Coléteres em Bathysa nicholsonii K. Schum.
(Rubiaceae): ultraestrutura, composição protéica da
secreção e sua atividade antifúngica
Emilio de Castro Miguel
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro
Campos dos Goytacazes
Coléteres em Bathysa nicholsonii K. Schum.
(Rubiaceae): ultraestrutura, composição protéica da
secreção e sua atividade antifúngica
Emilio de Castro Miguel
Dissertação a ser apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia para a obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.
Orientadora: Dr. Maura Da Cunha
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro
Campos dos Goytacazes, RJ
Coléteres em Bathysa nicholsonii K. Schum.
(Rubiaceae): ultraestrutura, composição protéica da
secreção e sua atividade antifúngica
Emilio de Castro Miguel
Dissertação a ser apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia para a obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.
Aprovada em 21 de Março de 2006
Comissão Examinadora
___________________________________________________ Dr. Ulysses Garcia Casado Lins – IM-UFRJ
___________________________________________________ Dra. Claudia Franca Barros - IPJBRJ
___________________________________________________ Dra. Kátia Valevski Fernandes - LQFPP-CBB-UENF ___________________________________________________
Dra. Maura Da Cunha LBCT-CBB-UENF
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Celular e Tecidual em colaboração com o Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Microorganismos do Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, sob orientação da Dr. Maura Da Cunha e com financiamento da CAPES, PETROBRAS, CNPq e FAPERJ e bolsa de mestrado concedida pela UENF/FAPERJ, durante a vigência do curso.
Agradecimentos
À Dra. Maura Da Cunha pelo aprendizado, orientação, estímulo, amizade e dedicação durante todo o tempo de nossa convivência.
À Dra. Valdirene Moreira Gomes pela ajuda nas análises bioquímicas e ensaios antifungicos.
Ao Dr. Marco Antonio de Oliveira pela ajuda nos microscópios e excelentes dicas técnicas. Ao Dr. Flávio Costa Miguens, pela criteriosa e bem humorada revisão.
Aos membros da Banca Examinadora Dra. Claudia Barros, Dr. Ulysses Lins e Dra. Kátia Valevski, por aceitarem o convite.
À Érica, Isabela, André, Felipe e Suzana, pela ajuda no LFBM. Ao Sr. Walter Silva pela ajuda da coleta do material botânico.
Ao Msc. Sebastião José da Silva Neto pela identificação no material botânico.
Ao Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, especialmente na figura dos seus técnicos, Beatriz Ribeiro; Márcia Adriana Carvalho; Giovana Alves e Noil Freitas, pelo auxílio nos microscópios e no setor de Preparo de Amostras para Microscopia.
Ao Programa Mata Atlântica pelo suporte técnico, e financeiro através da PETROBRAS. Ao IBAMA e ao Dr. Luis Henrique (Diretor da Reserva Biológica de Tinguá), pela permissão para a coleta de material botânico.
Aos colegas do nosso grupo de pesquisa.
Aos amigos Marcus Vinicius Oliveira e Leandro Mattos. A Lucas Miguel, meu querido irmão.
A todos que eu me esqueci de agradecer mas, de alguma forma, foram importantes para a realização desse trabalho. Vocês sabem como é final de tese...
Dedicatória
Dedico esse trabalho à:
Emil Miguel Rosa, Izaura de Freitas Castro Miguel Lucas de Castro Miguel
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO ... 01
1.1 Floresta Atlântica ... 02
1.2 Família Rubiaceae e Bathysa nicholsonii K. Schum ... 03
1.3 Estípulas ... 04
1.4 Tecidos secretores em plantas ... 05
1.5 Coléteres ... ... 06
1.6 Aspectos subcelulares do processo de secreção vegetal ... 08
1.6.1 Sistema endomembranar ... 09
1.6.2 Transporte de substâncias em células vegetais ... 10
1.6.3 Morte celular programada em plantas ... 11
1.7 Parede periclinal externa ... 13
1.7.1 Passagem de moléculas pela parede periclinal externa ... 13
1.8 Exsudatos vegetais: Características gerais e propriedades ... 14
2 OBJETIVOS ... 16 2.1 Objetivo geral ... 16 2.2 Objetivos específicos ... 16 3 MATERIAL E MÉTODOS ... 17 3.1 Área de coleta ... ... 17 3.2 Material botânico ... 17 3.3 Microscopia... 18 3.3.1 Microscopia Óptica... 18 3.3.2 Histoquímica... 18
3.3.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão... 19
3.3.4 Citoquímica... 19
3.3.5 Microscopia Eletrônica de Varredura... 21
3.3.6 Microanálise de Raio-X (Energia dispersiva de Raios-X)... 21
3.4 Detecção de proteínas totais na secreção (SDS-PAGE)... 22
3.5 Detecção de glicoproteínas... 23
3.6 Detecção de atividade antifúngica no extrato total da secreção... 23
4. RESULTADOS ... 25
5. DISCUSSÃO ... 44
6. CONCLUSÃO ... 52
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 53
RESUMO
Os coléteres são estruturas secretoras que podem ser encontrados em diversas famílias de Angiospermae. Por definição, são estruturas secretoras constituídas por um eixo central alongado, formado por parênquima fundamental, circundado por um estrato epidérmico em paliçada, sendo as células epidérmicas responsáveis pela secreção. A função protetora dos coléteres conferida pela sua secreção ainda é bastante discutível e pouco conhecida. A secreção trata-se de um complexo fenômeno de separação ou isolamento de certas substâncias do protoplasto, podendo incluir processo de síntese, acúmulo em determinados compartimentos intracelulares, assim como liberação ou eliminação extracelular para dentro de espaços internos próximos ou, então, para fora da superfície da planta. Durante esse processo, alterações ocorrem não só no citoplasma, mas também na parede celular. Para estudar a anatomia e ultraestrutura dos coléteres de Bathysa nicholsonii foram utilizadas técnicas de microscopia óptica; eletrônica de varredura, incluindo microanálise de Raios-X e eletrônica de transmissão. Para a detecção de proteínas na secreção foi feita eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS. Foram feitos, ainda, testes de inibição de crescimento de esporos de fungos fitopatogênicos. Na sua anatomia, os coléteres são do tipo cilindriforme, com eixo central parenquimático e células epidérmicas secretoras, apresentando estruturas lipídicas fortemente marcadas. Diversas fases de maturação do citoplasma puderam ser notadas. As mudanças citoplasmáticas sugerem que as células secretoras passam por um processo de morte celular programada não lisossomal durante o seu desenvolvimento. A parede periclinal externa também apresentou mudanças em sua organização durante a maturação. Foram notadas diversas fases, possivelmente envolvidas com o processo de passagem das moléculas para o meio externo. A secreção mostrou através de eletroforese a presença de várias bandas protéicas, com massas moleculares variando entre 66 e 24 kDa. Foram observadas duas proteínas majoritárias com massas moleculares de aproximadamente 26 e 36 kDa. O efeito da secreção obtida após processamento protéico sobre a inibição do desenvolvimento dos fungos causou uma significativa inibição no fungo Coletotrichum lindemuthianum, desde as primeiras horas de crescimento.
ABSTRACT
Colleters are secretory structures present in many Angiospermae families. These structures are constituted by an elongated central axis formed by fundamental parenchyma, surrounded by a palisade epidermis, being the epidermal cells responsible for the secretion. The protective function of colleters conferred by their secretion is still controvesal. The secretion is a complex phenomenon of separation and isolation of certain protoplast substances. It may include synthesis and accumulation process in certain intracellular compartments, well as liberation and extracelular elimination to nearby inner spaces or to the outer side of plant surface. During this process, alteration occur not only the cytoplasm but also in the cell wall. In orther to study the anatomy and ultrastructure of Bathysa
nicholsonii colleters, light microscopy, electron scanning microscopy, including X-Ray
microanalysis, and transmission electron microscopy were utilized. For protein detection, the secretion was analysed by SDS-PAGE. Tests on the inhibitory potential of secretion on the spore growth of phytophatogenic fungus were performed. In their anatomy, colleters are cilindriform, with a parenchymatic central axis and epidermal secretory cells, presenting lipophylic structures strongly stained. Many cytoplasm maturation phases could be noted. Cytoplasmic changes, observed in secretory cells are indicative or a possible event of non lisossomal programmed cell death occurring during the course of their development. The outer cell wall was also presented organizational changes during maturation. Several phases were noted, probably involved with molecules passage to the outside media. By electrophoresis, the presence of different proteins, covering the range of66 to 24 kDa were visualized in colleters secretion. Two majoritary proteins, with molecular masses of approximately 26 and 36 kDa were noted. secretion extracted proteins presented a inhibitory effect ont the growth of Colletotrichum lindemuthianum fungus, since the first hours of growth.
1. INTRODUÇÃO
Estruturas ou tecidos secretores podem estar presentes em diferentes regiões das plantas e possuir formas variadas (Dickinson, 2000). Partindo do princípio que estruturas secretoras formam um grupo polifilético, divergências evolutivas deram origem a diferentes mecanismos de síntese e externalização de variados exsudatos (Dickinson, 2000). Estas variações podem ser identificadas na anatomia e ultraestrutura das estruturas secretoras dos coléteres, que são constituídas por um eixo central vascularizado circundado por uma epiderme secretora, disposta em paliçada. Coléteres podem estar presentes na base das estípulas, cálices, folhas, flores e ápices caulinares.
A morfologia, anatomia e ultraestrutura de coléteres em diversos gêneros da família Rubiaceae foram recentemente descritas (Klein et al., 2004; Miguel, 2004; Miguel et al., 2005-submetido; Moraes et al., 2005). Contudo, muitas questões permanecem em aberto. Dentre estas, a morfofisiologia do processo de secreção em coléteres tem sido objetivo do nosso grupo no setor de Citologia Vegetal – LBCT/UENF, contribuir para elucidar os aspectos anatômicos e ultraestruturais da secreção em plantas, enfocando essas estruturas em espécies da família Rubiaceae que ocorrem na Floresta Atlântica.
O ambiente encontrado em regiões de Floresta Atlântica é úmido, sendo propício para o desenvolvimento de microrganismos, que apresentam diversas interações com estas plantas, inclusive patogenia. Estudos envolvendo estas relações microrganismos/plantas são necessários para elucidar os mecanismos de interação. Exemplifica esta abordagem, o fato de que tem sido sugerido que o exsudato de coléter apresente papel importante na interação bactéria/planta nos gêneros onde pode ser observada nodulação de bactérias (Horner e Lersten, 1968; Lersten, 1975). Assim, acredita-se que a caracterização da secreção e a avaliação de sua atividade biológica podem proporcionar o melhor entendimento do envolvimento da secreção no mecanismo de defesa das espécies em questão.
Pelo exposto, o presente estudo tem como objetivo a análise anatômica e ultraestrutural dos coléteres de Bathysa nicholsonii K. Schum (Rubiaceae), bem como, analisar parcialmente a composição protéica e atividade antifúngica da secreção produzida por estas estruturas secretoras.
1.1 Floresta Atlântica
O bioma Floresta Atlântica engloba vários tipos de vegetação (Rizzini, 1997) como florestas ombrófilas densas ou mistas, florestas estacionais e ecossistemas associados como restingas e manguezais. É uma das formações vegetais tropicais mais ameaçadas do mundo pelo crescente desmatamento (Myers et al., 2000). Desde o início da colonização, com a ocupação dos primeiros espaços territoriais próximos à região costeira, o Brasil passou por diferentes ciclos de exploração como: o do pau-brasil; da cana-de-açúcar; da pecuária; do ouro; e do café que contribuíram para a perda da cobertura florestal. Também a industrialização e conseqüente urbanização com o surgimento das principais cidades e metrópoles brasileiras fizeram com que a área originalmente ocupada pela Floresta Atlântica fosse reduzida drasticamente (Quinet et al., 2000).
Mundialmente, apenas da década de 80 foram extintos cerca de 154 milhões de hectares de florestas tropicais (FAO, 1993). Na Floresta Atlântica, possuindo altos índices de endemismo (WCMC, 1992), estima-se que ocorram cerca de 8000 espécies de plantas (Conservation International, 2006). No entanto, ainda é pouco conhecida em relação à composição florística e aos processos ecológicos que envolvem suas comunidades e populações. Originalmente, esta formação vegetal ocupava cerca de 1,2 milhões de km2, hoje ocupa apenas 7 % do território original, sendo que desta área, somente 1-2 % tem chances de ser preservada (Myers et al., 2000).
Atualmente, a Floresta Atlântica compreende remanescentes de cobertura florestais bastante diversificadas na sua fisionomia e florística. Com uma grande população humana vivendo em seu domínio, ocorre uma grande pressão sobre este conjunto de ecossistemas e sua biodiversidade. Esta ocupação desordenada acaba por causar utilização irracional de recursos naturais. Dentre as principais atividades presentes hoje nesse ecossistema, resultam da ação direta do homem sobre as florestas: expansão agropecuária e urbana, inclusive loteamentos clandestinos; empreendimentos de infra-estrutura; exploração predatória de recursos florestais, sendo exemplos a extração de madeira e o turismo desordenado; dentre outras (Fundação SOS Mata Atlântica, 2003).A cobertura atual desta formação vegetal apresenta uma alta diversidade de famílias botânicas. Em alguns trechos, a família Rubiaceae está dentre aquelas que apresentam grande número de indivíduos (Lima e Guedes-Bruni, 1997).
1.2 Família Rubiaceae e Bathysa nicholsonii K. Schum.
A família Rubiaceae encontra-se entre as quatro maiores famílias de Angiospermas, considerando-se o número de espécies, depois das famílias Asteraceae, Orchidaceae e Fabaceae (lato sensu = Leguminosae), com cerca de 13.000 espécies e 650 gêneros (Robbrecht, 2004). No Brasil, segundo Delprete (1998), a família compreende aproximadamente 118 gêneros e 1.600 espécies.
A última revisão taxonômica da família foi feita por Robbrecht (1988). Desde então, muitos trabalhos descrevendo novas espécies nessa família são encontrados na literatura como, por exemplo, Devesa e Ortega-Olivencia (2003), Ortega-Olivencia e Devesa (2003), Markey e de Lange (2003), Norton e de Lange (2003). Também são reportadas revisões do gênero Xantophytum (Axelius, 1990); Ernode (NegronOrtiz e Hickey, 1996) e Simira (Silva Neto, 2000)
Diversas espécies da família Rubiaceae apresentam um alto valor importância (VI) no bioma Floresta Atlântica. Lima e Guedes-Bruni (1997) demonstraram que aproximadamente 5 % das espécies catalogadas no remanescente de Floresta Atlântica da Reserva Biológica de Macaé de Cima pertenciam a esta família. Guedes-Bruni (1998) demonstra a importância desta família em outros remanescentes de Floresta Atlântica do Estado do Rio de Janeiro.
Desde o início do século XIX, com a extração e caracterização da cafeína, a família Rubiaceae tem se destacado pela presença de substâncias de propriedades terapêuticas em suas estruturas. Atualmente, a família Rubiaceae vem se destacando pela produção de substâncias medicinais ou potencialmente medicinais, por exemplo, microbicidas, anti plasmódio, analgésicos, anti inflamatórios, anti tumores dentre outras (Abdel-Kader et al., 1997; Capasso et al., 1997; Germano et al., 1999; Staerk et al., 2000; Kayser et al., 2001; Jayasinghe et al., 2002; Hamerski et al., 2003; Dongmo et al., 2003; Suksamrarn et al., 2003; Jangde e Bansod, 2004; Gattuso et al., 2004; Lorence et al., 2004).
Muitas características são marcantes na família Rubiaceae como folhas opostas com estípulas e ovário ínfero, além da presença de estípulas cobrindo e protegendo o meristema apical caulinar (Robbrecht, 1988). Embora, seja bem caracterizada como uma família, as delimitações de subfamílias, de tribos, e de gêneros têm sido discutidas em razão da grande riqueza e da variedade morfológica de seus caracteres, o que vem provocando muitas
mudanças na classificação hierárquica infrafamiliar (Andersson e Rova, 1999; Andreasen e Bremer, 2000; Piesschaert et al., 2000).
O gênero Bathysa é representado por cerca de 15 espécies, sendo árvores, arvoretas ou arbustos, distribuídos no Panamá, Guiana Francesa, Venezuela, Colômbia, Peru, Bolívia e Brasil. B. nicholsonii foi escolhida para este estudo pela presença de estípulas grandes que, em suas bases, apresentam coléteres com secreção abundante (Miguel, 2004). Bathysa
nicholsonii K. Schum. é uma árvore com até sete metros que apresenta casca castanha, com
placas longitudinais e ramos crassos, possuindo estípulas persistentes. No Estado do Rio de Janeiro, ocorre no Parque Nacional da Tijuca e na Reserva Biológica de , onde é encontrada na orla da mata associada com indivíduos de B. cuspidata, sendo conhecida vulgarmente por “bapebucu” e “quina-do-mato”. Segundo os critérios da IUNC (International Union for Nature Conservation), a espécie pode ser considerada rara. Indícios levam a crer que B.
nicholsonii tenha populações de tamanho reduzido, nos Estados do Rio de Janeiro e Minas
Gerais (Germano-Filho, 1999).
1.3 Estípulas
São apêndices presentes aos pares na base do pecíolo e, em sua maioria, fusionadas a uma estrutura interpeciolar em ambos os lados do caule, entre as folhas opostas, podendo ser de diferentes formas (Robbrecht, 1988). Em determinadas plantas, estas estruturas podem ser verdes, semelhantes às folhas e tendo capacidade fotossintética, mas sua principal função é, de fato, a proteção das folhas jovens em desenvolvimento (Fahn, 1990). A presença de estípulas é uma das características vegetativas mais importantes da família Rubiaceae. Contudo, pouco se sabe sobre a origem evolutiva e as funções das estípulas em dicotiledôneas (Cronquist, 1968; Rutischauser e Dickinson, 1989).
Em Rubiaceae sabe-se que, após o crescimento do ápice caulinar, as estípulas podem ser decíduas ou persistentes. Ocorrendo no ápice caulinar, sendo decíduas ou persistentes, freqüentemente, cobrem-no inteiramente. Estípulas persistentes são encontradas próximas às gemas axilares, cobrindo-as (Robbrecht, 1988). Assim, oferecem proteção aos meristemas apicais e/ou axilares na forma de uma barreira física. Esta forma de proteção em camadas de estípulas sobre o ápice é encontrada, principalmente, em dicotiledôneas arbóreas (Fahn, 1990). Em diversas espécies, podemos encontrar, na
superfície adaxial das estípulas, estruturas secretoras denominadas de coléteres. Ocasionalmente, as estípulas assumem uma tonalidade marrom em seus ápices, sendo indício de sua senescência.
1.4 Tecidos secretores em plantas
Estruturas ou tecidos secretores podem estar presentes em diferentes órgãos das plantas, possuindo formas variadas (Dickinson, 2000). A variação de formas destas estruturas reflete a variação de exsudatos produzidos. Atualmente, a classificação das estruturas secretoras é feita com base na morfologia ou no conteúdo do exsudato. Tal classificação é discutível devido ao fato de que tecidos secretores, geralmente, sofrem transformações relativamente rápidas. Em função disto, a estrutura, a ultraestrutura e o conteúdo bioquímico das células podem ser modificados em dias ou até em horas. Tal fato dificulta a classificação, pois tecidos iguais podem ser considerados diferentes somente por se encontrarem em uma etapa diferente da maturação (Fahn, 1979).
Fahn (1988) organizou uma listagem de diferentes tipos de estruturas secretoras de plantas e classificou-as, principalmente, quanto à sua morfologia e à composição química da secreção, sendo estas características complementares. No entanto, é senso comum na literatura que estruturas secretoras formam um grupo polifilético (Fahn, 1979; Laurence et
al., 2000).
Estudos morfofisiológicos têm sido realizados sobre estruturas secretoras em diferentes famílias. Dentre estes, se destacam os estudos de Gaffal e Heimler (1998), investigando a estrutura do nectário floral de Digitalis purpurea; Fahn e Shimony (1998), sobre a ultraestrutura das células secretoras de duas espécies de Fagonia (Zygophyllaceae); Silva e Machado (1999a e 1999b), com relação aos tricomas secretores em folhas de Piper
regnellii (Piperaceae); Fahn (2000), investigando a estrutura e função das células
secretoras; Bottega e Corsi (2000), sobre a estrutura e função de tricomas glandulares do cálice de Rosmarinus officinalis (Labiatae); Knight et al. (2001), sobre as glândulas de óleo do fruto de Citrus sinensis; Machado e Carmello-Guerreiro (2001), investigando a estrutura e desenvolvimento de canais secretores em frutos de Schinus terebinthifolius (Anacardiaceae); Miguel (2004), investigando os coléteres de espécies de Bathysa (Rubiaceae); e Klein et al. (2004), estudando coléteres de Simira (Rubiaceae).
Ultraestruturalmente, tem sido observado que células de tecidos secretores são caracterizadas por conterem numerosas mitocôndrias, pequenos vacúolos e citoplasma denso (Fahn, 1988). Segundo Fahn e Shimony (1998), células secretoras de Fagonia mollis (Zygoplhylaceae) possuem núcleo relativamente grande e numerosas mitocôndrias modificadas. Nas células secretoras dos ductos de goma de Lannea coromandelica (Anacardiaceae), o citoplasma é rico em ribossomos, retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias, vacúolos, corpos paramurais e inclusões lipídicas e, em algumas etapas de sua diferenciação, foram encontrados dictiossomos em abundância (Venkaiah, 1992). Werker e Kislev (1978) argumentam que a produção de secreção, em tricomas secretores da raiz de Sorghum, está relacionada ao complexo de Golgi.
1.5 Coléteres
São estruturas secretoras que podem ser encontradas em diversas famílias de Angiospermae. Por possuírem forma e funções variadas e estarem presentes em diversos grupos taxonômicos, estas estruturas foram descritas sob vários nomes. Os mais usuais são: squamallae (Ramayya e Bahadur, 1968); glândulas estipulares (Van Hove e Kagoyre (1974); nectário extra-floral (Dave e Patel, 1975); e glândula de resina (Curtis e Lersten, 1980).
Coléteres têm sido definidos como estruturas secretoras constituídas por um eixo central alongado, formado por parênquima fundamental, circundado por um estrato epidérmico em paliçada, sendo as células epidérmicas responsáveis pela secreção (Thomas, 1991; Da Cunha e Vieira, 1997). Essas estruturas foram inicialmente, descritas em 1848, por Hanstein (apud Thomas, 1991). Curiosamente, estes não constam na classificação de estruturas secretoras, proposta por Fahn (1988); embora sejam reconhecidos como estruturas secretoras por outros autores (Esau, 1974). O termo coléter deriva do termo grego “colla”, que quer dizer cola e refere-se à secreção pegajosa que o mesmo libera (Thomas, 1991). Lersten (1974a; 1974b) caracterizou morfologicamente dois tipos de coléteres em Rubiaceae, o "dendroid" e o "brushlike", classificando o tipo mais comum (padrão) como "standard". Da Cunha (2005) subdividiu morfologicamente o tipo standard em: cilindriforme e claviforme. Para a distinção de famílias, as variações dos coléteres
afazem-se pouco úteis, mas em termos de gêneros e subgêneros em Rubiaceae, esta característica se torna bastante consistente (Robbrecht, 1988).
De acordo com Thomas (1991), este tipo de estrutura secretora é encontrado na face adaxial de diferentes órgãos de membros de 60 famílias de Angiospermae. Robbrecht (1988) aponta que os coléteres podem ocorrer também em partes florais de Rubiaceae, Loganiaceae, Apocynaceae e outras famílias. González (1998) mostra que os coléteres de diferentes espécies da família Turneraceae estão distribuídos nos primórdios foliares.
O número de coléteres e a sua distribuição nos órgãos são variáveis. Estas estruturas podem estar; cobrindo o interior da estípula e/ou do cálice, com gradação variável; na estípula podem estar localizadas na borda ou podem estar inseridos em uma fileira única na base, sendo a última a ocorrência mais freqüente. Klein et al. (2004) mostraram que os coléteres de Simira pikia se encontram distribuídos em uma linha na base da estípula enquanto o conjunto dos coléteres de S. glaziovii forma dois triângulos na base da estípula. Miguel (2004) mostrou que os coléteres em três espécies de Bathysa são distribuídos na base das estípulas.
A variação de formas, que acarreta uma variação de nomenclatura, pode ser claramente notada na literatura. Robbrecht (1988) aponta que as estruturas secretoras pluricelulares que ocorrem no interior das estípulas e em outros órgãos, como encontrado em partes florais, de Rubiaceae, Loganiaceae, Apocynaceae e outras famílias de Asteridae, já foram chamadas por uma longa série de termos, como “Squamallae” por Ramayya e Bahadur (1968), "glândulas estipulares" por Van Hove e Kagoyre (1974), nectário extrafloral por Dave e Patel (1975) ou glândulas de resina por Curtis e Lersten (1980). González (1998) reconhece a variação de formas nos coléteres de Turneraceae e adiciona termos, à classificação, para os coléteres observados em gêneros de Turnera e Piriqueta.
Coléteres do tipo "standard" se mostram similares em muitos aspectos , contudo, é descrita uma grande diversidade de tamanhos, formatos, grau de desenvolvimento e diâmetro relativo do eixo central além da presença ou não do desenvolvimento da constrição basal (Robbrecht, 1988; Klein, 2002; Miguel, 2004). Há, ainda, estruturas vascularizadas e outras não vascularizadas. Tal fato é discutido por Thomas (1991) e Apezzato-da-Gloria e Estelita (2000), devido a sua importância para a nutrição da estrutura. Estas variações podem apresentar valor taxonômico (Robbrecht, 1988).
Em relação à ultraestrutura dos coléteres, Miller et al. (1983) mostram que as células secretoras dos coléteres de Allamanda cathartica (Apocynaceae) possuem retículo endoplasmático perinuclear, numerosas mitocôndrias, vacúolos ocupando grandes áreas do citoplasma, complexo de Golgi e plastídeos. Em Bathysa gymnocarpa, há evidências de que as células secretoras dos coléteres apresentam complexo de Golgi com cisternas mais abundantes do que B. stipulata (Miguel, 2004). Idioblastos cristalíferos e taníferos foram observados no eixo central de coléteres de Psychotria kirkii (Rubiaceae) (Thomas e Dave, 1989) e P. nuda (Moraes et al., 2005).
Tem sido proposto que a função protetora dos coléteres é conferida pela sua secreção (Mueller, 1985; Williams et al., 1982; Ramayya e Bahadur, 1968). De acordo com estes autores, o exsudato protege o meristema, que fica, algumas vezes, completamente coberto por secreção. Em espécies de Rubiaceae, esta secreção pode estar envolvida na formação de nódulos de bactérias (Horner e Lersten, 1968). No entanto, não é elucidada ainda a nodulação nestas plantas.
Paralelamente ao desenvolvimento do meristema apical, os coléteres tendem a senescer. Durante este processo, sua coloração torna-se gradativamente marrom. O processo de senescência inicia-se na epiderme da parte apical da estrutura e finda na basal central. A lignificação, intimamente ligada ao processo de senescencia dos coléteres, é um fenômeno centrípeto iniciando-se pelas paredes celulares da epiderme (Thomas e Dave, 1989; Miguel, 2004). A anatomia dos coléteres durante o processo de senescência encontra-se parcialmente descrita. No entanto, persiste a lacuna quanto às descrições ultraestruturais.
1.6 Aspectos subcelulares do processo de secreção vegetal
A secreção é um fenômeno complexo que, usualmente, envolve síntese, compartimentalização intracelular, liberação ou secreção propriamente dita para o apoplasto e, alternativamente, para a superfície da planta (Castro, 2000; Machado, 2000). Por isso, têm sido descritas peculiaridades intracelulares no processo de secreção. Dentre estas, Machado (2005) descreve características das células secretoras durante a secreção. Entre as organelas que mostram variações consideráveis, ao longo do processo secretor, estão os plastídios dos tricomas glandulares no gineceu de Zeyheria digitalis
(Bignoniaceae) (Machado et al., 1995) e os cloroplastos no parênquima secretor de
Citharexylum mirianthum (Verbenaceae) (Machado, 1999).
Considerando, ainda, que a secreção é um processo que envolve peculiaridades intracelulares, o estudo detalhado das células secretoras permite avaliar tanto a dinâmica do processo secretor, como fazer correlações entre a estrutura e o funcionamento de determinadas organelas envolvidas na secreção.
Estruturas secretoras, como tricomas glandulares e nectários, podem combinar simplicidade estrutural com atividade secretora intensa, mostrando-se modelos adequados para a investigação de questões fundamentais da biologia celular de plantas. Dentre estas, transporte à curta distância; síntese e transporte intracelular de macromoléculas; origem de vacúolos de estocagem ou com função lisossomal (Silva e Machado 1999a; Machado, 1999). Ultraestruturalmente, estas células possuem características particulares. Segundo Fahn e Shimony (1998), as células secretoras de Fagonia mollis (Zygoplhylaceae) possuem núcleo relativamente grande e numerosas mitocôndrias modificadas. Nas células secretoras dos ductos de goma de Lannea coromandelica (Anacardiaceae), o citoplasma é rico em ribossomos, retículo endoplasmático rugoso, mitocôndria, vacúolos, corpos paramurais e gotas lipídicas e em algumas etapas de sua diferenciação foram encontrados complexos de Golgi (Venkaiah, 1992). Werker e Kislev (1978) argumentam que a produção de secreção, em tricomas secretores da raiz de Sorghum (Poaceae), está relacionada com o complexo de Golgi.
1.6.1 Sistema endomembranar
O retículo endoplasmático é uma projeção do envelope nuclear para as regiões corticais da célula e pode ser subdividido em domínios funcionais distintos (Staehelin, 1997). O retículo endoplasmático é o ponto de entrada no sistema endomembranar para proteínas recém sintetizadas. Depois da remoção da seqüência sinal, por peptidases do lúmem do retículo, as proteínas mudam sua estrutura com a ajuda de chaperonas (Vitale e Denecke, 1999). Proteínas defeituosas parecem ser reconhecidas por um mecanismo de controle de qualidade, sendo transportadas para o citosol, onde são degradadas (Brandizzi
et al., 2003). A glicosilação de proteínas tem um papel fundamental na entrada destas no
ou faltando α-glicosidase I, são letais no embrião (Lukowitz et al., 2001; Gillmor et al., 2002; Boisson et al., 2001). Proteínas residentes do retículo são retidas nessa organela ou recicladas de volta do complexo de Golgi (Vitale e Denecke, 1999). O retículo endoplasmático segrega, ainda, compartimentos de membrana para seqüestro de lipídios ou proteínas, alguns desses evoluem para vacúolo de estocagem (Chrispeels e Herman, 2000).
O complexo de Golgi é conhecido desde 1843, quando foi descrito por Camillo Golgi. Em microscopia eletrônica de transmissão, foi visualizado nos anos 50. Essa organela não foi alvo de muitos estudos nas décadas seguintes, contudo, a partir da década de 90, foi redescoberta (Mollenhauer e Morré, 1994). Em células vegetais, é formado por várias pequenas pilhas de cisternas, reconhecidas, individualmente, também pelo nome de dictiossomos (Dupree e Sherrier, 1998). A quantidade dessas pilhas pode variar muito de acordo com a função da célula em questão. A variação é notada não somente na quantidade das cisternas, mas também na sua morfologia. Essas pilhas são polarizadas individualmente, diferenciando as faces cis e trans. Essa organela é extremamente dinâmica e móvel no citoplasma da célula, principalmente, no inicio do processo de divisão celular (Nebenführ e Staehelin, 2001) tendo grande importância na síntese de precursores de parede celular.
Dentre as muitas funções atribuídas ao complexo de Golgi se destacam, além da síntese de polissacarídeos da parede celular, a modificação de proteínas, como, por exemplo, proteínas de estocagem ou enzimas, que serão subseqüentemente distribuídas para outras partes da célula como o vacúolo e a membrana plasmática. Para exercer com precisão essas funções, a organela possui compartimentalização bioquímica, sendo as cisternas da face cis diferentes das da face trans. Pakelka e Robinson (2003) confirmam a existência de relação estrutural e funcional do complexo de Golgi com o retículo endoplasmático.
1.6.2 Transporte de substâncias em células vegetais
O movimento intracelular de moléculas é de vital importância na manutenção da identidade e funcionalidade dos compartimentos intercelulares (Jürgens, 2004). O transporte e endereçamento de proteínas para os vários compartimentos foram estudados extensivamente em células vegetais (Jürgens, 2004). Estes estudos permitiram a
identificação de várias seqüências de sinais de endereçamento. Essas seqüências são especificas não só para organelas, mas também para seus subcompartimentos.
O tráfego vesicular entre retículo endoplasmático, complexo de Golgi, vacúolo e membrana plasmática é complexo, podendo seguir muitas vias diferentes do transporte das vesículas (Hawes et al., 1999). Diferentes tipos de estresse podem afetar essas vias e modificá-las de várias formas. Estes efeitos podem ser suprimidos por mecanismos celulares (Levine, 2002). Os mecanismos de tráfego vesicular em plantas têm se demonstrado semelhantes aos de mamíferos e fungos com respeito ao transporte, ao ancoramento e a fusão vesicular. Contudo, moléculas únicas de vegetais também controlam esse fenômeno (Ueda e Nakano, 2002). Estudos mostram o envolvimento do gradiente de concentração de íons, especialmente cálcio e cloro, no processo de exocitose de células animais (Marengo, 2005) e em células vegetais (Zonia et al., 2001).
1.6.3 Morte celular programada em plantas
O processo de morte celular programada (MCP) muda a ultraestrutura e dinâmica da célula vegetal (Doorn e Woltering, 2005). Durante esse processo as vias metabólicas são desviadas; ou seja, toda a maquinaria celular que funciona para a manutenção celular, e/ou processos secretores, passa ser direcionada para suprir as necessidades do processo de MCP (Rose et al., 2006). Tal processo é de fundamental importância no desenvolvimento, resposta de defesa contra patógenos (McCabe e Leaver, 2000) e senescência (Doorn e Woltering, 2005).
De um modo geral, dois tipos de MCP são predominantes: autofagia e apoptose. Há, ainda, uma forma incomum, chamada de morte celular programada não-lisossomal (Doorn e Woltering, 2005). Uma das abordagens na diferenciação entre autofagia e apoptose é baseada na ultraestrutura das células durante o processo e pelas organelas que estão envolvidas.
Resumidamente, autofagia é um processo altamente regulado, durante o qual materiais citoplasmáticos são envolvidos por vesículas, constituídas de dupla membrana, que são então destinadas aos vacúolos ou lisossomos para degradação (Levine e Klionsky, 2004).
Em linhas gerais, a autofagia é um mecanismo pelo qual a célula degrada parte ou o citoplasma completo, exceto núcleo (Aubert et al., 1996). Esse processo pode ocorrer em todos os organismos eucariontes, seja como um processo natural, no curso do desenvolvimento ou em reposta aos estresses ambientais, como, por exemplo, depleção de nutrientes (Rose et al., 2006).
A via do processo autofágico envolve o seqüestro de porções do citoplasma por endomembranas, formando então o vacúolo autofágico. Em seguida, ocorre a degradação das estruturas capturadas por essas endomembranas, ao invés de sua reciclagem para manter as funções essenciais e homeostase celular (Rose et al., 2006). Podem existir variações, e outras classificações para o processo de autofagia em plantas, como a micro e macroautofagia (Doorn e Woltering, 2005).
A apoptose tem sido alvo de algumas revisões recentes (Yoshida et al., 2005; Doorn e Woltering, 2005; Selga et al., 2005). Três características principais podem ser observadas durante esse processo: fragmentação nuclear; formação de corpos apoptóticos; e engolfamento e degradação dos corpos apoptóticos nos lisossomos de outras células (Clarke, 1990). Outras características também são marcantes na apoptose como, por exemplo, a participação das caspases e a condensação da cromatina com degradação do DNA (Doorn e Woltering, 2005). Já que a apoptose inclui a degradação dos corpos apoptóticos em outras células, alguns autores argumentam que a apoptose verdadeira não ocorre em plantas (Doorn e Woltering, 2005).
Alguns exemplos de MCP em células de mamíferos mostram uma morfologia intermediária. Em algumas células, o processo autofágico precede a formação dos corpos apotóticos (Doorn e Woltering, 2005).
O processo de morte celular programada menos comum é a morte celular programada não lisossomal, que se diferencia das demais por não envolver lisossomos. A célula se mata, aparentemente, pela inibição das principais vias biossintéticas, pela desestabilização das membranas, ou por vias ainda não elucidadas (Doorn e Woltering, 2005). Esse processo também é chamado morte celular programada necrosis-like (Doorn e Woltering, 2005). Por ser menos freqüente, pouco se sabe sobre esse processo.
1.7 Parede periclinal externa
A parede periclinal externa é a fronteira entre a planta e o ambiente. Esta estrutura é formada por macromoléculas e constitui uma barreira ao fluxo bidirecional em grande parte dos tecidos de revestimento nas plantas. A parede periclinal externa tem sido relacionada também à proteção contra radiação, danos mecânicos, patógenos e pragas. A variedade de funções dessa estrutura tem sido associada à sua estrutura, complexidade e diversidade. A distribuição de seus componentes, usualmente, é heterogênea. A nomenclatura de seus estratos tem sido baseada nesta peculiaridade. Tenberge (1992) propõe que a parede celular é dividida em cera epicuticular e três camadas distintas: a cutícula propriamente dita, as camadas cuticulares, divididas em camada reticulada e camada arborescente, e camada rica em polissacarídeos. Outros autores também utilizam esta nomenclatura (Barros e Miguens, 1998; Klein et al., 2004 e Miguel, 2004, Moraes et al., 2005). A composição e estrutura das paredes celulares vegetais podem variar durante o crescimento e a diferenciação da célula e em resposta a fatores ambientais (Barros e Miguens, 1998; Marques, 1998). No entanto, a morfologia e fisiologia, sobretudo os mecanismos de secreção, da parede periclinal externa têm sido considerados espécie-específicas.
1.7.1 Passagem de moléculas pela parede periclinal externa
O transporte de moléculas pela parede periclinal externa ainda não foi elucidado. A maioria dos trabalhos, que se referem de alguma forma a passagem de moléculas pela parede periclinal externa, utilizou microscopia eletrônica de transmissão, e apenas citam a presença ou ausência de cutícula. Quanto ao mecanismo de secreção, Ascensão e Pais (1998) relatam o acúmulo da secreção no espaço periplasmático. A secreção passa pela parede celular e se deposita em um espaço subcuticular, formado pelo deslocamento da cutícula. Esse espaço recebe o nome também de espaço subcuticular (Possobom e Machado, 2005).
Kim e Mahlberg (1997), utilizando técnicas de imunolocalização, marcaram o Tetra-hidro-canabinol na parede periclinal externa de tricomas criofixados, reafirmando a função dessa cavidade na passagem de substâncias pela parede. Os mesmos autores descreveram a formação de vesículas secretoras em tricomas de espécies da família
Cannabacea (Kim e Mahlberg, 2003). Mesmo assim ainda ficam duvidas com relação a esta passagem.
Mahlberg e Kim (1992) e Kim e Mahlberg (1995 e 2000) sugerem que, em tricomas glandulares de Cannabis, a passagem da secreção através da parede periclinal externa é feita através de “cavidades secretoras” na parede que servem para a saída do exsudado após toda a passagem pelo tráfego de vesículas, sendo a parede celular o meio de exteriorização da secreção. Alguns aspectos dessa passagem ainda permanecem obscuros, pois nenhum estudo mostrou de maneira convincente todo esse processo em células de estruturas secretoras de vegetais. Estruturas semelhantes a essas “cavidades secretoras” forma descritas na parede periclinal externa dos coléteres de B. nicholsonii (Miguel, 2004). Estas estruturas tiveram a sua formação descrita (Miguel et al., 2005) e aparentemente estão envolvidas no processo de tráfego da secreção pela parede periclinal externa. No entanto, Jefree (1996) aponta outros mecanismos para este tráfego, dentre os quais, microcanais perpendiculares ao maior eixo da parede periclinal e acúmulo da secreção nas camadas cuticulares da parede celular. Esse acúmulo acaba por levar a ruptura física dessa camada.
1.8 Exsudatos vegetais: Características gerais e propriedades
Os exsudatos vegetais, que são classificados de acordo com sua composição química, têm uma ampla distribuição entre as famílias de vegetais superiores chamando a atenção de muitos pesquisadores, não só pela sua função na planta, como também pelo seu aproveitamento econômico. Os materiais secretados podem exercer várias funções na própria planta e, após serem eliminados das estruturas secretoras, geralmente não são reutilizados nos processos metabólicos do organismo produtor (Fahn, 1979). Diferentes espécies exsudam diferentes produtos, como pode ser visto ao se comparar os trabalhos de Curtis e Lersten (1974; 1980) e Durkee et al. (1984), em que o exsudato, nas espécies estudadas, é classificado como uma resina. Mueller (1985) classifica o exsudato de Alstonia
scholaris como sendo semelhante ao látex. Os trabalhos de Dexheimer e Guenin (1981) e
Horner e Lersten (1968) em Psychotria bacteriophila (Rubiaceae) e Miller et al. (1983) em
Psychotria kirkii (Rubiaceae) mostram que os coléteres destas espécies secretam
substâncias mucilaginosas. Ramayya e Bahadur (1968) caracterizaram o exsudato do coléter de Allamanda cathartica (Anacardiaceae) como uma substância parda e
transparente, considerada como resina de grandes polímeros. Ao investigar esta mesma secreção, Thomas e Dave (1989) não encontraram aminoácidos, no entanto, acharam alguns açúcares (glicose e rhamanose) e caracterizaram seus elementos químicos majoritários: Na (25 %), Fe (14 %) e Zn (13 %). A presença de proteínas na secreção dos coléteres foi identificada por Klein et al. (2004). Kristen (1976) aponta a necessidade de análises bioquímicas para determinação da composição de mucilagens.
O uso dos exsudatos vegetais na medicina popular é bastante amplo. Por isso, a etnofarmacologia pode crescer bastante nos últimos anos. O exsudato de Plectranthus (Lamiaceae) é utilizado em casos de dores de cabeça, dores de garganta, queimaduras, dermatite, náuseas e, até, picadas de escorpião (Riviera Nuñez e Óbon de Castro, 1992 e Bown, 1995). O extrato foliar de Piper regnellii (Piperaceae) é utilizado no tratamento de dores, infecções, febres reumáticas já que apresenta uma forte propriedade analgésica (Di Stasis, 1987 apud Silva e Machado, 1999b). Muitas espécies de Plectranthus são cultivadas como plantas ornamentais e como fontes de óleos essenciais utilizados na culinária, pelo seu sabor (Ascenção et al., 1999). Existem registros do uso da secreção dos coléteres de
Bathysa como cicatrizante (Sr. Walter Silva, comunicação pessoal). A utilização em
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Caracterizar a anatomia e a ultraestrutura dos coléteres de Bathysa nicholsonii K. Schum., bem como analisar o perfil protéico da secreção e sua ação antifúngica.
2.2 Objetivos específicos
ü Descrever a anatomia e ultraestrutura de coléteres de B. nicholsonii;
ü Caracterizar morfológica e temporalmente as células da epiderme secretora dos coléteres de B. nicholsonii;
ü Caracterizar citoquimicamente as células da epiderme secretora de coleteres de B.
nicholsonii;
ü Investigar preliminarmente a presença de proteínas na secreção dos coléteres de B.
nicholsonii;
ü Examinar a atividade antifúngica do extrato protéico da secreção dos coléteres de B.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Área de coleta
O material foi coletado na Reserva Biológica de Tinguá, com licença concedida pelo IBAMA (171/2003). Esta reserva localiza-se na porção central da cadeia da Serra do Mar, no trecho compreendido pelas serras do Tinguá, de São Pedro e do Macuco (22º28’ e 22º39’ S, 22°35' e 43º34’ W), municípios de Nova Iguaçu e Duque de Caxias. Os desníveis altimétricos da reserva variam entre 220 e 1.600 metros, destacando-se o maciço do Tinguá como a maior elevação. O solo é representado pelos tipos Cambissolos, Latossolos e Podzólicos. A temperatura média anual é de 21,6 °C e pluviosidade média anual de 2.268 mm. A vegetação local é reconhecida como Floresta Ombrófila Densa. A Reserva Biológica de Tinguá foi criada pelo Decreto de Lei Federal número 30.97.780 de 1989; sendo considerada Reserva de Biosfera pela Unesco em 1992. É a maior reserva florestal do Estado do Rio de Janeiro e, sofre sérios problemas com caça predatória, despejo de lixo, grileiros e extrativismo, representado principalmente pela presença de palmiteiros e madeireiros (SOS Mata Atlântica, 2002).
3.2 Material botânico
Ápices caulinares de indivíduos adultos, incluindo as estípulas e o meristema apical caulinar, de Bathysa nicholsonii K. Schum. (Rubiaceae) foram coletados com o auxílio de podão. Amostras testemunhas foram depositadas no Herbário do Jardim Botânico do Rio de Janeiro. As estípulas foram dissecadas dos ápices caulinares com o emprego de bisturis e pinças. Para microscopia, este material foi fixado quimicamente no local de coleta; e, para extração da secreção as estípulas foram levadas ao laboratório, acondicionadas de maneira a preservar as estruturas a temperatura ambiente, para os procedimentos. Na identificação das estípulas, seguiu-se descrição proposta por Klein (2002); o par de estípulas mais próximo ao meristema apical caulinar foi denominado estípulas do primeiro nó e o par seguinte, como do segundo nó.
3.3 Microscopia
3.3.1 Microscopia Óptica
Fragmentos da base da estípula, contendo coléteres, foram fixados em solução aquosa contendo glutaraldeído 2,5 %, formaldeído 4,0 % diluídos em tampão cacodilato de sódio 0,05 M, pH ~ 7,2, sob temperatura ambiente, durante 2 horas. Após serem lavados por 45 minutos no mesmo tampão, os fragmentos foram pós-fixados em solução aquosa contendo tetróxido de ósmio 1,0 % diluído em tampão cacodilato de sódio 0,05 M, pH ~ 7,2, temperatura ambiente, durante 1 hora na ausência de luz. Após três lavagens de 45 minutos no mesmo tampão, os fragmentos foram submetidos à série cetônica ascendente [50 %, 70 %, 90 %, 100 % (3X)], durante 1 hora em cada etapa, para desidratação. Então, os fragmentos foram infiltrados com resina epóxi (Epon Polibed), utilizando-se serie crescente de resina em propanona. A polimerização da resina foi realizada a 60 ºC. Cortes semifinos, aproximadamente 1 µm de espessura, foram obtidos com navalhas de vidro em ultramicrótomo (REICHERT ULTRACUT-S®). A coloração foi realizada com solução aquosa de azul de toluidina 1,0 % acrescido de 0,1% de Bórax. Lâminas permanentes foram montadas com Entellan®. A documentação analógica foi realizada em microscópio óptico Axioplan ZEISS (Oberkohen, Germany), utilizando-se filme fotográfico Kodalit, 35 mm, 32 ASA (Kodak, USA); dados digitais foram obtidos no mesmo equipamento, utilizando-se câmera digitalizadora Hamamatsu C3077 e software Analysis®- LINK/ISIS/ZEISS (Oxford, UK).
3.3.2 Histoquímica
Os testes histoquímicos da estípula foram realizados em cortes a mão livre de material recém coletado. A documentação analógica e digital foi realizada conforme descrito anteriormente.
Carboidratos (hidroxilas vicinais)
Cortes a mão livre de ápices caulinares foram lavados em água destilada e imersos em solução aquosa de ácido periódico de Schiff 1,0%, durante 5 minutos a temperatura ambiente. Após lavagem em água destilada, estes foram imersos em reagente de Schiff
durante 15 minutos, a temperatura ambiente, sendo então, lavados em água destilada, durante 5 minutos a temperatura ambiente (Hotchkiss, 1948).
Proteínas totais
Proteínas totais foram evidenciadas em cortes expostos a solução aquosa de Azul Brilhante de Coomassie G 0,25 % contendo 5 % de ácido acético, durante trinta minutos. Este procedimento foi seguido de lavagem em solução aquosa de ácido acético 5 % por três vezes, durante 5 minutos em cada etapa. Lâminas permanentes foram obtidas com glicerina 50%.
3.3.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão
Para microscopia eletrônica de transmissão foram utilizados os mesmos procedimentos que para microscopia óptica, exceto a ultramicrotomia e a contrastação. Cortes ultrafinos, com aproximadamente 70 nm de espessura, foram obtidos, utilizando-se navalha de diamante (Diatome®) em ultramicrótomo (REICHERT ULTRACUT-S®); os cortes, foram coletados em grades de cobre de 300 mesh. A contrastação foi realizada em solução aquosa saturada de acetato de uranila, durante 40 minutos, seguida de lavagem em água destilada e de 5 minutos em citrato de chumbo 1% (Reynolds, 1963). A documentação analógica foi realizada em microscópio eletrônico de transmissão (ZEISS EM 900), operando a uma aceleração de voltagem de 80 kV, em chapas fotográficas, 6” x 9”, Kodak 4489.
3.3.4 Citoquímica
As características ultraestruturais evidenciadas pelos métodos citoquímicos empregados foram documentadas como descrito no tópico anterior, relativo a microscopia eletrônica de transmissão.
Carboidratos (hidroxilas vicinais)
Para detecção de hidroxilas vicinais, predominantemente carboidratos, foi utilizado o método de Thiéry (1967), utilizando-se tiosemicarbazida-proteinato de prata (PATAg). Cortes ultrafinos, das amostras processadas para microscopia eletrônica de transmissão,
foram coletados em grades de ouro de 300 mesh e tratados com solução aquosa de ácido periódico 1 %, durante 30 minutos. Após lavagem em água destilada, as grades foram sobrepostas em gotas de solução aquosa de tiosemicarbazida 1 % contendo ácido acético a 10 %, durante 72 horas; segue-se uma série decrescente de ácido acético (10 %, 5 %, 2 % em água destilada). Então, os cortes ultrafinos foram expostos à solução aquosa de proteinato de prata 1 %, durante 30 minutos, seguindo-se lavagem em água destilada. O controle foi realizado pela exclusão do tratamento com solução aquosa de ácido periódico.
Detecção de lipídios insaturados
Objetivando detectar lipídios insaturados foi utilizada a técnica de tetróxido de ósmio-imidazol (Angermüller e Fahimi, 1982). Para tanto, fragmentos da base da estípula, contendo coléteres, foram fixados em uma solução aquosa contendo glutaraldeído 2,5 %, formaldeído 4,0 % diluídos em tampão cacodilato de sódio 0,05 M, pH ~ 7,2, em temperatura ambiente, durante 24 horas. Posteriormente, imersos em tampão imidazol 0,05 M, pH 7,2, temperatura ambiente, durante 24 horas, sendo, então, pós-fixados em solução aquosa de tetróxido de Ósmio 1,0 % e tampão imidazol 0,05 M, por 72 horas, na ausência do espectro visível da radiação eletromagnética. Em seguida, as amostras foram lavadas no mesmo tampão e, posteriormente, em tampão cacodilato de sódio 0,05 M As etapas subseqüentes foram as mesmas utilizadas para análise por microscopia eletrônica de transmissão. No material controle, o tampão imidazol 0,05 M foi substituído por tampão cacodilato de sódio 0,05M.
Detecção de moléculas orgânicas insaturadas
Fragmentos, após a fixação descrita anteriormente, foram tratados com solução aquosa contendo tetróxido de ósmio 1,0 % e iodeto de potássio 1,0 % diluídos em água destilada, durante 48 horas na ausência do espectro visível da radiação eletromagnética, a temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram lavadas, por duas vezes, em solução aquosa de iodeto de potássio 1,0% diluído em água destilada, durante 1 hora na ausência do espectro visível da radiação eletromagnética, a temperatura ambiente (Locke e Huie, 1983). Seguiram-se, então, os procedimentos para microscopia eletrônica de transmissão, descrita anteriormente. O controle foi realizado pela exclusão do iodeto de potássio.
3.3.5 Microscopia Eletrônica de Varredura
Foram utilizados para a microscopia eletrônica de varredura os procedimentos para microscopia eletrônica de transmissão como descrito anteriormente. Após a desidratação, as amostras foram secas pelo método do ponto crítico de CO2 utilizando o aparelho CPD-030
BAL-TEC (Liechtenstein). Fragmentos secos de estípula e ápices contendo coléteres foram aderidos com fita adesiva de carbono dupla-face (3M) e cola de carbono em suportes adequados. As amostras foram cobertas por sputtering com uma camada de aproximadamente 20 nm de ouro, utilizando-se aparelho SCD-050 BAL-TEC (Liechtenstein). A observação e documentação digital (512X480 TIFF) foram realizadas em microscópio eletrônico de varredura (DSM 962 – ZEISS), a uma aceleração de voltagem de 15 kV ou 25 kV.
3.3.6 Microanálise de Raio-X (Energia Dispersiva de Raios-X)
A análise qualitativa dos elementos químicos constituintes presentes na secreção dos coléteres e das estípulas foi realizada pela detecção da energia dispersiva de Raios-X em microscopia eletrônica de varredura. Estípulas, de ápices caulinares recém coletados, foram congeladas em nitrogênio líquido, por aproximadamente um minuto e, em seguida, liofilizadas. Pequenos fragmentos de estípula foram aderidos em suportes em fita adesiva de carbono dupla-face e com adesivo líquido a base de carbono e cobertos com carbono em aparelho XCD-010 BAL-TEC (Liechtenstien).
A análise qualitativa e o mapa de distribuição dos elementos foram realizados em microscópio eletrônico de varredura DSM 962 ZEISS (Oberkohen, Germany), acoplado a detector de raios-x de silício/lítio OXFORD Microanalysis Group (Oxford, UK) com resolução nominal de 138 eV, operando nas condições apresentadas abaixo (Quadro 1). Os resultados foram analisados em software LINK-ISIS, OXFORD Microanalysis Group (Oxford, UK).
Quadro 1
Microscópio Eletrônico de Varredura DSM 962 ZEISS EDX - condições de operação
Parâmetro Configuração
Aceleração de voltagem 30 KeV (SE)
Distância de trabalho 12-16 mm
Detector de Si/Li 1024 canais 0 - 15 KeV
Tempo de captação da microanálise 300 seg
Janela do detector UTW
Calibração EDX 99.9 Cu
MEV Imagens SE e BSE
3.4 Detecção de proteínas totais na secreção (SDS-PAGE)
A secreção foi analisada com relação ao perfil protéico utilizando o método de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE) em sistema de gel descontínuo como descrito por Laemmli (1970). Para tanto, aproximadamente 70 ápices caulinares, que se encontravam visualmente mais cobertos pela secreção, tiveram as estípulas dissecadas. A parte interna das estípulas foi lavada em solução contendo tampão Tris-HCl 0,1 M e Triton X-100 0,1 %, pH 8,0, para extrair a secreção. As amostras resultantes foram filtradas em papel de filtro e submetidas à precipitação de proteínas com solução aquosa de sulfato de amônio 90 %. Após 16 horas do tratamento de precipitação, as amostras foram centrifugadas a 10.000 g, por 30 minutos sendo o sobrenadante descartado e o precipitado diluído em água destilada. A suspensão foi então dialisada com membrana de diálise Merck, a 4 oC por 48 horas e, posteriormente liofilizado.
Para eletroforese, as proteínas liofilizadas, extraídas de 1 mL de secreção foram ressuspendidas em 100 µL de tampão de amostra (Tris-HCl 0,1 M em pH 8,0 contendo SDS 2 %, sacarose 10% e azul de bromofenol 0,025 %) com e sem a presença de 5 % de β-mercaptoetanol. As amostras foram aquecidas por 5 min a 100 °C e centrifugadas a 16 000 rpm por 3 min. Após este procedimento, 25 µL das amostras foram aplicadas no gel 15 %
de concentração. A corrida do gel se processou a uma corrente constante de 100 V por 2 horas.
A coloração foi realizada por imersão em solução corante de Azul brilhante de Coomassie R 0,05 %, durante 1 hora. Após este período, o corante foi retirado e o gel mantido em uma solução descorante de ácido acético glacial 10 %, metanol 20 % em água destilada, até visualização das bandas protéicas.
3.5 Detecção de glicoproteínas
Para a detecção de glicoproteínas, os procedimentos foram realizados de acordo com as recomendações do fabricante do kit de detecção de glicoproteínas, SIGMA ALDRICH. Os géis obtidos foram fixados em metanol 100 %, durante 30 minutos, seguindo-se de lavagem em água mili-Q, durante de 20 minutos, por duas repetições. Em seguida, o gel foi exposto à solução de oxidação (acido periódico), durante 30 minutos. Após lavagem em água mili-Q, durante de 20 minutos, por duas vezes, a coloração do gel foi realizada com solução corante por 2 horas, na ausência do espectro visível da radiação eletromagnética. Subseqüentemente, os géis foram expostos à uma solução aquosa de redução (metabisulfito de sódio) e estocados em solução aquosa de acido acético 5 % por 12 horas. A documentação fotográfica foi realizada com câmera digital SONY P-63, com 3,2 megapixels/polegada2.
3.6 Detecção de atividade antifúngica no extrato total da secreção
Para o ensaio de atividade antifúngica do extrato total da secreção, amostras de fungos filamentosos fitopatogênicos foram retirados de culturas mantidas no Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Microrganismos. Foram inicialmente colocados para crescer em placas de Petri contendo o meio ágar Saboraud durante 10 dias a temperatura ambiente. Após esse período de crescimento, 10 mL de solução salina estéril de 0,15 M foi vertida sobre as placas e para a liberação de esporos foi utilizada uma alça de Drigalski. Os esporos extraídos foram recuperados e quantificados em câmara de Neubauer.
Para o ensaio de atividade antifúngica do extrato total da secreção amostras dos fungos C. musae, C. lindemutianum e F. oxysporum, mantidos no Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Microrganismos, foram inoculados em meio sólido ágar Sabouraud em
placas de Petri, durante dez dias, a temperatura ambiente. Após este período, 10 mL de solução salina estéril de 0,15 M foi vertida no recipiente e para a liberação de esporos foi utilizada uma alça de Drigalski. Os esporos extraídos foram recuperados com uma pipeta e quantificados em câmara de Neubauer. A germinação foi determinada através da inoculação de esporos em meio líquido, 1x104 esporos/200 µL de meio de cultura Saboraud, contendo 250 µg/mL de proteínas do extrato total da secreção. O ensaio foi realizado em placas de cultura de células de 96 poços, a temperatura de 28 ºC, por um período de 60 h. O crescimento micelial foi determinado por densidade óptica com leitura de 6 em 6 h em um leitor de ELISA a 600 nm. Todo o ensaio foi feito sob condições estéreis em capela de fluxo laminar e em triplicatas (Broekaert et al., 1990).
4. RESULTADOS
Os exemplares coletados de Bathysa nicholsonii na Reserva Biológica de Tinguá mostraram poucos sinais de herbivoria nas estípulas no ápice caulinar (fig. 1A). Nas estípulas, que medem aproximadamente 5 cm (fig. 1C e 1D) a herbivoria foi menor que nas folhas. Quando as estípulas são destacadas do ápice caulinar é possível identificar, macroscopicamente, os coléteres (fig. 1E e 1F). Estas numerosas estruturas ocorrem distribuídas na forma de dois triângulos na base da face adaxial (fig. 1E), contornando o primórdio foliar do nó subseqüente. Ao destacar as estípulas, observou-se que a secreção produzida pelos coléteres, freqüentemente, se apresentava translúcida ou raramente amarelada e cobria as estruturas do ápice caulinar. Após exposição ao ambiente, esta secreção torna-se vítrea e friável. A secreção encontrada no ápice caulinar dificultou a separação das estípulas devido a sua viscosidade. Sob estereomicroscópio, coléteres caracterizavam-se por formato cilíndrico, superfície lisa e coloração uniformemente amarela brilhante (fig. 1F). Alguns coléteres apresentavam ápice com coloração amarronzada, sugerindo a sua senescência.
A microscopia eletrônica de varredura confirmou que os coléteres de B. nicholsonii são estruturas cilíndricas de base estreita, às vezes de ápice afinalado, sendo este um sinal de senescência (fig. 2A) na base das estípulas. Freqüentemente, a secreção cobria parte dos coléteres (fig. 2B), sendo este um indicativo de sua abundância. Em vista frontal, as células epidérmicas apresentavam perfil retangular e superfície lisa (fig. 2 A e 2B). Em cortes longitudinais (fig. 2C) e transversais (fig. 2D) foi identificado uma epiderme unisseriada dispostas em paliçada, e o eixo central parenquimático. Na região de ocorrência dos coléteres na estípula, foram identificados tricomas próximos a estas estruturas (dado não mostrado).
Em microscopia óptica, cortes transversais e longitudinais revelaram que coléteres de B. nicholsonii apresentavam eixo central vascularizado, formado por parênquima fundamental circundado por um estrato epidérmico em paliçada (fig. 3A-B, D-F). Estas estruturas inserem-se na estípula por uma região basal de menor diâmetro, apresentando constricção na base. Nesta foram observadas 2 ou 3 células epidérmicas isodiamétricas, seguidas de células de aspecto cilíndrico, cujo maior eixo aumenta gradativamente (fig. 3A). Em cortes longitudinais, evidenciou-se o formato cilíndrico das células
parenquimáticas, dispostas, tendo como referencial seu maior eixo, perpendicularmente à epiderme (fig. 3A e 3C). Neste eixo central, os feixes vasculares apresentavam-se discretos, em forma de traços vasculares. Em cortes transversais, eram observados o eixo central parenquimático e a epiderme. Estruturas grandes e osmiofílicas eram evidentes no citoplasma das células epidérmicas (fig. 3B e 3D). Em maiores aumentos, era clara a distinção entre estas estruturas e o núcleo celular, sendo também evidente a densidade citoplasmática (fig. 3C). Cortes a mão livre de material fresco não revelaram diferenças na organização tecidual dos coléteres (fig. 3E e 3F) quando comparados com material processado para microscopia (fig. 3A-3D). O método histoquímico de Schiff revelou a presença de açúcares, predominantemente no ápice das células epidérmicas e na secreção (fig. 3G e 3H); enquanto que a coloração com Azul Brilhante de Coomassie revelou proteínas com localização similar a dos polissacarídeos revelados pelo método de Schiff (fig. 3I).
Em microscopia eletrônica de transmissão foi possível flagrar diferentes momentos da epiderme secretora dos coléteres. No momento secretor, as células epidérmicas encontravam-se túrgidas e com aparato ultraestrutural típico de células altamente envolvidas em processos de síntese (fig. 2 a 5); e, um segundo momento senescente, em que eram evidentes o desmantelamento do aparato celular e progressiva plasmólise (fig. 6 e 7).
No primeiro momento, o citoplasma apresentou abundância de organelas, característica típica de células altamente funcionais, sendo evidente a distinção entre núcleo celular e inclusões osmiofílicas (fig. 4A). Tais inclusões são freqüentes no citoplasma e as imagens fortemente sugerem que se formam a partir de acréscimo de inclusões menores (fig. 4B). Elementos do retículo endoplasmático liso foram comumente observados lateralmente às inclusões (fig. 4B e 4C). O teste citoquímico de tetróxido de ósmio/imidazol confirmou a natureza lipídica desta estrutura (fig. 4C). O núcleo apresentou distinção clara entre eucromatina e heterocromatina, seu envelope nuclear aparece preservado (fig. 4D). Dispersos no citoplasma foram observados elementos do retículo endoplasmático rugoso dispostos concentricamente (fig. 4E) e paralelamente (fig. 4F). Retículo endoplasmático liso e rugoso e complexos de Golgi eram abundantes no citoplasma (fig 4F – 4H); enquanto que, as mitocôndrias, apresentando um grande número
