CAMILLA FERREIRA WENCESLAU
Efeito da Administração Crônica a Longo Prazo
de Ouabaína Sobre a Pressão Arterial e a
Reatividade Vascular de Artérias Mesentéricas
de Resistência de Rato:
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CAMILLA FERREIRA WENCESLAU
SÃO PAULO 2007
Strophanthus preussii: Planta da qual é extraído o glicosídeo ouabaína
Efeito da Administração Crônica a Longo Prazo de
Ouabaína Sobre a Pressão Arterial e a Reatividade Vascular
de Artérias Mesentéricas de Resistência de Rato:
Possíveis Mecanismos Envolvidos
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências (Fisiologia)
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CAMILLA FERREIRA WENCESLAU
SÃO PAULO 2007
Strophanthus preussii: Planta da qual é extraído o glicosídeo ouabaína Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Fisiologia
Orientador:
Profa. Dra. Luciana Venturini Rossoni
Efeito da Administração Crônica a Longo Prazo de
Ouabaína Sobre a Pressão Arterial e a Reatividade Vascular
de Artérias Mesentéricas de Resistência de Rato:
3 DEDICATÓRIA
Aos meus queridos pais, Adauto e Sandra, a minha querida avó, Adelina, aos meus irmãos, Carolina e Renato e ao meu companheiro Fábio, por serem todos os cúmplices dos meus sonhos, decepções, lutas e vitórias.
E, finalmente, a aqueles que deram à vida para que este trabalho fosse possível, os ratinhos.
4 AGRADECIMENTOS
Ninguém faz uma pesquisa deste nível sozinho e esta não foi uma exceção. Para realizá-la eu precisei da cooperação, incentivo e apoio de muita gente.
Com efeito, na estrada da vida somos todos devedores e seria impossível agradecer adequadamente a todos os que contribuíram para o desenvolvimento desta pesquisa, já que entre eles eu deveria incluir meus pais, meus professores pela vida afora, os amigos que se envolveram pelo apoio e incentivo, e todos os que influenciaram positivamente a minha vida.
Mas sou especialmente grata a Deus - a suprema fonte da sabedoria e da inspiração – a quem devo a própria vida em toda a sua plenitude.
Sou grata e devedora aos meus companheiros de guerra: a Ana Paula, a Gisele e ao Hildi, que foram, basicamente, amigos. Na verdade, não é muito básico ser um amigo, pois é necessário dar a compreensão, a tolerância, o estímulo, a palavra amiga e conselheira nas horas difíceis, a própria crítica construtiva e, acima de tudo carinho, seja ela de que forma for. Assim, recebi idéias e muito incentivo da Ana Paula; dedicação e sonhos da Gisele; apoio e risos do Hildi.
Também sou grata e devedora aos meus amigos: Lívia, Juliana Carmona, Emília, Luana, Kleiber, Carol, Eliana, Neves, Renata, Rapha, as meninas da Renal, os meninos da Farmacologia, as meninas mulheres da Autônoma de Madrid, à Profa. Maria e ao Zé Maria. Pois todos, sem exceção, tornaram bem mais fáceis os meus dias de trabalho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP), por ter acreditado na minha capacidade e ter concedido auxílio financeiro.
E, finalmente, ao Mestre com carinho, que me fez crescer por meio de seus ensinamentos nem sempre tão fáceis, mas valiosos, nesta estrada da vida: à Prof. Dra. Luciana Venturini Rossoni.
“Enquanto os rios correrem para os mares, os montes fizerem sombras aos vales e as estrelas fugirem no firmamento, deve durar a recordação do benefício recebido na mente do homem agradecido.”
5 RESUMO
Wenceslau CF.Efeito da Administração Crônica a Longo Prazo de Ouabaína Sobre a Pressão Arterial e a Reatividade Vascular de Artérias Mesentéricas de Resistência de Rato:
Possíveis Mecanismos Envolvidos [Dissertação]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2007.
A ouabaína (OUA), um hormônio inibidor da Na+K+-ATPase (NKA), está associada a hipertensão arterial (HA). Porém, o papel das arteríolas na manutenção da HA induzida por OUA é pouco conhecido. Assim, no presente estudo o tratamento com OUA, em ratos, por 5, 10 e 20 semanas induziu HA de similar magnitude. Entretanto, em artérias mesentéricas de resistência (AMR) observou-se: uma não alteração, uma redução e um aumento na resposta à noradrenalina (NA) após 5, 10 e 20 semanas, respectivamente. Essas alterações estavam associadas a uma modificação na modulação nitrérgica; na produção e liberação de prostanóides derivados da ciclooxigenase; na formação e/ ou biodisponibilidade de espécies reativas derivadas do oxigênio; e na atividade funcional da NKA. No entanto, não foram observadas modificações na resposta à acetilcolina e ao KCl. Em conclusão, o tratamento com OUA induziu uma HA leve independente do tempo de tratamento. Ao passo que promoveu alterações funcionais à NA em AMR na dependência do tempo, via modulação na função endotelial e na atividade da NKA.
Palavras-chave: Ouabaína; Na+K+-ATPase; Hipertensão; Artérias Mesentéricas de Resistência; Reatividade Vascular; Endotélio.
6 ABSTRACT
Wenceslau CF. Time-dependent effect of chronic ouabain administration in rats on blood pressure and vascular reactivity in mesenteric resistance arteries: The possible mechanisms involved [Master Thesis]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2007.
Ouabain (OUA), a hormone inhibitor of the Na+K+-ATPase (NKA), is associated to arterial hypertension (HA). However, the role of arterioles in maintenance of OUA-induced HA is not entirely clear. In this study in a similar manner OUA induced HA in rats after 5, 10 and 20 weeks of treatment. Meanwhile in mesenteric resistance arteries (MRA) was observed: no change, a reduction and an increase in noradrenaline (NA) response after 5, 10 and 20 weeks, respectively. These changes were associated with modifications in the nitrergic modulation; in the synthesis and release of cyclooxygenase derived prostanoids; in the synthesis and/ or bioavailability of the reactive oxygen species; and in the functional activity of the NKA. However, no changes in the response to acetylcholine and KCl were observed. In conclusion, the OUA treatment induced a weak independent HA. While this treatment causes time-dependent alterations to NA response in MRA, via modulation in the endothelial function and in the functional activity of the NKA.
Key words: Ouabain; Na+K+-ATPase; Hypertension; Mesenteric Resistance Arteries; Vascular Reactivity; Endothelium.
7 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
8
1.1 Definição de Hipertensão Arterial
11
1.2 Ouabaína Endógena
13
1.2.1 Modelo de hipertensão dependente de ouabaína
24
2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
31
2.1 Objetivos Específicos
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3 SUMÁRIO E CONCLUSÕES
35
8
9
1 INTRODUÇÃO
m dezembro, eu imobilizei uma égua, com 1,4m de altura e cerca de 14 anos, que tinha uma fístula na sua virilha. Não era nem forte, nem fraca. Tendo aberto sua artéria crural esquerda em cerca de 7,6cm a partir de seu ventre, eu inserí um tubo de cobre com 0,4cm de calibre e, através de um outro tubo de cobre que estava firmemente adaptado ao primeiro, eu fixei um tubo de vidro de, aproximadamente, o mesmo diâmetro, com 2,7m de comprimento. Então, soltando a ligadura da artéria, o sangue subiu a 2,5m no tubo de vidro, acima do ventrículo esquerdo do coração... quando atingia sua máxima altura, oscilava 5, 7,5 ou 10cm após cada pulsação. Então eu tirei o tubo de vidro, e deixei o sangue jorrar livremente, quando a altura máxima atingida pelo jato não era mais do que 61cm. Eu medí como o sangue jorrava da artéria, e após cada quart (1,14 L) que saía, eu refixei o tubo de vidro na artéria para ver o quanto a força do sangue tinha diminuído; isto eu repeti até 8 quart, quando a força tornou-se então fraca... Após a morte do animal, quase 3 quart do sangue permanecia no seu corpo, o qual somado com o que havia sangrado, totaliza 20 quart (22,8 L), o que, numa baixa estimativa, podemos calcular como a quantidade de sangue circulante de um cavalo. Reverendo Stephen Hales
(1677-1761) (Booth, 1977).
Após o Reverendo Stephen Hales, por meio de sua genialidade, mostrar ao mundo a existência da pressão arterial, há uma busca extenuante por parte dos pesquisadores em desvendar as causas das alterações da pressão arterial que culminam em uma doença que acomete uma grande parte da população, que é a hipertensão arterial.
Apesar da maioria dos livros e artigos citar como referência apenas países desenvolvidos, por exemplo os Estados Unidos, como sendo países que apresentam um grande número de pessoas com doenças cardiovasculares, é interessante notar que, no mundo todo, são as doenças cardiovasculares que apresentam a maior mortalidade, inclusive em países emergentes e em desenvolvimento como o Brasil (Kearney et al., 2005) e, dentre os
10 diversos fatores de risco das doenças cardiovasculares, a hipertensão arterial é uma das principais causas (IV Diretrizes Brasileira de Hipertensão Arterial, 2004).
A prevalência da hipertensão arterial aumenta progressivamente com a idade em ambos os sexos. Porém, a prevalência é sempre maior em qualquer idade na raça negra em relação à raça branca (Kaplan, 2006). Sendo assim, até os 40 anos, a prevalência da hipertensão arterial é próxima a 10% na raça branca (20% para a raça negra), até os 50 anos chega a 20% na raça branca (40% para a raça negra), após 60 anos essa prevalência se iguala ultrapassando os 40% e atingindo 60% após 70 anos (Kaplan, 2006).
O JNC VI (Sixth Report of the Joint National Committee on Prevention, Detection,
Evaluation and Treatment of High Blood Pressure) (1997) definiu e classificou hipertensão
em adultos com base na média entre 2 (duas) medidas de pressão arterial sistólica e diastólica em pelo menos 3 (três) visitas ao médico. Com a utilização desta definição, estima-se que aproximadamente 20% da população mundial seja classificada como hipertensa. Mas, por que a hipertensão possui uma prevalência tão alta na humanidade?
Esta questão pode ser respondida pelo fato de a hipertensão arterial ser uma doença complexa, multifatorial (Page, 1989), na qual diferentes pacientes podem apresentar diferentes fatores causais pelo traço, podendo estes serem tanto ambientais quanto genéticos (Dzau et al., 1995).
Esta característica da hipertensão arterial, ou seja, o fato desta enfermidade ser de origem multifatorial, é que levou os pesquisadores a proporem, ao longo do tempo, os mais diversos modelos experimentais de hipertensão arterial, cada um deles sendo gerados ou mantidos hipertensos por um ou mais mecanismos envolvidos na gênese e manutenção da pressão arterial. Dentre os modelos experimentais que desenvolvem hipertensão arterial, pode-se citar o modelo de hipertensão espontânea no rato (SHR, ratos espontaneamente hipertensos), desenvolvido por Okamoto e Aoki (1963), onde a hipertensão é de origem
11 genética e multifatorial. Também de origem genética está o modelo experimental com animais sensíveis ao sódio desenvolvido por Dahl et al. (1962). Além do mais, existem os modelos experimentais de hipertensão neurogênica (Doba et al., 1973); modelos experimentais de hipertensão renal, como a hipertensão renovascular (Goldblatt et al., 1934); modelos experimentais de hipertensão por inibição crônica da síntese do óxido nítrico (Ribeiro et al., 1992); modelos experimentais de hipertensão dependente de mineralocorticóides (modelo DOCA-Sal) (Selye et al., 1946); entre outros.
Estes modelos experimentais, citados acima, são alguns exemplos da busca extenuante, por parte dos pesquisadores, de um modelo que possa melhor caracterizar esta enfermidade tão importante para o ser humano.
1.1 Definição de Hipertensão Arterial
O JNC VII (Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention, Detection,
Evaluation and Treatment of High Blood Pressure) (2003) classificou hipertensão em adultos
da seguinte maneira:
CATEGORIA PRESSÃO SISTÓLICA (mmHg) PRESSÃO DIASTÓLICA (mmHg)
NORMAL PRÉ-HIPERTENSÃO HIPERTENSÃO ESTÁGIO 1 ESTÁGIO 2 <120 120-139 - 140-159 ≥160 <80 80-89 - 90-99 ≥100
Modificado do: JNC VII (Seventh Report of the Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation
12 A hipertensão arterial sistêmica é dividida etiologicamente em dois grandes grupos: hipertensão primária ou essencial e hipertensão secundária.
A hipertensão primária ou essencial se caracteriza pela elevada pressão sanguínea nas quais causas secundárias, tais como doença renovascular, insuficiência renal, hiperaldosteronismo, hipertensão gestacional, síndrome de Cushing, entre outras, não estão presentes (Kaplan, 1998; Carretero; Oparil, 2000; Kaplan, 2006). Sendo assim, quando a causa específica da hipertensão é desconhecida, ela é denominada hipertensão essencial.
Apesar de não ter uma causa definida, sabe-se que a hipertensão essencial é multifatorial, assim diferentes fatores podem contribuir para o desenvolvimento desta hipertensão. Dentre os fatores envolvidos na gênese e/ou manutenção da hipertensão essencial estão: o caráter hereditário, o sistema renina-angiotensina, a obesidade, a resistência à insulina, a alta ingestão de álcool, a alta ingestão de sal (em pacientes sensíveis ao sal), a idade, a raça, o estresse, a baixa ingestão de potássio, a baixa ingestão de cálcio, entre outros (INTERSALT Co-operative Research Group, 1988; Sever et al., 1989; Carretero; Oparil, 2000).
Ao contrário da hipertensão essencial na qual a causa específica da hipertensão é desconhecida, na hipertensão secundária é possível identificar uma causa específica que promove a elevação crônica da pressão arterial. Assim, a hipertensão que aparece durante o desenvolvimento da gestação (Cunningham et al., 1992) e a hipertensão renovascular (Kaplan, 2006), por exemplo, são formas de hipertensão onde os fatores causais são conhecidos e assim são classificadas como hipertensão secundária. Desta forma, quando a hipertensão tem causa identificável, quase sempre esta pode ser facilmente remediada.
A hipertensão secundária acomete cerca de 5% a 10% dos pacientes com hipertensão sistêmica, ou seja, é apenas uma pequena fatia do total de pacientes com hipertensão. Sendo
13 assim, a grande maioria dos pacientes diagnosticados como hipertensos são acometidos pela hipertensão essencial.
No entanto, o cerne da hipertensão essencial, da hipertensão secundária e dos vários modelos animais de hipertensão arterial é a elevada resistência vascular periférica (Shepherd, 1990). Esta, por sua vez, parece estar relacionada principalmente com alterações intrínsecas da parede vascular em vasos de resistência (os quais possuem diâmetro menor que 500 µm) (Mulvany; Aalkjaer, 1990). Estas alterações, tanto funcionais quanto estruturais, acometem principalmente as células endoteliais, as células musculares lisas e os componentes da matriz extracelular, em ambos os casos, contribuindo para o aumento da resistência vascular periférica (Shepherd, 1990).
Um novo fator associado à gênese e a manutenção da hipertensão arterial começou a ser caracterizado em 1961, quando de Wardener et al. sugeriram a presença de um inibidor da Na+K+-ATPase circulante dependente da expansão aguda do volume extra-celular. Porém, em 1976, Haddy e Overbeck sugeriram que esse fator inibidor da Na+K+-ATPase poderia exercer um papel importante na gênese da hipertensão dos modelos experimentais de hipertensão dependentes de volume. Por sua vez, Hamlym et al. (1989) identificaram e purificaram esse inibidor na circulação humana, o qual em 1991 foi caracterizado como ouabaína-endógena (Bova et al., 1991).
1.2
Ouabaína Endógena
Strophanthus (Figura 1) é o gênero de 35-40 espécies de plantas da família Apocynaceae,
14 Diversas tribos africanas usavam a Strophanthus como principal ingrediente para a produção de venenos que eram adicionados nas pontas das flechas. O glicosídeo ouabaína foi determinado como o primeiro componente ativo no veneno da Strophanthus há mais de 100 anos pelo antropólogo francês Arnaud (Lloyd; Cincinnati, 1897).
Figura 1: Strophanthus – Gênero da planta de onde é extraído o composto ouabaína.
Foto de Henriette Kress (2001).
Em 1785, Willian Withering introduziu os digitálicos, como a ouabaína, como um fármaco para o tratamento de insuficiência cardíaca congestiva. Desde então, os digitálicos são utilizados para o tratamento de enfermidades como: choque, insuficiência cardíaca, certas arritmias, além de seu emprego em estudos experimentais (Wray et al., 1985).
Devido a grande capacidade de inibir a Na+K+-ATPase e sua alta solubilidade em água, a ouabaína tem sido amplamente utilizada em estudos experimentais. O termo “ouabaína” foi indexado a aproximadamente mais de 13.000 artigos (Hamlyn et al., 1996) durante o período compreendido entre a década de 60 e 90, e chegou a quase 20.000 artigos
15 até o ano de 2006, refletindo uma volumosa literatura que nos permitiu ampliar os conhecimentos das propriedades e ações tanto farmacológicas como fisiológicas deste glicosídeo.
Desde a década de 60 quando de Wardener et al. (1961) demonstraram a presença de um fator inibidor da Na+K+-ATPase circulante no plasma após a expansão aguda de volume, muito se fez para poder identificar qual seria este fator. O fato da expansão aguda de volume induzir diurese, e desse fator endógeno ser capaz de inibir a Na+K+-ATPase (Kramer et al., 1969) e de reagir com anticorpos anti-digoxina (Gruber et al., 1980) fez com que esse fator fosse denominado digitálico-símile. De fato, em 1989 Hamlyn et al. identificaram e purificaram o composto inibidor da Na+K+-ATPase também na circulação humana. E, em 1991 o mesmo passou a ser denominado como ouabaína-endógena (Bova et al., 1991).
Como descrito por Hamlyn et al. (1996):
Nós usamos o termo ouabaína endógena para referirmos ao composto encontrado na circulação humana e este tem a composição (C29H44O12) elemental
idêntica à ouabaína....Exibe atividades física e bioquímica indistinguíveis as da ouabaína...A presença de significantes amostras de ouabaína na circulação e nos tecidos de muitos mamíferos, quando pareados com evidências de origem endógena e receptores específicos, indicam que este esteróide é um membro de uma nova classe de hormônios...
Em mamíferos, a ouabaína está presente em concentrações nanomolares, cuja produção concentra-se no córtex da glândula supra-renal na zona glomerulosa (Ludens et al., 1992; Laredo et al., 1997), no hipotálamo (de Wardener; Clarson, 1985) e na região anteroventral do terceiro ventrículo (AV3V) (Pamnani et al., 1981; Songu-Mize et al., 1982).
16 Os principais estímulos para a secreção deste digitálico são: o aumento da concentração plasmática de sódio e volume extracelular (de Wardener et al., 1961; Blaustein, 1993), a angiotensina II e o ACTH (Laredo et al., 1997). Mais recentemente Hamlyn et al. (2003) demonstraram que a biosíntese da ouabaína endógena na glândula adrenal pode estar envolvida com a via da 11β-hidroxilase, pois a formação de ouabaína é afetada por inibidores dessa enzima. Além do mais, neste mesmo trabalho também foi visto que a 11β-hidroxilase promove a síntese de ouabaína endógena por meio da formação de um 11β isômero de ouabaína em mamíferos.
Após a demonstração da presença da ouabaína endógena no plasma humano e sabendo do papel fundamental da Na+K+-ATPase na homeostasia celular e no controle no tônus vascular, surgiu a idéia de que alterações na síntese e/ou liberação deste glicosídeo poderiam estar relacionados com a gênese e/ou manutenção de algumas enfermidades em humanos. De fato, em humanos, algumas doenças cursam com um aumento dos níveis plasmáticos de ouabaína como: a hipertensão essencial (Poston et al., 1981; Hamlyn et al., 1982); a insuficiência cardíaca congestiva (Gottlieb et al., 1992); a insuficiência renal crônica (Hamlyn et al., 1996); o infarto agudo do miocárdio (Bagrov et al., 1994); o “ouabaínoma primário” ou adenoma cortical adrenal (Hamilton et al., 1994); entre outras (vide Tabela 1). Além do mais, um estudo realizado com pacientes em estado terminal que apresentavam enfermidades cardiovasculares, tais como insuficiência cardíaca e hipertensão arterial severa, demonstrou que os altos níveis de ouabaína plasmática nestes pacientes estavam associados com elevados índices de morbidade e mortalidade (Berendes et al., 2003).
17
Tabela 1. Níveis de ouabaína endógena no plasma
Condição Espécie Nível de Ouabaína endógena
Aldosteronismo Humana Aumentada Primário
Síndrome de Humana Aumentada Cushing
Hipotireoidismo Humana Aumentada Hipertireoidismo Humana Diminuída Insuficiência
Cardíaca Humana Aumentada Congestiva
Insuficiência
Renal Humana Aumentada Crônica
Ouabaínoma Humana Aumentada Primário
Hipertensão Humana Aumentada Essencial
SHR Rato Diminuida Adrenalectomia Rato Diminuida Expansão
Aguda do Cachorro Aumentada Volume
Modificado de Hamlyn et al. (1996).
Os níveis circulantes de ouabaína parecem estar aumentados de 30-200% em muitas formas de hipertensão arterial, incluindo a hipertensão essencial (Argento et al., 1991; Schaeffer et al., 1991; Manunta et al., 1992; Narause et al., 1994). Estes pesquisadores sugerem que o nível plasmático elevado de ouabaína endógena pode afetar uma grande parte da fração de indivíduos com hipertensão essencial e constituir um fenótipo intermediário. Além do mais, análises de regressão múltipla, em pacientes normotensos e hipertensos,
18 revelaram uma significante relação entre pressão sanguínea, índice de massa corporal, idade e os níveis plasmáticos de ouabaína endógena, porém nenhum dos parâmetros exibia alguma associação com renina ou aldosterona plasmática aumentadas (Rossi et al., 1995). Corroborando os resultados de Rossi et al. (1995), Manunta et al. (1999) elegantemente demonstraram uma forte correlação positiva entre altos níveis plasmáticos de ouabaína endógena, pressão diastólica elevada e massa ventricular esquerda aumentada em pacientes com hipertensão essencial.
Apesar de os níveis plasmáticos de ouabaína endógena estarem aumentados em pacientes com diversas formas de hipertensão, tanto em humanos quanto em animais de experimentação, a relação entre o efeito e a causa ainda possui muita controvérsia.
Em humanos (normotensos e hipertensos) a administração aguda do glicosídeo cardíaco aumenta seu nível circulante e se associa a pequeno aumento, transiente, da pressão sanguínea e aumento da resposta pressora à infusão de agentes vasoativos (Mason et al., 1964; Pidgeon et al., 1994). Além disso, foi visto que a administração aguda de ouabaína em animais aumenta a liberação de neurotransmissores no sinaptosoma e aumenta, tanto em nível central quanto periférico, a atividade do sistema nervoso simpático (Powis, 1983; Leenen et
al., 1994; Huang; Leenen 1994; 1996a,b). Também, já foi descrito que a ouabaína é capaz de
reduzir a função do barorreflexo e do reflexo cardiopulmonar (Huang et al., 1997), e aumentar o tônus simpático via ativação do sistema renina-angiotensina cerebral (Leenen et al., 1994; Huang; Leenen 1994; 1996a,b). Resultados similares foram observados quando a ouabaína foi administrada agudamente na área cinzenta pariaquedutal, ou seja, um aumento da pressão arterial e da resistência vascular em órgãos tais como: rins; intestino; músculo; pele; e baço (D´Amico et al., 2003). Entretanto, estes parâmetros foram bloqueados por antagonistas do receptor ETA para a endotelina-1 (D´Amico et al., 2003), o que sugere que a endotelina também pode mediar às ações da administração aguda de ouabaína em ratos. Além do mais, a
19 ouabaína é capaz de aumentar o tônus vascular em artérias isoladas (Karaki et al., 1978; Lang; Blaustein, 1980; Ponte et al., 1996; Zhang et al., 2005), ou ainda sensibilizar o leito vascular aumentando sua responsividade à substâncias vasopressoras tanto em animais normotensos quanto em hipertensos (Songu-Mize et al., 1995; Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 1999, 2001, 2003; Padilha et al., 2004).
O mecanismo pelo qual a ouabaína pode sensibilizar o músculo liso vascular ou o efeito de agentes vasoconstritores pode ser explicado, em parte, de acordo com o mecanismo que foi proposto por Blaustein et al. (1998) via ação da ouabaína inibindo preferencialmente as isoformas α2 e α3 da Na+K+-ATPase na microrregião da membrana plasmática denominada de plasmerosome.
A Na+K+-ATPase ou bomba de sódio e potássio, que está presente na maioria das células eucarióticas, é uma proteína integral de membrana e usa a energia da hidrólise da adenosina trifosfato (ATP) para realizar o transporte de sódio e potássio através da membrana plasmática (Sweadner, 1989; Skou; Esmann, 1992).
A Na+K+-ATPase é formada por três subunidades distintas (Figura 2) assim denominadas: α, com aproximadamente 113 kDa; β, com aproximadamente 55 kDa; γ, com aproximadamente 14 kDa (Sweadner, 1989; Blanco; Mercer, 1998). A subunidade α é a responsável pela atividade catalítica dessa enzima e possui sítios de ligação para os íons Na+ e K+, para o ATP e para os compostos digitálicos, dentre eles a ouabaína e a digoxina (Blanco; Mercer, 1998). Esta subunidade é composta de 6-7 domínios transmembranais e pode ser encontrada sob quatro isoformas distintas: α1, α2, α3 e α4, cuja expressão varia de acordo com o tecido estudado. Estas isoformas diferem pouco quanto ao seu peso molecular, mas são diferentes em relação à sensibilidade pelos compostos digitálicos em roedores. Desta forma, a isoforma que apresenta maior sensibilidade aos compostos digitálicos é a α3, seguida da α2, e
20 por fim a α1 (Blanco; Mercer, 1998). Foi descrito que o músculo liso vascular e o endotélio possuem três isoformas da subunidade α: α1, α2 e α3 (Sahin-Erdemli et al., 1994).
A subunidade β possui três distintas isoformas identificadas: β1, β2 e β3. A β1 está presente em quase todos os tecidos, porém é predominantemente renal; a β2 é encontrada no músculo esquelético, glândula pienal e sistema nervoso central; e a β3 está presente no testículo, retina, fígado e pulmão (Blanco; Mercer, 1998).
Já a subunidade γ foi a última a ser descoberta e não se sabe ao certo qual a sua importância para a atividade da Na+K+-ATPase (Blanco; Mercer, 1998). Porém, sabe-se que a sua expressão na fase embrionária do camundongo é importante para a formação do blastócito (Jones et al., 1997; Mobasheri et al., 2000).
Figura 2: Modelo tri-dimensional da estrutura da Na+K+-ATPase.
Modificado de: Mobasheri et al. (2000).
Blaustein et al. (1998) identificaram uma microrregião celular entre a membrana plasmática e a membrana do retículo sarcoplasmático, denominada por eles de plasmerosome, onde estão localizados o trocador Na+/Ca2+, o retículo sarcoplasmático e as isoformas α2 e α3 da Na+K+-ATPase (Figura 3). Nesta microrregião, os compostos digitálicos, como a ouabaína,
21 possuem uma importante função sobre a mobilização de Ca2+ intracelular. Estes compostos digitálicos ao inibirem as subunidades α2 e α3 da Na+K+-ATPase aumentam a concentração de Na+ intracelular nesse microdomínio específico, o que resulta na redução da atividade do trocador Na+/Ca2+ e conseqüente aumento da concentração dos íons Ca2+ livre no interior da célula. Esse Ca2+ é captado pela Ca2+-ATPase do retículo sarcoplasmático e estocado no interior dessa organela citoplasmática. Desta forma, após o estímulo de um agonista vasoconstritor como a noradrenalina, a resposta contrátil resultante seria amplificada em conseqüência de uma maior liberação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático. Esse mecanismo ajuda a explicar, em parte, como concentrações nanomolares de ouabaína podem amplificar a resposta a um agente vasoconstritor e representa um mecanismo adicional através do qual a ouabaína endógena pode contribuir para o processo hipertensivo.
Figura 3: Modelo do plasmerosome proposto por Blaustein e Colaboradores.
α1 Na pump: isoforma α1 da Na+K+-ATPase; PMCA: Ca2+-ATPase da
Membrana Plasmática; Agonist Receptor: Receptor para Agonista; SOC: Canal Operado porEstoque; α2/α3 Na pump: isoformas α2/α3 da Na+K+-ATPase; NCX: Trocador Na+/Ca2+; ECF: Fluído do Meio Extracelular; IP3: 1, 4, 5
Trifosfato Inositol; IP3 R: receptor para 1, 4, 5 Trifosfato Inositol; SERCA: Ca2+
-ATPase do Retículo Sarcoplasmático; RYR:Receptor para Rianodina; S/ER: Retículo Endoplasmático/ sarcoplasmático;BulkCytosol: Massa Plasmática.
22 Como citado acima, o mecanismo proposto por Blaustein et al. (1998) pode explicar apenas em parte o processo hipertensivo em resposta à ouabaína, pois, trabalhos recentes, demonstram que necessariamente não é a inibição da Na+K+-ATPase pela ouabaína que leva a alterações estruturais e/ou funcionais em alguns tecidos, mas essas alterações também podem ser acarretadas por meio de uma sinalização intracelular ativada pelo complexo ouabaína-Na+K+-ATPase.
Aizman et al. (2001) demonstraram que baixas concentrações de ouabaína inibem parcialmente a Na+K+-ATPase formando um complexo ouabaína-Na+K+-ATPase. Esta interação promove oscilações de Ca2+ no meio intracelular com conseqüente ativação da cascata de um importante fator de transcrição, o NF-ĸB. Já está bem descrito que o NF-ĸB está envolvido na ativação de genes que poderiam levar a proliferação e a diferenciação celular em diversos tecidos, inclusive na célula do músculo liso vascular (Martin et al., 2000).
Baseado nos resultados descritos acima, Schoner e Scheiner-Bobis (2007) sugeriram um mecanismo de transdução de sinais, via o complexo ouabaína-Na+K+-ATPase denominado de signalosome. O signalosome ocorre em uma região de membrana, a cavéola, e pode transferir sinais para o interior da célula no momento em que a Na+K+-ATPase é incapaz de trabalhar, por exemplo, quando a ouabaína inibe esta proteína (Figura 4). A interação da Na+K+-ATPase com proteínas do citoesqueleto, como a aducina, parece ser essencial para a funcionalidade desta proteína e a transdução de sinais para o interior da célula. Assim, o complexo ouabaína-Na+K+-ATPase pode levar a ativação de vários caminhos que levam a uma cascata de sinalização, tais como: ativação da PI3-kinase; da proteína kinase B (AKT); da tirosina kinase (Src); do receptor para fator de crescimento epidermal; da ERK; e do Ca2+ como segundo mensageiro (Figura 4) (Aizman et al., 2001; Schoner; Scheiner-Bobis, 2007).
Outros trabalhos, também recentes, demonstram que a ouabaína, além de atuar via inibição Na+K+-ATPase, pode atuar diretamente através de um outro receptor, ou seja, em um
23 receptor exclusivo para ouabaína (Ward et al., 2002). Essa hipótese surgiu devido a dois fatores: (1) a infusão prolongada de ouabaína induz hipertensão em ratos, mas comparáveis infusões de digoxina não o são capazes (Manunta et al., 2000); (2) a secreção de ouabaína em cultura de células adrenocorticais é regulada por uma inibição da mesma mediada pelo acúmulo de concentrações subnanomolares da própria ouabaína (Ward et al., 2002). Desta forma, Ward et al. (2002) demonstraram que existem receptores para ouabaína, os quais são distintos da Na+K+-ATPase e estes receptores estão localizados no córtex da adrenal podendo estar relacionados ao transporte e/ou regulação da liberação deste glicosídeo.
Modelo do signalosome sugerido por Schoner e Scheiner-Bobis.
Modificado de: Schoner e Scheiner-Bobis (2007).
Figura 4:
L-Type Ca2+ channel: Canal para Ca2+ Voltagem Sensitivo do tipo Lento; NCX1: isoforma 1 do
Trocador Na+/Ca2+; SOCs: Canais Operados por Estoque; CTS: Glicosídeo Cardíaco
Ouabaína; SP: Na+K+-ATPase; EGFR: Receptor para Fator de Crescimento Epidermal; IP
3: 1, 4, 5
Trifosfato Inositol; IP3 R: receptor para 1, 4, 5 Trifosfato Inositol; PLC: Fosfolipase C; Caveolin:
Caveolina; Endocytosis: Endocitose; Apoptosis: Apoptose; Calpain: Calpaína; FAK: Cinase de Adesão Focal; JNK: Cinase do Terminal-N c-Jun; ASK-1: Cinase-1 regulada pelo Sinal de
Apoptose; ROS: Espécies Reativas Derivadas do Oxigênio; NFkB: Fator de Transcrição Nuclear
Kappa-B; Src: Tirosina Cinase; Ras: Ras; Raf: Raf; MEK: Cinase Ativada por Mitógeno; Erk 1/2: Cinase 1 e 2 reguladas pelo sinal extracelular; GSK3: Cinase-3 da Sintase de Glicogêneo; AKt: Proteína Cinase B; AP-1: Proteína-1 Ativadora; Nucleus: Núcleo; Gene Activation: Ativação de Gene; Protein Biosynthesis: Biosíntese de Proteína; Differentiation: Diferenciação; Muscle Contraction; Contração do Músculo; Exocytosis: Exocitose; Heart Remodeling: Remodelamento Cardíaco; Cell Cycle and Heart Growth: Ciclo Celular e Crescimento Cardíaco; ER/SR: Retículo Endoplasmático / Retículo Sarcoplasmático.
24 Diversos modelos experimentais utilizando a administração aguda de ouabaína foram extensamente utilizados. Entretanto, foi em 1993 que pela primeira vez Yuan et al. demonstraram que a administração crônica de ouabaína, durante 3 à 4 semanas, promovia o desenvolvimento da hipertensão. Assim, foi dado o primeiro passo para surgir um novo modelo de hipertensão o qual é primariamente dependente do aumento das concentrações plasmáticas de ouabaína.
1.2.1 Modelo de hipertensão dependente de ouabaína
Desde 1993, quando Yuan et al. demonstraram que a administração de ouabaína durante 3-4 semanas era capaz de promover hipertensão, como descrito anteriormente, muito se tem estudado sobre os efeitos deste digitálico na indução de hipertensão. Desta forma, Manunta et al. (1994) começaram a caracterizar o modelo de hipertensão induzida pelo tratamento crônico com ouabaína. Estes pesquisadores administraram ouabaína durante 5 semanas e demonstraram que a hipertensão cursava com aumento dos níveis deste digitálico no plasma (1 a 10 nM), nos rins, no hipotálamo e na pituitária anterior.
Em 1994, Huang et al. demonstraram que a administração de ouabaína, durante 10 a 14 dias, pela via intravenosa, intracerebroventricular ou subcutânea, elevava a pressão arterial média de ratos normotensos e esta resposta se devia a uma ação da ouabaína sobre o sistema nervoso central.
Os sistemas renina-angiotensina (Doursout et al., 1992; Huang; Leenen, 1999; Cheung et al., 2006) e endotelina (Di Filippo et al., 2003) são exemplos de vias simpatoexitatórias envolvidas no efeito hipertensinogênico da ouabaína. Uma vez que, tanto a hiperatividade simpática como a hipertensão decorrente do tratamento crônico com este digitálico são prevenidas pelo tratamento com antagonistas do receptor AT1 para a
25 angiotensina II (Zhang; Leenen, 2001) ou com o antagonista do receptor ETA para a endotelina-1 (Di Filippo et al., 2003).
Além das ações centrais do tratamento crônico com ouabaína, Kurashina et al. (1996) demonstraram que o tratamento com ouabaína, por 6 (seis) semanas, promove alterações na hemodinâmica renal em ratos. Estes investigadores demonstraram que a inibição crônica da Na+K+-ATPase diminui a eficiência de autoregulação da taxa de filtração glomerular e do fluxo sanguíneo renal.
Adicionalmente, Rossoni et al. (2006) demonstraram que o tratamento com ouabaína em ratos, por 5 semanas, promove aumento da força de contração do músculo papilar e aumento da atividade da ATPase miosínica no coração desses animais. Estes fatores em conjunto levam a um aumento do efeito inotrópico e lusitrópico positivo medido por meio do cateterismo cardíaco em ratos acordados, ou seja, promovem um aumento na contratilidade cardíaca e da velocidade de relaxamento do ventrículo esquerdo de ratos, sendo este um fator importante para determinar um possível aumento no débito cardíaco e, consequentemente, na pressão arterial. Em um outro estudo, Jiang et al. (2007) também demonstram alterações na função e estrutura cardíaca em ratos após o tratamento durante quatro (4) semanas com ouabaína. Estes pesquisadores demonstraram que o tratamento crônico com ouabaína em ratos promoveu hipertrofia no ventrículo esquerdo; deterioração da ultraestrutura do miocárdio; e remodelamento da matriz extracelular. Ao passo que, piorou a função sistólica e diastólica. Os efeitos da ouabaína relatados acima, ocorreram antes da elevação da pressão arterial, indicando que a ouabaína pode prejudicar a estrutura e a função cardíaca dos ratos tratados por 4 semanas independente dos valores de pressão arterial (Jiang et al., 2007).
Além do mais, também foi demonstrado que a hipertensão induzida por ouabaína vem acompanhada de diferenças regionais na reatividade vascular (Cargnelli et al., 2000;
26 Kimura et al., 2000; Rossoni et al., 2002a, b; Xavier et al., 2004a, b, c). Rossoni et al. (2002a) demonstraram que o tratamento por 5 (cinco) semanas com ouabaína induz uma elevação significativa da pressão arterial em ratos normotensos (Wistar), associada a alterações na reatividade vascular à fenilefrina e na atividade e expressão protéica da Na+K+ -ATPase, entretanto estas alterações ocorriam na dependência do leito vascular estudado. Assim, em aortas e artérias mesentéricas superiores foi observada redução da resposta vasoconstritora à fenilefrina, enquanto que em anéis de artéria caudal nenhuma alteração foi encontrada (Rossoni et al., 2002a). Já em anéis de artéria renal, Kimura et al. (2000) demonstraram que a hipertensão por ouabaína durante 5 semanas cursa com um aumento da resposta contrátil à fenilefrina e ao cloreto de potássio (KCl). Corroborando com os resultados de Kimura et al. (2000), Di Filippo et al. (2003) demonstram que o efeito hipertensor da ouabaína está associado com redução do fluxo sanguíneo renal.
Rossoni et al. (2002b) demonstraram que a redução da resposta contrátil à fenilefrina em anéis de aorta de animais tratados com ouabaína durante 5 (cinco) semanas estava associada com um aumento da modulação endotelial, atribuído a uma maior produção do óxido nítrico assim como a de um abridor de canais para potássio. Reforçando estes resultados, foi encontrado aumento da expressão protéica da isoforma endotelial (eNOS) e neuronal da sintase de óxido nítrico (nNOS) em aortas e artérias mesentéricas superiores de ratos tratados com ouabaína, nas quais a modulação do óxido nítrico sobre a resposta da fenilefrina estava aumentada (Rossoni et al., 2002b; Xavier et al., 2004b).
Recentemente, o grupo da Dra. Rossoni tem sugerido possíveis mecanismos que poderiam contribuir para o aumento da via do óxido nítrico e, conseqüentemente, na redução da resposta contrátil induzida pela estimulação alfa-adrenérgica em artérias de ratos tratados cronicamente com ouabaína. Uma das hipóteses previamente elaboradas por estes pesquisadores é a de que as mudanças da resposta contrátil à fenilefrina em ratos hipertensos
27 pelo tratamento com ouabaína, por 5 semanas, poderia ser um mecanismo compensatório decorrente da pressão arterial elevada (Rossoni et al., 2002a, b; Xavier et al., 2004a). Entretanto, o tratamento crônico com losartan, um antagonista dos receptores AT1 para a angiotensina II, apesar de inibir o desenvolvimento de hipertensão, não foi capaz de prevenir as alterações vasculares decorrentes do tratamento crônico com este digitálico em aorta, em artéria mesentérica superior e em artéria mesentérica de resistência de ratos (Xavier et al., 2004b, c). Assim, nas artérias dos animais co-tratados com ouabaína e losartan a redução da resposta adrenérgica em decorrência da maior liberação de óxido nítrico ainda estava presente, similar à resposta observada em vasos de animais tratados somente com ouabaína. Estes resultados sugerem, que as alterações vasculares em artérias de ratos hipertensos pelo tratamento por 5 (cinco) semanas com ouabaína não parecem ser conseqüência da pressão arterial elevada, nem tampouco da ativação do sistema renina-angiotensina, mas possivelmente podem ser decorrentes dos elevados níveis circulantes deste digitálico.
Um segundo sistema estudado que possivelmente poderia estar envolvido nos efeitos vasculares da hipertensão induzida pela ouabaína foi o sistema endotelina. Alguns estudos, como já descritos anteriormente, haviam demonstrado que, além do sistema renina-angiotensina, um outro mecanismo central que estava associado ao efeito hipertensinogênico da ouabaína era a endotelina-1 (Di Filippo et al., 2003). Adicionalmente, Xavier et al. (2004c) demonstraram que a hipertensão induzida pelo tratamento crônico com ouabaína cursa com um aumento da expressão do RNA mensageiro (RNAm) para o polipeptídieo precursor da endotelina-1, a pré-pró-endotelina, e para o receptor ETA da endotelina em aortas de ratos. Além disso, o tratamento crônico com BMS182874, um antagonista dos receptores ETA para a endotelina, além de prevenir a hipertensão arterial, também preveniu o aumento da expressão protéica da eNOS e as alterações dependentes da liberação do óxido nítrico presente nesse leito arterial; modulando assim a resposta contrátil induzida pela fenilefrina em
28 aorta de ratos tratados por 5 semanas com ouabaína (Xavier et al., 2004c). Em conjunto, estes resultados sugerem que o tratamento crônico com ouabaína, por 5 semanas, ativa o sistema endotelina vascular e este, por sua vez, via o receptor ETA parece induzir aumento da síntese de óxido nítrico nas células endoteliais associado a uma maior expressão protéica da eNOS.
Recentemente, também foi demonstrado que ratos com hipertensão induzida pela administração de ouabaína por 5 semanas apresentam uma redução na resposta contrátil induzida pela estimulação elétrica em anéis de artéria mesentérica superior (Xavier et al., 2004a). Por sua vez, essa redução estava associada a um aumento da liberação de óxido nítrico das terminações nervosas nitrérgicas vasculares, uma vez que tanto o L-NAME (inibidos não seletivo da NOS) como o 7-NI (inibidor seletivo da isoforma neuronal da NOS) aboliam a redução da resposta à estimulação elétrica presente nos anéis vasculares dos animais ouabaína (Xavier et al., 2004a).
Além de modificações na função endotelial e na terminação nervosa nitrérgica, Rossoni et al. (2002a) também demonstraram que o tratamento crônico com ouabaína induz alterações sobre a atividade e a expressão protéica das isoformas α1 e α2 da Na+K+-ATPase vascular. Estas alterações eram dependentes do leito vascular estudado: aumento da atividade e expressão protéica da Na+K+-ATPase na aorta; ausência de alteração na artéria mesentérica superior; e redução na artéria caudal. Estas alterações na expressão e/ou atividade da Na+K+ -ATPase poderiam estar colaborando para as mudanças na resposta contrátil à fenilefrina.
Assim como observado em vasos de condutância e de transição, a hipertensão induzida por ouabaína, durante 5 semanas de tratamento, também cursa com alterações da modulação endotelial sobre a resposta contrátil induzida pela estimulação adrenérgica em artérias mesentéricas de resistência de rato (Xavier et al., 2004b). Nestas artérias, semelhante às artérias de condutância, o efeito modulatório do óxido nítrico sobre a resposta contrátil
29 induzida pela noradrenalina estava aumentado, em contrapartida tem-se à perda do efeito modulatório do fator hiperpolarizante derivado do endotélio (Xavier et al., 2004b).
Além do mais, a hipertensão induzida pelo tratamento com ouabaína, durante 5 (cinco) semanas, também cursa com alterações na atividade funcional da Na+K+-ATPase em anéis vasculares de artérias mesentéricas de resistência. Neste sentido, observou-se aumento da atividade funcional da Na+K+-ATPase em artérias mesentéricas de resistência de ratos hipertensos pelo tratamento por 5 semanas com ouabaína quando comparado aos controles (Xavier, 2005).
Assim, as alterações funcionais induzidas pelo tratamento crônico com ouabaína, durante 5 semanas, em vasos de resistência não parecem ser mecanismos contribuintes para o aumento da resistência vascular periférica, uma vez que os animais hipertensos apresentam um aumento da atividade funcional da Na+K+-ATPase e não aleração da resposta vasoconstritora à noradrenalina quando comparado aos animais normotensos. No entanto, apesar das alterações funcionais se contraporem ao quadro hipertensivo, o tratamento por 5 semanas com ouabaína promoveu um remodelamento hipotrófico para dentro em artérias mesentéricas de resistência, devido: (1) a uma diminuição no número de células do músculo liso vascular; (2) a um aumento na deposição de colágeno na camada média; e (3) a uma redução da luz em artérias mesentéricas de resistência (Briones et al., 2006). Estas alterações promovem um aumento da razão parede : luz, além da maior rigidez vascular devido ao aumento da deposição de colágeno, o que contribui para um prejuízo na distensão destes vasos os quais são importantes para o controle da resistência vascular periférica e da pressão arterial (Briones et al., 2006).
Baseado nos resultados descritos anteriormente, sabe-se que o sistema vascular, após 5 semanas de tratamento com ouabaína, funcionalmente parece estar se contrapondo à gênese da hipertensão arterial, exceto pelo fato de as artérias renais estarem aumentando a sua
30 resistência vascular. Porém, não se sabe qual seria o comportamento da pressão arterial e da reatividade vascular com um tratamento em longo prazo com ouabaína, acima de 5 semanas.
31
Justificativa
e
Objetivos
32
2
JUSTIFICATIVA E OBJETIVOSAs doenças do aparelho cardiovascular representam um importante problema de saúde pública, considerando-se a prevalência crescente e a morbi-mortalidade associada. Segundo a DATASUS do ministério da saúde, as doenças do aparelho circulatório são as maiores causas de mortalidade geral no Brasil (~30%), e representam 11% de todas as internações realizadas em hospitais do SUS. Cabe ressaltar que a via final de grande parte dessas doenças são complicações decorrentes do processo hipertensivo. Baseado em tais fatos, é de grande relevância investigar mais detalhadamente os mecanismos associados com a gênese e a manutenção da hipertensão arterial, com a finalidade de no futuro poder intervir de forma precoce neste processo patológico.
Embora muito se tenha sugerido sobre os mecanismos envolvidos na gênese e na manutenção da elevação da pressão arterial induzida por ouabaína, muitos questionamentos sobre os efeitos vasculares do tratamento crônico com este digitálico ainda existem. Este modelo de hipertensão até agora tem sido estudado com tempos de administração relativamente curtos: duas (Huang et al., 1994; Huang; Leenen, 1999; Zhang; Leenen, 2001), quatro (Cargnelli et al., 2000; Di Filippo et al., 2003), cinco (Manunta et al., 1994; Rossoni et
al., 2002 a,b; Xavier et al., 2004 a,b,c; Briones et al., 2006) ou seis semanas (Kurashina et al.,
1996).
Outra observação importante é de que nem o grupo da Dra. Rossoni (Rossoni et al., 2002 a; Xavier et al., 2004 b,c; Briones et al., 2006) e nem o do Dr. Hamlyn (Manunta et al., 1994) conseguiram demonstrar uma estabilização do processo hipertensivo com cinco semanas de tratamento com ouabaína. Assim, existe a possibilidade de que essa hipertensão torne-se mais severa com tempos mais longos de administração de ouabaína.
33 Além disso, como discutido anteriormente, o sistema vascular após 5 semanas de tratamento com ouabaína, funcionalmente parece se contrapor a gênese e a manutenção da pressão arterial, exceto pelo fato de as artérias renais estarem aumentando a sua resistência vascular. Porém não se pode descartar a possibilidade de que, com o passar do tempo, estas alterações vasculares se convertam em mecanismos contrinuintes para o desenvolvimento da hipertensão. Assim, sabendo da importância dos vasos de resistência no controle da resistência vascular periférica e da pressão arterial, é de grande relevância para o entendimento do processo da gênese e da manutenção da pressão arterial estudar mais profundamente os mecanismos vasculares envolvidos no modelo experimental de hipertensão induzida por ouabaína. Desta forma, o objetivo geral deste estudo é o de analisar possíveis alterações nos níveis de pressão arterial e de reatividade vascular em artérias mesentéricas de resistência de ratos submetidos ao tratamento com ouabaína durante 10 e 20 semanas, assim como os possíveis mecanismos envolvidos.
2.1 Objetivos específicos
2.1.1 Avaliar os níveis de pressão arterial de ratos tratados durante 10 e 20 semanas com ouabaína e compará-los com aqueles obtidos durante 5 semanas de tratamento;
2.1.2 Avaliar se o tratamento crônico com ouabaína após 10 e 20 semanas é capaz de modificar a função endotelial e a reatividade vascular à noradrenalina em artérias mesentéricas de resistência;
2.1.3 Avaliar uma possível modulação, por parte do endotélio sobre o efeito crônico da ouabaína, bem como estudar que possíveis fatores endoteliais poderiam estar envolvidos; 2.1.4 Avaliar como o tratamento por 10 e 20 semanas com a ouabaína modularia a atividade funcional da bomba de sódio e potássio;
34 2.1.5 Analisar através da técnica de Western Blot a expressão protéica das isoformas da sintase de óxido nítrico neuronal (nNOS), da ciclooxigenase-2 (COX-2) e da Cu-Zn-superóxido dismutase (SOD).
35
Sumário
e
Conclusões
36
6 SUMÁRIO E CONCLUSÕES
Com os resultados do presente estudo pode-se sumarizar que:
1. Ouabaína, em concentrações nanomolares, induziu aumento da pressão arterial caudal quando administrada cronicamente durante 5, 10 e 20 semanas e esta hipertensão estava acompanhada de modificações da modulação endotelial e da reatividade vascular à noradrenalina em anéis de artérias mesentéricas de resistência de ratos. 2. O tratamento por 5 semanas com ouabaína apresentou um aumento na modulação
endotelial negativa, via aumento do componente nitrérgico proveniente da isoforma neuronal da sintase de óxido nítrico e perda do efeito positivo exercido pelos prostanóides vasoconstritores na resposta contrátil induzida pela noradrenalina nas artérias mesentéricas de resistência. Além disso, o tratamento com ouabaína por este período, promoveu diminuição da expressão protéica da Cu-Zn superóxido dismutase, não alteração da expressão protéica da ciclooxigenase-2 e, finalmente, também não alterou a síntese e/ou liberação do fator hiperpolarizante derivado do endotélio.
3. O tratamento por 10 semanas com ouabaína, assim como observado no tratamento por 5 semanas, apresentou um aumento na modulação endotelial negativa, também via aumento do componente nitrérgico e, além de apresentar perda do efeito positivo exercido pelos prostanóides vasoconstritores, este tratamento promoveu um aumento na síntese de prostanóides vasodilatadores em artérias mesentéricas de resistência. Este período de tratamento com ouabaína, também não foi efetivo em alterar a síntese e/ou liberação do fator hiperpolarizante derivado do endotélio. No entanto, este tratamento diminuiu tanto a expressão protéica da isoforma neuronal da sintase de óxido nítrico quanto da ciclooxigenase-2 em artérias mesentéricas de resistência, apesar de não modificar a expressão protéica da Cu-Zn superóxido dismutase.
37 4. Após 20 semanas de tratamento com ouabaína, as modificações da modulação
endotelial e da reatividade vascular à noradrenalina continuaram, porém são alterações contribuintes e não contrárias à elevação crônica da pressão arterial. Desta forma, o tratamento por 20 semanas com ouabaína apresentou uma redução na modulação endotelial negativa via uma perda do componente nitrérgico das artérias mesentéricas de resistência, provavelmente devido a uma diminuição da expressão protéica da isoforma neuronal da sintase de óxido nítrico e um aumento da síntese de ânion superóxido, apesar do tratamento ter aumentado à expressão protéica da Cu-Zn superóxido dismutase. Além disso, neste período de tratamento também foi possível observar um aumento na síntese e/ou liberação do tromboxano A2 e/ou prostaglandina H2, provavelmente devido ao aumento da expressão protéica da isoforma ciclooxigenase-2. E, finalmente, o tratamento por 20 semanas com ouabaína não foi efetivo em alterar a síntese e/ou liberação do fator hiperpolarizante derivado do endotélio em artérias mesentéricas de resistência.
5. A atividade funcional da Na+K+-ATPase sensível à ouabaína foi aumentada nos animais que receberam ouabaína por 5 semanas e inalterada nos animais que receberam ouabaína por 10 e 20 semanas. No tratamento com ouabaína por 5 semanas, esta mudança parece ser um fator somatório para contrapor-se a hipertensão arterial. Em contrapartida, este fator compensatório é perdido em tempos maiores de tratamento com este digitálico.
Logo, estes resultados nos permitem concluir que os ajustes observados na dependência do tempo de tratamento com ouabaína, nesse modelo de hipertensão, não parecem induzir um modelo de hipertensão arterial severa, pois os valores de pressão arterial neste modelo enquadra-se no ESTÁGIO 1 de hipertensão arterial segundo o JNC VII (Seventh Report of the
38
Joint National Committee on Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure) (2003). Além disso, as alterações funcionais neste leito estudado são dependentes
do tempo de tratamento. Assim, em um tempo relativamente curto de tratamento com ouabaína por 5 semanas, parecem ser um fator compensatório à hipertensão, exceto pelo fato que existem ajustes estruturais nesse vaso que aumentam a razão parede : luz e a rigidez da parede (Briones et al., 2006). Com um tempo maior de tratamento, por 10 semanas, estes ajustes contrários à hipertensão ainda continuam, no entanto, com um tempo mais prolongado de tratamento com ouabaína, por 20 semanas, como visto no presente estudo, existe alterações funcionais, que de fato, parecem ser contribuintes a manutenção da hipertensão. Sendo assim, este modelo é extremamente importante de ser estudado para investigar a gênese e, principalmente, a manutenção da hipertensão arterial que cursa com o aumento das concentrações plasmáticas de ouabaína.
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Referências
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