UNIVERSIDADE PRSBITERIANA MACKENZIE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LUÍSE GARCIA RIBEIRO
ESTUDO DOS GENES TYR E P RESPONSÁVEIS PELO ALBINISMO DO TIPO OCA1 E OCA2 EM HUMANOS
SÃO PAULO
UNIVERSIDADE PRSBITERIANA MACKENZIE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LUÍSE GARCIA RIBEIRO
ESTUDO DOS GENES TYR E P RESPONSÁVEIS PELO ALBINISMO DO TIPO OCA1 E OCA2 EM HUMANOS
Monografia apresentada ao Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade Presbiteriana Mackenzie como parte dos requisitos para a conclusão do Curso de Graduação em Ciências Biológicas.
Orientadora de Iniciação Científica: Prof.ª Dra. Daniela Maria Oliveira Bonci
Orientadora de TCC: Prof.ª Dra. Ana Paula Pimentel Costa
São Paulo 2014
AGRADECIMENTOS
Ao Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Presbiteriana Mackenzie e a todos os meus professores, pela minha formação como Bióloga.
Ao CNPq, pela bolsa de iniciação científica que tornou possível a realização deste trabalho.
Ao Laboratório de Psicofisiologia Sensorial do Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo, onde aprendi e continuo aprendendo a ser pesquisadora.
À minha orientadora de IC Daniela, por ter sempre se mostrado disponível em me ajudar e me ensinar coisas que levarei pra vida e principalmente por acreditar em mim.
À professora Ana Paula, por ter aceitado ser minha orientadora do TCC. Ao Ronaldo Sano, por ter um trabalho tão bonito e ter me permitido fazer parte de um pouquinho disso, com a realização do meu TCC.
Aos meus pais, Ronaldo e Maria do Carmo, por terem investido nos meus estudos e que sem eles não me tornaria a bióloga que tanto sonhei.
Ao meu irmão Renan, por ter se empenhado em me ajudar sempre que precisei e pela preocupação que tem comigo.
Aos meus amigos da turma 311: Silvia, Andréa, Samar, Hernando, Thales, Guilherme, Caroline, Claus, Maísa, Marcela, Mayra, Maíra, Maysa, Verônica, obrigada pela parceria de todos os dias e por cada risada e momentos que passamos juntos, principalmente à Angelica e ao Renato por serem as melhores pessoas e me fazerem sorrir mesmo tendo que acordar às cinco da manhã.
Aos meus amigos que mesmo não sendo da minha turma, tive o privilégio de conhecer graças à faculdade.
Aos meus amigos do colégio: Marassi, Zanini, Basso, Lívia, Marina, Thiago Uema, Thiago Garcia e Marcello, obrigada por me apoiarem e estarem sempre tão presentes em cada momento que precisava de uma distração ou esquecer um pouco o stress da faculdade.
À Mariana e ao Filipe, por estarem envolvidos diretamente com meu TCC, por terem me apoiado e por terem se mostrado sempre disponíveis, obrigada por estarem comigo.
Ao Felipe Fill, por sempre me apoiar, incentivar e me fazer companhia sempre que precisei independente da ocasião, obrigada por estar sempre comigo.
Aos meus amigos do LabVis: Amanda, Aline, André, Diego, Viviani,Vitor, Luiz, Anna e Marcela, por terem tornado trabalhar uma tarefa mais divertida, obrigada principalmente à Silvia que me ajudou a fazer parte dessa equipe e por ser essa amiga tão especial; e aos meus amigos de PCR Felipe, Lívia e Einat, por terem me ajudado e ensinado tanto durante esse ano e por estarem sempre dispostos a me ajudar.
RESUMO
Albinismo em humanos é uma doença autossômica recessiva, na maioria dos casos, caracterizada pela ausência ou redução na síntese de melanina. Apresenta dois principais tipos: o albinismo ocular (Ocular Albinism – AO) manifestando alterações apenas oculares, e o albinismo óculo-cutâneo (Oculocutaneous Albinism – OCA) manifestando alterações na pele, olhos e cabelos. Existem dois principais tipos de OCA: o primeiro deles envolvendo o gene da tirosinase, denominado OCA1, caracterizado pela ausência total de melanina (OCA1A) ou podendo sintetizar uma pequena quantidade de melanina na pele ou no cabelo ao longo da vida (OCA1B); o segundo tipo OCA2, envolve alterações no gene P, com hipopigmentação na pele. Pacientes são diagnosticados a partir de uma análise dermatológica, a qual, aparentemente sozinha, não é suficiente para afirmar o tipo de albinismo presente no indivíduo, sendo necessária uma análise genética para confirmação do primeiro diagnóstico. Neste trabalho, foram feitas análises genéticas de 10 pacientes albinos, através do sequenciamento dos genes TYR e gene P, alguns deles apresentando seu pré-diagnóstico para uma comparação posterior com os resultados obtidos. Foram encontradas 3 mutações no gene P, para 6 pacientes, confirmando o diagnóstico prévio. A análise genética é de extrema importância para diagnosticar o tipo de albinismo, uma vez que podem existir falhas na análise dermatológica, sendo necessária a confirmação através do sequenciamento genético.
ABSTRACT
Albinism in humans is an autosomal recessive disorder that in most cases is characterized by the absence or reduction of the synthesis of melanin. There are two main types: Ocular Albinism - AO, that affects only the eyes; and Oculocutaneous Albinism – OCA, that affects the skin, eyes and hair. There are two main types of OCA: the first, called OCA1, it is related to the gene of tyrosinase, and can be identified by the complete lack of melanin (OCA1A), or a small amount can be synthesized in the skin or hair in a later life moment (OCA1B); the second, OCA2, it is related to P gene, with hypopigmentation of the skin. Patients can be diagnosed from a dermatological analysis, but it seems that it is not enough to identify the type of albinism, which requires a genetic analysis to confirm the first diagnostic. Genetic analysis was performed in 10 patients with albinism, through the sequencing of the genes TYR and P. Some of patients were pre-diagnosed for a later comparison with obtained results. Three mutations in the P gene were found among six patients, confirming the previous diagnostic. The genetic analysis is extremely important to diagnostic the albinism type, once that there can be flaws in the dermatological analysis, which makes necessary the confirmation through genetic sequencing.
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 8 1.1. Albinismo ... 8 1.2. Tipos de albinismo... 9 1.3. Sintomas ... 11 1.4. Prevalência ... 13 1.5. Melhorias ... 13
1.6. Causas genéticas do albinismo ... 14
2. OBJETIVO ... 15
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 15
3.1. Aspectos éticos ... 15
3.2. Pacientes ... 15
3.3. Extração de DNA ... 16
3.4. Reação em cadeia da polimerase – PCR... 16
3.5. Purificação das amostras ... 18
3.6. Sequenciamento das amostras ... 18
3.7. Análise dos resultados ... 18
4. RESULTADOS ... 19
5. DISCUSSÃO ...23
6. CONCLUSÃO ... 27
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 28
1. INTRODUÇÃO
1.1. Albinismo
O albinismo é um termo clínico genérico que descreve um grupo heterogêneo de doenças congênitas raras determinadas por múltiplas alterações genéticas que reduzem ou eliminam a expressão da melanina na pele, olhos ou cabelo (CASTILLO, et al., 2013; MÁRTINEZ-GARCÍA & MONTOLIU, 2013).
As células responsáveis pela síntese da melanina são os melanócitos, células dendríticas localizadas em várias partes do corpo como epiderme, olhos e cabelos. Os melanócitos sintetizam e acumulam a melanina em organelas chamadas de melanossomas (Figura 1), as quais podem ser produzidas em tamanhos, números e densidades variadas. A enzima responsável pela síntese de melanina é a tirosinase a qual está presente dentro dos melanossomos. Após a síntese de melanina, os melanossomos (também denominado nesta fase de “grânulo de melanina”), migram pelos prolongamentos dos melanócitos podendo ser transferidos para outras células ou mantidos nos melanócitos (HEARING & TSUKAMOTO, 1991).
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Em humanos a síntese de melanina – melanogênese – ocorre inicialmente a partir da conversão da tirosina em DOPA e esta em DOPAquinona através da enzima tirosinase (GIEBEL, et al., 1991) (Figura 2). O produto final desse processo é a síntese de dois pigmentos: a feomelanina, responsável pela cor amarelo-avermelhado; e a eumelanina, responsável pelas cores mais escuras como o marrom e o preto (LEVIN, et al., 2011).
Figura 2. O caminho da melanogênese (LEVIN, et al, 2010).
1.2. Tipos de albinismo
O albinismo pode ser classificado como:
1) albinismo ocular (Ocular Albinism - OA), caracterizado por hipopigmentação principalmente nas células do epitélio pigmentar da retina e na íris, mantendo uma pigmentação normal na pele e cabelos. Os melanócitos apresentam alteração nos melanossomos, pois estes aumentam muito de tamanho (SCHIAFFINO, et al., 1996). O albinismo ocular apresenta um padrão de herança recessiva ligada ao cromossomo X.
2) albinismo óculo-cutâneo (Oculocutaneous Albinism - OCA), grupo de albinismo com herança heterogênea e autossômica recessiva caracterizada pela falta total ou parcial de melanina, resultando na hipopigmentação do cabelo, pele e olhos, em humanos (PUROHIT, et al., 2014).
O tipo de albinismo mais frequente é o OCA, o qual pode ser dividido em até 7 tipos (Tabela 1), sendo dois deles mais comuns:
1) OCA1, derivado de mutações do gene da tirosinase, caracterizado pela ausência de melanina desde o nascimento até o decorrer da vida devido a mutações que inibem a atividade da tirosinase durante toda a vida (albinismo do tipo OCA1A); ou podendo desenvolver posteriormente uma pequena quantidade do pigmento na pele ou nos olhos devido a mutações que levam a alguma atividade enzimática com expressão e acúmulo de melanina ao longo do tempo (albinismo do tipo OCA1B) (GRONSKOV, et al., 2007);
2) OCA2, não apresenta mutações do gene tirosinase, pois a deficiência está no gene P (KING, et al., 2003). Existem poucos estudos na literatura a respeito da síntese da proteína P. Apresenta uma variedade de fenótipos com pele e cabelos com diferentes pigmentações. O indivíduo OCA2 apresenta pigmentação desde o nascimento.
OCA1A é o tipo mais severo de OCA por apresentar completa falta de produção de melanina durante a vida (PUROHIT, et al., 2012).
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Tabela 1. Classificação molecular do albinismo e outras síndromes (PUROHIT, et al.,
2014).
ALBINISMO GENE LOCALIZAÇÃO
CROMOSSÔMICA MUTAÇÕES OCA1 TYR 11q14-q21 303 OCA2 OCA2 15q11.2-q12 154 OCA3 TYRP1 9p23 16 OCA4 SLC45A2 5p13.3 78 OCA5 ND 4q24 1 OCA6 SLC24A5 15q21.1 2 OCA7 C10ORF11 10q22.2-q22.3 1 OA1 GPR143 Xp22.3 114 LYST CHS1 1q42.1-q42.2 53 HPS1 HPS1 10q23.1-q23.3 31 AP3B1 HPS2 5q14.1 20 HPS3 HPS3 3q24 7 HPS4 HPS4 22cen-q12.3 13 HPS5 HPS5 11p14 11 HPS6 HPS6 10q24.32 9 HPS7 DTNBP1 6p22.3 2 HPS8 BLOC1S3 19q13.32 2 HPS9 BLOC1S6 15q21.1 1
Fonte: Base de Dados de Gene e Mutação Humana, 05 Dezembro, 2013; ND: Não Determinado.
1.3. Sintomas
Todos os tipos de OCA e o AO apresentam sintomas oculares similares, incluindo nistagmo, hipopigmentação da íris levando a íris translúcida em casos extremos, redução da pigmentação do epitélio da retina, hipoplasia foveal, redução da acuidade visual, erros de refração, em alguns casos observa-se redução na visão de cores, fotofobia e redução da visão estereoscópica (GRONSKOV, et al., 2007; MÁRTINEZ-GARCÍA & MONTOLIU, 2013). Indivíduos albinos também são mais sujeitos ao câncer de pele devido à falta de pigmentação (OTTO, et al., 2010).
Atualmente, foram descritos 7 tipos de OCA que apresentam características oculares semelhantes, incluindo os sintomas descritos anteriormente. A redução de pigmentação ocorre em todos os tipos de albinismo, porém seu grau varia conforme o tipo (PUROHIT, et al., 2014):
OCA1A – cabelo, cílios e sobrancelhas são brancos, a pele é branca. A íris é azul, quase rosada e translúcida. Pigmentação não se desenvolve e pode ser presente pintas sem melanina. Os sintomas não variam conforme a idade ou raça. A fotofobia é intensa;
OCA1B – Com o passar dos anos, desenvolve alguma pigmentação na pele e no cabelo, e a íris de azul pode mudar para verde ou castanho. A manifestação da pigmentação pode variar conforme a temperatura corpórea em alguns casos; OCA2 – apresenta uma quantidade de pigmentação na pele a qual pode variar. Os recém-nascidos apresentam pigmentação no cabelo, pintas e sardas são comum. A coloração da íris pode variar e o rosado da íris visto em OCA1A é geralmente ausente. Em africanos, é encontrado pele e cabelos castanhos claro e íris cinza;
OCA3 - Apresentam cabelos ruivos e pele marrom avermelhada. Anomalias visuais nem sempre são detectadas, talvez pelo fato da hipopigmentação não ser suficiente para alterar o desenvolvimento visual. Até recentemente, OCA3 era encontrado apenas em indivíduos com descendência africana, porém atualmente, foram encontradas mutações em indivíduos de uma grande família Paquistão e pacientes brancos;
OCA4 – Mutações em proteínas de membrana de transporte estão associadas ao OCA4 (GRONSKOV, et al., 2007);
OCA 5 – Ainda não há informações sobre os sintomas sendo necessários mais estudos para maior conhecimento sobre o OCA5.
OCA6 E OCA7 – Pacientes com esses subtipos apresentam sinais visuais clássicos de albinismo, mas sem mudanças na pigmentação padrão.
A pouca pigmentação da pele e a presença de uma fóvea imatura no nascimento, pode gerar um atraso no diagnóstico da doença em casos de albinismo do tipo OCA, principalmente se o indivíduo for de descendência europeia, pois pode apresentar uma diminuição comum da pigmentação da pele e cabelos (SUMMERS, 2009) fato que contribui para a importância do diagnóstico genético do albinismo.
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1.4. Prevalência
O albinismo afeta 1 em 20,000 indivíduos no mundo, porém sua prevalência varia entre o subtipo de OCA em diferentes etnias. O OCA1 é o tipo mais comum encontrado entre os caucasianos e representam 50% dos casos no mundo todo; OCA2 representa 30% da população mundial e é mais comum entre os africanos; OCA3 é praticamente ausente na população branca, enquanto que é mais comum ser encontrado no sul da África e está presente em 3% da população; OCA4 também é raro entre os caucasianos e africanos, porém encontramos cerca de 17% no mundo, enquanto no Japão, estima-se que de quatro pessoas com OCA, uma é afetada pelo OCA4 (PUROHIT, et al., 2014).
1.5. Melhorias
Alguns cuidados podem ser tomados para melhorar o cotidiano dos pacientes albinos de acordo com as funções afetadas como: a redução da acuidade visual pode ser auxiliada com o uso de óculos de grau; a fotofobia pode ser melhorada através de óculos de sol; para o estrabismo é necessário o uso de “tampão” nas crianças forçando o uso do olho não preferencial. As crianças devem também, ter uma atenção especial na escola (GRONSKOV, et al., 2007). Para pele, recomenda-se o uso de protetor solar e camisetas desenvolvidas especialmente para proteção contra os raios ultravioletas (GRONSKOV, et al., 2007).
ONOJAFE et al., (2011) realizaram um experimento com camundongos portadores de deficiências no gene TYR, modelo para albinismo do tipo OCA1A e OCA1B. Neste experimento os autores tinham como objetivo aumentar a concentração de tirosina no plasma a partir da nitisinona, um inibidor da degradação da tirosina, o que poderia estabilizar a tirosinase e aumentar a pigmentação. Resultados mostraram que o aumento da tirosina melhorou a estabilidade da tirosinase no modelo de albinismo OCA1B o que aumentou a pigmentação na pele e íris assim como aumentou o número de melanossomos pigmentados. Em conclusão, os autores sugerem que o uso da nitisinona pode melhorar a pigmentação e as funções visuais em pacientes albinos do tipo OCA1B (ONOJAFE et al., 2011).
Para desenvolver um eficiente terapêutico, é necessário entender detalhadamente o mecanismo molecular das proteínas envolvidas nos diferentes tipos de albinismo (PUROHIT, et al., 2014).
1.6. Causas genéticas do albinismo
No geral, existem dois genes responsáveis pelo albinismo: o gene da tirosinase e o gene P, localizados em humanos nos cromossomos 11q14-21 e 15q11.2, respectivamente (SUMMERS, 2009).
O diagnóstico de OCA é baseado em achados clínicos referentes a hipopigmentação da pele e cabelo, além dos sintomas oculares característicos. Os diferentes tipos de OCA são causados por mutações em diferentes genes, mas o fenótipo nem sempre é distinto.Por esse motivo é necessário um diagnóstico molecular, para determinar a alteração do gene, e assim definir o subtipo de OCA (GRONSKOV, et al., 2007).
Algumas mutações foram descritas na literatura como responsáveis em gerar os diferentes tipos de OCA: OCA1 - mutações no gene da tirosinase levam a uma alteração na orientação estrutural do TYR, a qual modifica a função da proteína, levando ao albinismo do tipo OCA1; OCA2 – mutações no gene que expressa a proteína P alteram a função desta podendo causar perda da função catalítica da proteína P na biossíntese da melanina o que leva ao albinismo do tipo OCA2; OCA3 – mutações genéticas resultam na alteração da conformação estrutural da proteína TYRP1 que perde a flexibilidade mediante a mutação; OCA4 – a conformação estrutural e funcional da proteína SLC45A2/MATP é alterada por mutações nos genes que expressam essas proteínas (PUROHIT, et al., 2014).
Recentemente, dois novos genes SLC24A5 e C10orf11 foram identificados como responsáveis pelo OCA6 e OCA7, respectivamente. Também foi mapeado um lócus no cromossomo humano na região 4q24 responsável por causar o OCA5 (PUROHIT, et al., 2014).
Por se tratar de uma doença autossômica hereditária, os pais de uma criança afetada são portadores obrigatórios, e a chance de ocorrer uma nova criança afetada é de 25%. Portadores são assintomáticos (GRONSKOV, et al., 2007). É possível determinar a partir de diagnóstico pré-natal, se a criança nascerá albina, caso seja relatado que os pais são portadores. Os exames pré-natais podem ser
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feitos com a análise do DNA extraído do feto através da retirada de uma amostra de vilos coriônicos ou através de amniocentese (GRONSKOV, et al., 2007).
Outros distúrbios podem apresentar como característica o albinismo, é o caso das síndromes “Hermansky – Pudlak syndrome” (HPS), que resulta em albinismo óculo-cutâneo, “Chédiak-Higashi syndrome” (CHS1) que resulta num albinismo parcial (PUROHIT, et al., 2014).
2. OBJETIVO
O objetivo deste trabalho foi identificar as mutações genéticas responsáveis pelo albinismo envolvendo dois genes, TYR e gene P, num grupo de pacientes da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo.
3. MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho é parte do projeto de doutorado do aluno de doutorado Ronaldo Y. Sano, aluno do programa de Pós-Graduação em Neurociências e Comportamento, sob orientação da Profa. Dra. Dora Ventura o qual tem como principal objetivo avaliar as alterações oculares anatômicas e fisiológicas nos diferentes grupos de albinismo.
3.1. Aspectos éticos
Todos os procedimentos experimentais obedeceram às normas vigentes da comissão de ética da Universidade de São Paulo. O projeto foi aprovado pelo comitê de ética. CAAE: 06857513.5.0000.5561 (ANEXO 1).
3.2. Pacientes
Foram coletadas amostras de sangue de 10 pacientes albinos, 04 homens e 06 mulheres (Tabela 2), atendidos na Santa Casa de Misericórdia de São Paulo.
Tabela 2. Pacientes e sua classificação dermatológica quanto ao tipo de albinismo.
Pacientes Dermatológica Classificação
GLRS OCA2 MCASN OCA1 MFS ND MJC OCA2 MCC1 ND MCC2 OCA1A LIGM OCA2 LAS OCA2 LS1 ND PO2 OCA2 ND = não definido 3.3. Extração de DNA
A extração do DNA foi realizada com o kit Gentra® Puregene® de acordo com o protocolo proposto pelo fabricante, utilizando 3ml de sangue de cada paciente.
3.4. Reação em cadeia da polimerase – PCR
A reação de PCR foi realizada com o kit Platinum® Taq DNA Polymerase (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante. Para cada amostra utilizou-se 40,3 µl de água destilada (H2Od) autoclavada, 5 µl de tampão (10x
Buffer), 1 µl de deoxinucleotideos trifosfatos (dNTPs), 0,5 µl do iniciador direto (Foward), 0,5 µl do iniciador reverso (Reverse), 1,5 µl de cloreto de magnésio (MgCl2) e 0,2 µl da enzima Platinum Taq. Ao volume total da reação (49µl) foi
adicionado 1µL da amostra de DNA. Um controle negativo, sem amostra de DNA, e um controle positivo com DNA padronizado para a reação foram incluídos em todos os experimentos. Depois de prontas, as amostras foram colocadas no termociclador Veriti® Thermal cycle(Life Technologies).
As condições de PCR foram: 94ºC por 1 minuto, 37 ou 35 ciclos de 94ºC por 15 segundos, temperatura de anneling por 30 segundos e temperatura de extensão a 72ºC por 30 segundos, finalizando com 72ºC por 7 minutos, e 4ºC para armazenamento. A temperatura de anneling foi específica para cada primer, as quais variaram de 53 a 60 graus, conforme Tabela 3.
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Tabela 3. Descrição da sequência do iniciador utilizado para amplificar os genes da
tirosinase e gene P com sua respectiva sequência de nucleotídeos e temperatura de anelamento. SEQUÊNCIA AMPLIFICADA IDENTIFICAÇÃO DO INICIADOR TEMPERATURA DO ANELAMENTO SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO INICIADOR éxon 2,
gene TYR TYR 2 60ºC TTGTTTAACATGAGGGTGTTTTGTACAG éxon 3,
gene TYR TYR 3 55°C ATAATTATAAATCAATCACATAGGTTTTCA éxon 4,
gene TYR TYR 4 56ºC AAAATTTTCAAATGTTTCTTTTATACACA éxon 5A,
gene TYR TYR 5A 61ºC TGAAAGGATGAAGATGATGGTGATC éxon 11,
gene TYR TYR 11 59ºC CCAATTAGCCAGTTCCTGCAGA éxon 12,
gene TYR TYR 12 61°C TATAATAGGACCTGCCAGTGCTCTG éxon 13,
gene TYR TYR 13 60ºC TGTGTCAATGGATGCACTGCTT éxon 2, gene PG PG 2 58ºC AGTGGTTTCTTTCTGGCTGCCC éxon 5, gene PG PG 5 56ºC GAAAAGTGTCTGAGTCTGGG éxon 8, gene PG PG 8 53ºC AGATCCCAGATGGTGTCTCA éxon 9, gene PG PG 9 53ºC AGAGGGAGGTCCCCTAACTG éxon 10, gene PG PG 10 53ºC CTTTCGTGTGTGCTAACTCC éxon 13, gene PG PG 13 55ºC GCCTCTGTTCTACGAGCCTG éxon 14, gene PG PG 14 53ºC TTCACGATGTGTATAGTGGG éxon 17, gene PG PG 17 57ºC AGGCTCCAAGTCACAGACCG éxon 18, gene PG PG 18 53ºC AGTTGCGTAGGTTATGACAC éxon 20, gene PG PG 20 53ºC GAATCGGTGTGTTAACAGTG éxon 22, gene PG PG 22 53ºC TGGTGGGTCTGACCCTAAGT éxon 24, gene PG PG 24 55ºC GAGAACAGAAGCTTACCACC éxon 25, gene PG PG 25 57ºC CGTATCTCATGAGCTTATCC éxon 251, gene PG PG 251 53ºC TCTCATGAGCTTATCCAGATTTCAGA
Os resultados da PCR foram visualizados em gel de agarose (1%), após eletroforese, e fotografados no sistema de fotodocumentação AlphaImager® mini.
3.5. Purificação das amostras
A purificação das amostras foi realizada com o kit Illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band purification (GE Healthcare). Foi colocado nos collections tubes 500µL de capture buffer type 3 e em seguida adicionado cerca de 45ul do produto de PCR nessa solução. Essa solução foi transferida para colunas (GFX MicroSpin™ columns) e colocada no mesmo tubo para centrifugar a 16.000 rcf por 30 segundos. Em seguida o líquido foi descartado e na mesma coluna foi adicionado 500µL de tampão wash buffer type 1 seguida por centrifugação a 16.000 rfc por 30 segundos. A coluna foi transferida para um novo tubo de 1,5 ml e foi adicionado 15µl de tampão Elution buffer type 6 próximo a membrana da coluna seguida por centrifugação a 16.000 rcf por 3 minutos. A coluna foi descartada e as amostras foram mantidas a 4°C.
3.6. Sequenciamento das amostras
O sequenciamento das amostras foi realizado com o kit Big Dye Terminator (Life Technologies) utilizando o sequenciador 3500xL (Life Technologies) do Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa do Hospital Israelita Albert Einstein em São Paulo.
3.7. Análise dos resultados
A análise dos resultados foi realizada com o programa BioEdit v7.2.5. As sequencias de referência para comparação dos resultados foram obtidas no genebank tanto para o gene TYR (M27160.1, NM_000372.4) quanto para o gene P (NG_009846.1,NM_000275.2).
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4. RESULTADOS
Foram encontradas três tipos de mutações diferentes, em dois éxons num total de seis pacientes, descritos na tabela 4 a seguir, sendo assim dos dez pacientes analisados, seis podem ser classificados como OCA2, de acordo com o resultado:
Tabela 4. Descrição da mutação encontrada em cada paciente albino analisado em relação
ao éxon do gene, seguida pelo tipo (heterozigota ou homozigota), informando a posição e o nucleotídeo que causou a mutação, por fim o aminoácido alterado derivado dessa mutação.
Legenda: G=guanina, C=citosina, A=adenina, T=timina, R=guanina ou adenina; Y=timina ou citosina, M=adenina ou citosina, V=valina, I=isoleucina, R=arginina, T= treonina, P=prolina, W=triptofano.
A primeira mutação encontrada nas amostras GLRS e LAS (V443I) foi localizada no éxon 13 do gene P caracterizada como heterozigota. Nessa mutação, na posição 1329 podemos observar a presença de dois picos de nucleotídeos no mesmo lugar, identificado nesse caso por uma letra R, determinando a presença de uma guanina e uma adenina (G/A), como representado na Figura 3. A partir dessa alteração, o aminoácido sintetizado acaba sendo isoleucina, ao invés de valina, que seria o esperado.
AMOSTRA ÉXON/ GENE TIPO NUCLEOTÍDEO AMINOÁCIDO Diagnóstico genético
GLRS 13 / P Heterozigoto G1329R V443I OCA2
9 / P Heterozigoto C913Y R305W OCA2
LAS 13 / P Heterozigoto G1329R V443I OCA2
LIGM 13 / P Heterozigoto A1333M T445P OCA2
9 / P Homozigoto C913T R305W OCA2
MCC1 9 / P Homozigoto C913T R305W OCA2
MCC2 9 / P Homozigoto C913T R305W OCA2
Figura 3. Representação gráfica da sequência RTC caracterizando a mutação G1329R.
A segunda mutação encontrada foi observada na amostra LIGM, também localizada no éxon 13 do gene P do tipo heterozigota. Nessa mutação, na posição 1333 podemos observar a presença de dois picos de nucleotídeos no mesmo lugar, caracterizado nesse caso por um M, determinando a presença de uma adenina e uma citosina (A/C), como representado na Figura 4. A partir dessa alteração, o aminoácido sintetizado acaba sendo prolina, ao invés de treonina, que seria o esperado.
Figura 4. Representação gráfica da sequência MCC caracterizando a mutação A1333M.
A terceira mutação encontrada foi observada nas amostras GLRS, LIGM, MCC1, MCC2 e PO2, localizada no éxon 9 do gene P do tipo heterozigota para GLRS e homozigota para os demais. No primeiro caso, na posição 913 podemos observar a presença de dois picos de nucleotídeos no mesmo lugar, caracterizado nesse caso por um Y, determinando a presença de uma timina e uma citosina (T/C) resultando na mutação C913Y, como representado na Figura 5. Na Figura 6 encontra-se a representação da mutação homozigota C913T. A partir dessa
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alteração, o aminoácido sintetizado acaba sendo triptofano, ao invés de arginina, que seria o esperado.
Figura 5. Representação gráfica da sequência YGG caracterizando a mutação C913Y.
Figura 6. Representação gráfica da sequência TGG caracterizando a mutação C913T.
De acordo com os resultados observados foram encontradas duas mutações distintas, em dois éxons diferentes, em uma mesma amostra (GLRS). O mesmo ocorreu com outra amostra (LIGM), que apresentou duas mutações em dois éxons diferentes.
Os iniciadores PG-2 e PG-5 não foram sequenciados devido ao fato do material não amplificar em PCR. Outros iniciadores serão desenhados para estudo desta região.
Na tabela 5 encontra-se a comparação dos resultados genéticos com o diagnóstico dermatológico.
Tabela 5. Comparação do diagnóstico dermatológico com o diagnóstico genético de acordo com os resultados.
De acordo com a tabela 5, podemos comparar o diagnóstico dermatológico com o diagnóstico clínico de cada paciente, podendo confirmar ou não através da análise genética, o tipo de albinismo previamente descrito. Ainda com base na tabela 5, quatro pacientes não apresentaram diagnóstico genético, uma vez que esse trabalho ainda não foi concluído, sendo necessária a continuação das análises genéticas.
PACIENTE DIAGNÓSTICO DERMATOLÓGICO DIAGNÓSTICO GENÉTICO GLRS OCA2 OCA2 MCASN OCA2 ND MFS ND ND MJC OCA2 ND MCC1 ND OCA2 MCC2 OCA1A OCA2
LIGM OCA2 OCA2
LAS OCA2 OCA2
LS1 ND ND
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DISCUSSÃO
Os resultados apresentados nesse trabalho mostraram que as mutações encontradas confirmaram o diagnóstico dermatológico previamente realizado, uma vez que os pacientes GLRS, LIGM, LAS e PO2 foram antes do sequenciamento, classificados como OCA2 e os resultados genéticos mostram uma mutação do tipo R305W no gene P.
A mutação encontrada no paciente MCC1 sugere que o paciente apresente o albinismo do tipo OCA2, uma vez que pelos resultados das análises genéticas a mutação encontrada no gene P (R305W) justifica o albinismo mesmo sem o diagnóstico dermatológico prévio.
A mutação R305W foi descrita na literatura como deletéria e associada ao albinismo (KAMARAJ & PUROHIT, 2014). Usando recursos computacionais como modelagem molecular e simulação dinâmica molecular KAMARAJ & PUROHIT (2014) avaliaram o comportamento funcional e estrutural da proteína P sob mutação. O resultado deste estudo foi a comprovação de que devido a mutação R305W há uma perda da estabilidade da estrutura da proteína a qual se torna mais flexível em sua conformação perdendo sua função catalítica na biossíntese da melanina. A alteração na conformação da proteína pode ser observada na Figura 7 que mostra a densidade atômica da proteína nativa (A) e mutante (B).
Figura 7. Gráfico de densidade atômica da proteína P nativa (a) e com a mutação R305W (b) (KAMARAJ & PUROHIT, 2014).
A mutação V443I encontrada em dois pacientes foi previamente descrita na base de dados da Retina International Scientific Newsletter (http://www.retina-international.org/scinews/mutation.htm) e por PREISING et al., (2011) como associada ao albinismo tipo OCA2.
A mutação encontrada no paciente MCC2 sugere que o paciente apresente o tipo OCA2 de albinismo, porém esse paciente foi dermatologicamente diagnosticado como OCA1A, tipo que apresenta ausência de melanina total durante toda a vida. De acordo com os resultados, pode-se concluir que a mutação encontrada apesar de intimamente ligada ao albinismo do tipo OCA2, não seja a mutação que esteja provocando o albinismo nesse paciente. Provavelmente nesse caso, existe pelo menos alguma mutação no gene TYR, comprovando assim o albinismo do tipo OCA1A. O sequenciamento do gente TYR deste paciente precisa ser reavaliado para comprovação da mutação relacionada ao OCA1A. A idade do paciente também ajudar a concluir o tipo de albinismo é OCA1A, uma vez que nesse caso, o paciente apresenta 56 anos, idade na qual já haveria algum tipo de pigmentação caso o paciente fosse albino do tipo OCA2. Análises do gene TYR serão realizadas para se obter resultados mais conclusivos.
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Um estudo feito por WOLFE et al., (2013) comprovou tamanha importância de análises genéticas para determinação do tipo de albinismo, uma vez que em alguns casos um indivíduo pode ser precocemente diagnosticado por análise dermatológica como um tipo de albinismo e depois das análises genéticas observar uma mutação a qual corresponde a outro tipo de albinismo (Tabela 6).
Tabela 6. Comparação do diagnóstico dermatológico com o diagnóstico genético (Wolfe et al., 2013).
O albinismo é uma doença autossômica recessiva, sugerindo então que as mutações estejam em homozigose, pois precisam dos dois alelos presentes para que ocorra a doença. Porém, com base nos resultados observados, podemos analisar que algumas mutações foram encontradas em heterozigose, contradizendo então sua teoria, necessitando assim de mais estudos para melhor entender as mutações analisadas, uma vez que elas podem ser mutações que não são ligadas ao albinismo, apesar de parecer intimamente associado à doença. Também seria de grande importância, a análise familiar, pois no caso de pacientes albinos, espera-se que os pais sejam normais-portadores, corroborando com o fato da doença ser recessiva.
PACIENTE
DIAGNÓSTICO DERMATOLÓGICO
DIAGNÓSTICO
GENÉTICO AMINOÁCIDO NUCLEOTÍDEO
1 OCA1 OCA1 Arg >299 > Hist G > 896 > R 8 ND OCA1 Arg >402 > Gin G > 1205 > A
ND OCA1 Cys > 247 > Arg T > 740 > C 2 OCA2 OCA2 Arg > 305 > Trp C > 913 > T 10 ND OCA2 Arg > 305 > Trp C > 913 > T 9 OCA2 OCA2 Arg > 305 > Trp C > 913 > Y 3 OCA2 OCA2 Arg > 305 > Trp C > 913 > T 4 OCA1 OCA2 Arg > 305 > Trp C > 913 > T 5 OCA1 OCA2 Arg > 305 > Trp C > 913 > T 6 OCA1 OCA1 Arg > 116 > stop C > 913 > T 13 OCA1 OCA2 Arg > 305 > Trp C > 913 > Y OCA1 OCA2 Val > 443 > Ile G > 1327 > R 7 OCA2 OCA2 Arg > 419 > Gin G > 1256 > R
A idade também é um fator que pode ajudar no diagnóstico do albinismo, devido ao fato de alguns tipos de albinismo desenvolver pigmentação ao decorrer da vida, então se o indivíduo ainda é jovem, pode vir a sintetizar melanina ainda em algum momento.
Sendo assim, o presente trabalho é importante para auxiliar o trabalho do Ronaldo, uma vez que é necessária a confirmação do tipo de albinismo em cada paciente analisado, para que assim seja indicado um melhor tratamento para os pacientes, melhorando assim sua qualidade de visão.
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5. CONCLUSÃO
Neste trabalho, foram identificadas 3 tipos de mutações no gene P causadoras de albinismo OCA2 em seis pacientes albinos atendidos na Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. Os resultados genéticos comprovaram a avaliação dermatológica e classificaram o tipo de albinismo em pacientes sem diagnóstico prévio.
Devido a heterogeneidade de genótipos e fenótipos encontrada no albinismo, a análise genética é de extrema importância para o correto diagnóstico e tratamento em conjunto com a análise dermatológica, a qual, em alguns casos não é suficiente para diagnosticar com precisão o tipo de albinismo.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Estou ciente do conteúdo do Trabalho de Conclusão de Curso: “Estudo dos genes TYR e P responsáveis pelo albinismo do tipo OCA1 e OCA2 em humanos”
Prof.ª Dra. Ana Paula Pimentel Costa – Universidade Presbiteriana Mackenzie
Luíse Garcia Ribeiro – 3117750-6
