VERIFICAÇÃO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

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1. CAMPO DE APLICAÇÃO

1.1. Este procedimento se aplica aos Laboratórios Químicos de Controle da Qualidade.

2. OBJETIVO

2.1. Verificar os métodos analíticos normalizados, cuja aplicação permaneça dentro do escopo para o qual foi desenvolvido;

2.2. Validar os métodos analíticos não normalizados, desenvolvidos pelo laboratório, modificações de métodos normalizados e/ou aqueles aplicados fora dos escopos para as quais foram concebidos.

3. EQUIPE RESPONSÁVEL

3.1. Todos os colaboradores dos Laboratórios de Controle de Qualidade, incluindo estagiários supervisionados, que tenham recebido treinamento para este POP.

4. HIGIENE E SEGURANÇA

4.1. Os equipamentos de proteção individual (EPIs) necessários para a execução desse procedimento devem obedecer ao preconizado para a análise de cada parâmetro, conforme descrito em seus respectivos POPs.

5. DEFINIÇÕES

5.1. Ajuste: Conjunto de operações efetuadas em um sistema de medição de modo que ele forneça indicações prescritas correspondentes a determinados valores de uma grandeza a ser medida; 5.2. Branco do método: Água ultrapura ou outra matriz contendo todos os reagentes que normalmente

estão em contato com a amostra durante todas as etapas do procedimento analítico;

5.3. Comparação interlaboratorial: Organização, desempenho e avaliação de medições ou ensaios nos mesmos ou em itens similares por dois ou mais laboratórios, de acordo com as condições predeterminadas;

5.4. Curva analítica: Expressão da relação entre sinais analíticos (indicações) e o valor medido (grandeza) ao longo de uma determinada faixa;

5.5. Ensaio de proficiência: Determinação do desempenho de ensaios de laboratórios por meio de comparação interlaboratorial;

5.6. Erro de medição: Diferença entre o valor medido de uma grandeza e um valor de referência;

5.7. Erro sistemático: Componente do erro de medição que, em medições repetidas, permanece constante ou varia de maneira previsível;

5.8. Escopo: Fornecimento de evidência objetiva de que um dado item satisfaz requisitos especificados; 5.9. Exatidão de medição: Grau de concordância entre um valor medido e um valor verdadeiro de um

mensurando;

5.10. Faixa de trabalho: Faixa de concentração do analito na qual o método pode ser aplicado;

5.11. Fator: Variável quantitativa ou qualitativa que pode afetar o resultado com base na matriz de experimentos;

5.12. Grandeza: Propriedade de um fenômeno, corpo ou de uma substância que pode ser expressa quantitativamente sob a forma de um número ou referência (unidade de medida, procedimento de medição, material de referência ou uma combinação destes);

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5.13. Heterocedasticidade: Ausência de homocedasticidade, isto é, as variâncias dos diferentes níveis de concentração não são homogêneas. Infere-se que o modelo matemático dos mínimos quadrados ordinários (regressão linear simples) aplicado na correlação entre as medições sob diferentes níveis de concentração não é apropriado;

5.14. Homocedasticidade: Termo para designar a variância homogênea em diferentes níveis de concentração;

5.15. Incerteza de medição: Parâmetro não negativo que caracteriza a dispersão dos valores atribuídos a um mensurando com base nas informações utilizadas;

5.16. Indicação: Valor fornecido por um instrumento de medição ou por um sistema de medição (conjunto de um ou mais instrumentos de medição frequentemente montado a outros dispositivos, reagentes e insumos);

5.17. Limite de detecção: Menor concentração do analito, que sob uma determinada probabilidade, pode ser detectada (discriminada a partir do ruído do branco do método), mas não necessariamente quantificada;

5.18. Limite de quantificação: Menor concentração de analito que pode ser determinado com precisão e exatidão aceitáveis, sob condições experimentais específicas;

5.19. Limite de repetibilidade: Parâmetro que informa se há diferença significativa de precisão entre as análises realizadas sob condições de repetibilidade;

5.20. Limite de reprodutibilidade: Parâmetro que informa se há diferença significativa de precisão entre as análises realizadas sob condições de reprodutibilidade;

5.21. Linearidade: Característica de um método analítico em produzir resultados que sejam diretamente proporcionais à concentração do analito em amostras, em uma dada faixa de concentração;

5.22. Material de referência certificado (MRC): Material de referência acompanhado de uma documentação emitida por um organismo com autoridade, a qual fornece um ou mais valores de propriedades especificadas com as incertezas e as rastreabilidades associadas, utilizando procedimentos válidos;

5.23. Mensurando: Grandeza que se pretende medir;

5.24. Precisão: Grau de concordância entre indicações ou valores medidos, obtidos por medições repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares, sob condições especificadas (condições de repetibilidade, precisão intermediária ou reprodutibilidade);

5.25. Precisão intermediária: Condição de medição num conjunto de condições, as quais compreendem o mesmo procedimento de medição, mesmo local e medições repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares, ao longo de um período extenso de tempo, mas pode incluir outras condições submetidas a mudanças (ajustes, padrões, operadores, sistemas de medição, tempo, etc.);

5.26. Quantis: Plural de quantil. Conjunto de (n-1) valores ordenados e consecutivos de uma variável que é dividida em “n” proporções equivalentes, ou seja, “n” subconjuntos com a mesma quantidade de valores. Quando representados em termos percentuais, os quantis são denominados percentis (plural de percentil). A partir da função de distribuição acumulada, tem-se: 4 quantis = 1 quartil = 25º percentil = 25% de um conjunto ordenado;

5.27. Recuperação: Medida de eficiência do processo de isolamento do analito de interesse na matriz na qual se encontra presente;

5.28. Relatório de validação: Documento específico de cada método analítico que descreve os procedimentos, parâmetros e critérios de aceitação, bem como os resultados, a discussão e conclusão sobre o processo de validação;

5.29. Repetibilidade: Condição de medição num conjunto de condições, as quais compreedem o mesmo procedimento de medição, o mesmo operador, o mesmo sistema de medição, as mesmas condições

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de operação, o mesmo local, assim como medições repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares durante um curto período de tempo;

5.30. Reprodutibilidade: Condição de medição num conjunto de condições, as quais compreendem diferentes locais, diferentes operadores, diferentes sistemas de medição (com procedimentos analíticos diferentes ou não) e medições repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares. Trata-se de um parâmetro de validação obtido a partir de comparação interlaboratorial ou estudo colaborativo;

5.31. Resíduo: Diferença entre o sinal analítico medido e o sinal analítico previsto (aceito como verdadeiro);

5.32. Robustez: Parâmetro que mede a sensibilidade que um método analítico apresenta em face de pequenas variações. Um método diz-se robusto quando este for indiferente às variações que por ventura possam ocorrer durante a sua execução;

5.33. Seletividade: Propriedade de um sistema de medição, utilizado com um procedimento de medição especificado, segundo a qual o sistema fornece valores medidos para um ou vários mensurandos, tal que os valores de cada mensurando sejam independentes uns dos outros ou de outras grandezas associadas ao fenômeno, corpo ou substância em estudo;

5.34. Tendência: Estimativa de um erro sistemático;

5.35. Validação: Confirmação por exame e fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinado uso pretendido são atendidos;

5.36. Veracidade: Grau de concordância entre a média de um número infinito de valores medidos repetidos e um valor de referência;

5.37. Verificação: Avaliação de alguns parâmetros de validação de métodos analíticos quando o método for normalizado e dentro do escopo;

5.38. VMP: Valor máximo permitido.

6. PLANEJAMENTO DA VALIDAÇÃO

6.1. Os estudos para determinar os parâmetros de validação devem ser realizados com pessoal treinado, equipamentos calibrados e materiais de referência certificados;

6.2. As etapas para a realização de uma validação analítica são ilustradas pela Figura 1; Nota 1: A validação pode incluir procedimentos para amostragem, manuseio e transporte.

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Figura 1: Etapas para validação e verificação de procedimentos analíticos 7. PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

7.1. Os parâmetros que precisam ser avaliados durante o processo de validação podem variar de acordo com o tipo de ensaio, conforme mostrado no Quadro 1;

Parâmetro Tipo de ensaio Qualitativo Componente (ou analito) em maior teor Elementos menores e traços(1) Propriedades físicas Verificação (2) Precisão x x x x Seletividade x x x x Tendência / recuperação x x x Robustez x x x x

Sensibilidade / lineariedade / faixa de trabalho x x x x

Limite de detecção x x

Limite de quantificação x x

Quadro 1. Parâmetros de validação conforme o tipo de ensaio

(1)_{São considerados como de menor teor concentrações entre 0,01 a 1% e elementos traços, os elementos em concentração abaixo de 0,01%}

(2)_{Referente aos métodos analíticos que permanecem dentro do escopo normalizado para o qual foram concebidos}

Fonte: In-House Method Validation - A guide for Chemical Laboratories LGC / VAM, 2003

Ve

ri

fi

c

a

ç

ã

o

Va

li

d

a

ç

ã

o

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7.2. Se os dados de precisão (CVr e CRR) e exatidão (expressa pela recuperação) desse método não estiverem disponíveis, utilizar os critérios definidos na Tabela 2 conforme a faixa de concentração do analito nas amostras;

Tabela 2. Critérios de aceitação para precisão e exatidão em função da concentração do analito

Analito [%] Analito [fração] Unidade CVr [%] CVR [%] Recuperação [%] 100 1 100 % 1,3 2 98-102 10 10-1 _{10 %} _1,8 _2,8 _98-102 1 10-2 _{1 %} _2,7 ₄ _97-103 0,1 10-3 _0,1% _3,7 _5,7 _95-105 0,01 10-4 _{100 ppm} _5,3 ₈ _90-107 0,001 10-5 _{10 ppm} _7,3 _11,3 _80-110 0,0001 10-6 _{1 ppm} ₁₁ ₁₆ _80-110 0,00001 10-7 _{100 ppb} ₁₅ _22,6 _80-110 0,000001 10-8 _{10 ppb} ₂₁ ₃₂ _60-115(1) 0,0000001 10-9 _{1 ppb} ₃₀ _45,3 _40-120(2)

CVr = Coeficiente de variação estimado de Horwitz para repetibilidade

CVR = Coeficiente de variação estimado de Horwitz para a reprodutibilidade

(1)_{Recuperação recomendada de 70-110 % segundo Official Journal of the European Communities} (2)_{Recuperação recomendada de 50-120 % segundo Official Journal of the European Communities} Fontes: AOAC - Peer-Verified Methods Program, manual on policies and procedures, Arlington, VA, Nov. 1993 Official Journal of the European Communities, 2002/657/EC

Nota 2: Os coeficientes de variação estimados de Horwitz são válidos para qualquer método e independe da matriz ou do analito.

Nota 3: Para frações de analito abaixo de 100 ppb, a aplicação da equação de Horwitz resulta em valores de CVR relativamente altos e faixas de recuperação relativamente extensas. Portanto, para esses níveis de concentração, os referidos critérios de aceitação também poderão estar em consonância com as referências normativas para a determinação de analitos nesses níveis de concentração (como em cromatografia gasosa, por exemplo).

Nota 4: No caso de avaliação interlaboratorial, a reprodutibilidade do método analítico não deve ser maior que o critério de aceitação obtido a partir da metade da concentração máxima estabelecida pela legislação: CV (interlaboratorial) < CV (50% do VMP).

7.3. A validação deverá ser realizada na sequência ilustrada pelo fluxograma da Figura 2; 7.4. Registrar todos os cálculos e dados experimentais no relatório de validação;

Menor teor

Traços Maior teor

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Figura 2: Sequência de realização de parâmetros de validação

Nota 5: Adotar apenas um procedimento para avaliação de cada um dos parâmetros de validação, caso contrário justificar no relatório de validação;

Nota 6: Para verificações de métodos analíticos normalizados, adotar procedimentos de acordo com a ordem em que são descritos neste documento, em consonância com a viabilidade técnica desses métodos.

8. PROCEDIMENTO

8.1. Linearidade

8.1.1. Preparar pelo menos 6 níveis de concentração, preferencial e igualmente espaçados, ao longo da faixa de trabalho;

Nota 7: O branco do método deve ser usado para verificar se analitos ou interferentes estão presentes no sistema analítico, contudo não deve ser incluído na curva analítica, salvo se a viabilidade técnica do equipamento assim determinar;

Nota 8: Se a faixa de trabalho do método a ser validado for desconhecida ou se houver alteração no escopo analítico, proceder conforme instruções do Anexo A;

Atende Atende Linearidade Atende Atende Alt e ra ç ã o n o e s c o p o a n a lí tic o a n a lí tic o Não atende Não atende Não atende Não atende Não atende Não atende Método desenvolvido Seletividade Precisão Tendência Limite de quantificação Robustez Método validado Incerteza de medição Atende Atende Atende

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8.1.2. Analisar 3 replicatas independentes para cada nível de concentração de acordo com o método a ser validado (POP);

Nota 9: Recomenda-se que as medições dos níveis de concentração sejam realizadas em ordem aleatória, desde que esta não comprometa os sinais analíticos dos menores níveis de concentração;

8.1.3. Verificar a presença de valores discrepantes pelo teste de Grubbs (Anexo B). Esse teste deverá ser aplicado em cada nível de concentração, obedecendo a exclusão máxima de até 22,2% de todas as medições da curva analítica;

8.1.4. Verificar a homogeneidade de variâncias entre níveis de concentração pelo teste de Cochran (Anexo C). Se o resultado for homocedástico, proceder à regressão linear com o nível de concentração na abscissa e todas as respostas analíticas de cada triplicata na ordenada do gráfico. Se o resultado for heterocedástico, utilizar a transformação ponderada (Anexo D); 8.1.5. Construir o gráfico dos resíduos, plotando o nível de concentração na abscissa e todos os

resíduos de cada triplicata na ordenada (Equação 1). A distribuição dos valores em torno da linha central deve ser aleatória. Tendências nessa distribuição caracterizam a preseça de erro sistemático ou que o modelo matemático utilizado para a construção da curva é inadequado;

i i i =y yˆ

e - (Equação 1)

Onde: ei = resíduo referente à replicata de cada sinal analítico medido yi = sinal analítico medido

yˆ_i=sinal analítico previsto (estimado através da equação da regressão linear) 8.1.6. Verificar a normalidade dos resíduos através do teste de Ryan-Joiner (Anexo E);

8.1.7. Verificar se os resíduos são admissíveis através do teste-t unilateral (Equações 2 e 3). Excluir as replicatas correspondentes aos resíduos se tei > ttabelado para (n-2) graus de liberdade (Anexo F);

(

)

2 n yˆ y = s n 1 = i 2 i i res

-∑

(Equação 2) n s e = t res i ei (Equação 3)

Onde: sres = desvio-padrão dos resíduos de todos os níveis de concentração n = número total de replicatas

8.1.8. Verificar a independência dos resíduos através do teste de Durbin-Watson (Anexo G);

8.1.9. Verificar se o intervalo de confiança para o coeficiente linear (ICa) contém a origem do gráfico (Equações 4, 5 e 6). Os erros sistemáticos não são significativos se a reta de regressão linear passar por esse intervalo;

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(

)

∑

-n 1 = i 2 i n 1 = i 2 i res a x x n x × s = s (Equação 4) n x = x n 1 = i i

∑

(Equação 5) a a =a±ts IC (Equação 6)

Onde: sa = desvio-padrão do coeficiente linear x= média dos níveis de concentração n = número total de replicatas

a = coeficiente angular

t = valor de t-Student bilateral para (n-2) graus de liberdade (Anexo F)

8.1.10. Verificar se o coeficiente de correlação da regressão linear (Equação 7) atende ao critério de aceitação predefinido pelo método;

(

)(

)

(

)

∑

(

)

∑

-n 1 = i 2 i n 1 = i 2 i n 1 = i i i y y x x y y x x = r onde -1 < r < 1 (Equação 7)

Onde: x= média dos níveis de concentração y= média dos sinais analíticos

Nota 10: Curvas analíticas poderão ser rotineiramente preparadas sem replicatas por nível de concentração desde que os critérios de aceitação sejam atendidos.

8.2. Seletividade

8.2.1. A partir da recuperação

8.2.1.1. Definir o ponto médio da faixa de trabalho;

8.2.1.2. Definir a quantidade de padrão a ser adicionado à matriz empregada;

Nota 11: A limitação desse procedimento está no analito adicionado, pois ele não está necessariamente na mesma forma que a do analito já presente na matriz. Quando adicionado em uma forma mais facilmente detectável, pode resultar em avaliações superestimadas da recuperação.

Nota 12: Recomenda-se que a matriz contenha os demais parâmetros com concentrações semelhantes àquelas determinadas na rotina analítica.

8.2.1.3. Analisar a matriz fortificada, em triplicata, de acordo com o método a ser validado (POP); 8.2.1.4. Estimar a recuperação (Equação 8);

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100 c c c [%] o Recuperaçã 3 2 1 _        - (Equação 8)

Onde: c1 = concentração do analito na amostra fortificada c2 = concentração do analito na amostra não fortificada c3 = concentração do analito adicionado à amostra

8.2.1.5. Comparar o resultado com o critério de aceitação predefinido (Tabela 2);

8.2.1.6. Classificar como “satisfatório” se a recuperação estiver contida no invervalo correspondente ao nível de concentração;

Nota 13: A recuperação também poderá ser estimada em diferentes níveis de concentração da faixa de trabalho, se necessário.

8.2.2. A partir da linearidade

Nota 14: A curva analítica preparada para o estudo da linearidade deve ser empregada como referência a esse procedimento.

8.2.2.1. Seguir todo o item 8.1, substituindo a água ultrapura pela matriz;

8.2.2.2. Verificar se os coeficientes angulares e lineares são estatisticamente iguais (Anexo H). 8.3. Limite de detecção (LD)

8.3.1. A partir da linearidade

Nota 15: A curva analítica preparada para o estudo da linearidade deve ser empregada como referência a esse procedimento.

8.3.1.1. Estimar o limite de detecção (Equação 9).

b s × 3,3 = LD res (Equação 9)

Onde: sres = desvio-padrão dos resíduos de todos os níveis de concentração (Equação 9) b = coeficiente angular da curva analítica

Nota 16: O desvio-padrão do coeficiente linear (Equação 4) ou dos sinais analíticos de 7 replicatas do branco poderão ser alternativamente empregados no numerador da Equação 9.

8.3.2. A partir do branco

8.3.2.1. Analisar 7 replicatas do branco de acordo com o método a ser validado (POP); 8.3.2.2. Estimar o limite de detecção (Equações 10 e 11).

(

)

1 n x x = s n 1 = i 2 i

-∑

(Equação 10)

(10)

s t x

LD   (Equação 11)

Onde: x= média das concentrações dos brancos

s = desvio-padrão das concentrações dos brancos

t = valor de t-Student unilateral para (n-1) graus de liberdade (Anexo F)

8.3.3. A partir da menor concentração aceitável do analito no branco

8.3.3.1. Analisar 7 replicatas do padrão de acordo com o método a ser validado (POP);

8.3.3.2. Calcular o coeficiente de variação (Equação 12) e compará-lo com o critério de aceitação predefinido (Tabela 2);

100 × x s = CV (Equação 12)

8.3.3.3. Estimar o limite de detecção (Equação 13). s t

LD  (Equação 13)

Onde: s = desvio-padrão da menor concentração aceitável do analito (Equação 10)

t = valor de t-Student unilateral para (n-1) graus de liberdade (Anexo F)

8.4. Limite de quantificação (LQ) 8.4.1. A partir da linearidade

8.4.1.1. Estimar o limite de quantificação (Equação 14);

b s × 10 = LQ res (Equação 14)

Onde: sres = desvio-padrão dos resíduos de todos os níveis de concentração (Equação 9) b = coeficiente angular da curva analítica

8.4.1.2. Verificar se o LQ estimado atende aos critérios de aceitação para precisão e exatidão (Tabela 2) através da análise de 7 replicatas preparadas a partir da concentração estimada.

Nota 17: O desvio-padrão do coeficiente linear (Equação 4) ou dos sinais analíticos de 7 replicatas do branco poderão ser alternativamente empregados no numerador da Equação 14.

8.4.2. A partir do branco

8.4.2.1. Analisar 7 replicatas do branco de acordo com o método a ser validado (POP); 8.4.2.2. Estimar o limite de quantificação (Equação 15);

s 10 + x = LQ (Equação 15)

(11)

Onde: x= média das concentrações dos brancos

s = desvio-padrão das concentrações dos brancos

8.4.2.3. Verificar se o LQ atende aos critérios de aceitação para precisão e exatidão (Tabela 2) através da análise de 7 padrões preparados com a mesma concentração que foi estimada para o LQ.

8.4.3. A partir da menor concentração aceitável do analito no branco

8.4.3.1. Analisar 7 replicatas do padrão de acordo com o método a ser validado (POP);

8.4.3.2. Verificar se o LQ atende aos critérios de aceitação para precisão e exatidão (Tabela 2); 8.4.4. A partir da recuperação

8.4.4.1. Estimar o LQ a partir do primeiro nível de concentração da curva analítica;

Nota 18: Para analitos presentes no branco, esse nível de concentração deve ser estimado a partir do triplo do desvio-padrão ou da média da concentração desse branco (o que for maior);

8.4.4.2. Analisar 7 replicatas de acordo com o método a ser validado (POP);

8.4.4.3. Estimar a metade da faixa do intervalo previsto para os resultados (MFIPR) (Equação 16);

s 963 , 3

MFIPR  (Equação 16)

Onde: s = desvio-padrão das concentrações dos brancos 3,963 = valor constante para sete replicatas

8.4.4.4. Estimar as recuperações para os intervalos previstos superior (IPRSUP) e inferior (IPRINF) (Equações 17 e 18); 150% 100 a fortificad ão Concentraç MF x IPR IPR SUP     (Equação 17) 50% 100 a fortificad ão Concentraç MF x IPR IPR INF     (Equação 18)

Onde: x= média das concentrações dos brancos ou do menor nível de concentração 8.4.4.5. Verificar se as recuperações atendem ao critério de aceitação predefinido (Equações 17

e 18). Em caso afirmativo, atribuir o nível de concentração testado ao valor do LQ do método;

Nota 19: A recuperação também poderá ser estimada para diferentes níveis de concentração da faixa de trabalho, se necessário.

8.5. Exatidão

(12)

8.5.1.1. Verificar se o nível de concentração correspondente ao z-escore obtido pelo ensaio de proficiência está contido na faixa de trabalho do método a ser validado (POP);

8.5.1.2. Classificar como “satisfatória” a tendência do método se |z| ≤ 2; Se uma das etapas desse procedimento não forem satisfeitas, avaliar a tendência a patir de outro critério.

8.5.2. A partir do erro normalizado

8.5.2.1. Analisar 7 replicatas do nível de concentração a ser avaliado de acordo com o método a ser validado (POP);

8.5.2.2. Estimar o erro normalizado (Equação 19);

2 verdadeiro 2 verdadeiro U + U x x = EN - (Equação 19)

Onde:

x

= média das concentrações das replicatas

xverdadeiro = valor da concentração aceito como verdadeiro U = incerteza associada ao valor experimental

Uverdadeiro = incerteza associada ao padrão 8.5.2.3.

8.5.2.4. Classificar como “adequada” a tendência do método se |EN| ≤ 1; caso contrário, avaliar a tendência a partir de outro critério.

8.5.3. A partir da recuperação 8.5.3.1. Proceder ao item 8.2.1.4. 8.5.4. A partir do erro relativo

8.5.4.1. Analisar 7 replicatas do nível de concentração a ser avaliado de acordo com o método a ser validado (POP);

8.5.4.2. Calcular o erro relativo (Equação 20);

100 × x x x = [%] ER verdadeiro verdadeiro (Equação 20)

Onde:

x

= média das replicatas

xverdadeiro = valor aceito como verdadeiro a partir de um padrão

8.5.4.3. Comparar o resultado com o critério de aceitação predefinido (Tabela 2, Nota 14); Nota 20: A tendência também pode ser expressa através da recuperação analítica (Equação 21) onde, na

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100 × valor valor = [%] RA Esperado Observado (Equação 21)

Nota 21: Recomenda-se que o nível de concentração esteja prontamente disponível por um padrão. Caso contrário, preparar o nível de concentração desejado.

8.5.5. A partir do teste de hipótese

8.5.5.1. Analisar 7 replicatas do nível de concentração a ser avaliado de acordo com o método a ser validado (PO);

Nota 22: Recomenda-se que o nível de concentração esteja prontamente disponível por um padrão. Caso contrário, preparar o nível de concentração desejado.

8.5.5.2. Calcular o valor de t-Student (Equação 22);

(

)

n s x μ = t_i - (Equação 22)

Onde: μ = valor aceito como verdadeiro a partir de um MRC

x

= média das replicatas

n = número de replicatas

s = desvio-padrão das replicatas

8.5.5.3. Classificar como “satisfatória” a exatidão se ti < 2,447. 8.6. Precisão

8.6.1. A partir da estimativa do limite de repetibilidade 8.6.1.1. Definir o nível de concentração que será avaliado;

8.6.1.2. Analisar 7 replicatas da amostra ou de um padrão de acordo com o método a ser validado (POP);

8.6.1.3. Verificar a presença de valores discrepantes pelo teste de Grubbs (Anexo B);

8.6.1.4. Calcular o coeficiente de variação (Equação 12) e compará-lo com o critério de aceitação predefinido (Tabela 2);

8.6.1.5. Classificar como “satisfatório” se o CV ≤ CVr;

8.6.1.6. Determinar o limite de repetibilidade, r (Equação 23);

s × 748 , 2 = r (Equação 23)

Onde: s = desvio-padrão das replicatas

(14)

8.6.2. A partir da precisão intermediária (reprodutibilidade interna) 8.6.2.1. Definir o nível de concentração que será avaliado;

8.6.2.2. Analisar 7 replicatas da amostra ou de um padrão, por dia e por analista (2 dias e 2 analistas), de acordo com o método a ser validado (POP);

8.6.2.4. Calcular o coeficiente de variação (Equação 12), aplicando o desvio-padrão dado pela Equação 21;

8.6.2.5. Comparar o coeficiente de variação com o critério de aceitação predefinido (Tabela 2); 8.6.2.6. Classificar como “satisfatório” se o CV ≤ CVR;

8.6.2.7. Determinar o limite de reprodutibilidade interna, ri (Equação 24), aplicando o desvio-padrão dado pela Equação 21;

(

-

)

∑∑

(

-

)

2 1 = j 7 1 = i 2 j ji i _n_p ₁ x x 1 = s (Equação 24)

Onde: n(p-1) = graus de liberdade n = número de amostras

p = número de replicatas por amostra j = número da amostra

i = número da replicata

xji = valor da replicata i para a amostra j

x_j= média aritmética das replicatas da amostra j

8.6.2.8. Classificar como “satisfatória” a precisão intermediária se o módulo do erro entre replicatas < r;

Nota 23: Na maioria dos casos, o valor de precisão intermediária é função do nível de concentração do ensaio.

8.6.3. Reprodutibilidade

8.6.3.1. A partir de programas interlaboratoriais

8.6.3.1.1. Verificar se o nível de concentração da amostra fornecida pelo provedor está contido na faixa de trabalho do método a ser validado (POP);

8.6.3.1.2. Analisar a quantidade de replicatas sugerida pelo provedor do ensaio de proficiência (ou do estudo colaborativo, se for o caso) de acordo com o método a ser validado (POP);

8.6.3.1.3. Verificar a presença de valores discrepantes pelo teste de Grubbs (Anexo B); 8.6.3.1.4. Determinar o limite de reprodutibilidade, R (Equação 25);

(

2

)

entre 2 dentro+s s × 748 , 2 = R (Equação 25)

(15)

Onde: s2_dentro= média das variâncias dos resultados de cada laboratório (s2_dentro

deve ser menor que s2_entre)

2 entre

s = variância das médias dos resultados de cada laboratório

8.6.3.1.5. Classificar como “satisfatória” a reprodutibilidade do método se a diferença entre o valor médio de nossas replicatas e o valor médio de todo o grupo for menor que o limite de reprodutibilidade.

8.6.4. A partir do teste de hipótese

8.6.4.1. Definir o nível de concentração que será avaliado;

8.6.4.2. Analisar 7 replicatas da amostra ou de um padrão para cada um dos métodos sob comparação;

8.6.4.4. Comparar o valor calculado (Equação 26) com o F-tabelado (Anexo I). Se F < Ftabelado, então a precisão entre os métodos é considerada estatisticamente igual;

2 2 res 2 1 res s s = F (Equação 26)

Onde:

s

_res2 ₁= maior valor encontrado de variância das replicatas

s

_res2 ₂= menor valor encontrado de variância das replicatas

Nota 24: Na inexistência de métodos de referência validados com os quais possam ser comparadas as características de precisão, os valores aceitáveis de repetibilidade e reprodutibilidade podem ser calculados a partir das equações de Horwitz (Equações 27 e 28). A forma mais adequada para se avaliar a aceitabilidade da precisão de um método consiste no uso do valor de HorRat (Equação 29). Assim, considera-se a reprodutibilidade do método satisfatória se HorRat ≤ 2.

(1-0,5logC) R=2 CV (Equação 27) R r=0,67CV CV (Equação 28) ( ) R erimental exp R CV CV = HorRat (Equação 29)

Onde: CVR = coeficiente de variação estimado de Horwitz para reprodutibilidade obtida a partir de estudo colaborativo (expresso em %)

CVr = coeficiente de variação estimado de Horwitz para repetibilidade (expresso em %) C = concentração (expressa em fração decimal)

HorRat = Horwitz Ratio

CVR (experimental) = coeficiente de variação do método sob avaliação a partir de estudo intra ou interlaboratorial (expresso em %)

Nota 25: Na impossibilidade de obtenção do CVR (experimental), poder-se-á aplicar o CVr (experimental) ao numerador da razão de Horwitz (embora o primeiro procedimento seja o ideal), considerando-se o mesmo denominador.

(16)

8.7. Robustez

8.7.1. Definir os fatores críticos ao método analítico (por exemplo: temperatura, comprimento de onda, etc.);

Nota 26: Dois valores serão atribuídos por fator (por exemplo: temperatura “A” = 20°C e temperatura “a” = 25°C).

8.7.2. Preparar uma matriz de experimentos baseada na Tabela 3;

Nota 27: O número de experimentos será igual ao número de fatores mais um (NE = NF + 1).

Tabela 3. Matriz de experimentos de Plackett-Burman

Valor dos fatores Experimentos

1 2 3 4 5 6 7 8 A → a A A A A a a a a B → b B B b b B B b b C → c C c C c C c C c D → d D D d d d d D D E → e E e E e e E e E F → f F f f F F f f F G → g G g g G g G G g Resultados s t u v w x y z

8.7.3. Realizar os experimentos em triplicata de acordo com o método a ser validado (PO), obedecendo às combinações de fatores indicada pela matriz;

8.7.4. Calcular o efeito de cada fator (Equação 30);

m ) Minúsculo ( resultados m ) Maiúsculo ( resultados = Dx_i

∑

-

∑

(Equação 30)

Onde: Dxi = efeito do fator i

resultados (Maiúsculo) = resultados analíticos correspondentes aos experimentos que contemplam o fator identificado pela letra maiúscula (para o fator C, por exemplo, os resultados são: s, u, w e y)

resultados (Minúsculo) = resultados analíticos correspondentes aos experimentos que contemplam o fator identificado pela letra minúscula (para o fator c, por exemplo, os resulados são: t, v, x e z)

m = metade do número de experimentos

8.7.5. Verificar se há diferença na variação de cada fator através do teste-t (Equação 31), comparando-os com o valor unilateral para (n-1) graus de liberdade (Anexo F). Se txi < ttabelado, então o efeito do fator xi não é significativo;

(17)

2 s m Dx = t_x_i i (Equação 31)

Onde: Dxi = efeito do fator i

m = metade do número de experimentos

s = desvio-padrão do método Nota 29: Empregar o desvio-padrão ponderado se o experimento contiver vários níveis de concentração.

9. REFERÊNCIAS

9.1. NBR ISO/IEC 17025 – Requisitos gerais para competência de laboratórios de ensaio e calibração, ABNT, 2005;

9.2. VIM – Vocabulário internacional de metrologia, 1ª edição luso-brasileira, Inmetro, 2012; 9.3. RE 899 – Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos, Anvisa, 2003; 9.4. NIE-DIMEL-064 – Critérios para validação de métodos de ensaio, Inmetro, 2005;

9.5. DOQ-CGCRE-008_04 – Orientação sobre validação de métodos analíticos, Inmetro, 2011;

9.6. DOQ-CGCRE-020_05 – Definições de termos utilizados nos documentos relacionados à acreditação de laboratórios, produtores de materiais de referência e provedores de ensaios de proficiência, Inmetro, 2011;

9.7. NIT-DICLA-57_01 – Critérios para acreditação da amostragem de águas e matrizes ambientais, Inmetro, 2010;

9.8. ISO 5725-2 – Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method, 1994;

9.9. Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis, IUPAC technical report, Pure Appl. Chem., vol. 74, n. 5, pp. 835–855, 2002;

9.10. Validação de métodos de ensaios (Mery dos Santos Filho), apostila da Rede Metrológica do Estado de São Paulo, 2010;

9.11. Validação de métodos analíticos (Cleide Bassani Barros), apostila do Centro de Educação Profissional, 2011;

9.12. Statistics and chemometrics for analytical chemistry, 5th edition, J. N. Miller & J. C. Miller, 2005; 9.13. Validação de metodologias para análises físico-químicas (Roberto Gonçalves Junqueira), IX

Simpósio internacional ABRAPA de inocuidade de alimentos, 2010;

9.14. Procedimento para validação intralaboratorial de métodos de ensaio: Delineamento e aplicabilidade em análises de alimentos (Sheila Vitorino Carvalho de Souza), Tese de doutorado, UFMG, 2007;

9.15. The fitness for purpose for analytical methods: A laboratory guide to method validation and related topics, EuraChem, 1998;

9.16. How to meet ISO 17025 requirements for method verification: ALACC Guide, AOAC international, 2007;

9.17. Official journal of the european communities: Implementing council directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, 2002;

9.18. Technical note 17: Guidelines for the validation of quantitative and qualitative methods. NATA, 2012;

(18)

9.19. EPA 8260B - Volatile organic compounds by gas chromatography mass spectrometry (GCMS),

U.S. Environmental Protection Agency, 1996;

9.20. EPA 8270D - Semivolatile organic compounds by gas chromatography mass spectrometry (GCMS), U.S. Environmental Protection Agency, 1998;

9.21. EPA 524.3 - Measurement of purgeable organic compounds in water by capillary column gas chromatography mass spectrometry (CGMS), U.S. Environmental Protection Agency, 2009;

9.22. EPA 525.3 - Determination of semivolative organic chemical in drinking water by solid phase extraction and capillary column gas chromatography mass spectrometry (CGMS), U.S. Environmental Protection Agency, 2012.

10. ANEXOS

10.1. Anexo A: Determinação da Faixa de Trabalho 10.2. Anexo B: Teste de Grubbs

10.3. Anexo C: Teste de Cochran

10.4. Anexo D: Transformação Ponderada 10.5. Anexo E: Teste de Ryan-Joiner 10.6. Anexo F: Distribuição t-Student 10.7. Anexo G: Teste de Durbin-Watson 10.8. Anexo H: Teste t-Student

10.9. Anexo I: Distribuição F-Snedecor/Fisher 10.10. Anexo J: Exemplo de Avaliação de Robustez

(19)

ANEXO A: DETEMINAÇÃO DA FAIXA DE TRABALHO

a. Para qualquer método quantitativo, existe uma faixa de concentrações do analito ou de valores de uma dada propriedade na qual o método pode ser aplicado. Essa determinação é iniciada pela escolha de uma faixa preliminar (Etapa 1 do Quadro A.1);

b. A faixa de trabalho deve cobrir a faixa de aplicação para a qual o ensaio vai ser usado, cuja concentração mais esperada deve, sempre que possível, se situar no centro dessa faixa (Etapas 2 e 3 do Quadro A.1);

c. No limite inferior, o fator limitante é o valor do limite de quantificação. No limite superior, os fatores limitantes dependem do sistema de resposta do equipamento de medição;

d. Dentro da faixa de trabalho a resposta do sinal terá uma relação linear com o analito, onde sua extensão deve ser estabelecida durante a avaliação dessa faixa.

Etapa

(replicatas) Matriz Procedimento

Etapa 1 (n ≥ 7)

Água ultrapura com adição de concentrações variadas do analito

Obs.: Preparar diferentes concentrações de modo independente e não alíquotas da mesma solução mãe

Objetivo: Identificar inicialmente, por observação visual, a faixa linear aproximada e os limites inferior e superior da faixa de trabalho

i) Colocar no eixo x as concentrações do analito e no eixo y, suas respectivas respostas de medição

ii) Ir para a etapa 2

Etapa 2

(n ≥ 7) Diferentes concentrações de materiais de referência na faixa linear

Objetivo: Determinar a faixa de trabalho e confirmar a linearidade

i) Colocar no eixo x as concentrações do analito e no eixo y, suas respectivas respostas de medição

ii) Verificar visualmente a existência de dispersos que possam interferir na regressão (antes de remover os dispersos, fazer determinações nas proximidades das concentrações)

iii) Calcular os coeficientes da reta de regressão iv) Calcular e fazer o gráfico dos valores dos resíduos v) Ir para a etapa 3

Etapa 3 (n ≥ 7)

Água ultrapura com adição de concentrações variadas do analito próximas ao limite de detecção (LD)

Objetivo: Determinar o limite de quantificação (LQ), que efetivamente forma o limite mais baixo da faixa de trabalho

i) Expressar o LQ como a concentração mais baixa do analito que pode ser determinada com um nível aceitável de incerteza

(20)

ANEXO B: TESTE DE GRUBBS

Procedimento:

a. Colocar os valores em ordem crescente;

b. Calcular a média e o desvio-padrão desses valores (Equações 5 e 10);

c. Proceder ao teste de Grubbs para cada um dos valores das extremidades (Equação B.1);

s x x =

G_calculado i - (Equação B.1)

Onde: xi = valor suspeito x = média das replicatas

s = desvio-padrão das replicatas

d. Comparar o valor obtido com o valor tabelado (Tabela B.1);

Tabela B.1: Valores críticos de Grubbs para um nível de confiança de 95%

n Valor 3 1,154 4 1,481 5 1,715 6 1,887 7 2,020 8 2,127 9 2,215 10 2,290 11 2,355 12 2,412 13 2,462 14 2,507 15 2,549 16 2,586 17 2,620 18 2,652 19 2,681 20 2,708 30 2,908 n = número de amostras

e. Descartar o valor suspeito se Gcalculado > Gtabelado;

(21)

ANEXO C: TESTE DE COCHRAN

Procedimento:

a. Calcular a variância de cada um dos níveis de concentração; b. Proceder ao teste de Cochran (Equação C.1);

∑

3 1 = i 2 i 2 máx calculado s s = C (Equação C.1)

Onde: s2_máx= maior valor de variância dentre os níveis de concentração

∑

n 1 = i 2 i

s = somatório das variâncias de todos os níveis de concentração

c. Comparar o valor obtido com o valor tabelado (Tabela C.1);

Tabela C.1: Valores críticos de Cochran para um nível de confiança de 95%

NC Valor (p=3) 2 0,9750 3 0,8709 4 0,7679 5 0,6838 6 0,6161 7 0,5612 8 0,5157 9 0,4775 10 0,4420

NC = número de níveis de concentração ou variâncias p = número de replicatas por concentração

d. Se Ccalculado < Ctabelado, então haverá homocedasticidade entre os níveis de concentração; caso contrário, a condição será de heterocedasticidade.

(22)

ANEXO D: TRANSFORMAÇÃO PONDERADA Procedimento:

a. Calcular o fator de ponderação para cada nível de concentração (Equação D.1);

∑

n 1 = i 2 i 2 i i s 1 n 1 s 1 = w (Equação D.1)

Onde: wi = fator de ponderação do nível de concentração i si2_{= variância do nível de concentração i}

n = número total de replicatas

b. Calcular a média ponderada dos níveis de concentração (Equação D.2);

a - (Equação D.5)

Onde: aw = coeficiente linear ponderado

f. Determinar a concentração do analito na amostra (Equação D.6)

w w b a y = x - (Equação D.6)

Onde: x = concentração do analito na amostra y = sinal analítico do analito na amostra

(23)

ANEXO E: TESTE DE RYAN-JOINER

Procedimento:

a. Calcular os resíduos de cada replicata (Equação E.1);

i i i =y yˆ

e - (Equação E.1)

Onde: ei = resíduo correspondente à replicata

yi = sinal analítico medido

yˆ_i= sinal analítico estimado através da equação da regressão linear

b. Ordenar os resíduos em ordem crescente; c. Calcular os quantis normais (Equação E.2);

4 1 + n 8 3 i = q_i -(Equação E.2)

Onde: qi = quantil esperado

i = valor do resíduo ordenado de posição i n = número total de replicatas

d. Construir um gráfico dos valores dos resíduos versus os valores dos quantis estimados para uma distribuição normal reduzida (quantis normais);

e. Calcular o coeficiente de correlação crítico para um nível de confiança de 95% (Equação E.3);

2 crítico n 3505 , 1 + n 6118 , 0 n 1288 , 0 0063 , 1 r ≈ - - (Equação E.3)

Onde: n = número total de replicatas

f. Comparar o valor obtido com coeficiente de correlação gerado pelo gráfico. Se r > rcrítico, então há indício de normalidade dos resíduos da regressão linear.

(24)

ANEXO F: DISTRIBUIÇÃO T-STUDENT

Tabela F.1. Valores críticos de t-Student para um nível de confiança de 95%

Graus de liberdade (ν) Unilateral (α/2 = 0,025) Bilateral (α = 0,05) 1 6,314 12,706 2 2,920 4,303 3 2,353 3,182 4 2,132 2,776 5 2,015 2,571 6 1,943 2,447 7 1,895 2,365 8 1,860 2,306 9 1,833 2,262 10 1,812 2,228 11 1,796 2,201 12 1,782 2,179 13 1,771 2,160 14 1,761 2,145 15 1,753 2,131 16 1,746 2,120 17 1,740 2,110 18 1,734 2,101 19 1,729 2,093 20 1,725 2,086 21 1,721 2,080 22 1,717 2,074 23 1,714 2,069 24 1,711 2,064 25 1,708 2,060 26 1,706 2,056 27 1,703 2,052 28 1,701 2,048 29 1,699 2,045 ∞ 1,645 1,960 α = nível de significância

(25)

ANEXO G: TESTE DE DURBIN-WATSON

Procedimento:

a. Calcular o valor “d” (Equação G.1);

∑

- -n 1 = i 2 i n 1 = i 2 1 i i e ) e e ( = d (Equação G.1)

b. Calcular os limites críticos dI (inferior) e dS (superior) em um nível de confiança de 95% (Equações G.2 e G.3); 2 I n 6400 , 16 + n 4148 , 3 n 8607 , 2 9693 , 1 d ≈ - - (Equação G.2) 2 S n 3662 , 16 + n 3862 , 1 n 0547 , 3 9832 , 1 d ≈ - - (Equação G.3)

Onde: ei = resíduo correspondente à replicata

n = número total de replicatas

c. Avaliar os resultados com o seguinte critério:

Se d estiver entre os limites críticos, então o teste é inconclusivo; Se d < dI, então há indício de autocorrelação de resíduos; Se d > dS, então há indício de independência de resíduos.

Nota G.1: Se houver autocorrelação de resíduos, então o modelo matemático dos mínimos quadrados ordinários (regressão linear simples) aplicado na correlação entre as medições sob diferentes níveis de concentração não é apropriado.

(26)

ANEXO H: TESTES DE F-FISCHER E T-STUDENT

Procedimento:

a. Verificar a homogeneinade de variâncias de ambas as curvas analíticas através do teste F de Fisher (Equação H.1); 2 2 res 2 1 res s s = F (Equação H.1)

Onde:

s

2_res₁= maior valor encontrado de variância residual

s

_res2 ₂= menor valor encontrado de variância residual

b. Comparar o valor obtido com o F-tabelado. Se F < Ftabelado (homocedasticidade), então proceder ao teste t de Student, empregando as Equações H.2, H.3, H.4 e H.5. Caso contrário (heterocedasticidade), proceder ao teste t de Student, empregando as Equações H.6, H.7 e H.8; c. Comparar o valor calculado com o t-tabelado (Anexo F). Se ta e tb< ttabelado, então a hipótese de

4 n + n s 2 n + s 2 n = s 2 1 2 2 res 2 2 1 res 1 2 p -- (Equação H.4)

Onde: b1 e b2 = coeficientes angulares

2 p

(27)

2 xx 2 n 1 = i 2 2 2 p 1 xx 1 n 1 = i 2 1 2 p 2 1 a S n x s + S n x s a a = t

∑

-(Equação H.5)

Onde: a1 e a2 = coeficientes lineares

2 xx 2 2 res 1 xx 2 1 res 2 1 b S s + S s b b = t - (Equação H.6) 2 xx 2 n 1 = i 2 2 2 2 res 1 xx 1 n 1 = i 2 1 2 1 res 2 1 a S n x s + S n x s a a = t

∑

(Equação H.7) 2 n n s + 2 n n s n s + n s = ν 2 2 2 2 2 res 1 2 1 2 1 res 2 2 2 res 1 2 1 res -(Equação H.8)

(28)

ANEXO I: DISTRIBUIÇÃO F-SNEDECOR/FISHER

ν1 = graus de liberdade para o numerador

ν2 = graus de liberdade para o denominador

(29)

ANEXO J: EXEMPLO DE AVALIAÇÃO DE ROBUSTEZ

Dados:

a. Elaboração da matriz de experimentos para determinação do analito por cromatografia (Quadro J.1); b. Experimentos avaliados através de 4 replicatas com padrões em 3 níveis de concentração (mg/kg); c. Para cada replicata foi efetuado toda a sequência do método analítico;

d. Desvio-padrão ponderado = 0,167 mg/kg (ν = 9 graus de liberdade);

e. Cálculo do efeito dos fatores, bem como da estatística t para cada um deles; f. Comparação com o valor crítico (t = 1,833) e conclusão.

Identificação dos fatores Valor dos fatores Experimentos

1 2 3 4 5 6 7 8

Idade da coluna nova (A) velha (a) A A A A a a a A

Velocidade do fluxo 0,8mL/min (B) 1,2 mL/min (b) B B b b B B b B

Variável imaginária (inerte) + (C) - (c) C c C c C c C C

Fase móvel (MeOH/água) 90/10 v/v (D) 95/5 v/v (d) D D d d d d D D

Volume de injeção 15 μL (E) 25 μL (e) E e E e e E e E

Comprimento de onda do detector 320 nm (F) 330 nm (f) F f f F F f f F

Temperatura da coluna 30°C (G) sem forno (g) G g g G g G G G



-0,07 = 4 5,09 4,59 5,35 5,33 -4 4,79 4,75 5,07 5,47 = DxG       59 , 0 = 2 167 , 0 4 07 , 0 = t_G não significativo