Enzimas que ultrapassam o limite difusivo
Em certas condições é possível observar eficiências catalíticas superiores ao limite difusional do substrato e enzima.
1 - Canalização de substratos:
Enzima 1 Enzima 2 Enzima 3 Enzima 4
A difusão do produto de uma reacção enzimática é facilitada por canalização para o centro activo do próximo enzima da via metabólica. Por vezes as várias actividades enzimáticas estão localizadas num mesmo complexo multi-enzimático (e.g.: complexo piruvato desidrogenase no ciclo TCA)
A difusão de um substrato hidrófobo pode ocorrer no interior de uma membrana, limitando o volume disponível para a difusão até ao centro activo do enzima (e.g.:enzimas da cadeia respiratória)
Exemplo de canalização de substratos:
o complexo da piruvato desidrogenase
Reacção total catalizado pelo complexo piruvato desidrogenase
Exemplo de canalização de substratos:
cadeia respiratória mitcondrial
Enzimas que ultrapassam o limite difusivo
2 – Condução activa do substrato:
+
+ +
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Campo eléctrico positivo--
-
-
--
--
-
-Condução electrostática na superóxido dismutase
-+ -+
Campo eléctrico negativo--
-Anião superóxido (O2-)1 2 1 2
E
A
EA
E
P
k k k k − −→
→
+
←
1←
2+
1E
A
kEA
kE
P
k −→
+
←
→
+
Equação reversível de Michaelis-Menten
Uma vez que todas as reacção enzimáticas são, em princípio, irreversíveis, o tratamento apresentado para os enzimas mono-substrato só ficará completo se for permitida a reacção inversa à de formação do produto:
Também neste caso assumimos condições de estado estacionário para o complexo central:
[EA]
0
d
dt
=
Sendo a variação de [EA] dada por
1 0 2 0 1 2
[EA]
([E]
[EA])[A]
([E]
[EA])[P] (
)[EA]
0
d
k
k
k
k
Resolvendo em ordem a [EA] fica:
1 0 2 0
1 2 1 2
[E] [A]
[E] [P]
[EA]
[A]
[P]
k
k
k
k
k
k
− − −+
=
+
+
+
A velocidade efectiva de formação de produto já não é simplesmente dada por v=k2[EA], porque temos também que considerar a reacção inversa que consome P para formar EA:
2
[EA]
2([E]
0[EA])[P]
v
k
k
−
=
−
−
Substituindo o valor anterior de [EA] nesta expressão e simplificando, temos
1 2 0 1 2 0
1 2 1 2
[E] [A]
[E] [P]
[A]
[P]
k k
k k
v
k
k
k
k
− − − −−
=
+
+
+
(cont.)Equação reversível de Michaelis-Menten
Note-se que se tivermos [P]=0, esta expressão reduz-se a
1 2 0 0 2 0 0 1 2
1 2 1 0
0 1
[E] [A]
[E] [A]
[A]
[A]
k k
k
v
k
k
k
k
k
k
− −=
=
+
+
+
+
que é a simplesmente a equação de Michaelis-Menten obtida no contexto do mecanismo de Briggs-Haldane. (Porquê [A]o em vez de [A] ?...)
As expressões da constante de especificidade kA e para a constante de Michaelis, KmA, (o uso do “A” em índice denota reacção directa),
Têm um equivalente para a reacção inversa dado por
2 A 1 2 mA 1 2
k
k k
K
k
k
k
−=
=
+
1 mA 2 1K
k
k
k
−+
=
e 1 1 2 mP 2 P 1k
k
K
k
k
k
k
− − − −=
=
+
1 mP 2 2K
k
k
k
− −+
=
eEquação reversível de Michaelis-Menten
(oont.) se substituirmos esta definições na expressão da velocidade, fica:
0
A P
mA mP
0
[E] [A]
[E] [P]
[A]
[P]
1
k
k
K
K
v
=
−
+
+
Esta expressão é a forma reversível da equação de Michaelis-Menten, não sendo exclusiva do mecanismo particular a partir da qual foi obtida.
Mecanismos muito mais complexos podem produzir esta equação! Note-se que:
cat 0 A 0 m
m
[E] [A]
[E] [A]
[A]
[A]
1
k
k
v
K
K
=
=
+
+
logo a forma funcional da equação irreversível de MM fica semelhante à forma reversível desde que escrita em termos de kA e Km
Mecanismo reversível com dois complexos centrais
(mecanismo de 3 passos)
Uma extensão natural do mecanismo discutido consiste em assumir que a ligação do substrato e libertação do produto ocorrem de modo simétrico, e que o complexo enzima-produto tem uma existência que não é desprezável:
3 1 2 1 2 3
E
A
kEA
kEP
kE
P
k k k − − −→
→
→
+
←
←
←
+
0 A P mA mP 0[E] [A]
[E] [P]
[A]
[P]
1
k
k
K
K
v
=
−
+
+
A equação de velocidade tem a forma funcional do mencanismo anterior,
Mas as definições dos parâmetros observáveis em termos das constantes cinéticas são muito mais complexas.
Mecanismo reversível com dois complexos centrais
0
A P
mA mP
0
[E] [A]
[E] [P]
[A]
[P]
1
k
k
K
K
v
=
−
+
+
1 2 1 3 2 3 2 3 1 2 3 1 0 mA 0 A 2 2 3 2 2 3 mA 1 2 1 3 2 3(
)
k k
k k
k k
k k
k k k
k k
k
k
k
k
k
k
k
K
k
k
k k
k
k
K
k
− − − − − − − −+
+
=
=
=
=
+
+
+
+
+
+
1 2 1 3 2 3 1 2 1 2 3 3 1 2 2 1 2 2 1 2 1 3 0 mP 0 P mP 2 3(
)
k k
k k
k k
k k
k k k
k
k
k
k
k
k
K
k
k
k
k
K
k k
k k
k k
− − − − − − − − − − − − − − − − − −+
+
=
=
=
=
+
+
+
+
+
+
Note-se que temos 6 constantes de mecanismo (k1 k2 k3 k-1 k-2 k-3) mas apenas 4 parâmetros observáveis (KmA, KmP, kA e kP ), pelo que não existe uma única solução para os valores das constantes em termos de
observáveis.
N.B.: veja-se o uso de k
0 e k-0 para as constantes catalíticas da reacção
1 2 1 2 E A EA E P k k k k − − → → + ← ← + 1 2 1 2 3 3 E A k EA k EP k E P k k k − − − → → → + ← ← ← +
(
)
1 2 n n+1 1 1 2 -n n n complexos -(n+1) E A k EA k k EA k E P k k k k − − → → → → + ← ←L← ← + 1 complexo central 2 complexos centrais n complexos centrais condições de estado estacionário 0A
[E] [A]
0 P[E] [P]
[A]
[P]
1
k
k
K
K
v
=
−
+
+
A relação de Haldane
0
A P
mA mP
0
[E] [A]
[E] [P]
[A]
[P]
1
k
k
K
K
v
=
−
+
+
Os 4 parâmetros cinéticos da equação reversível de Michaelis-Menten,
Pois a constante de equilíbrio da reacção
eq
A
P
K
→
←
Não é alterada pela presença do catalisador.
Se [A]eq e [P]eq forem concentrações de equilíbrio, temos que ter
0 eq 0 e A P mA m q q q P e e
[E] [A]
[E] [P]
0
[A]
[P]
1
k
k
K
K
v
=
−
=
+
+
Porque no equilíbrio a velocidade de reacção é zero.
(cont.) daqui tiramos que:
A relação de Haldane
0 eq 0 eq
A
[E] [A]
P[E] [P]
0
k
−
k
=
e eq e P q A eq[P]
[A]
k
k
K
=
=
Relação de HaldaneA relação de Haldane também pode ser escrita como:
0 mA 0 mP eq -0 mP -0 mA
/
/
k
K
k K
K
k
K
=
k K
=
Da relação acima conclui-se que os 4 parâmetros cinéticos da reacção reversível, KmA,KmP, kA e kP não são independentes !
Enzimas “Irreversíveis”
Enzimas que apresentam enormes diferenças de velocidade na catálise da reacção directa e inversa, mesmo quando a reacção que catalisam tem uma constante de equilíbrio próxima da unidade.
Ex: o enzima metionina-adenosil-transferase catalisa a reacção directa 105
vezes mais depressa que a reacção inversa, mas o Keq da reacção é próximo de 1 !
Não existe qualquer impedimento termodinâmico. A relação de Haldane: A A cat mP max A mP A eq P A P cat mA max P mA
k
K
V
K
k
K
k
=
k
K
=
V
K
=
Limita o âmbito das constantes cinéticas, mas não impede este tipo de situação, porque KmA e KmP podem variar livremente.
Enzimas “Irreversíveis”
log([P]/[A]) log([P]/[A]) v v mP mA K << K mP mA K >> KAs setas indicam a direcção em relação ao equilíbrio, o qual é atingido quando [P]=[A] (sendo então log([P]/[A])=log(1)=0)
eq
eq
1
K
