43
Figura 16: Efeito dos derivados na proteólise causada pelo veneno de L. muta...43
Figura 17: Curva de veneno bruto de B. jararaca para a atividade proteolítica...44
Figura 18: Efeito dos derivados na proteólise causada pelo veneno de B. jararaca...45
Figura 19: Curva de concentração X efeito do veneno de L. muta na coagulação....46
Figura 20: Efeito dos derivados na coagulação causada pelo veneno de L. muta....47
Figura 21: Curva de concentração X efeito do veneno de B. jararaca na coagulação...48
Figura 22: Efeito dos derivados na coagulação causado pelo veneno de B. jararaca...49
x
Figura 24: Efeito dos derivados na hemólise causada pelo veneno de L. muta...51
Figura 25: Curva de veneno bruto de B. jararaca na atividade hemolítica...52
Figura 26: Efeito dos derivados na hemólise causada pelo veneno de B. jararaca...53
Figura 27: Efeito dos derivados na hemorragia causada por L. muta...54
Figura 28: Efeito dos derivados na hemorragia causada por B. jararaca...55
Figura 29: Efeito dos derivados no edema causado pelo veneno de L. muta...56
Figura 30: Efeito dos derivados no edema causado pelo veneno de B. jararaca...57
Figura 31: Efeito dos derivados na hemorragia por L. muta no protocolo tratamento...58
Figura 32: Efeito dos derivados na hemorragia por B. jararaca no protocolo tratamento...59
Figura 33: Efeito dos derivados na hemorragia por B. jararaca no protocolo prevenção...60
Figura 34: Efeito dos derivados na hemorragia por L. muta no protocolo prevenção...61
Figura 35: Efeito dos derivados na hemorragia por L. muta no protocolo gavagem...62
Figura 36: Efeito dos derivados na hemorragia por B. jararaca no protocolo gavagem...63
Figura 37: Resultado do estudo toxicológico teórico do derivado TRI 03...64
Figura 38: Resultado do estudo toxicológico teórico do derivado TRI 04...65
Figura 39: Resultado do estudo toxicológico teórico do derivado TRI 07...65
xi
Figura 41: Resultado do estudo toxicológico teórico do derivado TRI 09...66
Figura 42: Resultado do estudo toxicológico teórico do derivado TRI 16...67
Figura 43: Resultado do estudo toxicológico teórico do derivado TRI 17...67
Figura 44: Resultado do estudo toxicológico teórico do derivado TRI 18...68
Figura 45: Resultados dos Parâmetros físico-químicos dos derivados (D3 a D18)...69
Figura 46: Resultado dos valores de Druglikeness e Drug-score para o teste toxicológico teórico dos derivados sintéticos...70
Figura 47: Resumo da eficiência dos derivados contra os venenos de B. jararaca e L. muta... ...71
xii
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Relação das notificações de acidentes nos anos de 2001 a 2012...17
Quadro 2: Número de acidentes por envenenamento no Brasil em 2013...20
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
- Controle (C)
- Concentração Efetiva (CE)
- Comissão de Ética do Uso de Animais (CEUA) - Derivado (D)
- Dose Mínima Coagulante (DMC) - Dose Mínima Hemorrágica (DMH) - Dimetilsulfóxido (DMSO)
- Ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) - Fundação Nacional de Saúde (FUNASA) - Fundação Ezequiel Dias (FUNED)
- Organização Mundial da Saúde (OMS) - Fosfolipase A2 (PLA2)
- Rotação por minuto (RPM)
- Hidroximetil aminometano neutralizado com ácido clorídrico (Tris-HCl) - Veneno Bruto (VB)
xiv
SUMÁRIO
1. Introdução...16
1.1 Considerações iniciais...16
1.2 Epidemiologia ...18
1.3 Espécie Lachesis muta...20
1.4 Espécie Bothrops jararaca...21
1.5 Mecanismo de inoculação do veneno...22
1.6 Funções e constituição do veneno...24
1.7 Tratamento...27 1.8 Triazol...30 2 Objetivos...31 2.1 Objetivo Geral...31 2.2 Objetivo específico...32 3 Material e métodos...33
3.1. Obtenção do veneno de serpente...33
3.2. Obtenção dos animais...33
3.3. Obtenção dos compostos sintéticos...33
3.4 Ensaios Biológicos...35 3.4.1 ATIVIDADE PROTEOLÍTICA...35 3.4.2. ATIVIDADE COAGULANTE...36 3.4.3. ATIVIDADE HEMOLÍTICA...37 3.4.4. ATIVIDADE HEMORRÁGICA...38 3.4.5. ATIVIDADE EDEMATOGÊNICA...39
3.4.6. ESTUDO TEÓRICO DE TOXICIDADE...40
3.4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA...41
4. RESULTADOS...42
4.1. Efeito dos derivados na Atividade Proteolítica...42
4.1.1 Sobre o veneno de L. muta...42
xv
4.2 Efeito dos derivados na Atividade Coagulante...46
4.2.1 Sobre o veneno de L. muta...46
4.2.2. Sobre o veneno de B. jararaca...48
4.3 Efeito dos derivados na Atividade Hemolítica...50
4.3.1 Sobre o veneno de L. muta...50
4.3.2 Sobre o veneno de B. jararaca...52
4.4 Efeito dos derivados na Atividade Hemorrágica...53
4.4.1 Sobre o veneno de L. muta...54
4.4.2. Sobre o veneno de B. jararaca...55
4.5 Efeito dos derivados na Atividade Edematogenica...56
4.5.1 Sobre o veneno de L. muta...56
4.5.2 - Sobre o veneno de B. jararaca...57
4.6 Efeito dos derivados na Atividade hemorrágica (tratamento)...57
4.6.1 – Sobre o veneno de L. muta...57
4.6.2 – Sobre o veneno de B. jararaca...59
4.7 Efeito dos derivados na Atividade hemorrágica (Prevenção)...60
4.7.1 Sobre o veneno de B. jararaca ...60
4.7.2 sobre o veneno de L. muta...61
4.8 Efeito dos derivados na Atividade hemorrágica (Gavagem)...62
4.8.1 Sobre o veneno de L. muta...62
4.8.2 Sobre o veneno de B. jararaca...63
4.9 Estudo de toxicidade Teórica...64
4.9.1 Parâmetros de toxicidade...64
4.9.2. Parâmetros físico-químicos...69
4.9.3. Druglikeness e drug-score...70
5. Resumo da eficácia dos derivados sintéticos nas atividades...71
6. Discussão...72
7. Considerações finais...75
8. Conclusão...76
xvi
1. Introdução
1.1 Considerações iniciais
É sabido que os acidentes ofídicos representam risco elevado à saúde humana. O envenenamento envolvendo animais peçonhentos é um problema mundial, atingindo quase todas as regiões do globo, principalmente países subdesenvolvidos e regiões tropicais. São notificados mais de 420.000 acidentes envolvendo serpentes, com cerca de 20.000 mortes ao ano (Kasturiratne et. al., 2008). Porém este número cresce se agregar as subnotificações.
De acordo com a Figura 1, no Brasil, escorpiões e serpentes são os principais responsáveis por esses acidentes. Apesar dos acidentes escorpiônicos representarem maior número do total de acidentes, os acidentes ofídicos são de grande relevância por sua gravidade e sequelas deixadas nos acidentados.
Figura 1: Número de acidentes e óbitos envolvendo animais peçonhentos.
Fonte:http://portalarquivos.saude.gov.br/images/pdf/2016/maio/20/Informe. Epidemiológico-animais-peçonhentos---.pdf.
17 A taxa de mortalidade das vítimas e acidentes ofídicos varia de acordo com cada região do mundo (Graciano, 2014). No Brasil, de 2001 a 2012 foram notificados 325.733 casos de acidentes por serpentes (SINAN), sendo o gênero Bothrops o que apresentou maior incidência e Micrurus com menor incidência. (Quadro 1).
Quadro 1: relação das notificações de acidentes nos anos de 2001 a 2012. Fonte:BRASIL,
2014.
WALKER, e col., (2013) mostraram que há alguns anos foram utilizadas muitas técnicas nos acidentados que são consideradas prejudiciais nos dias de hoje, como por exemplo a aplicação de torniquete, que pode levar ao comprometimento do membro pelo bloqueio da circulação do sangue no mesmo. Isto leva a inutilizarão do mesmo, sendo necessário amputá-lo.
No Brasil, quatro gêneros são de relevância clínica: Micrurus (família
Elapidae), Bothrops, Crotalus e Lachesis (família Viperidae). A totalidade dos
acidentes está apresentada na Figura 2, na qual mostra o percentual dos acidentes causados pelos gêneros: Bothrops (86,4%), Crotalus (10,06%), Lachesis (2,40%) e
18
Figura 2. Percentual de Acidentes Ofídicos indicados por Gênero em 2016. Fonte: modificado de
Ministério da Saúde/SVS - Sistema de Informação de Agravos de Notificação -Sinan Net - 2019. (Disponível em: http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/tabcgi.exe?sinannet/cnv/animaisbr.def. Acesso em: 20/01/2019).
1.2 Epidemiologia
Como dito anteriormente, o gênero Bothrops é responsável pelos acidentes de maior incidência epidemiológica (Graciano, 2014). Os acidentes são muito comuns em zonas rurais, onde trabalhadores não utilizam equipamentos de proteção individual (Schaffazick, 2010), e as chances destes acidentes se elevam com as pessoas que mantém a criação de serpentes em cativeiro como um “hobby” sem possuir experiência para os cuidados e manejo do animal (Genderen, 2013). O aumento dos acidentes ofídicos se dá também por conta da invasão humana nas matas, bem como as condições precárias de saneamento e higiene. Paula (2010) confirmou esta teoria e destacou que por conta do péssimo acondicionamento de restos de alimentos, roedores são atraídos e por consequência, as serpentes também. Shaffazick e col. (2009) realizaram um estudo na qual demonstrou que os agricultores são vítimas mais comuns desses acidentes (Figura 3), e, além de trabalharem em locais onde esses animais habitam, não utilizam qualquer equipamento de proteção individual (EPI).
19
Figura 3: Frequência da ocorrência de acidentes em cada profissão. MODIFICADO DE
BORGES, et. al., 1999.
Atualmente, quatro sistemas vinculados ao Ministério da Saúde são responsáveis pelo registro dos acidentes, são eles: Sistema Nacional de Informação Tóxico-Farmacológicas (SINITOX/FIOCRUZ), Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN), Sistema de Informações sobre Mortalidade (SIM) e Sistema de Informações Hospitalares do Sistema Único de Saúde (SIH/SUS), mesmo assim os dados epidemiológicos estão sub notificados. O quadro 2 apresenta o número de acidentes ofídicos por mês ao longo de todo o ano de 2013.
20
Quadro 2: Número de acidentes por envenenamento no Brasil em
2013.
(Fonte SINAN. Disponível em: http://portalsaude.saude.gov.br/images/pdf/2014/ julho/21/Tabela-04--- CASOS-POR-MES---2013---21-05-2014.pdf).
1.3 Espécie Lachesis muta
O gênero Lachesis apresenta somente uma espécie, a Lachesis muta que é popularmente como surucucu e surucucu pico-de-jaca. apresenta todas as características descritas de uma serpente venenosa, como cabeça triangular, fosseta loreal e escamas da cauda eriçadas e em forma de “espinhos” (Melgarejo-Giménez, 2002), (Figura 4). Esta espécie é ovípara (põe até 15 ovos de uma vez) e possui o maior índice de letalidade (1%) em relação aos outros gêneros (FUNED, 2014).
Os hábitos desta serpente são preferencialmente noturnos. Os sintomas do acidente laquético são: dor e edema, vômito, diarreia, hipotensão, dentre outros (Fundacentro, 2001). Além do índice elevado de óbito entre os acidentados, o acidente envolvendo essa espécie provoca um considerável dano tecidual e variadas disfunções sistêmicas (Cunha, Fuly, Araújo, 2010). Além de resultar em
21 graves distúrbios sistêmicos e vascularização no entorno do local da picada (Matsui et al., 2000).
Figura 4: Exemplar da espécie Lachesis muta no Brasil e suas escamas em formato
de espinhos. MODIFICADO DE MELGAREJO-GIMÉNEZ 2002.
1.4 Espécie Bothrops jararaca
Os indivíduos desta espécie apresentam baixo índice de letalidade (0,3%), porém um alto índice no número de acidentes (90%). As serpentes do gênero Bothrops possuem como característica uma calda com pouca modificação (Figura 5), com escamas subcaudais em pares (Melgarejo-Giménez, 2002), fosseta loreal e cabeça triangular. Estas espécies ocupam áreas brasileiras como a Mata Atlântica e Cerrado (Souto-Neto, 2011).Os acidentes botrópicos apresentam ações proteolítica,
22 coagulante e hemorrágica, e com quadro clinico de dor, edema, equimose, sangramento.
Figura 5: Exemplar da espécie Bothrops jararaca no Brasil e suas escamas em
pares. MODIFICADO DE MELGAREJO-GIMÉNEZ 2002.
1.5 Mecanismo de inoculação do veneno
Apesar de todas as espécies pertencerem a mesma classe Reptilia, cada uma delas inocula quantidades diferentes de veneno em suas vítimas ou podem simplesmente não inocular. Essa quantidade de veneno inoculada depende muito do tipo de dentição apresentada pelo animal. As serpentes podem ser caracterizadas em quatro tipos de dentição: áglifa, opistóglifa, proteróglifa e solenóglifa (Figura 6).
A dentição do tipo áglifa é considerada homogênea com dentes maciços. Não possuem aparelho inoculador e nem sulcos para a passagem do veneno, apesar
23 disso, sua mordida pode causar dor e ferimento local nas vítimas. As serpentes que possuem esse tipo de dentição costumam matar sua presa por constrição. As integrantes mais conhecidas desse grupo são as sucuris e as jiboias.
As serpentes que possuem dentição do tipo opistóglifa apresentam um ou mais pares de presas contendo sulcos para inoculação de veneno na porção posterior ao maxilar. Por se encontrarem nessa região, os acidentes envolvendo a inoculação de veneno não são tão comuns. Exemplares que apresentam esse tipo de dentição são as falsas corais e muçuranas.
As serpentes com a dentição do tipo proteróglifa são integrantes da família Elapidae (corais verdadeiras). Possuem um par de presas anteriores com um profundo sulco que possibilita a inoculação do veneno. Por possuírem a boca com ângulo de abertura pequeno, a inoculação do veneno na vítima apresenta certa dificuldade, porém, quando inoculado, pode ser fatal.
A dentição do tipo solenóglifa, temos as cascavéis (Crotalus), surucucu (Lachesis) e jararacas (Bothrops). Estes indivíduos pertencentes à família Viperidae, possuem presas inoculadoras grandes com um canal central para a passagem de veneno. Estes animais possuem um aparato venenífero especializado e muito eficiente que permite que o bote seja preciso e com isso, bastante perigoso e letal.
Figura 6: Diferentes tipos de dentição. Dentições do tipo áglifa (A), opistóglifa (B),
24
1.6 Funções e constituição do veneno.
Apesar de ser conhecido por causar acidente, o veneno é uma complexa mistura de componentes proteicos e não proteicos que possui papel indispensável na predação, digestão e defesa para as serpentes (Figura 7). Apesar de algumas serpentes inocularem quantidades distintas de veneno nas vítimas, as variações na composição dos venenos das espécies são poucas, porém significativas. Os venenos possuem variadas funções de acordo com sua biologia, como por exemplo: arma para captura de presas, início da digestão das presas ingeridas, defesa contra predadores e também tem sua função na higiene oral (Brodie III, 2009). O envenenamento viperídeo é capaz de resultar em necrose do tecido, tendo as PLA2s, serinoproteases e metaloproteases, como principais causadoras dos efeitos tóxicos observados no envenenamento (Thwin, 2010).
25
26 O acidente ofídico provoca sintomatologia variada de acordo com a espécie. Os sintomas mais comuns são: neurotoxicidade, coagulação, hemorragia, efeito proteolítico e miotoxicidade (Quadro 3).
Quadro 3: Efeitos provocados por envenenamento ofídico. MODIFICADO DE
AZEVEDO-MARQUES, 2003.
As serinoproteases atuam diretamente na cascata de coagulação sanguínea clivando o fibrinogênio em fibrina (também conhecidas como, trombina-símile), sem contudo, ativar o fator XIII e impossibilitando dessa forma, a estabilidade do coágulo, que pode levar a formação de microcoágulos e espalhá-los pela circulação (Koh et. al., 2006, Ângulo e Lomonte, 2009, Teixeira et. al., 2009).
Por outro lado, não se pode apenas destacar efeitos negativos dos componentes do veneno para os humanos. Apesar de alguns componentes atuarem em sinergismo para causar efeitos tóxicos e letais nas vítimas, há componentes que isoladamente atingem um alvo específico, sendo assim possível sua utilização como protótipos para agentes terapêuticos (Lima et. al., 2008, Thomazini- Santos et.al., 2001). Desta forma, podemos destacar seu papel como ferramenta de pesquisa biotecnológica, fisiológica e/ou farmacológica. O captopril é o medicamento utilizado por pessoas hipertensas e é o exemplo mais conhecido de toxina ofídica usada no meio farmacológico como anti-hipertensivo, e que desde então rendeu bilhões de dólares à indústria farmacêutica. A sua estrutura molecular é responsável por mimetizar um peptídeo que inibe a enzima conversora de angiotensina (ECA), que é encontrada no veneno da espécie B. jararaca (Ferreira, 1965)
27
1.7 Tratamento
No veneno inoculado pelos ofídios há diversas toxinas que são capazes de produzir certos efeitos tóxicos no organismo, que vão desde efeitos locais, como reações no local da picada a efeitos sistêmicos, provocando um colapso no indivíduo.
Com a finalidade de reverter estes efeitos tóxicos causados pelo veneno, o tratamento atual preconizado pelo Ministério da saúde é a administração intravenosa de um soro heterólogo produzido pela hiperimunização em equinos, que contém imunoglobulinas específicas às quais são utilizadas na produção do soro antiveneno (Theakston, Warrell e Griffiths, 2003). No Brasil, três grandes centros produzem o soro: 1) Fundação Ezequiel Dias (Belo Horizonte, Minas Gerais), 2) Instituto Butantan (São Paulo, São Paulo), 3) Instituto Vital Brazil (Niterói, Rio de Janeiro).
A produção deste soro se dá da seguinte modo: o veneno, em doses não letais é inoculado no animal, que passa a produzir anticorpos para os antígenos do veneno. Posteriormente é realizada uma sangria, o sangue colhido é processado e são separados os seus componentes. As hemácias são devolvidas ao cavalo, enquanto que o soro é preparado utilizando-se o plasma (Figura 8).
Figura 8: Produção do soro antiofídico. Fonte: Biologia,
28 O soro tem a vantagem de prevenção do óbito. Porém, tem diversas desvantagens, tais como: - possuir em sua constituição anticorpos de equinos, não de humanos (Tambourgui, 2010); - termolabilidade, ou seja, não suporta condições extremas de temperatura, com isso, não seriam satisfatórias as tentativas de acondicionamento em locais sem energia elétrica. - O soro se mostra ineficaz na reversão dos efeitos locais (dermonecrose, edema, formação de bolhas, hemorragias, lesão tecidual), pois não é capaz de impedir a ação destas proteínas do veneno, tais como: serinoproteases (KOH et. al.,2006; ANGULO E LOMONTE, 2009; TEIXEIRA et. al., 2009), metaloproteases (HITE et. al., 1994; FOX E SERRANO, 2005,2008; ESCALANTE et. al., 2011; TAKEDA, et. al., 2011) e fosfolipases A2 (FULY e.t al.,1997, 2002; TSAI, 2007; ANGULO E LOMONTE, 2009; DOLEY E KIMI, 2009; GALLACCI E CAVALCANTE, 2010; SUN et. al., 2010) e lectinas (Calderon et. al., 2014), elevando assim a severidade do acidente, por causarem inchaço, bolhas, inflamações e necrose. - Os pacientes acidentados na maioria dos casos se submetem a um tratamento prolongado, recebendo várias doses do soro, que dessa forma aumenta o surgimento dos efeitos colaterais (desde febre a anafilaxia). Todos estes fatores podem acarretar em uma incapacitação do indivíduo para o trabalho, gerando um problema socioeconômico diretamente à família e/ou comunidade. Por isso, a busca por terapias alternativas eficientes, e com o mínimo de efeitos colaterais vem sendo amplamente investigada. Diversos trabalhos demonstraram que populações indígenas utilizam extratos vegetais como primeira alternativa no tratamento do envenenamento ofídico. Oliveira e col., (2014) avaliaram através de ensaios in vitro e in vivo, o efeito do extrato bruto e frações de
Manilkara subsericea contra certas atividades tóxicas do veneno de L. muta Neste
estudo, o resultado obtido foi satisfatório, pois alguns extratos e frações desta planta inibiram em até 100 % as atividades hemolítica, proteolítica, edematogênica, hemorrágica e coagulação do veneno de L. muta. Há também estudos que demonstram a utilização de extratos vegetais e substâncias isoladas de plantas como possíveis neutralizadores de certas ações tóxicas de venenos (Mors et. al., 2000). Extratos de plantas são muito importantes em diversos estudos, pois atuam como coadjuvantes no tratamento do envenenamento (da Silva et al., 2005), além de serem bastante comum a utilização de preparações obtidas por maceração de
29 plantas por nativos onde o acesso à soroterapia é escasso (De Paula, 2009). Além dos extratos de plantas, Faioli, 2013 realizou um estudo demonstrando que esponjas atuaram como inibidoras de certas atividades tóxicas dos venenos de B. jararaca e
L. muta. Como resultado, foi obtida inibição de até 50% da atividade hemorrágica
dos venenos. Porém, a pesquisa envolvendo moléculas produzidas através de síntese orgânica ainda é pouco realizada, merecendo assim, ser intensificada. Dados da literatura mostram que derivados sintéticos da família triazol possuem diversas propriedades, tais como: atividade fungicida, atua no combate à doença ferrugem da soja (Moura, 2013), inibição da enzima urease, causadora de infecção urinária (Hanif, 2012) e ainda foi descrito seu envolvimento na replicação do vírus da imunodeficiência adquirida (Zamoner, 2012). Com isso e embasados em dados da literatura, Domingos et al. (2013) demonstraram que derivados sintéticos da família triazol inibiram certas atividades tóxicas do veneno de L. muta. Neste estudo, os derivados sintéticos inibiram de maneira satisfatória atividades in vitro e in vivo do veneno em atividades como hemolítica e proteolítica. Alguns destes derivados sintéticos inibiram em até 100 % a atividade do veneno de L. muta. Com isso, a busca por terapias alternativas e/ou complementares se tornam necessárias. Porém a utilização de derivados sintéticos ainda é pouco investigada. Domingos et al., (2013) relataram que derivados sintéticos da família triazol inibiram certas atividades tóxicas do veneno de L. muta. Os derivados sintéticos possuem algumas vantagens em relação ao soro antiofídico, tais como: são de fácil reprodutibilidade de síntese; não são termolábeis; podem ser formados a partir de uma molécula básica ou até mesmo modificados afim de melhoramento de sua qualidade e eficiência contra o veneno. Mishra, 2010 apontou que os derivados possuíem similaridades com fármacos empregados na pesquisa clínica com propriedades antibacteriana e antifúngica. Com isso e com base em dados preliminares de Domingos et. al., 2013 que investigaram o potencial antiofídico de moléculas obtidas por síntese orgânica, conseguindo resultados satisfatórios destes triazóis contra algumas atividades tóxicas do veneno de L. muta, que este estudo nos motivou a estudar tais moléculas.
30
1.8 Triazol
Através da busca na literatura por métodos alternativos, os derivados sintéticos da família triazol se destacam por suas propriedades farmacológicas diversas, como seu potencial antimicrobiano (Mishra et. al. 2010) e antifúngico no combate à
cândida spp. e Aspergillus spp. (Georgiadis e Bergold, 2004). Esta família é formada
por cinco átomos, sendo dois átomos de carbono e três de nitrogênio, que são constituídos através de síntese orgânica. O que os tonam diferentes entre si são os constituintes adicionados durante o processo de síntese. Diversas propriedades desses derivados foram encontradas na literatura, tais como: leishmania, anti-malária (Corrales, et. al., 2011); antifúngica em animais de pequeno e grande porte (Nobre, et. al., 2002) e em humanos (Georgiadis e Bergold, 2004). Além disso, ZAMONER (2012) descreveu uma ação inibitória de uma enzima que é responsável por catalisar a hidrólise de ligações glicosídicas envolvidas no Diabetes mellitus e também na replicação do vírus da imunodeficiência adquirida (HIV) para derivados desta família. Entretanto, seu potencial antiveneno é pouco investigado.
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2 Objetivos
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a capacidade de moléculas sintéticas de triazóis dissubstituídos em neutralizar certas atividades tóxicas in vitro (hemolítica, coagulante e proteolítica) e
in vivo (hemorrágica e edematogênica) do veneno das serpentes L. muta e B. jararaca.
2.2 Objetivos específicos
- Avaliar o efeito dos derivados sintéticos na neutralização da proteólise causada pelo veneno das serpentes L. muta e B. jararaca;
- Avaliar o efeito dos derivados sintéticos na neutralização da hemólise causada pelo veneno das serpentes L. muta e B. jararaca;
- Avaliar o efeito dos derivados sintéticos na neutralização da coagulação causada pelo veneno das serpentes L. muta e B. jararaca;
- Avaliar o efeito dos derivados sintéticos na neutralização da hemorragia causada pelos venenos das serpentes L. muta e B. jararaca;
- Avaliar o efeito dos derivados sintéticos na neutralização do edema causado pelo veneno das serpentes L. muta e B. jararaca.
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3 Material e métodos
3.1. Obtenção do veneno de serpente
O veneno bruto de L. muta e B. jararaca foi gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Eladio Flores Sanchez da Fundação Ezequiel Dias (FUNED), Belo Horizonte, Minas Gerais. Os venenos foram mantidos a -20ºC até o momento da realização dos ensaios biológicos, e então solubilizados em salina 0,15 M.
3.2. Obtenção dos animais
Os camundongos da linhagem Balb/c (18 a 20 g) foram provenientes do Núcleo de Animais de Laboratório (NAL) da UFF. Os animais foram mantidos em ambiente com temperatura e luminosidade controladas, ração e água a vontade. Os experimentos foram realizados com a autorização do Comitê Institucional de Ética em Experimentação Animal da UFF.
3.3. Obtenção dos derivados sintéticos
As moléculas obtidas por síntese orgânica foram sintetizadas e cedidas pela Profa. Dra Sabrina Baptista Ferreira, do Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro e pelo Prof. Dr. Vitor Francisco Ferreira do Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química da Universidade Federal Fluminense. Os oito derivados sintéticos são da família triazol e foram sintetizadas a partir de um anel com 5 átomos, sendo 2 de carbono e 3 de nitrogênio. A estrutura química dos derivados sintéticos, com seus respectivos códigos (que foram criados para facilitar sua identificação nos “Resultados”) está mostrada na Figura 9. Os derivados foram dissolvidos em dimetilsufóxido (DMSO, da Sigma Chemical Co.) para a realização de todos os ensaios biológicos.
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TRI 03 TRI 04 TRI 07 TRI 08
TRI 09 TRI 16 TRI 17 TRI 18
Figura 9: Estrutura química dos derivados e seus códigos.
3.4 Ensaios Tóxicos
3.4.1 ATIVIDADE PROTEOLÍTICA
A atividade proteolítica do veneno de L. muta e B. jararaca foi realizada utilizando azocaseína como substrato (GARCIA et al., 1978), cujo protocolo experimental está mostrado na Figura 10. Alíquotas dos venenos foram incubadas
34 com azocaseína 0,2 % (p/v) em um tampão 200 mM Tris-HCl, 20 mM CaCl2, pH 8,8 a 37oC por 90 min., em meio reacional com volume final de 0,8 mL, completado pela adição de salina. Em seguida, a reação foi interrompida com a adição de 0,4 mL de 10% ácido tricloro acético (TCA), e os tubos foram centrifugados por 3 min. a 12.000 rpm. Alíquotas do sobrenadante (1,0 mL) foram retiradas e misturadas com 0,5 mL de NaOH 2N. Após, a atividade foi quantificada em espectrofotômetro na absorbância de 420 nm e uma Concentração Efetiva (CE), que representa a quantidade de veneno bruto (μg/mL) capaz de produzir uma variação de leitura de 0.2 em A 420 nm foi determinada.
O efeito dos derivados sintéticos nesta atividade foi avaliado incubando-os com uma CE do veneno por 30 min. a 25ºC. E, em seguida, uma alíquota fora retirada desta misturada e a atividade proteolítica foi realizada, como descrito acima. Paralelamente, experimentos controles foram realizados, nos quais foram incubados os solventes (salina, 0,15 M ou DMSO, 1% v/v) com o veneno bruto. Este controle também foi realizado com os derivados sintéticos e o solvente isoladamente.
35
3.4.2. ATIVIDADE COAGULANTE
A atividade coagulante do veneno de L. muta e B. jararaca se deu com a utilização de um “pool” de plasma humano cedido pelo setor de hemoterapia do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP), da UFF. A atividade foi representada do seguinte modo: o plasma citratado (1:9, citrato:sangue) foi mantido a 37°C por 1 minuto e, após, a reação foi iniciada pela adição de diversas concentrações do veneno bruto (Figura 11). O tempo de coagulação foi monitorado a 37oC em segundos em um coagulômetro digital da marca Amelung KC4 (Labcom, Germany). A quantidade de veneno (µg/mL) capaz de coagular o plasma em 60 segundos foi designada uma Dose Mínima Coagulante (DMC).
Posteriormente, o efeito dos derivados sintéticos na coagulação foi avaliado após serem incubados com 1 DMC dos venenos por 30 min. a 25ºC. Em seguida, 50 µL desta mistura foi adicionado a 200 µL do plasma e a coagulação monitorada no coagulômetro, e o tempo de coagulação obtido foi comparado com o controle (na ausência dos derivados). Em paralelo, os derivados ou solventes (salina, 0,15 M ou DMSO, 1% v/v) foram adicionados ao plasma, e o tempo de coagulação monitorado, como descrito anteriormente.
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3.4.3. ATIVIDADE HEMOLÍTICA
A atividade hemolítica do veneno de L. muta e B. jararaca foi realizada de acordo com o método da hemólise indireta (FULY et al., 1997), conforme mostrado na figura 12, e que consistiu de 2 etapas:
Primeira Etapa: O veneno foi incubado com a gema de ovo de galinha que
contém fosfolipídios (substrato). A gema foi diluída com um volume igual de NaCl 150 mM e centrifugada a 12.000 rpm por 60min a 10ºC, sendo utilizado apenas o sobrenadante. O veneno bruto foi incubado com a gema de ovo (em uma reação contendo CaCl2 e solução tampão a pH 7,5) por 15 min. a 37°C. Em seguida, a reação enzimática foi interrompida adicionando EDTA (concentração final, 10 mM). Nesta etapa, ocorre a formação de lisolecitina, que é o produto da ação das enzimas do tipo fosfolipases A2 (PLA2s) contidas no veneno sobre a gema do ovo (substrato). Esta lisolecitina tem ação hemolisante.
Segunda Etapa: Nesta etapa, foi adicionada ao ensaio uma suspensão de
hemácias humanas lavadas a 2% (v/v), obtida por centrifugação a 2200 rpm por 2 vezes. Após 60 min. a 37°C, a lisolecitina gerada enzimaticamente durante a primeira etapa foi quantificada pela liberação de hemoglobina das hemácias lisadas, através de leitura em absorbância (A) de 578 nm. 100 % de hemólise foi obtido através da adição de água destilada. A quantidade de veneno bruto (µg/mL) capaz de lisar 100% a suspensão de hemácias foi designada, Dose Mínima Hemolítica Indireta (DMHI).
O efeito inibitório dos derivados sintéticos na hemólise foi avaliado após incubá-los por 30 min a 25oC com 1 DMHI do veneno. Em seguida, uma alíquota foi retirada e adicionada ao meio reacional, e a atividade hemolítica foi realizada como descrito.
37
Figura 12: Esquema representativo da atividade hemolítica.
3.4.4. ATIVIDADE HEMORRÁGICA
A atividade hemorrágica (Figura 13) do veneno de L. muta e B. jararaca foi realizada de acordo com o método de KONDO e col., (1960). 100 µL de veneno foram injetados subcutaneamente (s.c.) na região abdominal dos camundongos, e após duas horas da injeção, os animais foram eutanasiados por inalação de isoflurano, sua pele foi removida, estirada e o local de hemorragia analisado visualmente e medido com auxílio de um paquímetro, em milímetros. A quantidade de veneno (µg/peso do animal) capaz de produzir um halo hemorrágico de aproximadamente de 10 mm foi designado de Dose Mínima Hemorrágica (DMH).
O efeito dos derivados sintéticos foi testado incubando-os por 30 min. a 25oC com 1 DMH do veneno e, em seguida, a mistura foi injetada nos animais e a hemorragia avaliada como descrito anteriormente. Em paralelo, experimentos controles foram feitos, onde salina, 0,15 M ou DMSO, 1% v/v foi incubado com o veneno bruto. De modo similar, DMSO ou os derivados sintéticos foram injetados isoladamente nos animais, e a atividade hemorrágica realizada, como descrita.
Três outros protocolos foram empregados, designados “tratamento”, “prevenção” e “gavagem”. No protocolo “tratamento”, 100 µL do veneno de L. muta ou B. jararaca foi injetado s.c. na região abdominal dos camundongos, e após 30 ou 45 min., os animais receberam injeção única (no mesmo sítio de injeção do veneno)
38 dos derivados sintéticos. Após duas horas, os camundongos foram eutanasiados e a atividade hemorrágica quantificada como descrito acima.
No protocolo “prevenção”, os derivados foram injetados s.c., e 30 ou 45 min. depois, o veneno foi injetado na mesma região. Em seguida, a atividade hemorrágica foi realizada como descrito.
No protocolo “gavagem”, o veneno foi injetado por via intraperitoneal e após 30 ou 45 min., os derivados sintéticos foram administrados por via oral. Posteriormente a hemorragia foi analisada.
Figura 13: Esquema representativo da atividade hemorrágica.
3.4.5. ATIVIDADE EDEMATOGÊNICA
A atividade edematogênica do veneno de L. muta e B. jararaca foi realizada através da injeção subcutânea (s.c.) de única dose (50 µL) do veneno na região subplantar da pata direita em camundongos (Figura 14). A pata esquerda (contralateral) foi utilizada como controle, recebendo a injeção de solução salina ou DMSO. Após uma hora da injeção das amostras, os animais foram eutanasiados por inalação de Isoflurano e as suas patas foram cortadas na junção do tornozelo e pesadas. A formação do edema foi analisada como a diferença no peso da pata que recebeu injeção do veneno comparado ao peso da pata que recebeu injeção do solvente.
O efeito neutralizante dos derivados sintéticos foi avaliado através da incubação destes com o veneno durante 30 min. a 25oC. Logo após, a mistura foi
39 injetada nos camundongos. A formação de edema foi representada como a diferença no aumento do peso da pata tratada com os derivados sintéticos comparada com o peso da pata tratada com os venenos. Paralelamente, experimentos controles foram realizados, onde foram incubados salina, 0,15 M ou DMSO, 1% v/v com o veneno bruto. Os derivados também foram injetados isoladamente.
Figura 14: Esquema representativo da atividade edematogênica.
3.4.6. ESTUDO TEÓRICO DE TOXICIDADE
Foram realizados estudos teóricos de toxicidade, onde cada estrutura dos oito
derivados sintéticos foi submetida ao programa de livre acesso denominado Osiris® Property Explorer (http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/). As estruturas são então comparadas com cerca de 3.000 fármacos e 15.000 substâncias tóxicas (RTECS) presentes no banco de dados. O programa resulta em parâmetros de toxicidade (mutagenicidade, tumorigenicidade, irritabilidade e efeitos negativos sobre a reprodução), parâmetros físico-químicos (lipofilicidade- cLogP, solubilidade - LogS e massa molecular) e druglikeness e drug-score. Todos esses parâmetros permitem visualizar se os derivados podem ou não ser protótipos a fármacos.
40
3.4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os experimentos foram representados graficamente utilizando-se o programa GraphPad Prisma® (versão 6) e após a análise os valores foram demonstrados e representaram a média ± desvio padrão (DP), utilizando Anova (para testar igualdade entre três ou mais médias populacionais) com valores p0,05 de significância.
41
4. RESULTADOS
O efeito protetor de oito derivados sintéticos sobre as atividades tóxicas in
vitro e in vivo dos venenos de L. muta e B. jararaca foi investigado. Ressalta-se que
os derivados receberam os seguintes códigos: TRI 03, TRI 04, TRI 07, TRI 08, TRI 09, TRI 16, TRI 17 e TRI 18 para facilitar visualização e compreensão dos resultados.
4.1. Papel protetor dos derivados na atividade proteolítica 4.1.1 Sobre o veneno de L. muta
O veneno de L. muta hidrolisou de modo concentração-dependente o substrato, azocaseína (Figura 15). E, após a construção desta curva, foi obtida a Concentração Efetiva (CE), que foi a quantidade de veneno que foi capaz de produzir uma variação na leitura em 420 nm de cerca de 0,2. A CE foi de 10 µg/mL.
V e n e n o d e L . m u t a (g /m L ) A b s o r b â n c ia 10 20 30 40 50 60 0 .0 0 .2 0 .4 0 .6
Figura 15: Curva de veneno bruto de L. muta para a atividade Proteolítica. Diferentes
concentrações (10-60 µg/mL) do veneno foram adicionadas ao meio reacional e a atividade proteolítica foi realizada como descrito em métodos. Os resultados expressam a média ± (DP) de três experimentos individuais (n= 3).
42 Posteriormente, 1 CE do veneno de L. muta (10 µg/mL) foi incubada com os derivados sintéticos (150 µg/mL) por 30 min. a 25oC, e a atividade proteolítica realizada como descrita. Como mostrado na figura 16, os derivados TRI 03 e TRI 08 apresentaram um percentual de inibição de 5% e 15%, respectivamente. Os derivados TRI 04, TRI 07, TRI 09, TRI 16, TRI 17 E TRI 18 não inibiram a proteólise causada pelo veneno de L. muta. Os derivados isoladamente e/ou o DMSO não interferiram na atividade proteolítica (dados não mostrados). A proporção veneno:derivado foi de 1:15 (p/p); In ib iç ã o d a p r o te ó li s e ( % ) TR I 0 3 TR I 0 4 TR I 0 7 TR I 0 8 TR I 0 9 TR I 1 6 TR I 1 7 TR I 1 8 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 V B +
*
Figura 16: Efeito dos derivados na proteólise causada pelo veneno de L. muta.
Os derivados (150 µg/mL) foram incubados com 10 µg/mL de veneno de L. muta (VB) por 30 min. a 25oC, e em seguida a atividade proteolítica realizada. Os resultados expressam a média ± (DP) (n=3).
43
4.1.2. Sobre o veneno de B. jararaca
O veneno de B. jararaca hidrolisou de modo concentração-dependente o substrato, azocaseína (Figura 17). E, após a construção desta curva, uma unidade foi criada e chamada de Concentração Efetiva (CE), que é a quantidade de veneno que foi capaz de produzir uma variação na leitura em 420 nm de cerca de 0,2. A CE foi de 15 µg/mL. B . j a r a r a c a (g /m L ) A b s o r b â n c ia ( n m ) 15 20 25 30 35 40 0 .2 0 .3 0 .4 0 .5 0 .6
Figura 17: Curva de veneno bruto de B. jararaca para a atividade proteolítica.
Diferentes concentrações (15-40 µg/mL) do veneno de B. jararaca foram adicionadas ao meio reacional e a atividade proteolítica foi realizada como descrito em métodos. Os resultados expressam a média ± (DP) de três experimentos individuais (n= 3).
44 Posteriormente, 1 CE do veneno de B. jararaca (15 µg/mL) foi incubada com os derivados sintéticos (150 µg/mL) por 30 min. a 25oC, e a atividade proteolítica realizada como descrita. Como mostrado na figura 18, o derivado TRI 03 apresentou um percentual de inibição de 20%. Os derivados TRI 07, TRI 08, e TRI 17 inibiram cerca de 30% da atividade do veneno. O derivado TRI 18 inibiu cerca de 80% a proteólise do veneno. Os derivados, TRI 04, TRI 09 e TRI 16 não inibiram a proteólise causada pelo veneno de B. jararaca. Os derivados isoladamente e/ou o DMSO não interferiram na atividade proteolítica (dados não mostrados). A proporção veneno:derivado foi de 1:10 (p/p). In ib iç ã o d a p r o te ó li s e ( % ) TR I 0 3 TR I 0 4 TR I 0 7 TR I 0 8 TR I 0 9 TR I 1 6 TR I 1 7 TR I 1 8 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 V B + ** * * * *
Figura 18: Efeito dos derivados na proteólise causada pelo veneno de B. jararaca.
Os derivados (150 µg/mL) foram incubados com 15 µg/mL de veneno de B. jararaca por 30 min. a 25oC, e em seguida a atividade proteolítica realizada. Os resultados expressam a média ± (DP) (n=3).
45
4.2 – Papel protetor dos derivados na Atividade Coagulante
4.2.1 Sobre o veneno de L. muta
A quantidade de veneno de L. muta (µg/mL) capaz de coagular o plasma em cerca de 60 segundos foi designada Dose Mínima Coagulante (DMC), e usada nos ensaios de inibição. Esta DMC foi de 25 µg/mL (Figura 19).
V e n e n o d e L . m u t a (g /m L ) T e m p o d e C o a g u la ç ã o ( s e g ) 5 10 15 20 25 30 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0
Figura 19: Curva de concentração X efeito do veneno de L. muta na coagulação.
Diferentes concentrações (5-30 µg/mL) do veneno de L. muta foram adicionadas ao plasma e a atividade coagulante realizada como descrito em métodos. Os resultados expressam a média ± (DP) de três experimentos individuais (n= 3).
46 Uma DMC do veneno (25 µg/mL) foi incubada com os derivados (150 µg/mL), e a mistura foi adicionada ao plasma e o tempo de coagulação foi monitorado em segundos. Como observado na Figura 20, o derivado TRI 17 foi o mais ativo, sendo capaz de prolongar o tempo de coagulação em até 300 segundos, representando assim um aumento de 5 vezes o tempo de coagulação que foi causado pelo veneno na ausência do derivado, de 60 segundos. Os demais derivados não interferiram significativamente no tempo de coagulação causado pelo veneno (Figura 20). E, os derivados isolados e DMSO não induziram a coagulação (dados não mostrados).
T e m p o d e C o a g u la ç ã o ( s e g ) DM SO Na Cl TR I 0 3 TR I 0 4 TR I 0 7 TR I 0 8 TR I 0 9 TR I 1 6 TR I 1 7 TR I 1 8 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 V B + *
Figura 20: Efeito dos derivados na coagulação causada pelo veneno de L. muta.
Os derivados (150 µg/mL) foram incubados com 25 µg/mL de veneno bruto de L. muta durante 30 min. a temperatura ambiente, e posteriormente a atividade coagulante realizada. Os resultados expressam a média ± (DP) (n=3).
47
4.2.2. Sobre o veneno de B. jararaca
A quantidade de veneno de B. jararaca (µg/mL) capaz de coagular o plasma em 60 segundos foi designada Dose Mínima Coagulante, DMC, e foi de 40 µg/mL (Figura 21). B . j a r a r a c a (g /m L ) T e m p o d e C o a g u la ç ã o ( s e g ) 10 20 30 40 50 60 0 5 0 1 0 0 1 5 0
Figura 21: Curva de concentração X efeito do veneno de B. jararaca na coagulação.
Diferentes concentrações (10-60 µg/mL) do veneno de B. jararaca foram inseridas ao meio reacional e a atividade coagulante realizada como descrito em métodos. Os resultados expressam a média ± (DP) de três experimentos individuais (n= 3),
48 Uma DMC do veneno de B. jararaca (40 µg/mL) foi incubada com os derivados (150 µg/mL), e a mistura foi adicionada ao plasma e o tempo de coagulação foi monitorado em segundos. A proporção veneno:derivado foi de 1:5 (p/p). Como observado na Figura 22, o derivado TRI 16 foi o mais ativo, sendo capaz de prolongar o tempo de coagulação próximo a 500 segundos. O derivado TRI 07 prolongou o tempo de coagulação em 400 segundos. Os derivados TRI 08 e TRI 09 prolongaram o tempo de coagulação abaixo de 300 segundos. Já os derivados TRI 03, TRI 04, TRI 17 E TRI 18 prolongaram o tempo de coagulação em até 200 segundos. Os demais derivados não interferiram significativamente no tempo de coagulação causado pelo veneno (Figura 22). E, os derivados isolados e DMSO não induziram a coagulação (dados não mostrados).
T e m p o d e C o a g u la ç ã o ( s e g ) DM SO Na Cl TR I 0 3 TR I 0 4 TR I 0 7 TR I 0 8 TR I 0 9 TR I 1 6 TR I 1 7 TR I 1 8 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 V B + * * * * * *
Figura 22: Efeito dos derivados na coagulação causada pelo veneno de B. jararaca.
Os derivados (150 µg/mL) foram incubados com 40 µg/mL de veneno de B. jararaca durante 30 min. a 25oC, e posteriormente a atividade coagulante realizada. Os resultados expressam a média ± (DP) (n=3), (p<0,05).
49
4.3 Papel protetor dos derivados na atividade hemolítica
4.3.1 Sobre o veneno de L. muta
Foi designada uma Dose Mínima Hemolítica Indireta (DMHI) do veneno de L.
muta obtida através da construção de uma curva, onde foram adicionadas diferentes
concentrações do veneno diferentes ao meio de reação e a atividade hemolítica foi realizada como descrita em métodos. A DMHI foi igual a 25 µg/mL (Figura 23), e utilizada nos ensaios de inibição.
L . m u t a (g /m L ) P e r c e n tu a l d e h e m ó li s e 5 10 15 20 25 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
Figura 23: Curva de veneno bruto de L. muta na atividade Hemolítica.
Diferentes concentrações (5-25 µg/mL) de veneno de L. muta foram inseridas ao meio reacional e a atividade hemolítica foi realizada como descrito. Os resultados expressam a média ± (DP) de três experimentos individuais (n= 3).
50 Como pode ser observado, todos os derivados foram capazes de inibir a hemólise causada pelo veneno de L. muta, porém com potências diferentes (Figura 24). O derivado TRI 18 foi o mais ativo, inibindo em 60% a hemólise. O derivado TRI 17 inibiu em 50%, e os derivados TRI 03, TRI 04, TRI 08, TRI 09 e TRI 16 obtiveram percentuais entre 10% a 40%. Os derivados isoladamente não promoveram hemólise (dados não mostrados).
In ib iç ã o h e m ó li s e (% ) TR I 0 3 TR I 0 4 TR I 0 7 TR I 0 8 TR I 0 9 TR I 1 6 TR I 1 7 TR I 1 8 0 2 0 4 0 6 0 8 0 V B + * * *
Figura 24: Efeito dos derivados na hemólise causada pelo veneno de L. muta.
Os derivados (150 µg/mL) foram incubados com 25 µg/mL de veneno de L. muta durante 30 min. a 25oC, e posteriormente a atividade hemolítica foi realizada. Os resultados expressam a média ± DP (n=3).
51
4.3.2 Sobre o veneno de B. jararaca
Foi designada uma Dose Mínima Hemolítica Indireta (DMHI) do veneno de B.
jararaca através da construção de uma curva, onde foram adicionadas diferentes
concentrações do veneno ao meio de reação e a atividade hemolítica foi realizada como descrita em métodos. A DMHI foi igual a 50 µg/mL (Figura 25), e utilizada nos ensaios de inibição. B . j a r a r a c a (g /m L ) P e r c e n tu a l d e h e m ó li s e 20 30 40 50 60 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
Figura 25: Curva de veneno bruto de B. jararaca na atividade Hemolítica.
Diferentes concentrações (20-60 µg/mL) de veneno de B. jararaca foram inseridas ao meio reacional e a atividade hemolítica foi realizada como descrito. Os resultados expressam a média ± SD de três experimentos individuais (n= 3).
52 Como pode ser observado, todos os derivados foram capazes de inibir a hemólise causada pelo veneno de B. jararaca em quase 100% (Figura 26). Os derivados isoladamente não promoveram hemólise (dados não mostrados). A proporção veneno:derivado foi de 1:3 (p/p).
In ib iç ã o h e m ó li s e (% ) TR I 0 3 TR I 0 4 TR I 0 7 TR I 0 8 TR I 0 9 TR I 1 6 TR I 1 7 TR I 1 8 0 5 0 1 0 0 V B + * * * * * * * *
Figura 26: Efeito dos derivados na hemólise causada pelo veneno de B. jararaca.
Os derivados (150 µg/mL) foram incubados com 50 µg/mL veneno de B. jararaca durante 30 min. a 25oC, e posteriormente a atividade hemolítica foi realizada. Os resultados expressam a média ± (DP) (n=3).
53
4.4 Papel protetor dos derivados na atividade hemorrágica
4.4.1 Sobre o veneno de L. muta
A injeção do veneno de L. muta nos camundongos provocou uma hemorragia com halo de aproximadamente de 10 mm (dados não mostrados), que foi estabelecida como Dose Mínima Hemorrágica (DMH). Esta DMH (100 µg/mL) foi utilizada nos ensaios de inibição.
Os derivados sintéticos foram incubados com 1 DMH do veneno de L. muta por 30 min., e em seguida a mistura foi injetada nos camundongos e a hemorragia avaliada. Como demonstrado na Figura 27, os derivados TRI 03, TRI 07 e TRI 17 foram os mais ativos, sendo capaz de inibir a hemorragia causada pelo veneno de L.
muta entre 40% a 60%. Os demais derivados não causaram interferência
significativa na hemorragia causada por L. muta. Quando injetados isoladamente, os derivados não promoveram hemorragia, nas concentrações testadas (dados não mostrados). V B + In ib iç ã o d a h e m o rr a g ia ( % ) TR I 03 TR I 04 TR I 07 TR I 08 TR I 09 TR I 16 TR I 17 TR I 18 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 * * *
Figura 27: Efeito dos derivados na hemorragia causada por L. muta.
Os derivados (150 µg/mL) foram incubados com 100 µg/mL do veneno de L. muta por 30 min. a 25oC, e posteriormente a atividade hemorrágica realizada. Os resultados expressam a média ± (DP) (n=3).
54
4.4.2. Sobre o veneno de B. jararaca
A injeção do veneno de B. jararaca desencadeou uma hemorragia com halo de aproximadamente de 10 mm (dados não mostrados), que foi estabelecida como Dose Mínima Hemorrágica (DMH). Esta DMH (100 µg/mL) foi utilizada para os ensaios de inibição.
Os derivados sintéticos foram incubados com 1 DMH do veneno de B.
jararaca por 30 min., e em seguida, a mistura injetada nos camundongos e a
hemorragia avaliada. Como demonstrado na Figura 28, o derivado TRI 07 foi o mais ativo e inibiu cerca de 70% a atividade hemorrágica causada pelo veneno de B.
jararaca. Os derivados TRI 03, TRI 04, TRI 08, TRI 09 e TRI 18 foram capaz de inibir
a hemorragia de 30% a 40%. Os demais derivados não causaram interferência significativa na hemorragia causada por B. jararaca. Quando injetados isoladamente, os derivados não promoveram hemorragia, nas concentrações testadas (dados não mostrados). V B + In ib iç ã o d a h e m o r r a g ia ( % ) TR I 0 3 TR I 0 4 TR I 0 7 TR I 0 8 TR I 0 9 TR I 1 6 TR I 1 7 TR I 1 8 0 5 0 1 0 0 * * * * * *
Figura 28: Efeito dos derivados na hemorragia causada por B. jararaca.
Os derivados (150 µg/mL) foram incubados com 100 µg/mL de veneno de B. jararaca por 30 min. a 25oC, e posteriormente a atividade hemorrágica realizada. Os resultados expressam a média ± (DP) (n=3).
